本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)，涉及一株農(nóng)業(yè)廢棄物梨樹(shù)修剪枝條降解細(xì)菌l2及其菌劑，該細(xì)菌l2專(zhuān)用于降解廢棄梨樹(shù)枝條生產(chǎn)有機(jī)肥料，實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化利用。

背景技術(shù)：

修剪是一項(xiàng)梨樹(shù)栽培和管理的重要技術(shù)措施，適量的修剪對(duì)果樹(shù)的生長(zhǎng)和果實(shí)的產(chǎn)量品質(zhì)都有積極的影響處于盛果期的梨園，修剪枝條量一般在1500-2250kg·hm^-2。農(nóng)業(yè)部市場(chǎng)與經(jīng)濟(jì)信息司統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)表明，2011年我國(guó)梨樹(shù)的栽培面積為110萬(wàn)多公頃，據(jù)這個(gè)數(shù)字推算，我國(guó)梨園每年枝條的修剪數(shù)量可達(dá)161-242萬(wàn)噸。枝條中含有豐富的纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和脂肪等有機(jī)物，以及各種大中微量無(wú)機(jī)養(yǎng)分，是寶貴的農(nóng)業(yè)資源，因此，梨樹(shù)枝條資源的開(kāi)發(fā)和利用有著非常廣闊的前景。然而，梨樹(shù)枝條中含有大量的木質(zhì)素和纖維素，因此不易腐爛，不能就地進(jìn)行還田處理。除了部分枝條應(yīng)用于食用菌的栽培以外，絕大部分梨樹(shù)枝條都被隨意堆放在路邊或就地焚燒，焚燒會(huì)造成嚴(yán)重的大氣污染，堆放會(huì)誘發(fā)田間的病蟲(chóng)害，同時(shí)也造成了寶貴資源的浪費(fèi)。

研究表明，修剪枝條等園林廢棄物，作為堆肥物料的調(diào)理劑，對(duì)堆肥物料的含水率、孔隙度和碳氮比等有良好的調(diào)節(jié)作用。隨著果樹(shù)修剪枝條資源規(guī)模的不斷擴(kuò)大和再利用難度的困擾，將果樹(shù)修剪枝條作為主要堆肥材料進(jìn)行堆肥技術(shù)化的研究逐步增加。通過(guò)聯(lián)合堆肥化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，枝條堆肥養(yǎng)分豐富全面，病菌數(shù)量達(dá)到無(wú)害化，是一種成熟穩(wěn)定和富含營(yíng)養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥和土壤改良劑。可見(jiàn)將梨樹(shù)枝條進(jìn)行固體有機(jī)廢棄物資源化(堆肥)是解決梨樹(shù)枝條再利用問(wèn)題的簡(jiǎn)單有效途徑。

然而在堆肥過(guò)程中，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等大分子的分解是限制堆肥腐熟的主要因素，通過(guò)接種木質(zhì)素降解細(xì)菌菌劑，可以加速堆體升溫，加快堆肥底物中木質(zhì)素的分解，從而縮短堆肥腐熟的周期。若能篩選到相應(yīng)的高效降解功能菌株，并將其用于梨樹(shù)修剪枝條堆肥生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于篩選一種能夠高效分解梨樹(shù)枝條木質(zhì)素的細(xì)菌，通過(guò)其對(duì)木質(zhì)素的高效降解效果，達(dá)到加速梨樹(shù)枝條堆肥腐熟的目的。從而使梨樹(shù)修剪枝條能夠通過(guò)堆肥化得以大規(guī)模的資源化再利用，確?？沙掷m(xù)農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一株能降解梨樹(shù)枝條的細(xì)菌菌株l2，該菌株屬于巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)，于2013年7月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，菌種保藏號(hào)為cgmccno.7899。其生物學(xué)特征為：在lb平板上菌落近圓形，表面凸起，黃色，不透明，菌落2-4mm，邊緣整齊，表面有光澤或較暗，不分泌色素；為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，桿狀，1.2～1.5×2.0～4.0μm，不運(yùn)動(dòng)，芽孢橢圓形，端生，芽孢膨大不明顯，液化明膠慢、胨化牛奶、水解淀粉、不還原硝酸。

細(xì)菌l2可在以木質(zhì)素類(lèi)似物愈創(chuàng)木酚為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；細(xì)菌l2在lb-愈創(chuàng)木酚平板上無(wú)顯色反應(yīng)，但可以在lb-苯胺藍(lán)平板上產(chǎn)生褪色圈。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的細(xì)菌l2在梨樹(shù)修剪枝條降解方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有所述的細(xì)菌l2的細(xì)菌菌劑。

所述的細(xì)菌菌劑是由以下方法制備而成：

(1)、將細(xì)菌l2接種于lb液體培養(yǎng)基中，28-37℃振蕩培養(yǎng)，使含菌量達(dá)到10⁹/ml，芽孢形成率達(dá)90％以上；

(2)、將步驟(1)培養(yǎng)好的菌懸液5000-6000rpm離心10min，用少量的lb液體培養(yǎng)基重懸，使細(xì)菌l2達(dá)到1×10⁹～10¹⁰/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的液體培養(yǎng)基由以下配制方法制得：烘干后粉碎的梨樹(shù)枝條粉末20g，葡萄糖5g，(nh4)2so42g，k2hpo42g，mgso4·7h2o0.3g，cacl20.4g，胰蛋白胨1g，feso4·7h2o0.0075g，mnso4·h2o0.0025g，znso40.002g，cocl20.003g，水1000ml，ph自然。

所述的梨樹(shù)枝條粉末的制備方法：梨樹(shù)枝條烘干至恒重，粉碎過(guò)40-60目篩。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的細(xì)菌菌劑在梨樹(shù)枝條降解方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明菌株l2可在以木質(zhì)素類(lèi)似物愈創(chuàng)木酚為唯一碳源或以梨樹(shù)枝條粉末為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且可在lb-苯胺藍(lán)平板上產(chǎn)生退色圈。試驗(yàn)表明，在該培養(yǎng)基上按1％接種量接種細(xì)菌l2的菌種懸液(10¹⁰/ml)后，固態(tài)發(fā)酵30d，培養(yǎng)基失重率可到達(dá)10％。在21d的液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力最高值為21.76u·ml^-1，錳過(guò)氧化物酶活力最高值為106.36u·ml^-1。

利用本發(fā)明細(xì)菌l2，采用微生物發(fā)酵的方法降解農(nóng)業(yè)廢棄物梨樹(shù)修剪枝條，促進(jìn)梨樹(shù)枝條堆肥的腐熟進(jìn)程，為梨樹(shù)枝條堆肥化的推廣利用提供技術(shù)支持，達(dá)到變廢為寶、保護(hù)環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的目的，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為細(xì)菌l2的退色反應(yīng)圖(第6d退色反應(yīng))。

圖2為細(xì)菌l2基于16srdna序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

圖3為細(xì)菌l2的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(lip)的活性。

圖4為細(xì)菌l2的錳過(guò)氧化物酶(mnp)的活性。

生物材料保藏信息

l2，分類(lèi)命名為巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)，于2013年7月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為cgmccno.7899。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1梨樹(shù)枝條降解細(xì)菌l2的富集、分離篩選及鑒定

1)梨樹(shù)枝條高效降解菌的富集：降解菌樣品采自蘭州常年堆置的梨樹(shù)腐爛枝條，過(guò)20目篩制成樣品。取枝條樣品0.2g混勻在20g以梨樹(shù)枝條為唯一碳源的固態(tài)富集培養(yǎng)基中固態(tài)富集30d，挑取枝條表面碎屑有黑色降解斑的培養(yǎng)基0.2g，混勻接種到新的固態(tài)富集培養(yǎng)基中繼續(xù)富集30d。繼續(xù)挑取枝條表面碎屑有黑色降解斑的培養(yǎng)基1g接種到100ml液態(tài)富集培養(yǎng)基，160rpm搖床培養(yǎng)培養(yǎng)，定期補(bǔ)加無(wú)菌水；30d后接種1ml至新的液態(tài)富集培養(yǎng)基中，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)30d，獲得對(duì)梨樹(shù)枝條有高效降解效果的菌株。其中，固態(tài)富集培養(yǎng)基：烘干粉碎過(guò)20目篩的梨樹(shù)枝條粉末20g，添加超純水至濕潤(rùn)。液態(tài)富集培養(yǎng)基：(nh4)2so40.5g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，水1l。

2)梨樹(shù)枝條降解菌的分離篩選：利用梯度稀釋涂布法將逐級(jí)稀釋的富集樣品的懸液涂布到愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基上，挑選生長(zhǎng)較快的幾株菌株進(jìn)行分離純化，然后接種到lb-愈創(chuàng)木酚平板和lb-苯胺藍(lán)平板上觀察其顯色圈和褪色圈產(chǎn)生的時(shí)間和大小。最終獲得對(duì)梨樹(shù)枝條有高效降解效果的菌株l2。l2在lb-愈創(chuàng)木酚平板上無(wú)顯色反應(yīng)，在lb-苯胺藍(lán)平板上接種2d開(kāi)始產(chǎn)生褪色圈(見(jiàn)圖1)，第6d時(shí)菌落直徑為5mm，褪色圈直徑為20mm，a值達(dá)到4(a＝d/d)。其中，愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基：愈創(chuàng)木酚1g，kno32g，mgso40.5g，kh2po41g，nacl1g，na2hpo41g，瓊脂20g，水1l。lb-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基：lb培養(yǎng)基中加入1g·l^-1愈創(chuàng)木酚。lb-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基：lb培養(yǎng)基加入0.1g·l^-1苯胺藍(lán)。

3)細(xì)菌l2的鑒定：

生物學(xué)特性為：在lb培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)36h，菌落近圓形，表面凸起，黃色，不透明，菌落2-4mm，邊緣整齊，表面有光澤或較暗，不分泌色素；為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，桿狀，1.2～1.5×2.0～4.0μm，不運(yùn)動(dòng)，芽孢橢圓形，端生，芽孢膨大不明顯，液化明膠慢、胨化牛奶、水解淀粉、不還原硝酸。

采用細(xì)菌通用引物27f和1492r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，在genbank中以blast進(jìn)行序列同源性比較，與bacillusmegaterium的同源性達(dá)99％，選取和它相近的一些菌株繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖2)，以及結(jié)合菌落特征，鑒定該菌株l2為巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)。

實(shí)施例2降解酶活力的測(cè)定

按1％接種量接種細(xì)菌l2的菌種懸液(10⁷/ml)接入已裝有100ml液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶(250ml)中，置28℃下160r/min振蕩培養(yǎng)21d。每2d取樣1次，發(fā)酵液離心過(guò)濾除去菌體和雜質(zhì)，得到粗酶液，測(cè)定其中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(lip)和錳過(guò)氧化物酶(mnp)的活性。結(jié)果如圖3和圖4所示，菌株l2可以產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力較強(qiáng)，產(chǎn)酶較快，產(chǎn)酶維持時(shí)間較長(zhǎng)，菌株l2產(chǎn)以上兩種酶的酶活均在第15天達(dá)到最高值，維持lip酶活在10u·ml^-1以上達(dá)3d多，具有良好的產(chǎn)lip的效果。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活最高值為21.76u·ml^-1，錳過(guò)氧化物酶活最高值為106.36u·ml^-1。

lip的酶活定義為每分鐘氧化1μmol的藜蘆醇為一個(gè)酶活單位(u)。

mnp的酶活定義為每分鐘氧化1μmol的mn²⁺為mn³⁺為一個(gè)酶活單位(u)。

液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(/l)：葡萄糖20g，酒石酸銨0.2g，梨樹(shù)枝條粉1g，基礎(chǔ)培養(yǎng)基100ml，0.1mol/lnaac-hac緩沖液(ph＝4.5)100ml，吐溫801.0g，vb11.0mg，加水定容至1l。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(/l)：k2po420g，mnso45g，cacl21g，微量元素液100ml，加水定容至1l

微量元素液(/l)：mgso43.0g，mnso40.5g，nacl1.0g，feso4·7h2so40.1g，cocl20.1g，cuso40.1g，h3bo30.01g，znso4·7h2o0.1g，alk(so4)2·12h2o0.01g，na2moo4·2h2o0.01g，加水定容至1l。

實(shí)施例3固態(tài)降解能力測(cè)定

制備l2細(xì)菌菌劑，方法如下：(1)、將細(xì)菌l2接種于lb液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩36h，使含菌量達(dá)到10⁹/ml，芽孢形成率達(dá)90％以上；(2)、將步驟(1)培養(yǎng)好的菌懸液6000rpm離心10min，用少量的lb液體培養(yǎng)基重懸，使細(xì)菌l2達(dá)到10¹⁰/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

向分化罐中加入5g烘干梨樹(shù)枝條粉(40-60目)和10ml固態(tài)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)液(固態(tài)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)液：nh4cl2.0g，mgso4·7h2o0.5g，kh2po41.0g，na2hpo40.2g，mnso40.035g，cuso4·5h2o0.007g，feso4·7h2o0.007g，水1l)，至固液混勻并顯平坦?fàn)睿?21℃滅菌20min，按1％接種量接種l2細(xì)菌菌劑(10¹⁰/ml)，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)30d。培養(yǎng)期間，每隔1d加5ml無(wú)菌水保持培養(yǎng)基表面濕潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置重復(fù)三次。以接種等量無(wú)菌水作為空白試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，于105℃下烘干至恒重稱(chēng)重，測(cè)定降解率。

降解率＝(降解前總質(zhì)量-降解后總質(zhì)量)/5g×100％。

結(jié)果表明，細(xì)菌l2的降解率為10±0.03％?？瞻讓?duì)照降解率為0.08±0.02％。