本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及貼壁生長(zhǎng)的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離的一種新方法。
背景技術(shù):
單細(xì)胞克隆是由單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分裂、增殖,形成具有相同遺傳性狀的細(xì)胞群體。由于來(lái)源于同一個(gè)祖先細(xì)胞,擴(kuò)增形成的細(xì)胞群還具有十分相近的形態(tài)特征和基本一致的生理、生化特性。
單細(xì)胞克隆是建立穩(wěn)定細(xì)胞系的重要環(huán)節(jié),因而在現(xiàn)代生物技術(shù)和醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的常用方法有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法和病毒侵染法,兩種方法都需要借助抗生素篩選,通過(guò)單細(xì)胞克隆分離最終獲得表型穩(wěn)定、遺傳特性一致的細(xì)胞群。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法是通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒dna導(dǎo)入細(xì)胞,其中極少部分dna會(huì)整合到基因組,通過(guò)單細(xì)胞克隆分離和抗生素篩選,獲得表達(dá)效率高、整合穩(wěn)定的細(xì)胞群,最終構(gòu)建成穩(wěn)定細(xì)胞系;而病毒侵染法則是通過(guò)將攜帶目的片段的病毒,常用的如慢病毒,轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞,再通過(guò)單細(xì)胞克隆和抗生素篩選,獲得穩(wěn)定細(xì)胞系。
目前常規(guī)的單細(xì)胞克隆分離技術(shù)主要包括有限稀釋法、克隆環(huán)法和顯微操作法。有限稀釋法是通過(guò)將細(xì)胞懸液連續(xù)梯度稀釋,使最終在細(xì)胞培養(yǎng)板的一個(gè)孔中僅有1個(gè)細(xì)胞,再經(jīng)過(guò)兩周左右時(shí)間增殖,形成細(xì)胞群,再經(jīng)過(guò)驗(yàn)證獲得穩(wěn)定克隆;克隆環(huán)法是通過(guò)在10-15cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,將細(xì)胞接種低密度,使分散的單個(gè)細(xì)胞各自增殖成細(xì)胞群,用克隆環(huán)方式與周圍的細(xì)胞隔離開(kāi),通過(guò)胰酶消化,轉(zhuǎn)到新的孔板中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增,并檢測(cè)驗(yàn)證而獲得穩(wěn)定克?。伙@微操作法是借助顯微鏡,在放大的視野下挑取單細(xì)胞,再轉(zhuǎn)至培養(yǎng)孔中,逐漸擴(kuò)增獲得單克隆。
這三種方法有各自一定的局限性:有限稀釋法對(duì)懸浮細(xì)胞較為合適,但是實(shí)際中貼壁細(xì)胞的需求占絕大多少,而且很多細(xì)胞在極低密度下生長(zhǎng)極慢甚至不能生長(zhǎng),無(wú)法進(jìn)行單細(xì)胞克?。豢寺…h(huán)法不僅需要購(gòu)買克隆環(huán),而且因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量較少時(shí)肉眼難辨,必須等到細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增到幾百時(shí)才能進(jìn)行分離,因此需要等待較長(zhǎng)時(shí)間,而且操作步驟多、難度大,實(shí)驗(yàn)人員通常需要有豐富經(jīng)驗(yàn);顯微操作法需要借助昂貴的特殊顯微鏡或?qū)⒊R?guī)顯微鏡搬至安全柜內(nèi)使用,操作難度加大,而且易造成細(xì)胞污染而前功盡棄。
本發(fā)明涉及到的染色試劑中性紅(neutralred),學(xué)名“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪鹽酸鹽”,是一種堿性吩嗪染料,常作為酸堿指示劑使用,變色范圍在ph6.4-8.0之間(由紅變黃);在組織和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通常用于細(xì)胞核和溶酶體的染色。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便有效,無(wú)需昂貴的設(shè)備就能實(shí)現(xiàn)的單細(xì)胞克隆分離方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為:
一種單細(xì)胞克隆分離方法,其特征在于,包括以下步驟:
1)培養(yǎng)細(xì)胞:在培養(yǎng)箱中用適合待培養(yǎng)細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)溫度為37℃,培養(yǎng)箱中控制二氧化碳含量為5%;細(xì)胞控制密度不超過(guò)90%,傳代用0.25%胰酶,消化時(shí)間根據(jù)各細(xì)胞的具體特點(diǎn)調(diào)整,常規(guī)為1-2分鐘;
2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪板,過(guò)夜后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,4-6小時(shí)后換成完全培養(yǎng)液;
3)病毒侵染細(xì)胞:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪板,過(guò)夜后加入病毒液,病毒液的用量按照該細(xì)胞的病毒侵染參數(shù)(即moi值),侵染6小時(shí)至12小時(shí),換成新鮮完全培養(yǎng)液;
4)加抗生素篩選:對(duì)(2)和(3)步驟中的細(xì)胞換液后,繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),加入對(duì)應(yīng)的抗生素,濃度參考該細(xì)胞的抗生素耐受濃度;1-2周后將細(xì)胞傳代,計(jì)數(shù)并接種至新10cm皿中,使每個(gè)皿中細(xì)胞數(shù)100-200個(gè);
5)再經(jīng)過(guò)1-2周后,觀察細(xì)胞克隆小團(tuán),一般在細(xì)胞數(shù)達(dá)到30-100個(gè)可進(jìn)行克隆挑選:用中性紅溶液對(duì)細(xì)胞染色1-3分鐘,用移液器吸取少量低濃度胰酶,局部消化克隆團(tuán),將細(xì)胞吸至96孔板;
6)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),直至細(xì)胞增殖至6孔板的一個(gè)孔長(zhǎng)滿;
7)進(jìn)行目的基因表達(dá)檢測(cè),確認(rèn)克隆細(xì)胞。
步驟1)所述的常規(guī)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液包括dmem、1640等培養(yǎng)液,且需要加入10%胎牛血清和1%的青鏈霉素。
相比于現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明的有益效果如下:
1.本發(fā)明在單細(xì)胞克隆分離過(guò)程中,創(chuàng)新地使用中性紅溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間染色,使得細(xì)胞小團(tuán)快速著色,肉眼易見(jiàn),提高操作準(zhǔn)確性;
2.本發(fā)明在細(xì)胞團(tuán)挑取過(guò)程中,使用較低濃度的胰酶溶液,不僅能使細(xì)胞從器皿壁上脫落下來(lái),又能減少對(duì)細(xì)胞損傷,有利于細(xì)胞的存活和增殖;
3.本發(fā)明使用手動(dòng)移液器吸取少量胰酶,局部消化細(xì)胞小團(tuán)的方法,與傳統(tǒng)的克隆環(huán)法相比步驟簡(jiǎn)化,且無(wú)需購(gòu)買特殊材料--克隆環(huán);與有限稀釋法比,更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng),避免了很多細(xì)胞不能在獨(dú)立環(huán)境中單個(gè)生長(zhǎng)的問(wèn)題;與借助顯微鏡的方法比較,操作方便,大大減少污染的幾率。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞并構(gòu)建單克隆細(xì)胞系
1.培養(yǎng)293細(xì)胞:將凍存的293細(xì)胞復(fù)蘇,培養(yǎng)于dmem+10%胎牛血清+1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)基,置于含5%co2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng);
2.轉(zhuǎn)染前一天,將狀態(tài)良好的細(xì)胞以6孔板每孔5*105數(shù)量接種;第二天用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,常用的有invitrogen公司的lipofectamine2000。
3.轉(zhuǎn)染當(dāng)天,將6孔板每孔換新鮮dmem完全培養(yǎng)液,每孔2ml,取2個(gè)ep管,分別標(biāo)記為a管和b管。a管:250ul無(wú)血清dmem+4ug質(zhì)粒dna;b管:250ul無(wú)血清dmem+10ullipofectamine2000。b管混勻后靜置5分鐘,再將a管液體加至b管中,混勻,靜置15分鐘后加至上述換液后的6孔板中,轉(zhuǎn)染后5-6小時(shí)換成dmem+10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,再以37℃co2培養(yǎng)箱中溫育48小時(shí)。
4.將細(xì)胞傳至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿:將6孔板中細(xì)胞用pbs洗一次,加入300ul0.25%胰酶消化1分鐘,用600ul完全培養(yǎng)液終止消化,2000rpm2分鐘離心后,將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液重懸,稀釋后接種到10cm皿中,使每個(gè)10cm皿中細(xì)胞數(shù)約100左右,同時(shí)在培養(yǎng)液中加入該載體對(duì)應(yīng)的抗生素以殺死未導(dǎo)入質(zhì)粒的陰性細(xì)胞。
5.單細(xì)胞克隆的分離:上述細(xì)胞生長(zhǎng)1-2周后,10cm培養(yǎng)皿中會(huì)出現(xiàn)顯微鏡下可見(jiàn)的293細(xì)胞小群,每個(gè)小群細(xì)胞含有幾十個(gè)細(xì)胞(通常在30-100個(gè)范圍)。(1)用pbs溶液洗一遍;(2)加入中性紅溶液使終濃度為20ug/ml,37度二氧化碳培養(yǎng)箱靜置3分鐘,可看到細(xì)胞染成較明顯的紅色;(3)棄去中性紅溶液,pbs洗一次,吸盡;(4)用移液器吸5ul0.05%胰酶,局部消化細(xì)胞小團(tuán),并將細(xì)胞吸至預(yù)先加入完全培養(yǎng)液的96孔板中,37度培養(yǎng)。
6.擴(kuò)增培養(yǎng):每隔2-3天觀察96孔板中細(xì)胞,至生長(zhǎng)滿整個(gè)孔。再用常規(guī)胰酶消化、傳代方法將細(xì)胞接種至24孔板;長(zhǎng)滿后再接種至6孔板。
7.基因表達(dá)檢測(cè):取2*105細(xì)胞按照常規(guī)方法抽提rna,再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cdna,進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè),確定每個(gè)克隆中特定基因的表達(dá)量。
我們采用本方法進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離,成功構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系,基因水平比對(duì)照細(xì)胞高500倍以上,達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。
實(shí)施例2:用慢病毒侵染nih-3t3細(xì)胞并構(gòu)建單克隆細(xì)胞系
1.培養(yǎng)nih-3t3細(xì)胞:將凍存在液氮中的nih-3t3細(xì)胞復(fù)蘇,培養(yǎng)于dmem+10%胎牛血清+1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)基,置于含5%co2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng);
2.侵染前準(zhǔn)備:將狀態(tài)良好的細(xì)胞用0.25%胰酶消化,計(jì)數(shù),以6孔板每孔3*105數(shù)量接種;
3.侵染:侵染所用慢病毒為本公司產(chǎn)品(pds019),滴度為1*108tu/ml。向3*105細(xì)胞數(shù)的6孔板中加入30ul病毒液和終濃度8ug/ml的polybrene,混勻后靜置于37度細(xì)胞培養(yǎng)箱,6小時(shí)后換新鮮培養(yǎng)液,再置于37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。
4.將細(xì)胞傳至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿:將6孔板中細(xì)胞用pbs洗一次,加入300ul0.25%胰酶消化1分鐘,用600ul完全培養(yǎng)液終止消化,2000rpm2分鐘離心后,將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液重懸,計(jì)數(shù),根據(jù)細(xì)胞數(shù)量,將細(xì)胞液稀釋后接種到10cm皿中,使每個(gè)10cm皿中細(xì)胞數(shù)約100左右,同時(shí)在培養(yǎng)液中加入對(duì)應(yīng)的抗生素殺稻瘟菌素,使終濃度2ug/ml,以殺死未侵染慢病毒的陰性細(xì)胞。
5.單細(xì)胞克隆的分離:上述細(xì)胞生長(zhǎng)1-2周后,10cm培養(yǎng)皿中會(huì)出現(xiàn)顯微鏡下可見(jiàn)的小細(xì)胞群,每個(gè)小群細(xì)胞含有幾十個(gè)細(xì)胞(通常在30-100個(gè)范圍)??寺〉姆蛛x采用以下步驟:(1)棄去培養(yǎng)液,用pbs溶液洗一遍;(2)加入中性紅溶液使終濃度為40ug/ml,37度二氧化碳培養(yǎng)箱靜置2分鐘,可看到細(xì)胞染成較明顯的紅色;(3)棄去中性紅溶液,pbs洗一次,吸盡;(4)用移液器吸5ul0.05%胰酶,局部消化細(xì)胞小團(tuán),并將細(xì)胞吸至預(yù)先加入完全培養(yǎng)液的96孔板中,37度培養(yǎng)。
6.擴(kuò)增培養(yǎng):每隔2-3天觀察96孔板中細(xì)胞,至生長(zhǎng)滿整個(gè)孔。再用常規(guī)胰酶消化、傳代方法將細(xì)胞接種至24孔板;隨后再擴(kuò)大培養(yǎng)至6孔板。
7.基因表達(dá)檢測(cè):熒光顯微鏡下觀察抗生素篩選后細(xì)胞,是否有g(shù)fp熒光,也可以取2*105細(xì)胞按照常規(guī)方法抽提dna,再用熒光定量pcr檢測(cè)gfp的表達(dá)。
我們采用慢病毒侵染、抗性篩選并結(jié)合單細(xì)胞克隆分離方法,成功完成穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞系構(gòu)建,通過(guò)擴(kuò)增特定序列,驗(yàn)證了細(xì)胞基因組中含有病毒載體攜帶的目的基因。