本發(fā)明涉及微生物酶制備技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種草酸脫羧酶的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

草酸(oxalicacid)，又叫乙二酸(ethanedioicacid)，是生物體的一種代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物、動(dòng)物和真菌體中，并在不同的生命體中發(fā)揮不同的功能。研究發(fā)現(xiàn)至少有100多種植物富含草酸，尤以菠菜、莧菜、甜菜、馬齒莧、芋頭、茶葉、可可、甘薯和大黃等植物的葉片和種子中含量最高，由于草酸可降低礦質(zhì)元素的生物利用率，在人體中容易與鈣離子形成草酸鈣導(dǎo)致腎結(jié)石，所以草酸往往被認(rèn)為是一種礦質(zhì)元素吸收利用的拮抗物。草酸在人體內(nèi)不容易被氧化分解掉，經(jīng)代謝作用后形成的產(chǎn)物，屬于酸性物質(zhì)，可導(dǎo)致人體內(nèi)酸堿度失去平衡，吃得過多還會(huì)中毒。而且草酸在人體內(nèi)如果遇上鈣和鋅便生成草酸鈣和草酸鋅，不易吸收而排出體外，影響鈣與鋅的吸收。兒童生長發(fā)育需要大量的鈣和鋅，如果體內(nèi)缺乏鈣和鋅，不僅可導(dǎo)致骨骼、牙齒發(fā)育不良，而且還會(huì)影響智力發(fā)育，過量攝入草酸還會(huì)造成人體內(nèi)血液和尿液中的草酸含量過高，容易與鈣離子形成不溶性的草酸鈣晶體，草酸鈣晶體很容易形成泌尿系結(jié)石。因此，控制從飲食中攝取的草酸，很大程度上就可以降低尿草酸量，從而降低患結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)。低草酸飲食或降解食物中草酸的防治草酸鈣結(jié)石的策略在醫(yī)學(xué)界已成為共識(shí)。

泌尿系結(jié)石是泌尿系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，該病的主要特點(diǎn)是臨床治愈后復(fù)發(fā)率較高，給患者帶來了極大的痛苦，給家庭帶來了沉重的心理和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。草酸鈣是泌尿系結(jié)石的主要成分，占比達(dá)80％，導(dǎo)致草酸鈣結(jié)石癥的重要原因是人體內(nèi)缺乏降解草酸的代謝途徑。近年來，研究酶法降解草酸預(yù)防治療草酸鈣結(jié)石癥成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)(賀俊斌,林日輝,龍寒等.草酸降解酶預(yù)防治療草酸鈣結(jié)石癥的研究進(jìn)展.[j]廣東醫(yī)學(xué),36(7):1132-1136)。

目前生物界降解草酸的酶包括草酸氧化酶(oxalateoxidase,ec1.2.3.4)、草酸脫羧酶(oxalatedecarboxylase,ec4.1.1.2，以下簡稱oxdc)和草酰輔酶a脫羧酶(oxaly1-coenzymeadecarboxylase,ec4.1.1.8)。oxdc是將草酸分解為甲酸和二氧化碳的酶，其內(nèi)部含有錳。迄今已知，許多細(xì)菌如芽胞桿菌(bacillus)屬，集胞藻和乳酸菌屬等、霉菌如曲霉(aspergillus)屬等、金針菇(flammulinavelutipes)，彩絨革蓋菌(coriolusversicolor)，疣孢漆斑菌(myrotheciumverrucaria),白腐菌(trametesversicolor),褐腐菌屬(monilinia)等含有草酸脫羧酶基因(以下也稱“oxdc基因”)。

草酸脫羧酶在上述物種中的表達(dá)量極低，而且多數(shù)菌種生長緩慢，成分復(fù)雜，分離提取純化十分困難，不具備商業(yè)化應(yīng)用可能，所以將草酸脫羧酶進(jìn)行重組表達(dá)生產(chǎn)成為其商業(yè)化應(yīng)用的必然選擇。目前草酸脫羧酶中實(shí)現(xiàn)原核重組表達(dá)的還比較少，多數(shù)是在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)。金針菇來源的oxdc有通過煙草表達(dá)成功過報(bào)道，但表達(dá)量極低。但目前用芽胞桿菌中表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源的oxdc尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道，尤其是來源于真核生物的oxdc。另外，大腸桿菌中表達(dá)真菌來源的oxdc存在酶活力低，不能實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，非常易于形成包涵體，復(fù)性和純化困難，用作食品原料和藥物原料的oxdc在生產(chǎn)純化過程中需要去除內(nèi)毒素。真菌來源的oxdc多數(shù)在酸性ph條件下活力較高且較為穩(wěn)定，溶解狀態(tài)的oxdc對(duì)環(huán)境的ph比較敏感，而枯草芽胞桿菌中的最適生長ph一般在6.5-7.5之間，ph低于5.5幾乎不生長，因此在枯草芽胞桿菌中和其它芽胞桿菌系統(tǒng)中表達(dá)真菌來源的oxdc還沒有成功的案例。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中真菌來源oxdc無法在芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效分泌表達(dá)，以及分泌到胞外的oxdc能在發(fā)酵液中維持穩(wěn)定的這一技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種高效生產(chǎn)真菌來源的草酸脫羧酶的方法。具體而言，本發(fā)明的目的在于提供對(duì)于高效生產(chǎn)真菌來源的重組草酸脫羧酶表達(dá)載體、使用該載體制備的重組菌和使用該重組菌的草酸脫羧酶生產(chǎn)方法及其應(yīng)用。

一種高效生產(chǎn)真菌來源的重組草酸脫羧酶表達(dá)載體，包括含有酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子、分泌信號(hào)肽、去原始信號(hào)肽的草酸脫羧酶基因和trpa終止子的表達(dá)質(zhì)粒，其中，所述酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子是在指ph值為1.5～4.5的條件下，能在芽胞桿菌中啟動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子，所述分泌信號(hào)肽是指在芽胞桿菌中能促進(jìn)真菌來源的草酸脫羧酶基因分泌表達(dá)信號(hào)肽序列。

如上所述的重組草酸脫羧酶表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子自枯草芽胞桿菌bs168菌株的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子，所述分泌信號(hào)肽來源于解淀粉芽胞桿菌的α-淀粉酶amyq或堿性蛋白酶、枯草芽胞桿菌的堿性蛋白酶apre或α-淀粉酶amye、地衣芽胞桿菌的α-淀粉酶amyl或堿性蛋白酶、嗜熱脂肪地芽胞桿菌的α-淀粉酶amys或堿性蛋白酶。

如上所述的重組草酸脫羧酶表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述去原始信號(hào)肽的草酸脫羧酶基因的序列如seqidno.1～seqidno.5任一所述的序列。

如上所述的重組草酸脫羧酶表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子的序列如seqidno.6所示，所述分泌信號(hào)肽的序列如seqidno.7所示，所述去原始信號(hào)肽的草酸脫羧酶基因的序列如seqidno.1～seqidno.5任一所述的序列，所述trpa終止子的序列如seqidno.8所示。

如上所述的重組草酸脫羧酶表達(dá)載體，優(yōu)選地，酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子為發(fā)生突變的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其序列如seqidno.9所示。

一種草酸脫羧酶的制備方法，將如上所述的重組草酸脫羧酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到在ph≤4.5下正常生長的耐酸性的芽胞桿菌中，制備草酸脫羧酶重組菌，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)該重組菌，并補(bǔ)加酸至ph值為3.0～4.5進(jìn)行草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述耐酸性的芽胞桿菌為環(huán)狀芽胞桿菌、嗜熱脂肪地芽胞桿菌或解淀粉芽胞桿菌。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述補(bǔ)加酸時(shí)所用的酸為鹽酸、磷酸、硫酸、草酸/草酸鹽、乙酸、丙二酸、丁二酸、檸檬酸或植酸。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，培養(yǎng)重組菌至od600達(dá)到0.8～3.0后，再補(bǔ)加酸，誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后通過離心收集上清，調(diào)節(jié)該上清的ph值和硫酸銨沉淀實(shí)現(xiàn)重組草酸脫羧酶的初步純化。

如上所述的制備方法制備的草酸脫羧酶在診斷試劑，藥物組合物、食品制品中的應(yīng)用。

本發(fā)明方法制備的胞外草酸脫羧酶用于診斷試劑原料，藥物組合物、保健食品或特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的原料。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果在于：

本發(fā)明的重組表達(dá)方法，將真菌來源草酸脫羧酶基因oxdc成功通過耐酸性芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)，直接重組草酸脫羧酶重組分泌到發(fā)酵液中，且分泌到發(fā)酵液中的oxdc穩(wěn)定性較好，表達(dá)量高，不形成包涵體，無需細(xì)胞破碎和包涵體復(fù)性，提高了表達(dá)效率，簡化生產(chǎn)和純化步驟，降低了生產(chǎn)成本；且分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會(huì)混雜有內(nèi)毒素(熱源性脂多糖)，具有生物安全性。本發(fā)明采用的芽胞桿菌系統(tǒng)具有較強(qiáng)的分泌能力，能在相對(duì)簡單的培養(yǎng)基中能生長到很高的密度，生產(chǎn)成本低。

本發(fā)明還采用了突變的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子替換重組表達(dá)載體中的原始酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)化芽胞桿菌獲得更高的表達(dá)量。

附圖說明

圖1為包含酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體phyaq-oxdc的構(gòu)建示意圖。

圖2為本發(fā)明一優(yōu)選的重組菌株在不同ph值產(chǎn)oxdc的相對(duì)酶活力。

圖3為本發(fā)明一優(yōu)選的重組菌株采用不同的酸誘導(dǎo)產(chǎn)oxdc的相對(duì)酶活力。

圖4為本發(fā)明優(yōu)選的重組菌株與對(duì)照菌株的產(chǎn)oxdc的酶活力。

圖5為本發(fā)明一優(yōu)選的重組菌株產(chǎn)oxdc的sds-page電泳圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人為了發(fā)現(xiàn)高效生產(chǎn)真菌來源的oxdc的方法進(jìn)行了反復(fù)研究。具體而言，使用五種真菌來源的oxdc作為代表，構(gòu)建其高效生產(chǎn)系統(tǒng)。

首先，制作枯草芽胞桿菌屬的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在該啟動(dòng)子的調(diào)控下連接有分泌信號(hào)肽和去原始信號(hào)肽的oxdc基因的重組表達(dá)質(zhì)粒載體，所述的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子是在酸性條件下(ph1.5～4.5)能在芽胞桿菌中啟動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選來自枯草芽胞桿菌bs168菌株的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子。

信號(hào)肽是影響低ph穩(wěn)定且有活力的草酸脫羧酶表達(dá)的關(guān)鍵因素，因此編碼信號(hào)肽部分的基因必須能夠高效引導(dǎo)外源草酸脫羧酶的分泌；所述的分泌信號(hào)肽來源于解淀粉芽胞桿菌(bacillusamyloliquefaciens)的α-淀粉酶amyq或堿性蛋白酶，枯草芽胞桿菌(bacillussubtilis)的堿性蛋白酶apre或α-淀粉酶amye，地衣芽胞桿菌(bacilluslicheniformis)的α-淀粉酶amyl或堿性蛋白酶，嗜熱脂肪地芽胞桿菌(bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶amys或堿性蛋白酶等，優(yōu)選來自淀粉酶的信號(hào)肽，更優(yōu)選來解淀粉芽胞桿菌的α-淀粉酶amyq的信號(hào)肽。

優(yōu)選地，上述真菌來源的oxdc序列(seqidno.1～5)是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列；所述密碼子優(yōu)化是將其密碼子更換為更加適合于芽胞桿菌系統(tǒng)表達(dá)的密碼子。然后，得到用該載體轉(zhuǎn)化耐酸性性的芽胞桿菌屬的菌株，得到系列重組菌。絕大多數(shù)的芽胞桿菌能在ph5.5～9.0的范圍生長，只有少數(shù)的幾種芽胞桿菌耐酸性較強(qiáng)，能在ph≤4.5的培養(yǎng)基中正常生長。通常情況下，真菌來源的草酸脫羧酶很難在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)成功。以上所述的耐酸性芽胞桿菌為環(huán)狀芽胞桿菌(bacilluscirculans)，嗜熱脂肪地芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌，但不限于這三種菌，能在ph4.5及以下的培養(yǎng)條件下正常生長的芽胞桿菌菌株都在上述耐酸性芽胞桿菌的范圍?？疾熘亟M菌的草酸脫羧酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種耐酸性的重組芽胞桿菌都有草酸脫羧酶活性，優(yōu)選解淀粉芽胞桿菌。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用發(fā)生突變的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子(突變型啟動(dòng)子)時(shí)可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)oxdc生產(chǎn)率的提高。另一方面，研究了以解淀粉芽胞桿菌為宿主的生產(chǎn)系統(tǒng)中的培養(yǎng)條件，確定了其最佳產(chǎn)酶條件，成功實(shí)現(xiàn)了真菌來源草酸脫羧酶在解淀粉芽胞桿菌中的高效分泌表達(dá)。

下面通過具體實(shí)施例來說明本發(fā)明，應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。

在本說明書中，除非特別指明，否則所用技術(shù)術(shù)語為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員常用術(shù)語；本說明書中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法是按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法；本說明書中所用的試驗(yàn)材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品，各種試劑及培養(yǎng)基的成分和配制方法可參見常規(guī)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中的操作。

本發(fā)明中用到的cicc編號(hào)的芽胞桿菌菌株均來源于cicc(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，http://www.china-cicc.org/)，大腸桿菌-芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒phy300plk來源于takara公司(http://www.takara.com.cn/)；本發(fā)明中用到的所有的phusiondna聚合酶、限制性內(nèi)切酶、dna連接酶、磷酸化酶等分子生物學(xué)試劑從thermofisher公司購買(http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/thermo-scientific.html)；無縫克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司(http://www.vazyme.com/)；其它常用生化試劑均是市售分析純。pcr產(chǎn)物回收和膠回收dna的方法均采用omega公司的試劑盒的方法。

實(shí)施例1耐酸性芽胞桿菌的篩選

本發(fā)明人先后篩選了實(shí)驗(yàn)室保藏和菌種保藏中心購買的百余種芽胞桿菌物種，其中包含環(huán)狀芽胞桿菌cicc10353、cicc10403、cicc21250和cicc23053等，嗜熱脂肪地芽胞桿菌cicc10142、cicc10267、cicc10362、cicc10392、cicc10425、cicc10782和cicc10842等，解淀粉芽胞桿菌cicc10025、cicc10035、cicc10036、cicc10063、cicc10074、cicc10081和cicc10079、cicc10163等。篩選到幾株耐酸性較強(qiáng)的芽胞桿菌。篩選方法如下：

種子培養(yǎng)基為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l，kh2po42g/l，葡萄糖10g/l，ph6.0；篩選培養(yǎng)基(1l):玉米粉20g，玉米漿5g，酵母粉2g,氯化銨1.0g，氯化錳0.5g，mgso4·7h2o0.91g，cacl20.5g，ph3.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1mol/l)500ml，培養(yǎng)過程維持ph值為3.5-4.0之間，初始裝液量為250ml搖瓶裝篩選培養(yǎng)液50ml，接種量為2％，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時(shí)間48h。

培養(yǎng)結(jié)束后，測定各菌株的吸光度值od600值，選擇值較高的吸光度值(如od600值大于20)作為候選的耐酸性宿主菌。芽胞桿菌的許多種屬都較難遺傳轉(zhuǎn)化，用phy300plk質(zhì)粒作為測試質(zhì)粒，對(duì)候選宿主菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，考察轉(zhuǎn)化效率，選擇轉(zhuǎn)化率高(如轉(zhuǎn)化率大于1)的菌株作為優(yōu)選的宿主菌；最終發(fā)現(xiàn)，cicc10074，cicc10079，cicc10035和cicc10267等適合為宿主菌。

實(shí)施例2草酸脫羧酶基因的克隆

本發(fā)明中的真菌草酸脫羧酶基因是基于公共數(shù)據(jù)庫中登錄的真菌來源的oxdc基因，按照解淀粉芽胞桿菌的密碼子進(jìn)行優(yōu)化得到優(yōu)化基因，然后通過商業(yè)化的基因測序和合成公司全基因合成。以下是基于公共數(shù)據(jù)庫中登錄的真菌來源oxdc基因的進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得的去原始信號(hào)肽的草酸脫羧酶基因的幾個(gè)例子(微生物名：數(shù)據(jù)庫名：原始基因登錄號(hào)：優(yōu)化的基因序列在序列表的序列編號(hào))如下：

真姬菇(hypsizygusmarmoreus):genbank:luez01000002.1:seqidno.1；

灰蓋鬼傘菌(coprinopsiscinereaokayama):genbank:xm_001836586.2:seqidno.2；

變色栓菌(trametesversicolor):genbank:xm_008041462.1:seqidno.3；

島生異擔(dān)子菌(heterobasidionirregulare):genbank:xm_009546343.1:seqidno.4；

毛韌革菌(stereumhirsutum):genbank:xm_0073008481:seqidno.5。

本發(fā)明的最大特征在于組合使用芽孢桿菌屬來源的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子和真菌來源的oxdc基因在耐酸性芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，并且真菌來源的oxdc基因的種類沒有特別限制。因此，只要是迄今為止鑒定的真菌來源的oxdc基因原則上均可以采用，優(yōu)選使用低ph值下穩(wěn)定的可食用真菌來源的oxdc基因，即上述優(yōu)化后去原始信號(hào)肽的oxdc基因序列如seqidno.1～5所示，均可實(shí)現(xiàn)在耐酸性芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)。

其中，序列seqidno.1所示的真姬菇的oxdc基因hmoxdc，其對(duì)應(yīng)的蛋白序列為seqidno.10所示。序列seqidno.1可全基因合成得到，也可pcr擴(kuò)增獲得，pcr擴(kuò)增基因hmoxdc可采用的上下游引物為hmoxdc-f1和hmoxdc-r1，擴(kuò)增條件：50μl的pcr體系為：5xphusionhfbuffer10μl,10mmdntp1μl,10μmprimerf/r各1.5μl，模版dna0.5μl，phusiondnapolymerase0.5μl，dh2o35μl；pcr反應(yīng)條件如下:98℃30s，30個(gè)循環(huán)(98℃10s，58℃30s，72℃50s)，72℃5min，4℃保溫10min；其中hmoxdc-f1和hmoxdc-r1的序列如下：

hmoxdc-f1(seqidno.11)：5’-gcaccggcacctgcagcatcatct-3’

hmoxdc-r1(seqidno.12)：5’-ttacttcggaccaaccaccgtcag-3’

seqidno.1～seqidno.5及seqidno.10的序列如下：

seqidno.1：

5’-gcaccggcacctgcagcatcatcttcagcaccgacagtgagcacggtgtcttcagtcattgcaccgatcagcccgacggccgaaagctcagttgctgcctccagcgcctcaaacaaaccgcgtccgacgtcgacggcgacagccacggaaccgacagcaacggtgccgttcattgacctggacccgaatgaaccgctttggaacgaagacacaccgggaatccatcaaccgattcatggctcacttggagccaaacttctgggaccgacaaacaacgcgatcgtcaaacagaacccggacttactggctccgccgacgacagatcacggcagcgtaccgaatgccaaatggccgttcagccttagccataatcgtctgcaaacaggaggctgggcgcgtgaagaaaatattgctgtaatgccggtcgcccaggctatggccagcgtcaacatgcgccttgaagctggtgcagtacgtgaactgcactggcataaaacagcagaatgggcatatgttctgaaaggctccacgcaagtcacagccgtggatgccgatgggcgtaacttcgtctccacggttggcccgggtgacctttggtacttcccgcctggtatcccgcattcacttcaagcaacgaatgacgaccctgatggttctgaattcgtcttagtcttcgactcaggctcttttagcgaagattcaacgttcttacttacagattggttagatcacgttccggctgaaggtacatggtcaattccgatcacgttagtatctcttaactccggacattttcagtattggccgaaaatttccaaatgtcgcaacatctctgccttcgcacacattcctgctgaggaactgtacattttcccggctgcactgccggaacctgatagcgctgctccgaaaagcccgcaaggcacagtcccggatccgttttcattttcaatgtcaaaagtcaaaccgacgcagctgacgggaggcacggtcaaagttgtggattccacaacgttcaaaatctccaaaacaattgccgctgcagaagtcacagttgaaccgggtgcaattcgggagctgcattggcacccgacacaagacgaatggagcttctttattgagggtgaaggtcgtatgacgattttcgcctcgcagtccaatgcccgtacgttcaactatcaggctggtgatatcgcaaaaacgaaccgcagcacagggcattacctggagaacaccggcaacacgacactgcggttcctggagattttcaaatccgagaaattccaggatatcagcttagctcagtggcttgcattgacgccgccgaaattagtcaaagagcatttaggtttctctgacgacgtcattgctcggctttcgaaaacaaaactgacggtggttggtccgaagtaa-3’

seqidno.2：

5’-gtgccgtctccgtgggtgaaacacatcccgagggagcttgagggcagcttctggccgcacccgcctaaaccgcagtctcaaagcgaaatccttggcggcggcacagctccgcactcaggcaacgagtctccgtctacaccgcaggatacgccgagcgcttcaggtacggacacagctgtgccggcgcacgaaacggtcccgacaatttctttggaccgcaacgacccggtttgggactctagctttgagggcccgttcgatgctatccgtggaccgctgggcgcgacgattattggcccgaataacccgaacatcgcggttcagaatccggacttgttcgctccgccgtctacggattctggtacagtaccgaacgtcaaatggccgatgtctttgagccataatcgccttcaaacgggtggatgggcacgtcaacagaacattgatgtcatgccgatcgcgaaagctatggctggtgtgaacatgcgtttgaaaccgggagctattcgtgaactgcactggcattctacggcagaatgggcttatgtgattaaaggatctacacaagtcacatctgtcgatgctgagggtcgtaacttcatctcaacggttggcccgggcgatttgtggtacttcccgccgggtatcccgcattctttgcaagctacaggtgacgacccggaaggctcagagttcttgcttgtgttcgacgatggcgcgttctctgaagacaatacattcatgctgacagactggcttgctcacgtcccggctggagtgctggagaaaaacttccaacttggtgctacagctttcgcagaccttccggctaaagacctgtacatcttcccggctgacgtcccggcagacgaccaagaagcaccggagagcccgttcggaacagtgccggacccgttctctttcgctctttctaaaatgaacgctacgcaatttgaaggtggatctgtgaaaattgtcgattctacaacatttaaaatctctaaaacgattgcggctgctgaggttacggttgaaccgggtgcaatgcgtgagcttcactggcacccgacacaggacgagtgggatttcttcctggagggtcaaggtcgtatcacagtattcgctgctcagggcaatgctcgtacattcgatttccaggctggagatgttggttatattccggcatcattcggacattacatcgagaacacgggtaacacaacattgaaattccttgaaatttggaatacaccgaaattccaggatatctctttggctcagtggctggctcttatcccgccgtctcttgtcaaagctcatcttggattcacggacgaagtgatcgagaaattgccgaaaacgaaaccggttgttgtagtcccgaaaagcgcttctaaataa-3’

seqidno.3：

5’-gcaccggctgctgcgtcttctggcatcgcgagcagcgcagctgctacagcgagctcagcggcttcgtcggctgcgttcgcgagcgctagctctgcggtctctagcgtgtttgcgtctgctagctctgctgtggcttctagcgaccttcgctctagcaaaacagtggctccgacaagctctttctcagctgaaccggcttctgtcacggtgccgttcgctagcgatgacccgaacggcatgttatggggcgaagattctacaacagacccgcaggctattcgtaacacgcttggtgcgacaatcatgggcccgcagaacattccgatcgcgctgcagaacccggaccttcttgcgccgccgagcacagacgaaggcagcgttcagaatgctaaatggccgttcgcgctgagccacaaccgcctgcaaacgggcggatgggcacgtcagcagaacatcgatgtgatgccgatcgcgaaatctatggctggcgttaacatgcgtcttgaagcgggcgcgattcgtgaacttcactggcacaaaacagctgaatggtcttatgttacaaaaggctctgttcaggtgtcttctatcaactctgacggccaaaactaccttgctacggcgagcgcgggcgacctctggtacttcccgccgggcgtgccgcattctcttcaggcgacagctgatgacccggacggcacggaattcctgctggtcttcgacgacggcgcgttcagcgaagactcaacattcctgcttacggattggcttgcacacgtcccgaaagaagtgcttgcgaaaaacttcaaaacaaatatctctgcattcgaccacatcccggcgaaacagctttacatcttcccgtctgcgccgccgccggacaacgctcaggctccgtctgacccgcagggtcagatcccgagcccgttcgtgttccacctgtctcaggtgaaagcgacggatctggacggcggctctgtcaaagtcgtcgactctacaacattcccggttgctcaggcgatcgctgtcgctgaagtcacagtcgagccgggagcgatgcgtgagcttcactggcacccgacacaggacgagtggacatactaccttgagggccagggccgcgtgacgcttttcgcatctagcagcaacgcgcgcacgttcaactacgaggcgggagacgtcggcttcgtgccggcttctttcggacactacgtcgaaaacacgggcaacacaacgcttcgcttccttgaaatcttcaacacgaaccgcttcgaagacatttctctcagccagtggcttgcgcttacgccgccggctctggttaaagcgcacctggaccttgacgacgaaacgatcgctaacctgagcaaaacaaaactgacagtcgtcggcccggcttaa-3’

seqidno.4：

5’-gcaccggcgagcaacccgtctgcagcgacatcttctacagctctggcatctccggtatctgtatctaactctacggattctacagcgtctgtctctggaccgccgtctgcgacgtctgacgcgtcagcagctagcccgagcccgacggttccgtttgcgtctgacgacccgaacacagtcatcttctctccgggcgcagacgtccagccggaagctcaacgtggcacacttggcagcacagttatcggaccgcagaatgtgcaaatcgatcgtcaaaatccggacttcctggcaccgccgacaacggacaatggagacgtgtctaatgcgaaatggccgtttggactgagccacaatcgtatccagacaggaggctgggcacgtcagcaaaacatcgagaatatgccgattgctacgcagatggctggagttgacatgcgtcttgaaccgggcgctgttcgtgagcttcattggcacaaaacgtctgaatggtcttatgtcatcaaaggctctacgcaagttacggctgttgatcaagacggcaaaaactatctggctacagtgaacgcaggtgacctttggtacttcccgccgggcattccgcactctcttcaagcgacgaatgactctgcagagggcacagagttcctgctggtcttcgacgatggagcttttagcgaagacgctacatttctgctgacagattggcttgcgcatgtcccgaaagaggtcatcgctaaaaacttccagacagacatttctgcgtttgatgatatcccgggacgtgagctttacattttcccggctgcggttccgtcttctgatgctacagctgtctcagatccgcaaggccaggttccgaatgctttctctttcgctatgtctaaaatcaatgctacacaattatcaggtggaacagttaaaattgtggattcgacgacattcccgatctcaacgacaatcgctgctgcggacgtcacggttgaaccgggagctatgcgtgagttacactggcatccgacacaggatgaatggacgtatttcattgaaggcgatgctcgcatgacaatctttgcatcacaaagcaacgcacgtacatttgattatcaagctggcgatattggatatgttccggcatctttcggccattatgtcgagaatattggaaatacgacactgcactaccttgagatcttcaaaacggatcgtttccaggatgtcagcctgagccagtggcttgctcttacaccgccggagcttgtcaaagctcatcttggcctttctgatgctacgattgcaacgctgaaaaaaacgaaacaaacggttgttggaccgtcttaa-3’

seqidno.5：

5’-gctccggcagctacgtcttctgacgcgtctctgtctatctctgtcgaatcttcttctacggaaacagcttctgcgtctgctgctgcagaatctccgtctacaacagtgtctctggcaccgacggctccgaatggcccgctgtacacgccgggcgcagacatccaaccggaaccgatccgtggaacgcttggaggcacgatcctgggcccgcagaacattgctatcgaccagcagaatccggacatgcttgcgccgccgacgacagatcatggcgacgtgccgaacgctaaatggccgttttctctgtctcacaatcgtctgcaaacaggaggatgggctcgtcagcagaacattgaagtaatgccgatcgcaacacagatggctggcgtggatatgcgtctggaaccgggcgcaattcgtgaactgcactggcacacaagctctgaatgggcttatgtcctgaaaggatctacacaagtcacagcggtagatcaaaatggcaaaaactttctggctacggtggaaccgggagacctgtggtacttcccgccgggtatcccgcactctctgcaggctacgaacgagtctacagaaggcagcgagtttctgctggtattcgatgatggtgctttctctgaagacgacacatttttactgacagactggttagctcatgtcccgaaagaggtcatcgctaaaaactttcagctggatatttctgacttcaattctctgccgggcgaagaactgtacatcttcccggcagaaccgccgtctccggatgcagtagcgccgtctgacccgctgggccaagtaccgcaagctttttctttcgctatgtctaaaatgaatgctacgcagctgagcggaggcacagtcaaaatcgtggactctacagtcttctctgtttcaacgacaattgctgctgcggatgttacagtcgaaccgggcgctatgcgtgaactgcactggcacccgacgcaggacgaatggtcattcttcatcgaaggcacaggacgtatgacaatcttcgcatctgacagcaacgctcaaacattcgactacgaagctggcgatattggctacgtgccggctacatatggccactacgtggaaaacgtcggcaacacgacgctgcattatctggaaatcttcaaaacggatcgcttccaggacgtttctctggctcagtggctggcactgacaccgccggctctggtcaaagctcacctgggcctgtctgacgaagtcatcgcgcagttcaacaaaacaaaacaggtcgtcgtcggcccgcgccactaa-3’

seqidno.10(真姬菇(hypsizygusmarmoreus)oxdc蛋白序列去信號(hào)肽部分)：apapaasssaptvstvssviapisptaessvaassasnkprptstatateptatvpfidldpneplwnedtpgihqpihgslgakllgptnnaivkqnpdllappttdhgsvpnakwpfslshnrlqtggwareeniavmpvaqamasvnmrleagavrelhwhktaewayvlkgstqvtavdadgrnfvstvgpgdlwyfppgiphslqatnddpdgsefvlvfdsgsfsedstflltdwldhvpaegtwsipitlvslnsghfqywpkiskcrnisafahipaeelyifpaalpepdsaapkspqgtvpdpfsfsmskvkptqltggtvkvvdsttfkisktiaaaevtvepgairelhwhptqdewsffiegegrmtifasqsnartfnyqagdiaktnrstghylentgnttlrfleifksekfqdislaqwlaltppklvkehlgfsddviarlsktkltvvgpk。

實(shí)施例3酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子的克隆

酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子使用芽胞桿菌屬來源的啟動(dòng)子，只要是迄今為止鑒定的芽胞桿菌屬來源的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子原則上均可以采用，這里以枯草芽胞桿菌來源的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子為例。首先由枯草芽胞桿菌bs168菌株通過常規(guī)方法獲得染色體dna。參考數(shù)據(jù)庫上的枯草芽胞桿菌oxdc基因(geneid938620)前的序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子區(qū)域的引物f2和r2，以枯草芽胞桿菌bs168菌株的染色體dna作為模板，使用設(shè)計(jì)好的引物(f2和r2)進(jìn)行pcr，由此得到酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子poxdc的dna片段，其序列如seqidno.6所示。

f2(seqidno.13)：5’-agcttgaccacttcatttttc-3’

r2(seqidno.14)：5’-gaaatgtttcctccttacat-3’

實(shí)施例4重組表達(dá)載體構(gòu)建

在耐酸性的芽胞桿菌中表達(dá)真菌來源的重組oxdc表達(dá)載體中oxdc基因表達(dá)框由以下原件構(gòu)成：酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列，分泌信號(hào)肽序列，去原始信號(hào)肽序列的真菌來源oxdc基因序列，終止子序列。其中，所述分泌信號(hào)肽序列是指在芽胞桿菌中能促進(jìn)真菌來源oxdc基因分泌表達(dá)信號(hào)肽序列，如以解淀粉芽胞桿菌作為表達(dá)宿主情況下優(yōu)選來自解淀粉芽胞桿菌的分泌信號(hào)肽。以phy300plk穿梭載體為骨架，構(gòu)建的重組oxdc表達(dá)載體如圖1所示。

具體地，要獲得分泌信號(hào)肽序列，先設(shè)計(jì)引物f3和r3，以解淀粉芽胞桿菌cicc10074的基因組dna為模版，克隆編碼解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶amyq基因信號(hào)肽的dna序列，序列如seqidno.7所示，其對(duì)應(yīng)的蛋白序列如seqidno.15所示。

分泌信號(hào)肽序列還可采用解淀粉芽胞桿菌(bacillusamyloliquefaciens)的堿性蛋白酶，枯草芽胞桿菌的堿性蛋白酶apre或α-淀粉酶amye，地衣芽胞桿菌的α-淀粉酶amyl或堿性蛋白酶，嗜熱脂肪地芽胞桿菌的α-淀粉酶amys或堿性蛋白酶等。

設(shè)計(jì)重疊pcr引物，通過重疊pcr的方法將酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子poxdc(seqidno.6)、解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶信號(hào)肽序列(seqidno.7)、真姬菇草酸脫羧酶基因hmoxdc和trpa終止子序列(seqidno.8)拼接成一個(gè)完整的基因表達(dá)框序列，再用無縫克隆試劑盒的方法，將這一基因表達(dá)框插入到phy300plk載體中。具體地，第一步以實(shí)施例3和上述的描述分別擴(kuò)增獲得seqidno.6和seqidno.7的dna片段，以濃度1:1混合作為模版，設(shè)計(jì)重疊pcr引物擴(kuò)增兩個(gè)片段的融合片段，標(biāo)記這個(gè)序列為片段a；第二步，真姬菇草酸脫羧酶基因hmoxdc是按實(shí)施例2擴(kuò)增獲得，trpa終止子序列(seqidno.8)是直接合成得到，以真姬菇草酸脫羧酶基因hmoxdc和trpa終止子dna片段濃度的3:1混合物為模版，設(shè)計(jì)重疊pcr引物擴(kuò)增兩個(gè)片段的融合片段，標(biāo)記這個(gè)序列為片段b；然后將片段a和片段b以濃度比1:2混合作為模版，設(shè)計(jì)重疊pcr引物擴(kuò)增兩個(gè)片段的融合片段即獲得拼接的基因表達(dá)框序列；第三步，設(shè)計(jì)引物f4和r4線性化phy300plk載體；第四步，設(shè)計(jì)引物f5和r5擴(kuò)增上述拼接的基因表達(dá)框序列，通過無縫克隆試劑盒的方法，將基因表達(dá)框序列整合到用引物f4和r4線性化后phy300plk載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α。用inoue法制備dh5α超級(jí)感受態(tài),方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》，涂布到含有100μg/ml氨芐青霉素的抗性lb固體培養(yǎng)基平板上篩選，通過pcr驗(yàn)證和測序驗(yàn)證陽性克隆子，測序正確的重組質(zhì)粒命名為phy-hmoxdc；其中，采用f5和r5的擴(kuò)增條件：50μl的pcr體系為：5xphusionhfbuffer10μl,10mmdntp1μl,10μmprimerf5/r5各1.5μl，模版dna0.5μl，phusiondnapolymerase0.5μl，dh2o35μl；pcr反應(yīng)條件如下:98℃30s，30個(gè)循環(huán)(98℃10s，58℃30s，72℃60s)，72℃5min，4℃保溫10min。

采用的引物序列如下：

f3(seqidno.16)：5’-atgattcaaaaacgaaagcg-3’

r3(seqidno.17)：5’-ggctgatgtttttgtaatcg-3’

f4(seqidno.18):

5’-tgagcgggcttttttacggatccccgggaattcct-3’

r4(seqidno.19):5’-cgacctgcagatctctagaag-3’

f5(seqidno.20):

5’-gagatctgcaggtcgagcttgaccacttcatttttc-3’

r5(seqidno.21):5’-aaaaaagcccgctcattaggc-3’。

其它序列如下：

seqidno.6：

5’-agcttgaccacttcatttttcaatcgaagttgacttttcactggtttttttcacttaacaaaacagaagggaaaacgaaaggcctttcaccttctctttctgctatcacatttaaatgtaaggaggaaacatttc-3’

seqidno.7：

5’-atgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagcc-3’

seqidno.15：miqkrkrtvsfrlvlmctllfvslpitktsa

seqidno.8：

5’-tgaattcgagcactagtgcagcccgcctaatgagcgggctttttt-3’

進(jìn)一步，以啟動(dòng)子poxdc(seqidno.6)為模版，通過定點(diǎn)突變的方法獲得突變的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子(seqidno.9)，將該序列送到基因合成公司進(jìn)行合成，然后將其連接到t載體上，采用f6(seqidno.22)(5’-atgattcaaaaacgaaagcg-3’)和r4線性化phy-hmoxdc載體。具體地，采用f7和r7擴(kuò)增，其擴(kuò)增條件：50μl的pcr體系為：5xphusionhfbuffer10μl,10mmdntp1μl,10μmprimerf7/r7各1.5μl，模版dna0.5μl，phusiondnapolymerase0.5μl，dh2o35μl；pcr反應(yīng)條件如下:98℃30s，30個(gè)循環(huán)(98℃10s，58℃20s，72℃10s)，72℃5min，4℃保溫10min；模版是基因合成seqidno.9；擴(kuò)增獲得突變的的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子(seqidno.9)，通過無縫克隆試劑盒的操作方法，將通過用f6和r4線性化后的載體phy-hmoxdc中的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子替換成突變的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子即含有seqidno.9，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，涂布到含有100μg/ml氨芐青霉素的抗性lb固體培養(yǎng)基平板上篩選，通過pcr驗(yàn)證和測序驗(yàn)證陽性克隆子，測序正確的重組質(zhì)粒命名為phy2-hmoxdc。其中：

seqidno.9：

5’-atcatgcaagcaatgatttttcaatcgaagttgactttcactggtttggtttcacttaacaaatcaaaatttttaaaaatcgaaatctctttcaccttgtctttgtgctattacatttaaatgtaaggaggaaacatctt-3’

f7(seqidno.23)：

5’-gagatctgcaggtcgatcatgcaagcaatgatttttc-3’

r7(seqidno.24)：

5’-tcgtttttgaatcataagatgtttcctccttacat-3’

實(shí)施例5重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

根據(jù)質(zhì)粒抽提試劑盒說明書的方法提取上述實(shí)施例中制備的phy300plk、phy-hmoxdc和phy2-hmoxdc質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化到解淀粉芽胞桿菌cicc10074中，涂布到含有10μg/ml氯霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基平板上篩選陽性克隆子。陽性克隆子命名為cicc10074-phy-hmoxdc和cicc10074-phy2-hmoxdc，即重組表達(dá)菌株，對(duì)照菌株為cicc10074-phy300plk。解淀粉芽胞桿菌cicc10074感受態(tài)細(xì)胞制備和電轉(zhuǎn)化方法參考枯草芽胞桿菌的電轉(zhuǎn)化的方法(參見文獻(xiàn)：xuegpetal.,highosmolarityimprovestheelectro-transformationefficiencyofthegram-positivebacteriabacillussubtilisandbacilluslicheniformis.jmicrobiolmeth.1999,34(3):183-191.)。

實(shí)施例6分析方法

草酸hplc測定方法:采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法(clausencaetal.,oxalateanalysismethodologyfordecayedwood，internationalbiodeteriorationandbiodegradation.2008,62:372-375)。草酸脫羧酶活力測定：將1ml5mm草酸鹽溶液(其中含50mm檸檬酸鹽緩沖液，ph3.0)，在37℃預(yù)熱10分鐘后，加入0.05-0.1ml含草酸脫羧酶的適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液上清，37℃，200rpm恒溫震蕩反應(yīng)30分鐘，加入50μl的2.5mh2so4終止反應(yīng)，立即將終止反應(yīng)后的樣品12000rpm離心10min，取上清用0.45μm膜過濾至液相進(jìn)樣瓶中，用hplc測定殘留草酸鹽濃度。一個(gè)酶活力單位(u)為在此條件下，每分鐘降解1μmol草酸鹽所需的酶量。蛋白條帶分析采用sds-page分析的方法。

實(shí)施例7重組菌的培養(yǎng)方法

上述制備的重組表達(dá)菌株在5ml種子培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)12h。種子培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl,5g/l，kh2po42g/l，葡萄糖10g/l，起始ph6.0。以4％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始裝液量為250ml搖瓶裝液50ml，接種量為2％，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)到od600到達(dá)0.8～3.0之間開始補(bǔ)酸誘導(dǎo)，優(yōu)選采用培養(yǎng)4小時(shí)左右，od600到達(dá)1.0開始誘導(dǎo)。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米粉20g/l，玉米漿5g/l，酵母粉2g/l,氯化銨1.0g/l，氯化錳0.5g/l，mgso4·7h2o0.91g/l，cacl20.5g/l，ph4.8的0.1mol/l檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液500ml/l。

補(bǔ)加酸直到發(fā)酵液ph為3.0～4.5之間進(jìn)行誘導(dǎo)草酸脫羧酶的表達(dá)，用20％的磷酸分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為3.0,3.5,3.8,4.0,4.2和4.5,37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)30h。

用實(shí)施例5制備的重組表達(dá)菌株cicc10074-phy-hmoxdc進(jìn)行上述表達(dá)測試，采用實(shí)施例6所述的方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明在ph4.0時(shí)酶活力最高。

補(bǔ)酸時(shí)采用鹽酸、磷酸、硫酸、草酸/草酸鹽、乙酸、丙二酸、丁二酸、檸檬酸和植酸，分別用以上的酸誘導(dǎo)劑調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為4.0,37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)30h，用實(shí)施例5制備的重組表達(dá)菌株cicc10074-phy-hmoxdc進(jìn)行上述表達(dá)測試，采用實(shí)施例6所述的方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示，表明用植酸作為酸誘導(dǎo)劑時(shí)，酶活力最高。

對(duì)比兩種重組表達(dá)菌株和對(duì)照菌株的產(chǎn)酶效率，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液的od600達(dá)到1.0時(shí)，采用植酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph為4.0，每隔4-8h取樣一次，每次取樣1ml，采用實(shí)施例6方法測定發(fā)酵液ph和發(fā)酵液上清的oxdc活力。結(jié)果如圖4所示，酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子能成功誘導(dǎo)真菌來源草酸脫羧酶的高效表達(dá)，突變的酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子啟動(dòng)oxdc基因表達(dá)的效率比原始酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子高，發(fā)酵60小時(shí)時(shí)重組表達(dá)菌株cicc10074-phy2-hmoxdc分泌的oxdc的活力比重組表達(dá)菌株cicc10074-phy-hmoxdc高30％左右，活力達(dá)到50,000u/l。

實(shí)施例8重組oxdc的初步純化

采用實(shí)施例7所述的發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵,收集重組表達(dá)菌株cicc10074-phy2-hmoxdc的發(fā)酵液1l，12000g，4℃離心10分鐘，取上清到燒杯中，加熱到55℃保溫10分鐘，用6m的hcl調(diào)節(jié)ph2.5，12000g，4℃離心10分鐘，上清倒入另外一個(gè)燒杯置于冰浴中，加入總體積25％的硫酸銨對(duì)蛋白進(jìn)行沉淀45分鐘，加入固體硫酸銨時(shí)，邊加入邊攪拌，12000g，4℃離心10分鐘，沉淀用25mm的ph3.0的檸檬酸緩沖液溶解，對(duì)上述通過離心收集上清，調(diào)節(jié)ph值和硫酸銨沉淀等簡單步驟的初步純化獲得的oxdc即真姬菇的oxdc，進(jìn)行sds-page分析和酶活力測定分析。如圖5是初步純化后的真姬菇的oxdc，分子量大小約為50kda，純度在90％以上。

上述重組表達(dá)的oxdc直接分泌到發(fā)酵液中，穩(wěn)定性較好，且不形成包涵體，無需細(xì)胞破碎和包涵體復(fù)性，表達(dá)量高，提高了表達(dá)效率，有效簡化生產(chǎn)和純化步驟，降低了生產(chǎn)成本。

將實(shí)施例4制備的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到其它耐酸性的芽胞桿菌，如環(huán)狀芽胞桿菌、嗜熱脂肪地芽胞桿菌等均可獲得穩(wěn)定表達(dá)的oxdc，在此將不再贅述。

應(yīng)當(dāng)指出，以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)于本技術(shù)中的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)特征的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些潤飾和改進(jìn)也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>武漢康復(fù)得生物科技股份有限公司

<120>一種草酸脫羧酶的制備方法及應(yīng)用

<130>

<160>24

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1413

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

gcaccggcacctgcagcatcatcttcagcaccgacagtgagcacggtgtcttcagtcatt60

gcaccgatcagcccgacggccgaaagctcagttgctgcctccagcgcctcaaacaaaccg120

cgtccgacgtcgacggcgacagccacggaaccgacagcaacggtgccgttcattgacctg180

gacccgaatgaaccgctttggaacgaagacacaccgggaatccatcaaccgattcatggc240

tcacttggagccaaacttctgggaccgacaaacaacgcgatcgtcaaacagaacccggac300

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<213>人工合成

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<211>1401

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<213>人工合成

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<213>真姬菇(hypsizygusmarmoreus)oxdc蛋白序列去信號(hào)肽部分

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130135140

alametalaservalasnmetargleuglualaglyalavalargglu

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210215220

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225230235240

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serproglnglythrvalproasppropheserphesermetserlys

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325330335

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trpserphepheilegluglygluglyargmetthrilephealaser

370375380

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thrasnargserthrglyhistyrleugluasnthrglyasnthrthr

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leuargpheleugluilephelysserglulyspheglnaspileser

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<213>人工合成

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<212>prt

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