本發(fā)明屬于生物技術(shù)-單克隆抗體領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種拮抗抑制程序性死亡受體pd-1(programmeddeath-1)與其配體結(jié)合的單克隆抗體及其編碼序列與其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：：長(zhǎng)期以來(lái)，生物醫(yī)學(xué)界一直認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體內(nèi)的免疫功能狀態(tài)息息相關(guān)。體內(nèi)免疫系統(tǒng)在正常狀態(tài)下發(fā)揮著監(jiān)控(immunesurveillance)變異的腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的功能。免疫系統(tǒng)如出現(xiàn)功能抑制或低下時(shí)，腫瘤增長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)則會(huì)加快，嚴(yán)重時(shí)更危及生命。因此以通過(guò)調(diào)動(dòng)機(jī)體自身免疫功能來(lái)直接攻擊或殺滅腫瘤為目的的“腫瘤免疫療法(tumorimmunotherapy)”是腫瘤臨床治療領(lǐng)域追求的一大目標(biāo)。自2011年以來(lái)，免疫療法在腫瘤臨床治療領(lǐng)域取得了一系列具革命性變化(revolutionizingcancertreatment)的重大突破(見(jiàn)綜述：topaliansl等:cancerimmunotherapycomesofage.jco2011；29:4828-4836；pardolld和drakec：immunotherapyearnsitsspotintheranksofcancertherapy.jexpmed2012；209：201-209；pagedb,postowma,callahanmk,allisonjpandwolchokjd：immunemodulationincancerwithantibodies.annurevmed2014；65:185–202)。這些革命性突破則主要得益于免疫學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的進(jìn)展及以雜交瘤/基因工程抗體等為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展。免疫學(xué)基礎(chǔ)研究表明由胸腺發(fā)育而來(lái)的t淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在識(shí)別監(jiān)控及/或直接攻擊消滅腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中起著非常致為關(guān)鍵的作用。t淋巴細(xì)胞在功能上大致可分為兩大類(lèi)：即以調(diào)控免疫功能為主的輔助t細(xì)胞(thelpercells)和直接參與識(shí)別靶抗原與攻擊殺傷靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性t細(xì)胞(cytotoxictcells，ctl)。輔助t細(xì)胞或細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)的活化、增生及其在清除靶抗原與攻擊殺傷靶細(xì)胞等免疫功效階段一般都需要兩個(gè)信號(hào)通路的協(xié)同作用：協(xié)同信號(hào)通路1是通過(guò)t細(xì)胞上的特異識(shí)別不同抗原的受體蛋白(t-cellreceptor，tcr)與表達(dá)在腫瘤靶細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞(antigen-presentingcells,apc)上相應(yīng)的特異抗原多肽(antigenpeptide)-mhc(majorhistocompatibility)的結(jié)合而傳導(dǎo)，該信號(hào)通路為抗原特異性的；協(xié)同信號(hào)通路2則是通過(guò)t細(xì)胞上的協(xié)同刺激因子(co-stimulatorymolecules)或協(xié)同抑制因子(co-inhibitorymolecules)與其相應(yīng)表達(dá)在靶細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcells，apc)上的配體結(jié)合而傳導(dǎo)，該信號(hào)通路為抗原非特異性的。t淋巴細(xì)胞一般只有在協(xié)同信號(hào)通路1與協(xié)同信號(hào)通路2都同時(shí)存在的狀態(tài)下才發(fā)生活化增生與清除靶抗原及殺滅靶細(xì)胞的作用。正向上調(diào)免疫功能的協(xié)同刺激因子主要包括cd28與其配體b7-1(cd80)、b7-2(cd86)；cd40與其配體cd40l；cd137(又稱(chēng)為4-1bb)與其配體cd137-l；cd278(icos，induciblet-cellcostimulator)與其配體icos-l等。負(fù)向下調(diào)免疫功能的協(xié)同抑制因子(又稱(chēng)為免疫抑制檢查點(diǎn)，inhibitoryimmunecheckpointmolecules)則主要包括ctla-4(cytotoxict-lymphocyteantigen-4)與其配體b7-1(cd80)、b7-2(cd86)；程序性死亡受體pd-1(programmeddeath-1)與其配體pd-l1和pd-l2；lag-3(lymphocyteactivationgene-3)與其配體；tim-3(t-cellimmunoglobulindomainandmucindomain3)與其配體；btla(bandtlymphocyteattenuator)與其配體等。這些協(xié)同刺激/協(xié)同抑制因子在分子結(jié)構(gòu)上都很相似，均屬于免疫球蛋白超家族成員(見(jiàn)綜述：chenlp：co-inhibitorymoleculesoftheb7-cd28familyinthecontroloftcellimmunity。natureimmunol2004,336-347)。理論上，至少可以通過(guò)兩大不同途徑達(dá)到上調(diào)或提高體內(nèi)免疫功能的目的：途徑1是通過(guò)激活cd28等協(xié)同刺激因子而直接達(dá)到上調(diào)免疫功能的效果；途徑2則是通過(guò)降低或阻斷ctla-4，pd-1/pd-l1，tim-3，lag-3或btla等因子介導(dǎo)的免疫抑制，從而間接達(dá)到上調(diào)免疫功能的效果。通過(guò)激活cd28等協(xié)同刺激因子盡管可以達(dá)到直接上調(diào)免疫功能的效果，但由于2006年在英國(guó)進(jìn)行的一代號(hào)為tgn1412的抗cd28單克隆抗體藥物的臨床i期研究中，6位健康受試者在接受注射該抗體藥物的當(dāng)天即發(fā)生了極其嚴(yán)重的不良反應(yīng)(suntharalingamg等，nengljmed2006；355：1018-1028)，因此目前醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為激動(dòng)型抗cd28抗體類(lèi)藥物在臨床應(yīng)用上具有很高的安全風(fēng)險(xiǎn)，其未來(lái)開(kāi)發(fā)上市的前景存在很多擔(dān)憂(yōu)與不確定性。相反的，目前以去除或降低ctla-4，或pd-1/pd-l1等因子介導(dǎo)的的免疫抑制作用的拮抗型單克隆抗體藥物，由于其在國(guó)際上開(kāi)展的多個(gè)臨床研究中都表現(xiàn)出非常明顯的抗腫瘤療效及可接受的安全性，現(xiàn)反而已成為國(guó)際腫瘤藥物研究與開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的最成功熱點(diǎn)；其中靶向pd-1/pd-l1的單抗藥物開(kāi)發(fā)尤其引入注目(quezadasaandpeggsks：britishjournalofcancer2013；108：1560–1565；flemminga:natrevdrugdiscov.2012，11:601)。pd-1基因最早是由日本科學(xué)家tasukuhonjo及其同事在1992年發(fā)現(xiàn)與克隆的，其胞外區(qū)有1個(gè)igv樣區(qū)，與ctla-4有23％的同源性(ishida,y.,agata,y.,shibahara,k.andhonjo,t.：emboj.1992；11:3887)。pd-1主要表達(dá)于活化的t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞上(yasutoshiagata等，internationlimmunology1996；8：675)。pd-1的受體或配體有兩個(gè)：分別為pd-l1(freemangj等，jem2000；192:1027-1034)，或又稱(chēng)b7-h1(dongh等，naturemedicine1999；5：1365-1369)和pd-l2(latchmany等，nat.immunol.2001；2：261-268),或又稱(chēng)b7-dc(tsengsy等，jem2001；193：839-845)。pd-l1及pd-l2主要表達(dá)在腫瘤等靶細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞上(thompsonrh等，cancerres2006；66：3881-3885)。pd-1參與負(fù)向下調(diào)體內(nèi)免疫功能的這一現(xiàn)象最早是由tasukuhonjo及其同事在pd-1基因敲除小鼠中觀察到的。他們發(fā)現(xiàn)pd-1基因敲除的小鼠在c57bl/6基因背景下，發(fā)生狼瘡樣腎小球腎炎和關(guān)節(jié)炎(nishimurah等：immunity1999；11:141)；而在balb/c基因背景下，則產(chǎn)生高滴度的抗心肌組織抗體并由此引發(fā)嚴(yán)重的自身免疫性心肌病(nishimurah.等：science2001；291:319)。體內(nèi)正常組織細(xì)胞中因表達(dá)有pd-l1或pd-l2基因而使其免于受周?chē)馨图?xì)胞無(wú)故攻擊或殺傷排斥(keirm.e.等:jexpmed2006；203：883-895；keirme,buttemj,freemangj,sharpeah：annurevimmunol2008；26:677–704)。不幸的是，變異的腫瘤細(xì)胞也能夠借調(diào)高pd-l1或pd-l2基因的表達(dá)而與淋巴細(xì)胞上的pd-1受體的結(jié)合，抑制淋巴細(xì)胞活性，從而逃避免疫攻擊或免疫殺傷排斥反應(yīng)而不斷增長(zhǎng)(dongh等，naturemedicine2002；8：793-800；azumat等，blood2008；111：3635-3643)。體內(nèi)如給予中和性pd-1抗體或pd-l1抗體阻斷淋巴細(xì)胞上的pd-1與腫瘤細(xì)胞上的pd-l1/pd-l2結(jié)合，則可恢復(fù)淋巴細(xì)胞免疫識(shí)別與殺傷變異的腫瘤細(xì)胞的能力，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、甚至徹底消滅與排斥腫瘤的良好效果(iwaiy等，pnas2002；99：1229；hiranof等，cancerres2005；65：1089-1096)?；谶@些前期基礎(chǔ)研究與令人鼓舞的臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，國(guó)際上多家制藥企業(yè)如美國(guó)bristol-myerssquibb(bms)/medarex(米德列斯)公司，美國(guó)merck公司，美國(guó)genentech公司早在2003年前后就起動(dòng)了以阻斷pd-1與其配體(pd-l1)結(jié)合為目的抗體新藥研制并開(kāi)始申請(qǐng)了相關(guān)專(zhuān)利。例如，美國(guó)medarex(米德列斯)公司及日本小野藥品工業(yè)株式會(huì)社(onopharmaceutical)在一項(xiàng)授權(quán)專(zhuān)利號(hào)為no8，008，449的美國(guó)發(fā)明專(zhuān)利文件中公開(kāi)了由轉(zhuǎn)染cho細(xì)胞及其表達(dá)的含全長(zhǎng)或含胞膜外區(qū)人pd-1蛋白作為混合抗原，交叉免疫具人免疫球蛋白(ig)轉(zhuǎn)基因的工程小鼠(humabmouse)中篩選獲得的多個(gè)抗人pd-1抗體的雜交瘤及其分泌的抗體蛋白、編碼抗體蛋白的核苷酸序列，及該抗體用于pd-1蛋白檢測(cè)及治療腫瘤等疾病的應(yīng)用。美國(guó)mercksharp&dohme公司(以下簡(jiǎn)稱(chēng)merck公司)在一項(xiàng)授權(quán)專(zhuān)利號(hào)為no8，168，757美國(guó)發(fā)明專(zhuān)利文件中，也公開(kāi)了其由含pd-1基因的dna分子免疫小鼠后篩選獲得的多個(gè)抗人pd-1抗體的雜交瘤及其抗體蛋白、其編碼核苷酸序列，及該抗體用于通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)免疫功能而達(dá)到治療腫瘤及感染性疾病的目的。美國(guó)genentech公司在一項(xiàng)授權(quán)專(zhuān)利號(hào)為no8，217，149的美國(guó)發(fā)明專(zhuān)利文件中，公開(kāi)了從噬菌體抗體展示基因庫(kù)(phage-display)中篩選擴(kuò)增獲得的多個(gè)抗人pd-l1抗體的抗體蛋白片段、其編碼核苷酸序列及其用途。在中國(guó)，這些國(guó)際制藥企業(yè)也已向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局先后提交了有關(guān)pd-1抗體的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)，其中如美國(guó)medarex(米德列斯)公司通過(guò)國(guó)際pct申請(qǐng)(pct/us2006/026046)進(jìn)入中國(guó)的名為“抗程序性死亡配體1(pd-l1)的人單克隆抗體。申請(qǐng)文件號(hào)：200680028238.9”專(zhuān)利申請(qǐng)文件中就披露了其從免疫小鼠中篩選獲得的高親和力特異結(jié)合人pd-l1的單克隆抗體、其編碼dna序列及其用該類(lèi)抗體用于治療包括癌癥和傳染病在內(nèi)的各種疾病的方法。美國(guó)weythe(惠氏)公司及medimmune(免疫醫(yī)療有限公司)在其名為“抗pd-1抗體及其用途。專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01010170022.4”發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)文件中披露了從噬菌粒scfv基因展示庫(kù)篩選獲得的抗人pd-1抗體的片段、其編碼dna序列及該類(lèi)抗體作為藥物成分，用于治療包括自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、癌癥等免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的應(yīng)用。除國(guó)外制藥企業(yè)之外，自2013年起，國(guó)內(nèi)也已經(jīng)有多家研發(fā)機(jī)構(gòu)與企業(yè)先后向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交了有關(guān)pd-1抗體的pct或中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)。國(guó)內(nèi)機(jī)構(gòu)最早提出的有關(guān)pd-1單抗的專(zhuān)利申請(qǐng)為由鄭州大學(xué)于2013年5月27日提交的文件名為“一種全人源化抗pd-1單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用”(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?cn201310199947.5，申請(qǐng)公開(kāi)文件號(hào)：cn103242448b)。該專(zhuān)利申請(qǐng)文件公開(kāi)了一種對(duì)pd-1有很高的親和力和很低的免疫原性的全人源化抗pd-1單克隆抗體及其重鏈與輕鏈氨基酸序列。該文件還描述了該全人源化抗pd-1單克隆抗體特異性阻斷pd-1/pd-l抑制信號(hào)，及其增強(qiáng)促進(jìn)機(jī)體中失能的效應(yīng)性細(xì)胞生物學(xué)功能恢復(fù)，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原、外來(lái)入侵的病毒等的殺傷力，提高機(jī)體免疫力，及時(shí)清除腫瘤細(xì)胞和病毒的應(yīng)用。該專(zhuān)利法律狀態(tài)為最初于2015年1月14日獲授權(quán)，但在2016年7月20日因未繳年費(fèi)專(zhuān)利權(quán)已被終止。國(guó)內(nèi)申請(qǐng)靠前的其他研發(fā)機(jī)構(gòu)與企業(yè)的幾項(xiàng)有關(guān)pd-1單抗的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)依次如下：2013年6月26日由上海君實(shí)生物醫(yī)藥科技有限公司及蘇州君盟生物醫(yī)藥科技有限公司共同申請(qǐng)的文件名為“抗pd-1抗體及其應(yīng)用”(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺篶n201310258289，專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文件號(hào)：cn104250302a)提供了一種新的pd-1抗體或其功能性片段。該文件還涉及所述抗體在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。2013年9月13日由百濟(jì)神州有限公司提交的申請(qǐng)文件名為“抗pd-1抗體及其作為治療劑與診斷劑的用途”(申請(qǐng)?zhí)?cn201380079581.6，專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文件號(hào)：cn105531288a)，該發(fā)明提供特異性結(jié)合程序性死亡-1(pd1、pdcd-1或cd279)、抑制免疫細(xì)胞中pd1介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及活性，并結(jié)合pd1的配體所需要的一套氨基酸殘基的抗體，及這些抗體治療或診斷由pd-1介導(dǎo)的功能所調(diào)控的癌癥、傳染性疾病或其他病理病癥的用途。2013年10月25日蘇州思坦維生物技術(shù)有限責(zé)任公司提交的文件名為“拮抗抑制程序性死亡受體pd-1與其配體結(jié)合的單克隆抗體及其編碼序列與用途”(申請(qǐng)?zhí)?cn201310512512.1；專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文件號(hào)：cn104558177a)。該發(fā)明公開(kāi)了一種拮抗抑制pd-1與其配體結(jié)合的小鼠單克隆抗體及其重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。該發(fā)明還公開(kāi)了編碼該抗體重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)的dna分子核苷酸序列。該發(fā)明還公開(kāi)了該抗體的人-鼠嵌合抗體及其衍生體的制備方法，以及其在pd-1蛋白檢測(cè)上的應(yīng)用。2013年11月14日上海恒瑞醫(yī)藥有限公司及江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提交了文件名為“pd-1抗體、其抗原結(jié)合片段及其醫(yī)藥用途”(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺篶n201480011008.6，專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文件號(hào)：cn105026428a)專(zhuān)利申請(qǐng)。上述專(zhuān)利申請(qǐng)及其后的pd-1抗體專(zhuān)利申請(qǐng)目前大都均處于文件公開(kāi)或?qū)嵸|(zhì)審查階段。2015年10月28日小野藥品工業(yè)株式會(huì)社(onopharmaceutical)/美國(guó)medarex(梅達(dá)雷克斯)公司遞交的一項(xiàng)名為“程序性死亡-1(pd-1)的人單克隆抗體及使用抗pd-1抗體來(lái)治療癌癥的方法”的專(zhuān)利申請(qǐng)正式獲得中國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局授權(quán)(授權(quán)專(zhuān)利號(hào):cn103059138b)。該授權(quán)專(zhuān)利保護(hù)的是限定了cdr序列的具體抗體結(jié)構(gòu)程序性死亡-1(pd-1)的人單克隆抗體及使用該pd-1抗體來(lái)治療癌癥的方法。而在pd-1/pd-l1藥物全球開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，到目前為止還僅只有以下三個(gè)抗體藥物先后獲美國(guó)fda批準(zhǔn)上市：1)opdivo(通用名為nivolumab，曾用代號(hào)bms-936558，mdx-1106)，是一全人源pd-1單抗(igg4-kappa型)，由美國(guó)bristol-myerssquibb/medarex公司和日本小野制藥公司共同開(kāi)發(fā)的，于2014年7月率先在日本獲批準(zhǔn)上市用于治療晚期黑色素瘤，成為全球首個(gè)批準(zhǔn)上市pd-1抑制劑藥物。其后opdivo(nivolumab)于2014年12月12首次獲美國(guó)fda批準(zhǔn)上市用于一線治療對(duì)其它藥物沒(méi)有應(yīng)答的手術(shù)不可切除的或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者。2)抗-pd1單抗藥物keytruda(通用名為pembrolizumab；曾用代號(hào)mk3475，lambrolizumab)，是一種人源化pd-1單抗(igg4-kappa型)，由美國(guó)merck公司開(kāi)發(fā)，于2014年9月4日首次獲美國(guó)fda快速審批通道批準(zhǔn)用于那些晚期黑素瘤患者在已經(jīng)ipilimumab(伊匹單抗，抗人ctla4單抗)治療后，或因攜帶braf基因突變而使用過(guò)braf抑制劑治療后使用。keytruda也因此成為首個(gè)在美國(guó)獲批上市的抗pd-1藥物。3)tecentriq(通用名atezolizumab；曾用代號(hào)mpdl3280a)，是一種人源化pd-l1單抗(igg1-kappa型)，由美國(guó)genentech/roche公司開(kāi)發(fā)，2016年5月19日首次獲美國(guó)fda批準(zhǔn)上市，作為二線藥物用于治療晚期膀胱癌。在歐盟，opdivo(nivolumab)和keytruda(pembrolizumab)相繼分別在2015年6月及2015年7月獲批準(zhǔn)上市。在中國(guó)，目前還無(wú)pd-1單抗藥物或pd-l1單抗藥物獲批上市。獲美國(guó)/歐盟/日本等國(guó)家和地區(qū)批準(zhǔn)上市的上述兩個(gè)pd-1單抗藥物和一個(gè)pd-l1單抗藥物，在其各自的早期臨床試驗(yàn)(i期)中就業(yè)已表現(xiàn)有抑制腫瘤生長(zhǎng)、甚至徹底消滅與排斥腫瘤及顯著延長(zhǎng)患者生存期的客觀療效，而且其長(zhǎng)期使用的安全性也可接受(brahmerjr等，jco2010；28：3167-3175；topalians等，nejm2012；366：2443-2454；brahmerjr等，nejm2012；366：2455-2465；hamido等，nejm2013；369:134-144)。其中最早公開(kāi)報(bào)道的及最具轟動(dòng)效果的大型臨床試驗(yàn)結(jié)果是由topalian等于2012年6月在國(guó)際著名醫(yī)學(xué)雜志nengljmed發(fā)表(topalians等：nengljmed2012，366：2443-2454)。該文章中報(bào)道：在一項(xiàng)有296例晚期惡性腫瘤患者參與的i期臨床研究中，患者每2周接受靜脈注射美國(guó)bms公司的pd-1單抗藥物nivolumab(代號(hào)bms-93655)后，結(jié)果有高達(dá)28％的黑色素瘤患者、27％的腎細(xì)胞癌患者及出乎意料之高的18％非小細(xì)胞肺癌(nsclc)患者，其腫瘤出現(xiàn)抑制或縮??；nivolumab在臨床上治療腫瘤的療效上還表現(xiàn)出長(zhǎng)期持久的特點(diǎn)：如在已隨訪1年以上的31位患者中，有20位(64.5％)臨床上依然有效。其后研究進(jìn)一步證實(shí)nivolumab在臨床上治療晚期惡性腫瘤的療效甚至好于化療藥物:如robert等于2015年1月在nengljmed雜志發(fā)表的文章中報(bào)道(robertcetal：nengljmed.2015；372:320-30)：在一項(xiàng)由bms公司發(fā)起與資助的名為checkmate066的臨床研究中，418例未經(jīng)治療過(guò)的、braf基因無(wú)突變的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤晚期患者隨機(jī)分組，分別接受nivolumab(每2周一次)治療或化療藥物dacarbazine治療，結(jié)果在入組治療1年后，與dacarbazine治療組相比，nivolumab治療組患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均顯著改善。其中nivolumab組的總生存率達(dá)到72.9％，而dacarbazine組的總生存率為42.1％(p<0.001)；nivolumab組的中位無(wú)進(jìn)展生存期為5.1個(gè)月，而dacarbazine組為2.2個(gè)月(p<0.001)；nivolumab組客觀緩解率為40.0％，而dacarbazine組為13.9％(p<0.001)。與nivolumab的多項(xiàng)臨床研究結(jié)果相類(lèi)似，pembrolizumab的臨床研究結(jié)果也同樣驚艷與令人振奮。如hamid等于2013年7月在nengljmed雜志發(fā)表的文章中報(bào)道(hamido等，nengljmed2013，369:134-144)：在一國(guó)際多中心i期試驗(yàn)中，之前至少接受過(guò)兩次以上的ipilimumab治療后病情發(fā)生進(jìn)展的晚期黑素瘤的患者隨機(jī)分配至接受每3周靜脈給予pembrolizumab(劑量：2mg/kg)或每3周靜脈給予pembrolizumab(劑量：10mg/kg)，直到疾病進(jìn)展或發(fā)生不可耐受的毒性或患者志愿同意退出研究。研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：pembrolizumab治療后有高達(dá)38％的患者腫瘤出現(xiàn)抑制或縮?。辉陔S訪中位數(shù)時(shí)間為11個(gè)月的52位腫瘤患者中，有42位(81％)依然有效，還在繼續(xù)接受pembrolizumab治療。robertc等于2014年9月在國(guó)際雜志lancet發(fā)表的文章中報(bào)道(robertcetal:lancet.2014sept.20；384:1109-17)：173名之前曾接受過(guò)ipilimumab治療但無(wú)效的晚期黑素瘤患者，隨機(jī)入組分別接受每三周靜脈給予pembrolizumab(劑量：2mg/kg，n＝89)或每三周靜脈給予pembrolizumab(劑量：10mg/kg，n＝84)，直到疾病進(jìn)展或發(fā)生不可耐受的毒性或患者志愿同意退出研究。結(jié)果顯示中位隨訪時(shí)間為8個(gè)，pembrolizumab單抗倆劑量組的總生存率(orr)為26％，其中2mg/kg劑量組81位患者中有21位存活，10mg/kg組中76位患者中有20位存活。opdivo(nivolumab)及keytruda(pembrolizumab)單抗藥物雖已在腫瘤治療領(lǐng)域帶來(lái)革命性變化(revolutionizingcancertreatment)，但其在臨床上也還有不少缺陷與不足，這些缺陷與不足至少包括以下幾方面：1)opdivo(nivolumab)及keytruda(pembrolizumab)單抗藥物目前臨床上還只獲批用于治療晚期黑素瘤、腎癌、非小細(xì)胞肺癌(nsclc)、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(hnscc)、膀胱癌等少數(shù)瘤種，對(duì)其他常見(jiàn)及多發(fā)惡性腫瘤臨床治療上的安全性及有效性還有待研究與確證。2)對(duì)于已獲批腫瘤，opdivo(nivolumab)及keytruda(pembrolizumab)單抗藥物的治療有效率一般也僅在15-50％之間，患者中位pfs也僅有幾個(gè)月。這意味著對(duì)大多數(shù)腫瘤患者來(lái)說(shuō)，即使接受了現(xiàn)有的pd-1單抗藥物，也并不能確?？梢垣@益或顯著延長(zhǎng)其生存時(shí)間。3)opdivo(nivolumab)及keytruda(pembrolizumab)藥物的長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致患者發(fā)生包括如免疫介導(dǎo)性肺炎(immune-mediatedpneumonitis)等免疫相關(guān)不良事件(immune-relatedadverseevents)；這些免疫相關(guān)不良事件有時(shí)還涉及皮膚、胃腸道、肝臟、內(nèi)分泌等其他多個(gè)組織器官(naidoojetal：annoncol.2015；26:2375-91)。要克服上述這些缺陷與不足，除需加強(qiáng)對(duì)已有opdivo(nivolumab)及keytruda(pembrolizumab)藥物的具體靶向位點(diǎn)(epitope)、作用機(jī)制、藥物不良反應(yīng)產(chǎn)生的原因等作進(jìn)一步的基礎(chǔ)及臨床研究之外，臨床上用也還需推出具獨(dú)特抗原結(jié)合區(qū)域/結(jié)合位點(diǎn)(epitop)且體內(nèi)外生物活性/抗腫瘤療效優(yōu)于現(xiàn)有的opdivo(nivolumab)及keytruda(pembrolizumab)的、全新的抗pd-1的單克隆抗體藥，以滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外眾多腫瘤患者藥的迫切需求。鑒于pd-1與其受體(pd-l1或pd-l2)的結(jié)合具有結(jié)合區(qū)域廣泛、參與結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)數(shù)目多達(dá)幾十個(gè)以上等特點(diǎn)；同時(shí)再考慮到人pd-1蛋白與小鼠pd-1蛋白在氨基酸序列上的同源性?xún)H有60％左右，因此理論上推測(cè)，如采用傳統(tǒng)的抗原蛋白免疫小鼠及雜交瘤技術(shù)，應(yīng)可以制造或開(kāi)發(fā)出針對(duì)不同結(jié)合區(qū)域/或結(jié)合位點(diǎn)的各種全新的抗pd-1單克隆抗體。這些具新的、獨(dú)特抗原結(jié)合區(qū)域/結(jié)合位點(diǎn)(epitop)的單克隆抗體，有望取得比現(xiàn)已上市的pd-1單抗opdivo(nivolumab)或keytruda(pembrolizumab)更強(qiáng)的體內(nèi)外生物活性或更安全、更優(yōu)良的療效。這些新的單抗作為藥物成分，一方面可與目前已上市的pd-1單抗藥物或pd-l1單抗藥物聯(lián)合或序貫使用，達(dá)到進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及增強(qiáng)抗腫瘤療效的作用；另一方面，也有望獨(dú)立開(kāi)發(fā)成為單獨(dú)使用的新型免疫功能增強(qiáng)劑或抗腫瘤藥物制劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種抗原結(jié)合區(qū)域/結(jié)合位點(diǎn)(epitop)不同于現(xiàn)有的opdivo(nivolumab)或keytruda(pembrolizumab)的、全新的抗pd-1的單克隆抗體或其衍生體如抗體fab片段、單鏈抗體等。該單克隆抗體或其衍生體可拮抗抑制pd-1抗原與其配體(pd-l1及pd-l2)結(jié)合。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供編碼上述抗體的dna分子或基因。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供含有上述抗體的藥物或藥物組合物。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之四是提供含有上述抗體的藥物或藥物組合物在治療腫瘤上的應(yīng)用。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之五是提供制備上述抗體的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：在本發(fā)明第一方面，提供了一種抗原結(jié)合區(qū)域/結(jié)合位點(diǎn)(epitop)不同于現(xiàn)有的opdivo(nivolumab)或keytruda(pembrolizumab)的、全新的抗pd-1的單克隆抗體或其衍生體，其包含第一可變區(qū)和第二可變區(qū)，其中所述第一可變區(qū)是抗體輕鏈可變區(qū)，其抗原互補(bǔ)決定區(qū)cdr1，cdr2和cdr3分別為seqidno：3，seqidno：4及seqidno：5所示的氨基酸序列；其中所述第二可變區(qū)是抗體重鏈可變區(qū)，其抗原互補(bǔ)決定區(qū)cdr1，cdr2和cdr3分別為seqidno：8，seqidno：9及seqidno：10所示的氨基酸序列。所述抗體包括人源化單克隆抗體，所述衍生體包括抗體fab片段、單鏈抗體、雙特異抗體(bi-specific)等。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第一可變區(qū)是抗體輕鏈可變區(qū)，為seqidno：11所示的氨基酸序列；其所述第二可變區(qū)是抗體重鏈可變區(qū)，為seqidno：12所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，其包含所述抗體輕鏈可變區(qū)和人抗體輕鏈恒定區(qū)，及包含所述抗體重鏈可變區(qū)和人抗體重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)，ch1區(qū)，ch2區(qū)和ch3區(qū)。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述人抗體輕鏈恒定區(qū)來(lái)自人抗體kappa鏈或抗體lamda鏈，所述人抗體重鏈恒定區(qū)來(lái)自人igg1，igg2，igg3或igg4等亞型，其中優(yōu)選的為igg4亞型。在本發(fā)明第二方面，提供了一種編碼上述抗體或其衍生體的dna分子或基因核苷酸序列，其抗體輕鏈可變區(qū)基因核苷酸序列為seqidno：13所示，抗體重鏈可變區(qū)可變區(qū)基因核苷酸序列為seqidno：14。本發(fā)明的第三方面是提供了一種表達(dá)載體，它含有編碼上述抗體或其衍生體的dna分子/基因核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。本發(fā)明的第四方面提供了一種重組宿主細(xì)胞，它由上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而成。該重組宿主細(xì)胞或其子代細(xì)胞表達(dá)上述抗體或其衍生體。該抗體包括人源化單克隆抗體，衍生體包括抗體fab片段、單鏈抗體、雙特異抗體(bi-specific)等等。本發(fā)明的第五方面是提供一種藥物或藥物組合物，它含有藥學(xué)上有效量的上述抗體或其衍生體，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的第六方面是提供上述抗體的藥物或藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。所述腫瘤優(yōu)選為結(jié)腸癌。在本發(fā)明的具體實(shí)施實(shí)例中，本發(fā)明描述了該人源化抗體在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)的應(yīng)用。本發(fā)明第七方面是提供制備上述抗體或其衍生體的方法，該方法包括：a)提供一表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有上述dna序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；c)在適合所述抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞：和d)從該宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中分離純化獲得所述抗體。本文所采用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體(單抗)”指從一純系細(xì)胞得到的免疫球蛋白，具有相同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性，對(duì)單一抗原決定簇有特異性。單克隆抗體與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對(duì)不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過(guò)雜交瘤或重組工程細(xì)胞培養(yǎng)獲得，不會(huì)混雜有其它免疫球蛋白。修飾語(yǔ)“單克隆”表示了抗體的特性，是從均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來(lái)生產(chǎn)抗體。本文所采用的術(shù)語(yǔ)“人源化單克隆抗體”系將鼠源單克隆抗體的氨基酸序列除保留互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregions，cdr)外，其它序列(包括可變區(qū)中的框架區(qū)序列)全部或大部分替換成人免疫球蛋白的氨基酸序列，以達(dá)到通過(guò)基因工程手段最大限度地降低鼠源性單克隆抗體的免疫原性。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(l)和兩個(gè)相同的重鏈(h)組成。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(vh)。其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(vl)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。本文所用的術(shù)語(yǔ)“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個(gè)抗體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中成為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)或超變區(qū)中的三個(gè)片段中?？勺儏^(qū)中較保守的部分稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)(frameworkregions，fr)。抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個(gè)fr區(qū)，它們大致上呈β-折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個(gè)cdr相連，在某些情況下可形成部分β折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的cdr通過(guò)fr區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的cdr一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見(jiàn)kabat等，nihpubl.no.91-3242，卷1，647-669頁(yè)(1991))?？贵w恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體的依賴(lài)于抗體的細(xì)胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity，adcc)或補(bǔ)體介導(dǎo)毒性(complemnt-dependentcytotoxicity，cdc)。本發(fā)明的抗體通常可以通過(guò)以下方法來(lái)制備：首先，將含有編碼本發(fā)明的抗體的基因插入到含有合適的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)調(diào)控序列”通常指參與控制基因表達(dá)的序列。表達(dá)調(diào)控序列包括與目標(biāo)基因操作性相連的啟動(dòng)子和終止信號(hào)。編碼本發(fā)明抗體的基因(dna)序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的蛋白質(zhì)序列人工合成或用pcr法擴(kuò)增得到。其后可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將合成或pcr擴(kuò)增得到的dna片段插入到合適的表達(dá)載體中。本發(fā)明中所用的表達(dá)載體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的市售表達(dá)載體，如invitrogen公司的pcdna3.1表達(dá)載體。用于接納表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的合適宿主細(xì)胞一般包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。在本發(fā)明中，較佳的宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是中華倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在合適的條件下(如以無(wú)血清培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)瓶或生物反應(yīng)器中貼壁或懸浮培養(yǎng))培養(yǎng)后，收獲培養(yǎng)上清液，然后用包括protein-a親和層析、離子交換層析、過(guò)濾除菌等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離步驟或手段純化得到本發(fā)明的抗體。純化得到的本發(fā)明抗體可以溶于適當(dāng)?shù)娜軇┤鐭o(wú)菌生理鹽水液體中，溶度可以制備成0.01至100mg/ml之間，理想的最終溶度可以制備成1至20mg/ml之間。為獲得一種拮抗抑制pd-1(programmeddeath-1)與其配體結(jié)合的鼠源單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細(xì)胞系，本發(fā)明選取哺乳動(dòng)物表達(dá)的重組人pd-1胞膜外蛋白為免疫抗原，通過(guò)反復(fù)多次小劑量的小鼠皮下免疫，獲得分泌抗pd-1蛋白的多克隆抗體；再?gòu)闹刑羧『咝r(jià)抗體的小鼠，取其脾臟細(xì)胞，通過(guò)體外與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合、再經(jīng)藥物篩選及亞克隆等步驟而建立了多株穩(wěn)定分泌抗人pd-1蛋白的抗體的雜交瘤單克隆細(xì)胞。其中一代號(hào)為ab21的小鼠雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)elisa、免疫印跡、免疫組化等多種方法鑒定，證實(shí)其所分泌的單克隆抗體不但能夠特異結(jié)合人pd-1蛋白，而且可阻斷抑制pd-1蛋白與其配體(pd-l1，pd-l2)的結(jié)合。本發(fā)明通過(guò)基因工程等手段獲得了編碼該鼠源抗體重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的基因片斷，在此基礎(chǔ)上對(duì)該抗體進(jìn)行了人源化改造及其表達(dá)載體(pcdna3.1-hab21)的構(gòu)建。該表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入中華倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞，獲得穩(wěn)定高效分泌表達(dá)該人源化抗體的重組工程細(xì)胞，并從重組工程細(xì)胞培養(yǎng)液中分離純化獲得到具有生物活性的人源化hab21抗體蛋白。競(jìng)爭(zhēng)elisa分析表明該人源化hab21抗體結(jié)合pd-1的位點(diǎn)(epitope)既顯著不同于nivolumab單抗的結(jié)合位點(diǎn)，也不同于pembrolizumab(mk3475單抗)的結(jié)合位點(diǎn)。人源化hab21抗體體內(nèi)給藥后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,且療效明顯優(yōu)于已上市的pembrolizumab(mk3475單抗)藥物。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中人pd-1與小鼠pd-1蛋白氨基酸序列比對(duì)分析示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中以elisa法檢測(cè)小鼠雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品與包被在96-孔板上的重組人pd-1胞膜外蛋白結(jié)合的結(jié)果示意圖。其中mab21及mab11為兩株不同雜交瘤的上清液樣品，陰性對(duì)照樣品為未融合的sp2/0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品。圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中以流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析小鼠抗體樣品中抗體與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人pd-1基因的cho細(xì)胞(cho/pd-1)的結(jié)合結(jié)果示意圖；其中，圖3a代表control-igg，為陰性對(duì)照樣品；圖3b代表人pdl2-fc融合蛋白，為陽(yáng)性對(duì)照樣品；圖3c代表雜交瘤mab7細(xì)胞上清液樣品；圖3d代表雜交瘤mab21細(xì)胞上清液樣品。圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中以免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，ihc)方法檢測(cè)mab21單抗樣品與組織切片的特異結(jié)合的結(jié)果示意圖；其中，圖4a代表食蟹猴脾組織切片；圖4b代表食蟹猴淋巴結(jié)組織切片。圖5a為本發(fā)明實(shí)施例4中以體外競(jìng)爭(zhēng)elisa法檢測(cè)分析mab21單抗樣品或mk3475單抗樣品拮抗阻斷生物素標(biāo)記的人pdl2-fc蛋白(biotin-pdl2)結(jié)合包被在96-孔板上人pd-1蛋白的結(jié)果示意圖。其中的hpv19為非相關(guān)的單抗樣品，為陰性對(duì)照。圖5b為本發(fā)明實(shí)施例5中以體外競(jìng)爭(zhēng)elisa法檢測(cè)分析mab21單抗樣品或mk3475單抗樣品拮抗阻斷生物素標(biāo)記的mk3475單抗(biotin-mk3475)結(jié)合包被在96-孔板上人pd-1蛋白的的結(jié)果示意圖。其中的hpv19為非相關(guān)的單抗樣品，為陰性對(duì)照。圖6a為本發(fā)明實(shí)施例8中人源化hab21單抗輕鏈可變區(qū)與nivolumab單抗輕鏈可變區(qū)及mk3475單抗輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列比對(duì)分析示意圖。其中方框標(biāo)識(shí)的為cdr1，cdr2及cdr3氨基酸序列。圖6b為本發(fā)明實(shí)施例8中人源化hab21單抗重鏈可變區(qū)與nivolumab單抗(nivo)重鏈可變區(qū)及mk3475單抗重鏈可變區(qū)的氨基酸序列比對(duì)分析示意圖。其中方框標(biāo)識(shí)的為cdr1，cdr2及cdr3的氨基酸序列。圖7為本發(fā)明實(shí)施例10中elisa法檢測(cè)對(duì)比分析三種igg4型單抗(hab21單抗、nivolumab及mk3475單抗)與三種igg1型單抗(avastin、hpv19及eribitux)與包被在96-孔板上重組人fcr蛋白(cd64蛋白)的結(jié)合的結(jié)果示意圖。圖8為本發(fā)明實(shí)施例11中elisa法檢測(cè)對(duì)比分析人源化hab21單抗、nivolumab單抗(nivo)及mk3475單抗與人pd-1-fc及其他多個(gè)免疫相關(guān)蛋白-fc融合蛋白結(jié)合的結(jié)果示意圖。其中的hpv19為非相關(guān)的單抗樣品，為陰性對(duì)照。圖9a為本發(fā)明實(shí)施例12中以競(jìng)爭(zhēng)elisa法體外檢測(cè)分析人源化hab21單抗、nivolumab單抗(nivo)及mk3475單抗拮抗阻斷生物素標(biāo)記的mk3475單抗(biotin-mk3475)與包被在96-孔板上人pd-1蛋白結(jié)合的結(jié)果示意圖。其中的hpv19為非相關(guān)的單抗樣品，為陰性對(duì)照。圖9b為本發(fā)明實(shí)施例12中以競(jìng)爭(zhēng)elisa法體外檢測(cè)分析人源化hab21單抗、nivolumab單抗(nivo)及mk3475單抗樣品拮抗阻斷生物素標(biāo)記的nivolumab單抗(biotin-nivolumab)與包被在96-孔板上人pd-1蛋白結(jié)合的結(jié)果示意圖。其中的hpv19為非相關(guān)的單抗樣品，為陰性對(duì)照。圖9c為本發(fā)明實(shí)施例12中以體外競(jìng)爭(zhēng)elisa法檢測(cè)分析人源化hab21單抗、nivolumab單抗(nivo)、mk3475單抗、nivolumab單抗與mk3475單抗混合物(mk3475+nivo)樣品拮抗阻斷生物素標(biāo)記的hab21單抗(biotin-hab21)結(jié)合包被在96-孔板上人pd-1蛋白的結(jié)果示意圖。其中的hpv19為非相關(guān)的單抗樣品，為陰性對(duì)照。圖10a為本發(fā)明實(shí)施例13中流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析不同溶度的nivolumab與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人pd-1基因的cho細(xì)胞結(jié)合(cho/pd-1)的結(jié)果示意圖。其中虛線點(diǎn)圖(dothistograms)為陰性對(duì)照igg結(jié)果。圖10b為本發(fā)明實(shí)施例13中流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析不同溶度的hab21單抗樣品與轉(zhuǎn)染人pd-1基因的cho細(xì)胞結(jié)合(cho/pd-1)的結(jié)果示意圖。其中虛線點(diǎn)圖(dothistograms)為陰性對(duì)照igg結(jié)果。圖10c為本發(fā)明實(shí)施例13中根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果所作的平均熒光強(qiáng)度(meanfluorescenceintensity，mfi)與hab21單抗或nivolumab單抗的溶度曲線圖。圖11為本發(fā)明實(shí)施例14中流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析不同溶度的nivolumab(nivo,left)或hab21單抗樣品(hab21,right)與pha激活的人jurkatt細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果示意圖；其中虛線點(diǎn)圖(dothistograms)為陰性對(duì)照igg結(jié)果。圖12為本發(fā)明實(shí)施例15中流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析不同溶度的hab21單抗樣品(hab21,right)，或不同溶度的nivolumab(left)與pha激活的人外周血單核細(xì)胞(hpbmc)結(jié)合的結(jié)果示意圖；其中虛線點(diǎn)圖(dothistograms)為陰性對(duì)照igg結(jié)果。圖13a為本發(fā)明實(shí)施例16中hpd-1人源化小鼠皮下種植鼠源mc38結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤模型的第1階段研究中，hab21單抗或mk3475單抗(pembrolizumab)給藥后腫瘤增長(zhǎng)曲線圖。圖13b為本發(fā)明實(shí)施例16中hpd-1人源化小鼠皮下種植鼠源mc38結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤模型的第1階段研究中中，hab21單抗或mk3475單抗(pembrolizumab)給藥后小鼠體重增長(zhǎng)曲線圖。圖14a為本發(fā)明實(shí)施例16中hpd-1人源化小鼠皮下種植鼠源mc38結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤模型的第1階段研究中，生理鹽水陰性對(duì)照組(a組)每只個(gè)體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤增長(zhǎng)體積趨勢(shì)。圖14b為本發(fā)明實(shí)施例16中hpd-1人源化小鼠皮下種植鼠源mc38結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤模型的第1階段研究中，pembrolizumab(mk3475)單抗治療組(b組)每只個(gè)體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤增長(zhǎng)體積趨勢(shì)。圖14c為本發(fā)明實(shí)施例16中hpd-1人源化小鼠皮下種植鼠源mc38結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤模型的第1階段研究中，hab21單抗治療組(c)(a組)每只個(gè)體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤增長(zhǎng)體積趨勢(shì)。圖15為本發(fā)明實(shí)施例16中hpd-1人源化小鼠皮下種植鼠源mc38結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤模型中的第2階段研究中，重新種植的腫瘤增長(zhǎng)曲線圖，及其與種植在普通c57bl/6小鼠皮下的腫瘤增長(zhǎng)曲線圖對(duì)比。圖16為本發(fā)明實(shí)施例17中普通c57bl/6小鼠皮下種植鼠源mc38結(jié)腸癌細(xì)胞模型研究中，hab21單抗治療組和生理鹽水對(duì)照組動(dòng)物體內(nèi)腫瘤增長(zhǎng)體積趨勢(shì)。圖17為本發(fā)明實(shí)施例18中食蟹猴單次靜脈給予hab21單抗后的藥物溶度-時(shí)間曲線圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施實(shí)例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例只是為了起說(shuō)明作用，而不是用來(lái)限制本發(fā)明。實(shí)施例1:分泌抗pd-1抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞系的建立與篩選鑒定1)人pd-1蛋白的氨基酸序列與小鼠pd-1蛋白的氨基酸序列比對(duì)分析人pd-1蛋白的氨基酸序列與小鼠pd-1蛋白的氨基酸序列比對(duì)分析如圖1(其中的以方框斜體標(biāo)注的氨基酸序列為引導(dǎo)細(xì)胞外分泌表達(dá)pd-1蛋白的信號(hào)肽(signalpeptide)，以方框粗體標(biāo)注的氨基酸序列為pd-1蛋白的跨細(xì)胞模區(qū)域，tm)。如圖1所示：在氨基酸序列上，人pd-1與小鼠pd-1蛋白整體同源性?xún)H有60％，而其中直接參與識(shí)別及結(jié)合其配體(pd-l1或pd-l2)的胞模外區(qū)域(含igv區(qū)域)在人和小鼠中的氨基酸差異位點(diǎn)數(shù)也有三十多個(gè)。因此推測(cè)，如采用傳統(tǒng)的抗原蛋白免疫小鼠及雜交瘤制備技術(shù)，應(yīng)可以制備出針對(duì)各種不同結(jié)合區(qū)域或氨基酸結(jié)合位點(diǎn)的鼠抗人pd-1單克隆抗體。這些抗人pd-1單克隆抗體，或因其抗原結(jié)合區(qū)域/結(jié)合位點(diǎn)(epitop)不同于已有pd-1單抗如opdivo(nivolumab)或keytruda(pembrolizumab)，其體內(nèi)外生物活性及療效有望不同于或甚至更優(yōu)于opdivo(nivolumab)或keytruda(pembrolizumab)。這類(lèi)識(shí)別新位點(diǎn)的、全新的pd-1單抗作為藥物成分，一方面可與目前已上市的pd-1單抗藥物或pd-l1單抗藥物聯(lián)合或序貫使用，達(dá)到進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及增強(qiáng)抗腫瘤療效的作用；另一方面，該類(lèi)全新的抗體也有望獨(dú)立開(kāi)發(fā)成為單獨(dú)使用的新型免疫功能增強(qiáng)劑或抗腫瘤藥物制劑。為此，本發(fā)明開(kāi)展了這類(lèi)全新的pd-1單抗研發(fā)與制備，其具體制備步驟如下：2)分泌抗pd-1抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞系的建立與篩選鑒定步驟1.重組人pd-1蛋白(免疫抗原)的來(lái)源與動(dòng)物免疫在本發(fā)明實(shí)施例中，用于免疫的抗原為由哺乳動(dòng)物表達(dá)的重組人pd-1胞膜外蛋白(北京義翹神州公司產(chǎn)品)。該重組人pd-1蛋白與弗氏完全佐劑(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)混合后，于皮下多點(diǎn)注射balb/c小鼠(100μl/只，每次10μgpd-1蛋白)。首次免疫2-3周后，小鼠再給予皮下多點(diǎn)注射含人pd-1蛋白與弗氏不完全佐劑(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)的混合物，加強(qiáng)免疫3-4次后，取少量小鼠血清，用包被重組人pd-1蛋白的96-板以elisa法檢測(cè)小鼠血清中抗pd-1抗體的效價(jià)，取效價(jià)高者小鼠的脾細(xì)胞用于下一步的細(xì)胞融合。步驟2、細(xì)胞融合在末次免疫后3-4天，無(wú)菌制備小鼠脾細(xì)胞懸液，與小鼠sp2/0骨髓瘤細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞保藏中心)，以5：1或10：1的比例在50％peg-1000(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)作用下融合。融合按常規(guī)法(kohlerg.andmilsteinc:nature1975；256:495-497),peg用量1ml，60秒內(nèi)緩慢加完。反應(yīng)90秒后，以無(wú)血清的rpmi-1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000rpm離心10min,去除上清液，再將離心沉淀下的細(xì)胞以含10％hat(h為次黃嘌呤、a氨基碟呤、t胸腺嘧啶核苷，為美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)的rpmi1640-10％fcs培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1х106/ml，加入96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔200μl)，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中(美國(guó)thermo公司產(chǎn)品)培養(yǎng)2-3周。步驟3、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)篩選抗體分泌陽(yáng)性的小鼠雜交瘤細(xì)胞同樣，以重組人pd-1蛋白(2μg/ml，ph9.6，0.1mnahco3液)包被96-孔酶標(biāo)板，37℃包被2小時(shí)后，再加入2％牛血清白蛋白(bsa)4℃封閉過(guò)夜。次日，包被板經(jīng)pbs-0.1％tween20液洗滌后，加入待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液(以未融合的sp2/0骨髓瘤細(xì)培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照)37℃孵育2小時(shí)；經(jīng)pbs-0.1％tween20液洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶hrp-標(biāo)記的羊抗小鼠igg(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)，37℃孵育1小時(shí)；再經(jīng)pbs-0.1％tween20液充分洗滌后，加入鄰苯二胺(opd)-0.1％h2o2底物液顯色10-15min后再加入0.1mhcl終止反應(yīng)。其后在mk3-multiskan酶標(biāo)儀(美國(guó)thermoscientific公司產(chǎn)品)中讀取492nm處od值。測(cè)得的od492值比陰性對(duì)照值高5-10倍的雜交瘤細(xì)胞再克隆化，并進(jìn)行擴(kuò)增凍存。步驟4、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆-有限稀釋法將初篩得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞以rpmi-1640-10％fcs培養(yǎng)基稀釋至每孔1-10個(gè)細(xì)胞，鋪于96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周。待克隆長(zhǎng)成，取上清液以elisa再次檢測(cè)鑒定抗pd-1抗體。圖2為以elisa法篩選檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞亞克隆上清液與重組人pd-1蛋白結(jié)合的結(jié)果示意圖，其中一代號(hào)為mab21的雜交瘤細(xì)胞株上清液含高滴度的抗pd-1抗體。實(shí)施例2流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析鼠源單克隆抗體mab21與轉(zhuǎn)染表達(dá)人pd-1基因的cho細(xì)胞(cho/pd-1)結(jié)合在本實(shí)施例中，以鼠源mab21單抗上清，或已知的結(jié)合人pd-1蛋白的鼠源mab7單抗上清(見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文件cn104558177a)為一抗，以fitc熒光標(biāo)記的羊抗小鼠igg為二抗，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析mab21單抗樣品與穩(wěn)定表達(dá)人pd-1基因的cho細(xì)胞(cho/pd-1)結(jié)合。為此,將cho-pd-1細(xì)胞分別與含小鼠igg(陰性對(duì)照，a)、人pdl2-fc融合蛋白(b)、鼠抗-pd-1陽(yáng)性樣品mab7上清液(c，1:5稀釋)或鼠mab21上清液中(d，1：5稀釋)；4℃孵育1小時(shí)及經(jīng)pbs-0.1％fcs液洗滌后，加入fitc-標(biāo)記的羊抗小鼠igg(sigma公司產(chǎn)品)(對(duì)于人pdl2-fc融合蛋白樣品，則加入fitc-標(biāo)記的羊抗人igg-fc)；4℃孵育1小時(shí)及再經(jīng)pbs-0.1％fcs液洗滌后，將樣品上樣至cytomicsfc500mcl)流式細(xì)胞儀檢測(cè)(美國(guó)beckmancoulter公司)。圖3為該流式細(xì)胞儀檢測(cè)代表性結(jié)果示意圖。如圖3所示：與小鼠igg陰性對(duì)照樣品(見(jiàn)圖3a)相比，人pdl2-fc融合蛋白樣品(見(jiàn)圖3b)、陽(yáng)性樣品鼠單抗mab7單抗上清(見(jiàn)圖3c)及測(cè)試樣品mab21單抗單抗上清(見(jiàn)圖3d)均可與cho/pd-1細(xì)胞特異結(jié)合；mab21單抗樣品的結(jié)合強(qiáng)度高于mab7單抗。實(shí)施例3免疫組化(ihc)方法檢測(cè)鼠源mab21單抗與食蟹猴組織細(xì)胞結(jié)合在本實(shí)施例中，采用免疫組化(ihc)方法檢測(cè)分析了mab21單抗樣品與來(lái)源于正常食蟹猴組織切片(由昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司提供)的結(jié)合，其檢測(cè)步驟如下：食蟹猴(脾及淋巴結(jié)組織)石蠟切片復(fù)水及抗原回訪處理后，加入mab21單抗單抗上清作為一抗，常溫下孵育1小時(shí)及經(jīng)洗滌后，再加入稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗小鼠igg(二抗)，常溫下孵育1小時(shí)及經(jīng)洗滌后，加入底物dab顯色，蘇木素復(fù)染，封片，照相。該免疫組化代表性結(jié)果如圖4：結(jié)果表明mab21單抗樣品可與猴的脾組織(見(jiàn)圖4a)及淋巴結(jié)組織(見(jiàn)圖4b)特異結(jié)合。實(shí)施例4競(jìng)爭(zhēng)性elisa法檢測(cè)mab21單抗拮抗阻斷pd-1蛋白與其受體結(jié)合的生物活性。體外檢測(cè)mab21單抗的生物活性方法之一是采用競(jìng)爭(zhēng)性elisa法是檢測(cè)其拮抗阻斷pd-1蛋白與其受體(pd-l1及pd-l2)的結(jié)合。該競(jìng)爭(zhēng)性elisa法的基本原理與過(guò)程是：先將不同溶度的mab21單抗樣品或陽(yáng)性對(duì)照樣品如mk3475單抗與固定溶度的生物素標(biāo)記的生物素標(biāo)記的人pd-1受體蛋白(如pdl1-fc或pdl2-fc融合蛋白)混合，之后再將混合物轉(zhuǎn)入預(yù)先包被有pd-1蛋白的96-孔板，經(jīng)孵育及洗脫后，加入酶標(biāo)記的avidin(如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的avidin)；再經(jīng)孵育及洗脫后，加入底物顯示并測(cè)定od值。其中，該競(jìng)爭(zhēng)性elisa法檢測(cè)的具體步驟如下：1)用重組人pd-1胞膜外蛋白(北京義翹神州公司產(chǎn)品)包被96-孔板(包被溶度：2μg/ml,50μl/孔)，4℃過(guò)夜；2)經(jīng)pbs液漂洗及2％bsa(稀釋在pbs-0.1％tween20液中)室溫封閉后,分別加入含固定溶度的生物素標(biāo)記的pdl1-fc蛋白或pdl2-fc蛋白(pdl1-fc蛋白及pdl2-fc蛋白均為北京義翹神州公司產(chǎn)品)與不同溶度的ab7抗體，或非相關(guān)的小鼠抗體(mouseigg)，37℃孵育2h；3)經(jīng)pbs-t洗脫后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的avidin(1：5000)，37℃孵育1h；4)經(jīng)pbs-t洗脫后，加入顯色液(鄰苯二胺)-3％雙氧水，室溫10min至顯色；5)加入hcl終止反應(yīng)，以酶聯(lián)免疫儀測(cè)定492nm波長(zhǎng)處各孔的吸光值。圖5a為測(cè)試樣品mab21單抗及陽(yáng)性樣品mk3475單抗體外與生物素標(biāo)記的pdl2-fc蛋白(biotin-pdl2fc)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合pd-1蛋白的代表性結(jié)果。如圖5a所示:在加入不同溶度的mab21單抗或mk3475單抗與固定溶度的生物素標(biāo)記的pdl2-fc蛋白的樣品中，各孔顯色反應(yīng)od值與加入的抗體蛋白量成反比關(guān)系：即加入的mab21單抗或mk3475單抗量越高，其顯色od值越低。而非相關(guān)單抗樣品hpv19的加入量多少對(duì)各孔o(hù)d值影響不大。此結(jié)果清楚表明，與mk3475單抗一樣，mab21單抗具有體外競(jìng)爭(zhēng)阻斷pd-1與其受體結(jié)合的生物活性。實(shí)施例5elisa法檢測(cè)分析mab21單抗與mk3475單抗競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合pd-1蛋白采用類(lèi)似與實(shí)施例4的競(jìng)爭(zhēng)性elisa法檢測(cè)分析mab21單抗與mk3475單抗競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合pd-1蛋白，其基本原理與檢測(cè)過(guò)程是：先將不同溶度的mab21單抗或mk3475單抗與固定溶度的生物素標(biāo)記的mk3475單抗(biotin-mk3475)與混合，之后再將混合物轉(zhuǎn)入預(yù)先包被有pd-1蛋白的96-孔板，經(jīng)孵育及洗脫后，加入酶標(biāo)記的avidin(如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的avidin)；再經(jīng)孵育及洗脫后，加入底物顯示并測(cè)定od值。圖5b為競(jìng)爭(zhēng)性elisa法檢測(cè)分析的代表性結(jié)果。如圖5b所示：在加入不同溶度的mab21單抗或mk3475單抗與固定溶度的生物素標(biāo)記的biotin-mk3475樣品中，各孔顯色反應(yīng)od值與加入的維標(biāo)記的單抗樣品量成反比關(guān)系：即加入的mab21單抗或mk3475單抗量越高，其顯色od值越低。而非相關(guān)單抗樣品hpv19的加入量多少對(duì)各孔o(hù)d值影響不大。此結(jié)果表明，mab21單抗體外可與mk3475競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合pd-1。實(shí)施例6.鼠源mab21抗體可變區(qū)編碼基因的克隆在此，先從小鼠mab21雜交瘤細(xì)胞中提取出總rna中，再以該rna為模板，采用兼并引物(degenerateprimers)，以reversetranscription-polymerasechainreaction(rt-pcr)法(wangy等：degeneratedprimerdesigntoamplifytheheavychainvariableregionfromimmunoglobulincdna。bmcbioinformatics.2006；7suppl(4):s9)分別克隆擴(kuò)增獲得mab21抗體重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的cdna基因片段。其中cdna基因克隆步驟如下：步驟1、采用試劑盒(江蘇海門(mén)碧云天公司產(chǎn)品)從小鼠ab21雜交瘤細(xì)胞中提取出mrna；步驟2、采用逆轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)方法在eppendorf管獲得cdna模板。其中用于mab21抗體輕鏈可變區(qū)逆轉(zhuǎn)錄pcr引物(ab21-l)序列為：tgtcgttcactgccatcaat用于mab21抗體重鏈可變區(qū)逆轉(zhuǎn)錄pcr引物(ab21-h)序列為：gcaaggcttacaaccacaatc；rt-pcr反應(yīng)體系如下：引物2μlrna模板30μl72℃孵育10分鐘，然后冰上放置2分鐘。于42℃溫度下反應(yīng)1小時(shí)，隨后溫度升至75℃，15分鐘滅活后將獲得的cdna置于-20℃，保存?zhèn)溆?。步驟3、mab21抗體輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)基因的pcr克隆擴(kuò)增用于兼并引物(degenerateprimers)pcr法克隆擴(kuò)增該ab21抗體輕鏈可變區(qū)基因的一對(duì)引物為：正向引物：gacattgtgatgwcmca反向引物：ctgaggcacctccagatgtt其中w＝a或t，m＝a或c。而用于兼并引物(degenerateprimers)pcr法克隆擴(kuò)增ab21抗體重鏈可變區(qū)基因的一對(duì)引物為：正向引物：gtrcagcttcaggagtc其中r＝a或g。反向引物：gtgctggaggggacagtcactpcr擴(kuò)增得到的dna產(chǎn)物在1％agarose膠中電泳分析。電泳結(jié)束后，將分離的dna條帶切下并分別進(jìn)行測(cè)序獲得抗體輕鏈及重鏈可變區(qū)dna的核苷酸序列。測(cè)得的該抗體輕鏈可變區(qū)dna的核苷酸序列見(jiàn)seqidno.:1，由該dna核苷酸序列推測(cè)得到的抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列見(jiàn)seqidno.:2。該輕鏈抗原互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregions，cdr)的cdr1、cdr2及cdr3的氨基酸序列分別見(jiàn)seqidno.:3、seqidno.:4和seqidno.:5。測(cè)得的該抗體重鏈可變區(qū)dna的核苷酸序列見(jiàn)seqidno.:6，由該dna的核苷酸序列推測(cè)得到的抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列見(jiàn)seqidno.:7。該重鏈抗原互補(bǔ)決定區(qū)的cdr1、cdr2及cdr3的氨基酸序列分別見(jiàn)seqidno.:8、seqidno.:9和seqidno.:10。實(shí)施例7鼠源mab21抗體的人-鼠嵌合抗體(cab21)的構(gòu)建將實(shí)施例6中克隆擴(kuò)增獲得的ab21抗體輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因分別與人-kappa輕鏈恒定區(qū)(c-domain)和人igg1-重鏈恒定區(qū)基因片段融合，獲得人-鼠嵌合輕鏈基因(cab21l)及人-鼠嵌合重鏈基因(cab21h)。其后將輕鏈嵌合基因與重鏈嵌合基因分別克隆至pcdna3.1表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌擴(kuò)增，分離獲得大量含人-鼠嵌合抗體基因的表達(dá)質(zhì)粒。含人-鼠嵌合抗體基因的表達(dá)質(zhì)粒再與fugen-6脂質(zhì)體(roche)混合后共轉(zhuǎn)染入cho細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后2-3天，取培養(yǎng)上清液，用包被人pd-1蛋白的96-孔板，用hrp酶標(biāo)記的goat-anti-human-igg為二抗(購(gòu)自上海西塘生物公司)，為檢測(cè)二抗，以elisa法檢測(cè)上清中的嵌合抗體(cab21)與人pd-1蛋白結(jié)合。該elisa代表性檢測(cè)結(jié)果如下表1：表1elisa法檢測(cè)嵌合抗體(cab21)基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清與人pd-1蛋白的結(jié)合表1結(jié)果表明，人-鼠嵌合抗體基因cab21表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞培養(yǎng)上清可與人pd-1的蛋白特異結(jié)合。上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清經(jīng)離心及0.45μm濾膜過(guò)濾后，上樣至proteina親合層析柱(proteina-sepharosefastflow，美國(guó)通用電氣ge公司產(chǎn)品)，經(jīng)分離純化，獲得人-鼠嵌合抗體(cab21)抗體蛋白。實(shí)施例8鼠源mab21抗體的人源化基因工程改造在elisa法檢測(cè)初步證明人-鼠嵌合抗體(cab21)保持有與人pd1蛋白高親合力結(jié)合活性的基礎(chǔ)上，采用pcr等系列基因工程克隆手段將該嵌合抗體輕鏈和重鏈中的抗原互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)基因片段分別移植到對(duì)應(yīng)人kappa-輕鏈和igg4-重鏈可變區(qū)骨架(frameworkregions，fr)上，獲得人源化hab21抗體。1)mab21抗體輕鏈的人源化通過(guò)氨基酸序列分析，確定人免疫球蛋白kappa輕鏈第一v區(qū)胚系基因的表達(dá)產(chǎn)物(igkv1-9，ncbigeneid:28941)與mab21輕鏈可變區(qū)具有最高同源性。據(jù)此，將mab21輕鏈骨架區(qū)(fr)用人igkv1-9的同源序列替換，然后將替換后的可變區(qū)基因與人免疫球蛋白igg-kappa輕鏈的恒定區(qū)編碼序列拼接，最后成功獲得人源化的輕鏈編碼基因(hab21-l)。其中人源化hab21抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列見(jiàn)seqidno.:11，其核苷酸序列為seqidno：13所示。圖6a為人源化hab21單抗輕鏈可變區(qū)與nivolumab單抗輕鏈可變區(qū)及mk3475單抗輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果:其中hab21單抗輕鏈可變區(qū)氨基酸序列中不同于nivolumab單抗或mk3475單抗之處均以“x”符號(hào)表示，各單抗輕鏈可變區(qū)的cdr1，cdr2及cdr3氨基酸序列則均以方框標(biāo)識(shí)。如圖6a所示，hab21單抗輕鏈可變區(qū)及cdr序列既不同于nivolumab單抗，也不同于mk3475單抗。2)mab21抗體重鏈的人源化通過(guò)氨基酸序列分析，確定人免疫球蛋白重鏈第三v區(qū)胚系基因的表達(dá)產(chǎn)物(ighv3-23，ncbigeneid:28442)與mab21抗體重鏈具有最高同源性。據(jù)此，將mab21重鏈骨架區(qū)(fr)用人ighv3-23的同源序列替換，同時(shí)為了降低人源化抗體與機(jī)體內(nèi)的免疫球蛋白-fc受體(fcr)結(jié)合及其介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity，adcc)對(duì)pd-1表達(dá)陽(yáng)性免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)的殺傷作用，特意將人源化的mab21抗體重鏈可變區(qū)基因與編碼人免疫球蛋白-igg4重鏈的恒定區(qū)序列拼接，并將igg4重鏈的恒定區(qū)中鉸鏈區(qū)(hingeregion)內(nèi)處于第228點(diǎn)位的氨基酸由原有的serline替換成proline(s228p)。經(jīng)此基因工程系列改造，最后成功獲得含人源化重鏈編碼可變區(qū)、人igg4-重鏈恒定區(qū)(s228p)的全長(zhǎng)hab21抗體重鏈。其中人源化hab21抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列見(jiàn)seqidno.:12，其核苷酸序列為seqidno：14所示。圖6b為人源化hab21單抗重鏈可變區(qū)與nivolumab單抗重鏈可變區(qū)及mk3475單抗重鏈可變區(qū)的氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果:其中hab21單抗重鏈可變區(qū)氨基酸序列中不同于nivolumab單抗或mk3475單抗之處均以“x”符號(hào)表示，各單抗重鏈可變區(qū)的cdr1，cdr2及cdr3氨基酸序列則均以方框標(biāo)識(shí)。如圖6b所示，hab21單抗的重鏈可變區(qū)及cdr序列既不同于nivolumab單抗，也不同于mk3475單抗。實(shí)施例9穩(wěn)定高效分泌表達(dá)人源化hab21抗體的cho細(xì)胞工程株的建立及抗體蛋白的分離純化將含人源化重鏈基因(hab21h)、人源化輕鏈基因(hab21l)分步克隆到pcdna3.1-hygro表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后擴(kuò)增分離獲得人源化hab21表達(dá)質(zhì)粒。其后將表達(dá)嵌合抗體cab21和人源化抗體hab21的重組質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染cho細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，吸取孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)上清，以pd-1蛋白為包被抗原，hrp酶標(biāo)記的goat-anti-human-igg為檢測(cè)二抗(購(gòu)自上海西塘生物公司)，opd為顯色底物，以直接elisa法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中抗體與人pd-1抗原結(jié)合的活性。下表2為該elisa代表性檢測(cè)結(jié)果。表2elisa分析瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清結(jié)合人pd-1蛋白活性如表2中結(jié)果所示：與人-鼠嵌合型cab21抗體一樣，人源化hab21抗體(igg4-kappa)保持與人pd-1蛋白結(jié)合的活性。上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)克隆篩選及無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)馴化后，成功獲得多個(gè)穩(wěn)定高效分泌表達(dá)人源化hab21抗體蛋白的cho細(xì)胞工程株(表達(dá)量達(dá)1g/l以上)。其后，從中選取一細(xì)胞工程株再經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基放大擴(kuò)增培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)上清液，上清液經(jīng)離心及0.45μm濾膜過(guò)濾后，上樣至包括含proteina親合層析柱(proteina-sepharosefastflow，美國(guó)通用電氣ge公司)、離子交換析柱、病毒去除/滅活、及過(guò)濾除菌(0.22μm濾膜過(guò)濾)在內(nèi)的多個(gè)分離純化步驟后，最終獲得高純度(蛋白純度達(dá)99％以上)的人源化hab21抗體。純化的hab21抗體再溶于無(wú)菌生理鹽水中(1-20mg/ml)，低溫(-20o以下)保存。實(shí)施例10elisa法檢測(cè)分析純化的hab21單抗與fcr受體蛋白結(jié)合采用直接elisa法檢測(cè)分析了純化獲得的hab21(igg4-kappa)單抗與包被在96-孔板上的重組fcr受體(如fcγrⅰ受體，cd64)蛋白的結(jié)合，其結(jié)果并與同類(lèi)igg4型單抗(nivolumab及mk3475單抗)及三種igg1型單抗(avastin、hpv19及eribitux)進(jìn)行比較。該elisa法檢測(cè)基本步驟如下：將對(duì)倍系列稀釋的含igg4型單抗(hab21、nivolumab及mk3475單抗)或igg1型單抗(avastin、hpv19及eribitux)樣品加入預(yù)包被有重組人fcγrⅰ受體蛋白(cd64，北京義翹神州公司產(chǎn)品))的96孔板中，經(jīng)37℃孵育2h及洗滌后，各孔再加入hrp-標(biāo)記的山羊抗人igg-fab抗體(sigma公司產(chǎn)品)，經(jīng)37℃孵育1h及洗滌后，各孔加入opd底物顯色。圖7為該elisa法檢測(cè)分析的代表性結(jié)果。結(jié)果顯示，與三種igg1型單抗(avastin、hpv19及eribitux)相比，三種igg4型單抗(hab21、nivolumab及mk3475)與fcγrⅰ受體(cd64)的結(jié)合活性明顯降低(下降達(dá)95％以上)，此結(jié)果也與預(yù)期的相符合。實(shí)施例11elisa法檢測(cè)分析mab21單抗與pd-1及免疫相關(guān)其他蛋白的結(jié)合采用直接elisa法比較分析了純化的hab21單抗，nivolumab及mk3475單抗與pd-1及其他相關(guān)蛋白的結(jié)合活性。該elisa法檢測(cè)基本步驟如下：將對(duì)倍系列稀釋的pd-單抗(hab21、nivolumab及mk3475單抗)或非相關(guān)單抗hpv19樣品分別加入預(yù)包被了重組pd1-fc或免疫相關(guān)其他基因-fc融合蛋白(包括cd28、b7、ctla4、cd3、pd-l1、pd-l2、btla等)96孔板中，經(jīng)37℃孵育2h及洗滌后，96孔板各孔再加入hrp-標(biāo)記的山羊抗人igg-fab抗體(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)，經(jīng)37℃孵育1h及洗滌后，各孔加入opd底物顯色。圖8為該elisa法檢測(cè)分析的代表性結(jié)果。結(jié)果顯示，與nivolumab及mk3475一樣，hab21單抗僅與人pd-1蛋白特異結(jié)合，與免疫相關(guān)其他蛋白如cd28,cd28、b7、ctla4、cd3、pd-l1、pd-l2、btla等都不結(jié)合。實(shí)施例12競(jìng)爭(zhēng)性elisa法對(duì)比分析mab21單抗、nivolumab及mk3475單抗與pd-1蛋白結(jié)合的位點(diǎn)為證明ab21單抗與pd-1蛋白結(jié)合的位點(diǎn)是否與nivolumab的結(jié)合位點(diǎn)或mk3475單抗的結(jié)合位點(diǎn)不同，本實(shí)施例中采用類(lèi)似實(shí)施例5的競(jìng)爭(zhēng)性elisa法對(duì)比分析了mab21單抗、nivolumab及mk3475單抗與pd-1蛋白結(jié)合的位點(diǎn)圖9a為競(jìng)爭(zhēng)elisa法檢測(cè)hab21單抗、nivolumab單抗(nivo)及mk3475單抗拮抗阻斷生物素標(biāo)記的mk3475單抗(biotin-mk3475)與包被在96-孔板上人pd-1蛋白結(jié)合的代表性結(jié)果。如圖9a所示，hab21單抗幾乎達(dá)到與mk3475單抗一樣的拮抗阻斷biotin-mk3475與pd-1蛋白結(jié)合的效果；而nivolumab拮抗阻斷biotin-mk3475與pd-1蛋白結(jié)合的效率在50％左右；非相關(guān)單抗hpv19無(wú)拮抗作用。圖9b為競(jìng)爭(zhēng)elisa法檢測(cè)hab21單抗、nivolumab單抗(nivo)及mk3475單抗拮抗阻斷生物素標(biāo)記的nivolumab單抗(biotin-nivolumab)與包被在96-孔板上人pd-1蛋白結(jié)合的代表性結(jié)果。如圖9b所示，hab21單抗幾乎也達(dá)到與nivolumab一樣的拮抗阻斷biotein-nivolumab與pd-1蛋白結(jié)合的效果；而mk3475拮抗阻斷biotein-nivolumab與pd-1蛋白結(jié)合的效率在70％左右；非相關(guān)單抗hpv19無(wú)作用。圖9c則為以該體外競(jìng)爭(zhēng)elisa法檢測(cè)hab21單抗、nivolumab單抗(nivo)、mk3475單抗、nivolumab單抗合并mk3475單抗(mk3475+nivo)拮抗阻斷生物素標(biāo)記的hab21單抗(biotin-hab21)與包被在96-孔板上人pd-1蛋白結(jié)合的代表性結(jié)果。如圖9c所示，nivolumab單抗或mk3475單抗均只部分阻斷biotin-hab21與pd-1蛋白結(jié)合(拮抗抑制率：nivolumab單抗為20％左右；mk3475單抗為50％左右)；此外，即使合并同時(shí)加入nivolumab單抗與mk3475單抗，其拮抗抑制biotin-hab21與pd-1蛋白結(jié)合效率也僅達(dá)到70％左右。綜合分析上述競(jìng)爭(zhēng)elisa結(jié)果可知：本發(fā)明中的hab21單抗，其結(jié)合人pd-1蛋白的位點(diǎn)(epitope)既顯著不同與nivolumab單抗，也顯著不同于mk3475單抗。實(shí)施例13流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析hab21單抗及nivolumab與表達(dá)人pd-1基因的cho細(xì)胞(cho/pd-1)結(jié)合在本實(shí)施例中，以hab21單抗或nivolumab單抗作為一抗，以fitc熒光標(biāo)記的羊抗人igg作為二抗，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析hab21單抗或nivolumab與表達(dá)人pd-1基因的cho細(xì)胞結(jié)合。為此，將穩(wěn)定表達(dá)人pd-1基因的cho細(xì)胞株(cho/pd-1)與普通cho細(xì)胞株以(1:2)比例混合后，等量分別溶于含不同溶度(0.003-10μg/ml)的hab21單抗或nivolumab單抗溶液中；4℃孵育1小時(shí)及經(jīng)pbs-0.1％fcs液洗滌后，加入fitc-標(biāo)記的羊抗人igg(sigma公司產(chǎn)品,1:200)，4℃孵育1小時(shí)；再經(jīng)pbs-0.1％fcs液洗滌后，將樣品至流式細(xì)胞儀檢測(cè)(cytomicsfc500mcl，美國(guó)beckmancoulter公司產(chǎn)品)。圖10a為nivolumab單抗的流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析代表性結(jié)果圖譜。如圖10a所示：溶度范圍為0.03-10μg/ml的nivolumab單抗均可與cho/pd-1細(xì)胞結(jié)合，結(jié)合的熒光強(qiáng)度(mfi)與nivolumab單抗溶度呈正相關(guān)。圖10b為hab21單抗的流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析代表性結(jié)果圖譜。如圖10b所示：溶度范圍為0.03-10μg/ml的hab21單抗也均可與(cho/pd-1)細(xì)胞結(jié)合，結(jié)合熒光強(qiáng)度(mfi)與hab21單抗溶度呈正相關(guān)。圖10c則為根據(jù)該流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果所作的平均熒光強(qiáng)度(mfi)與hab21單抗或nivolumab單抗的溶度曲線圖，如圖10c所示：hab21單抗組樣品與cho-pd-1細(xì)胞的結(jié)合熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于nivolumab單抗組樣品。實(shí)施例14流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析hab21單抗及nivolumab與pha激活的人jurkatt細(xì)胞株的結(jié)合在本實(shí)施例中，以hab21單抗或nivolumab作為一抗，以fitc熒光標(biāo)記的羊抗人igg作為二抗，用于檢測(cè)分析并比較hab21單抗或nivolumab與pha激活的人jurkatt細(xì)胞株的結(jié)合。為此，先將人jurkatt細(xì)胞株(購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞保藏中心)置于含濃度為3μg/ml的淋巴細(xì)胞活化因子-植物血凝素pha(phytohaemagglutinin，美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)的rpmi-10％fcs培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以激活jurkatt細(xì)胞及誘導(dǎo)pd-1蛋白的表達(dá)。pha激活誘導(dǎo)24-48小時(shí)后，細(xì)胞經(jīng)離心分離后重溶于含不同溶度(0.1-3μg/ml)的hab21單抗或nivolumab單抗樣品溶液中，同時(shí)以含終溶度為1μg/ml的人igg作為陰性對(duì)照樣品；4℃孵育1小時(shí)及經(jīng)pbs-0.1％fcs液洗滌后，加入fitc-標(biāo)記的羊抗人igg(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品,1:200)；4℃孵育1小時(shí)及再經(jīng)pbs-0.1％fcs液洗滌后，將樣品至流式細(xì)胞儀檢測(cè)(cytomicsfc500mcl，美國(guó)beckmancoulter公司)。圖11為hab21單抗(right)及nivolumab(left)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果圖譜。如圖所示：與陰性對(duì)照igg樣品相比，在1-3μg/ml溶度范圍，hab21單抗及nivolumab均可檢測(cè)到與pha激活的jurkat細(xì)胞結(jié)合；而在更低溶度范圍下(0.1-0.3μg/ml)還可以檢測(cè)hab21單抗與jurkat細(xì)胞結(jié)合，而nivolumab單抗與jurkat細(xì)胞結(jié)合不明顯。實(shí)施例15流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析hab21單抗及nivolumab與pha激活的人外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，pbmcs)結(jié)合在本實(shí)施例中，以hab21單抗或nivolumab為一抗，fitc熒光標(biāo)記的羊抗人igg作為二抗，用于檢測(cè)分析并比較hab21單抗或nivolumab與pha激活的來(lái)源于人外周血的單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，pbmcs)結(jié)合。為此，先將來(lái)源于健康志愿者外周全血經(jīng)加入一定體積的ficol液體，經(jīng)常溫離心后，分離其中的單核細(xì)胞，再溶于含終濃度為3μg/ml的淋巴細(xì)胞活化因子-植物血凝素pha(phytohaemagglutinin，美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)的rpmi-10％fcs培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以激活淋巴細(xì)胞與誘導(dǎo)pd-1蛋白的表達(dá)。pha激活誘導(dǎo)48-72小時(shí)后，細(xì)胞經(jīng)離心分離后重溶于含不同溶度(0.015-4μg/ml)的hab21單抗或nivolumab，同時(shí)以含終溶度為1μg/ml的人igg樣品(作為陰性對(duì)照)；4℃孵育1小時(shí)及經(jīng)pbs-0.1％fcs液洗滌后，加入fitc-標(biāo)記的羊抗人igg(sigma公司產(chǎn)品,1:200)；4℃孵育1小時(shí)及再經(jīng)pbs-0.1％fcs液洗滌后，將樣品至cytomicsfc500mcl流式細(xì)胞儀檢測(cè)(美國(guó)beckmancoulter公司)。圖12為hab21單抗(right)及nivolumab單抗(left)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果圖譜。如圖12所示：與陰性對(duì)照igg樣品相比，在0.25-4.0μg/ml溶度范圍，hab21單抗及nivolumab單抗均可檢測(cè)到與pha激活的人pbmc細(xì)胞結(jié)合。實(shí)施例16pd-1人源化小鼠體內(nèi)測(cè)試hab21的抗腫瘤療效由于hab21單抗不識(shí)別小鼠pd-1，故無(wú)法在一般的普通小鼠體內(nèi)直接測(cè)試hab21單抗的療效。為此，在本實(shí)施例中，特別選用經(jīng)基因工程改造過(guò)的pd-1人源化小鼠進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試hab21單抗的抗腫瘤療效的系列研究。該動(dòng)物試驗(yàn)研究分兩階段，其中第一階段的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⒔o藥分組及試驗(yàn)結(jié)果描述如下：第一階段研究：動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ图敖o藥分組：將數(shù)量為1x106的來(lái)源于c57bl/6小鼠的mc38結(jié)腸癌細(xì)胞(上海南方模式生物科技股份有限公司提供)接種于基因背景同樣為c57bl/6的pd-1人源化純合子小鼠右側(cè)背部皮下(上海南方模式生物科技股份有限公司提供，該pd-1人源化小鼠是通過(guò)cas9方式利用基因同源重組，將人的pd-1基因替換到小鼠pd-1基因位置，從而表達(dá)人pd-1而非小鼠內(nèi)源pd-1蛋白)；待接種的腫瘤體積長(zhǎng)至約米粒大小(約40-50mm3，腫瘤細(xì)胞接種后第6-7天左右)時(shí)將動(dòng)物隨機(jī)分為以下3組：a：生理鹽水陰性對(duì)照組(n＝6，等體積生理鹽水)b：pembrolizumab(mk3475)單抗治療組(n＝6，給藥劑量10mg/kg體重)c：hab21單抗治療組(n＝6，給藥劑量10mg/kg體重)動(dòng)物自分組當(dāng)天起(即接種腫瘤后第6-7天)，每周腹腔注射(i.p.)給藥2次(每隔3-4天)，連續(xù)給藥4次(給藥共2周)。期間每天觀察動(dòng)物一般臨床癥狀，每隔3-4天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(mm)和短徑(mm)及動(dòng)物體重。腫瘤體積計(jì)算公式為：體積(mm3)＝長(zhǎng)徑(mm)x短徑(mm)x短徑(mm)x0.5。如測(cè)量時(shí)腫瘤體積超過(guò)4000mm3則對(duì)測(cè)試動(dòng)物實(shí)行安樂(lè)死(euthanized)。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果：圖13a為各組試驗(yàn)動(dòng)物腫瘤的平均增長(zhǎng)體積趨勢(shì)；圖13b為各組試驗(yàn)動(dòng)物平均體重增長(zhǎng)趨勢(shì)。圖14a，圖14b及圖14c則分別為各給藥組每只個(gè)體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤增長(zhǎng)體積趨勢(shì)圖。下表3-5則為各給藥組中每只動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)測(cè)量結(jié)果。table3:tumorvolume(mm3)inmicetreatedwithns-controlgroup(n＝6)*:numbersin()aredaysafterreceived1sttreatmenttable4:tumorvolume(mm3)inmicetreatedwithpembrolizumab(n＝6)*:numbersin()aredaysafterreceived1sttreatmenttable5:tumorvolume(mm3)inmicetreatedwithhab21mab(n＝6)*:numbersin()aredaysafterreceived1sttreatment結(jié)果如上表3-5，圖13a,圖14a，圖14b及圖14c所示：與生理鹽水陰性對(duì)照組相比，hab21單抗治療組或pembrolizumab治療組在給藥后5-8天后的腫瘤增長(zhǎng)即受到抑制。更驚奇的及令人鼓舞的是hab21單抗治療mc38結(jié)腸癌移植瘤的療效遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于pembrolizumab。hab21單抗治療組在僅給藥兩次后(即首次給藥后第8天)所有測(cè)試動(dòng)物(6/6)的腫瘤全部出現(xiàn)萎縮或徹底消失；在完成4次給藥(也是最后一次給藥)后停藥，腫瘤也無(wú)恢復(fù)生長(zhǎng)(該實(shí)驗(yàn)已觀察至腫瘤接種后第50天，即最后一次給藥后的第32天)；而pembrolizumab治療組僅有一只動(dòng)物(1/6)在給藥三次后(即首次給藥后第12天)腫瘤出現(xiàn)萎縮消失，其他各動(dòng)物在結(jié)束4次給藥治療后腫瘤均又都恢復(fù)生長(zhǎng)(另有一只動(dòng)物在首次給藥后的第15天發(fā)現(xiàn)死亡)，至腫瘤接種后第43天，這4只動(dòng)物均死亡或安樂(lè)死。圖13b為各組試驗(yàn)動(dòng)物的平均體重增長(zhǎng)趨勢(shì)。如圖13b所示，與生理鹽水陰性對(duì)照組相比，hab21單抗或pembrolizumab給藥后對(duì)測(cè)試動(dòng)物體重增長(zhǎng)無(wú)影響。第二階段研究：研究目的、動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ图胺纸M該第二階段研究的目的是評(píng)估上述經(jīng)hab21成功治療過(guò)的pd-1人源化小鼠，在不再繼續(xù)給藥的情況下是否還排斥重新接種的mc38腫瘤(初步驗(yàn)證是否有免疫記憶功能)。動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ图胺纸M試驗(yàn)分以下c和d兩組：c：試驗(yàn)組：上述6只接受過(guò)hab21單抗治療并都徹底排斥了mc38腫瘤的pd-1人源化小鼠，在腫瘤排斥后的大約20天后(即hab21單抗最后一次給藥后第10天)在小鼠另一側(cè)(左側(cè))皮下重新接種同數(shù)量的(1x106)mc38腫瘤細(xì)胞；d：對(duì)照組：同時(shí)選取5只普通c57bl/6小鼠(周齡6-8周)左側(cè)皮下接種同數(shù)量的(1x106)mc38腫瘤細(xì)胞。兩組動(dòng)物在研究期間均不接受任何給藥或治療。種瘤后第6天起每天觀察動(dòng)物一般臨床癥狀，每隔3-4天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(mm)和短徑(mm)及動(dòng)物體重。腫瘤體積計(jì)算公式為：體積(mm3)＝長(zhǎng)徑(mm)x短徑(mm)x短徑(mm)x0.5。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果：圖15為兩組試驗(yàn)動(dòng)物腫瘤的平均增長(zhǎng)體積趨勢(shì)。下表6則為各組中每只動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)測(cè)量結(jié)果。table6:mc38tumorgrowthvolume(mm3)inwild-typec57bl/6miceorinhumanizedpd-1micehavebeenpreviouslytreatedwithhab21mab●:numbersin()aredaysafter1stinoculationofmc38tumorinhumanizedpd-1mice結(jié)果如表6及圖15所示：普通c57bl/6小鼠組接種的mc38腫瘤增長(zhǎng)快速，而在hab21單抗治療過(guò)的pd-1人源化小鼠，再次接種的mc38腫瘤在觀察期間無(wú)增長(zhǎng)，且在接種后第8至第15天被徹底排斥。此結(jié)果初步表明hab21成功治療過(guò)的pd-1人源化小鼠具有免疫記憶，可在不再繼續(xù)給藥的情況下排斥重新接種的mc38腫瘤。實(shí)施例16普通c57bl/6小鼠體內(nèi)測(cè)試hab21的抗腫瘤活性研究目的：該研究目的是評(píng)估在不表達(dá)人pd-1基因的普通小鼠中，hab21單抗給藥后是否排斥腫瘤。動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ图胺纸M：選取普通c57bl/6小鼠(周齡6-8周)右側(cè)皮下接種1x106數(shù)量的mc38腫瘤細(xì)胞，待接種的腫瘤體積長(zhǎng)至約米粒大小(約40-50mm3，腫瘤細(xì)胞接種后第6天左右)時(shí)將動(dòng)物隨機(jī)分為以下2組：a：生理鹽水對(duì)照組(n＝6，等體積生理鹽水)b：hab21單抗治療組(n＝6，給藥劑量10mg/kg體重)動(dòng)物自分組當(dāng)天起(即接種腫瘤后第6天)，每周腹腔注射(i.p.)給藥2次(每隔3-4天)，連續(xù)給藥4次(給藥共2周)。期間每天觀察動(dòng)物一般臨床癥狀，每隔3-4天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(mm)和短徑(mm)及動(dòng)物體重。腫瘤體積計(jì)算公式為：體積(mm3)＝長(zhǎng)徑(mm)x短徑(mm)x短徑(mm)x0.5。試驗(yàn)結(jié)果：圖16為兩組試驗(yàn)動(dòng)物腫瘤的平均增長(zhǎng)體積趨勢(shì)。下表7則為各組中每只動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)測(cè)量結(jié)果。table7:mc38tumorgrowthvolume(mm3)inc57bl/6wtmice*:numbersin()aredaysafterreceived1sttreatment結(jié)果如上表7及圖16所示：hab21單抗治療組的mc38腫瘤體積增長(zhǎng)趨勢(shì)與生理鹽水對(duì)照組的增長(zhǎng)趨勢(shì)基本相同。此結(jié)果表明在不表達(dá)人pd-1基因的普通小鼠中，hab21單抗對(duì)腫瘤的增長(zhǎng)無(wú)明顯作用。實(shí)施例18hab21單抗在食蟹猴體內(nèi)的初步藥物代謝及毒理/安全性實(shí)驗(yàn)評(píng)估由于已知mab21單抗識(shí)別并結(jié)合食蟹猴的pd-1(見(jiàn)實(shí)施例3)，為此在本實(shí)施例中，選取在正常食蟹猴進(jìn)行靜脈輸注hab21單抗的初步藥代動(dòng)力學(xué)及毒理/安全性實(shí)驗(yàn)評(píng)估(委托昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司完成)。試驗(yàn)選用2只雄性食蟹猴，靜脈單次輸注劑量為10mg/kg體重的hab21單抗注射液，給藥后不同時(shí)間采集血清，用經(jīng)驗(yàn)證的elisa法檢測(cè)血清樣本hab21單克隆抗體注射液的含量。實(shí)驗(yàn)中2只食蟹猴單次靜脈輸注劑量為10mg/kg體重的hab21單抗注射液后動(dòng)物精神狀態(tài)、行為活動(dòng)等均未觀察到可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的異常表現(xiàn)。采用winnonlin非房式模型計(jì)算藥后各動(dòng)物hab21單克隆抗體主要代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)下表8及圖17：表8食蟹猴單次靜脈輸注hab21單抗的藥代學(xué)參數(shù)*表示動(dòng)物可能產(chǎn)生了抗藥抗體并且影響了血藥濃度檢測(cè)如表8及圖17所示：2只食蟹猴單次靜脈輸注給予10mg/kg的hab21單抗后，cmax非常相近，分別為234.06及247.22μg/ml；體內(nèi)半衰期(t1/2)分別402.56h及58.84h，2號(hào)動(dòng)物藥后第28天血藥濃度數(shù)值驟降，懷疑2號(hào)動(dòng)物藥后17天可能產(chǎn)生抗藥抗體，影響了血藥濃度檢測(cè)及其參數(shù)如t1/2。由于人類(lèi)免疫球蛋白的氨基酸序列與非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(如食蟹猴)抗體蛋白的不同，故食蟹猴在給予具免疫原性的人或人源化抗體藥物后而產(chǎn)生抗藥抗體(抗抗體)并不意外(vanmeerpj,etal.immunogenicityofmabsinnon-humanprimatesduringnonclinicalsafetyassessment.mabs2013；5:810–6)。實(shí)際上，bms公司的全人化nivolumab單抗藥物在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(食蟹猴)中進(jìn)行的非臨床研究中也發(fā)現(xiàn)1mg/kg劑量組6只動(dòng)物中的5只，10mg/kg劑量組3只動(dòng)物中的2只在給藥后第28天均檢測(cè)到抗-nivolumab抗體(包括中和抗體陽(yáng)性)，但抗抗體的出現(xiàn)對(duì)動(dòng)物沒(méi)有產(chǎn)生不利影響(wangcetal:cancerimmunolres.2014；2：1-11)。序列表<110>蘇州思坦維生物技術(shù)有限責(zé)任公司<120>拮抗抑制人pd-1抗原與其配體結(jié)合的單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用<130>hj17-13150<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>321<212>dna<213>小鼠(musmusculus)<400>1gacattgtgatgacccagtctcacaaattcatgtccacatcagtgggagacagggtcagc60atcacctgcaaggccagtcaggatgcgggttctgctgtagcctggtatcaacagaaacca120ggacaatctcctaaactactgatttactgggcatccactcggcacactggagtccctggt180cgcttcacaggcagtggatctgggacagacttcactctcaccattagcaatgtgcagtct240gaagacttgtcagattatttctgtcagcaatatagcagctatccgtggacgttcggtgga300ggcaccaagctggaaatcaag321<210>2<211>107<212>prt<213>小鼠(musmusculus)<400>2divmtqshkfmstsvgdrvsitckasqdagsavawyqqkpgqspklliywastrhtgvpg60rftgsgsgtdftltisnvqsedlsdyfcqqyssypwtfgggtkleik107<210>3<211>11<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>3kasqdagsava11<210>4<211>7<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>4wastrht7<210>5<211>9<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>5ssypwtfgg9<210>6<211>357<212>dna<213>小鼠(musmusculus)<400>6gaggtgcagctggtggagtctgggggagactttgtgaagcctggagggtccctgaaactc60tcctgtgcagcctctggattcactttcagtaggtatgatatgtcttgggttcgccagact120ccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggtggtcgttacacctactat180ccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtac240ctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatttatttctgtacaagtccctat300ggtaactacggaatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcc357<210>7<211>119<212>prt<213>小鼠(musmusculus)<400>7evqlvesggdfvkpggslklscaasgftfsrydmswvrqtpdkrlewvatisgggrytyy60pdsvkgrftisrdnakntlylqmsslksedtaiyfctspygnygmdywgqgtsvtvssa119<210>8<211>8<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>8gftfsryd8<210>9<211>10<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>9isgggrytyy10<210>10<211>9<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>10pygnygmdy9<210>11<211>107<212>prt<213>人工序列<400>11diqltqspsflsasvgdrvtitckasqdagsavawyqqkpgkapklliywastrhtgvps60rfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqyssypwtfgggtkleik107<210>12<211>119<212>prt<213>人工序列<400>12evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsrydmswvrqapgkglewvstisgggrytyy60pdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyyctspygnygmdywgqgtsvtvssa119<210>13<211>321<212>dna<213>人工序列<400>13gacatccagctgacccagtcccccagcttcctgtccgcttccgtgggcgacagggtgacc60atcacctgcaaggcctcccaggatgccggatccgctgtggcctggtaccagcagaagccc120ggcaaggcccctaagctgctgatctactgggcttccaccaggcacaccggcgtgccttcc180aggttttccggctccggctccggcacagagttcaccctgaccatctcctccctgcagccc240gaggacttcgccacctactactgccagcagtacagctcctacccttggaccttcggcggc300ggcaccaagctggagatcaag321<210>14<211>357<212>dna<213>人工序列<400>14gaggtgcagctggtggagtccggcggaggactggtgcaacctggcggaagcctgaggctg60tcctgtgccgcctccggcttcaccttctccaggtacgacatgtcctgggtgaggcaggct120cctggcaagggcctggagtgggtgtccaccatttccggcggcggcaggtacacctactac180cccgactccgtgaagggcaggttcaccatctccagggacaactccaagaacaccctgtac240ctgcagatgaactccctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcaccagcccctac300ggcaactacggcatggactactggggccagggcacctccgtgacagtgtcctccgct357當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12