本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)分子診斷及生物技術(shù)，涉及一種引物組合物及其組成的試劑盒和應(yīng)用，具體涉及一種檢測taz基因新突變c.622a>g的引物及探針。

背景技術(shù)：

肥厚型心肌病(hcm)為一種最常見的遺傳性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室或雙心室不對稱性肥厚，較少患者表現(xiàn)出左室流出道梗阻。主要病理特征為心肌細胞彌漫性肥大、畸形、核大、深染和心肌纖維紊亂等。hcm臨床表現(xiàn)從無征兆到呼吸困難、暈厥、胸痛甚至發(fā)生心源性猝死和致命性的心律失常。

hcm是第一個從遺傳角度闡明病因的遺傳性心臟疾病，是青少年及年輕運動員猝死的主要原因之一。1990年在一個加拿大家族性肥厚型心肌病患者中發(fā)現(xiàn)第一個致病基因myh7，其主要遵循的是常染色體顯性遺傳模式。但部分hcm患者也表現(xiàn)為常染色體隱性及性染色體遺傳，大約有50％的hcm患者為家族性遺傳，稱為家族性肥厚型心肌病(fhcm)。hcm的全球發(fā)病率和年死亡率分別約為1/500和1％。相關(guān)證據(jù)表明，zou等人隨機抽查中國9個省的成年人8080人，其中男性4064人，女性4016人，并對其進行超聲心動圖檢測，結(jié)果表明中國人群患hcm的概率大約為0.8/500。實際上，超聲心動圖對肥厚型心肌病的檢測為一種患病后的診斷方式，還存在更多潛在的hcm患者，依此推斷，中國人群中至少存在200萬hcm患者。該病也是是青少年和年輕運動員猝死的最主要原因之一，morn等人對1986-2006年猝死的1886名美國年輕運動員進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，死亡的主要原因為心血管疾病1056名，占約56％，其中hcm的患者就占據(jù)了36％。

眾多研究表明，hcm的致病基因除肌節(jié)基因外，還包括和能量代謝基因、離子通道基因、tafazzin(taz，genbank:ng_009634.1)基因及心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。其中taz基因高表達于心肌組織，除與hcm的發(fā)病相關(guān)外，還與擴張型心肌病和左心室發(fā)育不全有關(guān)。對hcm患者進行基因檢測和家族篩查能夠為臨床診斷提供重要的指導(dǎo)作用，主要體現(xiàn)為：1)產(chǎn)前診斷，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育；2)輔助明確診斷，進行臨床干預(yù)；3)家族篩查，進行家族疾病發(fā)生風(fēng)險評估及管理。

目前，遺傳疾病基因突變的檢測方法較多，如：限制性片段長度多太性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、高分辨率溶解曲線分析、熒光定量pcr的檢測方法、pcr擴增直接測序和高通量測序。上方法各有優(yōu)缺點，毛細管電泳技術(shù)是基因突變檢測的金標準，但因其對設(shè)備的要求高、價格昂貴等缺點，很難從實驗室普及到臨床，而熒光定量pcr具有快速、簡便、經(jīng)濟和準確等特點。

cn102965428a公開了一種檢測遺傳性心肌肥厚相關(guān)基因突變樣品制備試劑盒。該試劑盒采用探針捕獲測序，主要針對的是多個基因的多個變異位點，該方法耗時長，且價格十分昂貴。針對單個突變位點來說，實時熒光pcr檢測方法具有快速、簡便、經(jīng)濟和準確等特點。

值得一提的是taqman-mgb熒光定量pcr的檢測方法，該方法與傳統(tǒng)的taqman不同的是在探針的3’端連接了非熒光的猝滅基團mgb(minorgroovebinder，mgb)，當(dāng)探針序列與模板結(jié)合時，mgb能高度結(jié)合于dna雙鏈的小溝，增加了寡核苷酸探針和單鏈模板結(jié)合的穩(wěn)定性，由此通過縮短探針序列長度，增加探針序列的特異性，實現(xiàn)了能區(qū)分一個堿基的差別。當(dāng)具有5’-3’外切酶活性的dna聚合酶對堿基進行延伸時，可把發(fā)光基團解離下來，解除了非熒光的猝滅基團對發(fā)光基團的抑制，實現(xiàn)了熒光信號的積累與pcr產(chǎn)物的同步進行，從而能較好的區(qū)分野生型、純合突變和雜合突變樣本。taqman-mgb對單核苷酸多態(tài)性檢測方面有較多的應(yīng)用，如：慢性骨髓增殖性疾病、病原微生物的耐藥突變檢測和腫瘤細胞p⁵³基因突變等。

cn104388595a公開了一種豬圓環(huán)病毒2型實時熒光定量pcrmgb-taqman探針檢測方法，該方法利用熒光定量pcr技術(shù)，采用mgb探針，建立了豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)檢測方法。但目前mgb探針還未用于hcm的檢測。

因此，為肥厚型心肌病建立一種簡便、快速、經(jīng)濟和準確的突變篩查方法，為肥厚型心肌病的預(yù)防、輔助臨床診斷和預(yù)后評估提供技術(shù)平臺顯得尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足及實際的需求，本發(fā)明提供了一種引物組合物及其組成的試劑盒和應(yīng)用，本發(fā)明通過所述引物可以構(gòu)建陽性野生型taz-c.622a和純合突變型taz-c.622g的載體，應(yīng)用abi7500實時熒光pcr儀，以陽性載體為參照，建立一種簡便、快速、準確和經(jīng)濟的肥厚型心肌病taz基因c.622a>g突變檢測方法，為肥厚型心肌病的臨床早期診斷和預(yù)防提供了新的技術(shù)平臺。

為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種引物及探針序列，所述序列能檢測新突變位點taz-c.622a>g的實時熒光pcr引物和taqman-mgb探針序列。

優(yōu)選地，所述檢測taz-c.622a>g新突變位點的實時熒光pcr引物的核酸序列如seqidno.1-2所示，所述taqman-mgb探針的核酸序列如seqidno.3-4所示；

具體的序列如下所示：

優(yōu)選地，所述taqman-mgb探針的核酸序列5’端標記有發(fā)光的報告熒光基團，3’端標記有不發(fā)光的淬滅基團mgb。

優(yōu)選地，所述發(fā)光的報告熒光基團為fam和hex。

優(yōu)選地，所述不發(fā)光的淬滅基團為mgb小分子化合物。

第二方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包括如第一方面所述的實時熒光pcr引物和taqman-mgb探針序列。

第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的引物及探針或如第二方面所述的試劑盒用于肥厚型心肌病相關(guān)致病taz基因新突變c.622a>g的檢測。

第四方面，本發(fā)明提供一種肥厚型心肌病相關(guān)致病taz基因新突變c.622a>g的檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組；

(2)以步驟(1)的基因組為模板，進行pcr擴增，構(gòu)建野生型、純合突變型及雜合突變型陽性質(zhì)控品；

(3)將步驟(2)得到的陽性質(zhì)控品采用如第一方面所述的引物組合物進行實時熒光pcr檢測。

優(yōu)選地，步驟(1)所述的基因組來自于人的外周血、心肌組織、淋巴器官、脾臟、骨髓或肝臟中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，步驟(2)所述的pcr擴增的引物的核酸序列如seqidno.5-6所示，所述pcr擴增的引物的核酸序列如下：

優(yōu)選地，步驟(2)所述的pcr擴增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共45個循環(huán)；72℃延伸5分鐘；

優(yōu)選地，構(gòu)建陽性質(zhì)控品的具體步驟如下：將pcr擴增產(chǎn)物進行純化，將純化后的片段克隆到pmd-18t載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌jm109，挑選單克隆，測序驗證野生型及純合突變型陽性質(zhì)粒，將野生型和純合突變型陽性質(zhì)粒按摩爾比1:1混合后即得到雜合突變型陽性質(zhì)控品。

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實時熒光pcr的條件中檢測taz-c.622a>g新突變位點的反應(yīng)體系為：pcr擴增反應(yīng)混合酶5μl，50×的rox校正染料0.1μl，上下游引物各0.3μl，taqman-mgb探針seqidno.30.5μl，taqman-mgb探針seqidno.40.5μl，基因組0.5μl和純凈水為2.8μl。

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實時熒光pcr條件中檢測taz-c.622a>g新突變位點的pcr反應(yīng)條件為循環(huán)外95℃預(yù)變性30s，循環(huán)內(nèi)95℃變性5s、58℃退火及延伸34s、45個循環(huán)，循環(huán)外60℃延伸1min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明一次可檢測多個病例樣本，具有簡便、快速、準確和經(jīng)濟等特點，為肥厚型心肌病的臨床早期分子診斷和預(yù)防建立了新的方法；

(2)本發(fā)明方法可用于產(chǎn)前診斷，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育，輔助明確診斷，進行臨床干預(yù)，家族篩查，進行家族疾病發(fā)生風(fēng)險評估及管理；

(3)本發(fā)明的方法方便快捷，成本低，利用96孔pcr反應(yīng)管可一次性檢測多個樣本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明陽性質(zhì)控品taz，c.622a>g菌液pcr瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為本發(fā)明陽性質(zhì)控品tnni3，c.622a毛細管電泳檢測；

圖3為本發(fā)明陽性質(zhì)控品tnni3,c.622g毛細管電泳檢測；

圖4為taz，622aa基因型的taqman-mgb的靈敏性檢驗的擴增曲線；

圖5為taz，622aa基因型的taqman-mgb的靈敏性檢驗的標準曲線；

圖6為taz，622gg基因型的taqman-mgb的靈敏性檢驗的擴增曲線；

圖7為taz，622gg基因型的taqman-mgb的靈敏性檢驗的擴增曲線；

圖8為以野生型為模板的新變異位點taz，c.622a>g的taqman-mgb特異性檢測的擴增曲線，其中，fam代表野生型探針，hex代表突變型探針，；

圖9為以純合突變型為模板的新變異位點taz，c.622a>g的taqman-mgb特異性檢測的擴增曲線，其中，fam代表野生型探針，hex代表突變型探針；

圖10為以雜合突變型為模板的新變異位點taz，c.622a>g的taqman-mgb特異性檢測的擴增曲線，其中，fam代表野生型探針，hex代表突變型探針；

圖11為以不同基因型為模板的新變異位點taz，c.622a>g的taqman-mgb特異性檢測的散點圖分布，其中，fam代表野生型探針，hex代表突變型探針；

圖12為對72例已知基因型的肥厚型心肌病患者進行taz，c.622a>g突變位點實時熒光檢測的基因分型散點圖。

具體實施方式

為更進一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內(nèi)。

實施例1

應(yīng)用本發(fā)明方法對參照2011年美國心臟病協(xié)會肥厚型心肌病診斷指南，在云南省第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科臨床確診的1例家族性肥厚型心肌病先證者(患者簽訂知情同意書，且通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準)外周血基因組進行實時熒光pcr的突變篩查，尋找可能的與hcm發(fā)病相關(guān)的致病性變異位點。

一種肥厚型心肌病相關(guān)致病基因taz，c.622a>g突變的檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組：對入選臨床確診的家族性肥厚型心肌病1例先證者，抽取其外周靜脈血1ml，edta抗凝后，采用商業(yè)化的小量基因組提取試劑盒(axygen,美國)提取其全基因組后，進行瓊脂糖凝膠電泳后、對濃度和od值進行測定，od260/280為1.8-2.0之間為可用；

(2)以步驟(1)的基因組為模板，進行pcr擴增：

其中，步驟(2)所述的pcr擴增的引物的核酸序列如seqidno.5和6所示，具體如下：

，pcr擴增的反應(yīng)條件如下：

，pcr擴增反應(yīng)完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示，顯示目的片段大小與預(yù)期大小一致，并對其進行純化；

(3)pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠dna純化試劑盒純化后，用pmd-18t載體進行t-a克隆后，篩選出陽性克隆菌株，提取其質(zhì)粒載體。

(4)利用abi3130毛細管電泳儀對含有克隆目的片段后的質(zhì)粒載體進行毛細管電泳，其檢測反應(yīng)體系為：模板dna1μl，引物(3.2pmol/ul)0.5μl，bigdye染料(2.5x)8μl，純凈水10.5μl；

(5)克隆載體毛細管電泳pcr反應(yīng)條件如下

(6)以靶基因taz(genbank:ng_009634.1)的基因序列為模板，利用bioedit序列分析軟件對變位點進行分析。

結(jié)果如圖2和3的測序結(jié)果可以看出，成功構(gòu)建野生型和突變型的陽性質(zhì)控品。

實施例2

應(yīng)用本發(fā)明方法對參照2011年美國心臟病協(xié)會肥厚型心肌病診斷指南，在云南省第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科臨床確診的1例家族性肥厚型心肌病先證者(患者簽訂知情同意書，且通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準)外周血基因組進行實時熒光pcr的突變篩查，尋找可能的與hcm發(fā)病相關(guān)的致病性變異位點。

一種肥厚型心肌病相關(guān)致病基因熱點突變的檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組：對入選臨床確診的家族性肥厚型心肌病1例先證者，抽取其外周靜脈血1ml，edta抗凝后，采用商業(yè)化的小量基因組提取試劑盒(axygen,美國)提取其全基因組后，進行瓊脂糖凝膠電泳后、對濃度和od值進行測定，od260/280為1.8-2.0之間為可用；

(2)以步驟(1)的基因組為模板，進行pcr擴增，構(gòu)建野生型、純合突變及雜合突變陽性質(zhì)控品；

其中，步驟(2)所述的pcr擴增的引物的核酸序列如seqidno.5和6所示，具體如下：

，pcr擴增的反應(yīng)條件如下：

，pcr擴增反應(yīng)完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示，顯示目的片段大小與預(yù)期大小一致；

構(gòu)建野生型、純合突變及雜合突變陽性質(zhì)控品的具體步驟如下：將純化后的片段克隆到pmd-18t載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌jm109，挑選單克隆，測序驗證野生型和純合突變型陽性質(zhì)粒，將野生型和純合突變型陽性質(zhì)粒按摩爾比1:1混合后即得到雜合突變型陽性質(zhì)控品；

(3)將步驟(2)得到的陽性質(zhì)控品采用所述的引物組合物進行實時熒光pcr檢測，所述引物及探針序列如下：

具體反應(yīng)體系如下：

分別把taz基因c.622a>g野生型和突變型模板進行10倍梯度稀釋，利用abi7500實時熒光pcr儀對引物探針的靈敏性進行檢驗，具體條件如下：

結(jié)果如圖4-7的擴增曲線和標準曲線所示，隨著模板起始拷貝數(shù)的降低，ct值開始相應(yīng)增加，標準曲線的線性關(guān)系較好(r²>0.98)，以上結(jié)果說明了引物探針具有較好的靈敏性。

實施例3

經(jīng)條件優(yōu)化，步驟(4)所述的引物-探針的序列的重復(fù)性驗證，分別進行3次重復(fù)試驗(批間和批內(nèi)重復(fù))。觀察模板的ct值，并計算其變異系數(shù)，變異系數(shù)(p)＝標準偏差(sd)/平均數(shù)(x)，測試檢測方法的靈敏性和重復(fù)性。

批間和批內(nèi)重復(fù)結(jié)果分別如表1-表2所示：

表1

表2

從表1-表2可見，批間和批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)均小于2％，具有較好的批間和批內(nèi)重復(fù)性。

實施例4

經(jīng)條件優(yōu)化，步驟(4)所述的引物-探針的序列的特異性驗證。

特異性驗證以變異位點taz，c.622a>g的野生型、純合突變型和雜合突變型的陽性質(zhì)粒為模板，同時加入雙標記探針，按照優(yōu)化好的條件對其進行taqman-mgb的特異性實驗驗證，結(jié)果如圖8-11所示。

結(jié)果顯示，圖8中的野生型樣本反應(yīng)的曲線表現(xiàn)為野生型探針產(chǎn)生的熒光信號增高，而純合突變無熒光信號或僅有很低的熒光信號；圖9中的純合突變表現(xiàn)為只有突變型探針產(chǎn)生熒光信號；圖10中的雜合突變樣本能使野生型和突變型探針都表現(xiàn)出相對較高的熒光信號；更重要的是，圖11所示，通過反應(yīng)結(jié)果的散點圖可以明顯看出不同基因型的樣本單獨成簇。

實施例5

本發(fā)明中，對來自于已知(sanger測序)基因型的72例肥厚型心肌病患者(患者知情同意，且得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準)進行taz，c.622a>g突變檢測。圖12為檢測變異位點的基因分型散點圖，aa基因型為64例，ag基因型為6例，gg基因型為2例，檢測結(jié)果與sanger測序結(jié)果一致，準確率為100％。

綜上所述，由實施例的結(jié)果分析可得出，本發(fā)明建立了肥厚型心肌病致病基因taz新突變位點c.622a>g的簡便、快速、準確和經(jīng)濟的遺傳篩查方法。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>昆明理工大學(xué)

<120>一種引物組合物及其組成的試劑盒和應(yīng)用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>1

cgcctgattgctgagtgtcat21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>2

gacgtcattcattcctgcagc21

<210>3

<211>14

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>3

tcaaccccatcatc14

<210>4

<211>14

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>4

tcaaccccgtcatc14

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>5

gtagatgggcgtgtttgtagcg22

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工合成序列

<400>6

taatgtctcggtgccaggaagtc23