本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種原發(fā)性高甘油三酯血癥易感基因angptl8基因rs577224723位點(diǎn)的基因變異，本發(fā)明還涉及該變異位點(diǎn)的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

高脂血癥(hyperlipoidemia)又稱血脂異常，是以血漿中甘油三脂(tg)和/或總膽固醇(tc)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)水平增高和高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)水平降低為特征的一種代謝紊亂性疾病，是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、缺血性腦卒中、胰島素抵抗、脂肪肝等多種疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。2016年發(fā)布的中國成人血脂異常防治指南指出，近30年來，隨著人民生活水平提高、飲食習(xí)慣改變，居民的血脂水平逐步升高，血脂異?；疾÷拭黠@增加，而且還有逐漸上升的趨勢(shì)。調(diào)查顯示，中國成人血脂異?？傮w患病率高達(dá)40.40％，兒童和青少年高脂血癥患病率也有明顯升高，預(yù)示著未來我國成人血脂異常及相關(guān)疾病負(fù)擔(dān)將繼續(xù)加重。

高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia，htg)是一種復(fù)合的代謝綜合征，作為血脂異常的一種，與多種疾病具有相關(guān)性。前瞻性流行病學(xué)和tg相關(guān)的通路研究報(bào)道tg濃度與冠心病顯著相關(guān)。高甘油三酯血癥可分為原發(fā)性高甘油三酯血癥和繼發(fā)性高甘油三酯血癥兩種類型。原發(fā)性高甘油三酯血癥多與遺傳有關(guān)，是由于單基因或多基因缺陷或突變，使參與脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝的受體、酶或載脂蛋白異常所致，具有家族聚集性，也有少數(shù)是由于環(huán)境因素或不良生活方式(飲食、營養(yǎng)、藥物)等造成的。最近的全基因組關(guān)聯(lián)分析(gwas)已經(jīng)確定了多種與tg濃度相關(guān)的基因。然而，在這些基因中遺傳的因素僅僅能夠解釋不到10％的tg在人群中的變化，這也說明了可能存在其他的未知因素影響tg的變化。

繼發(fā)性高甘油三酯血癥是指由于其他疾病所引起的血脂異常，可引起血脂異常的疾病主要有肥胖、高血壓、糖尿病、腎病綜合征、甲狀腺功能減退癥、腎功能衰竭、肝臟疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖原累積癥、骨髓瘤、脂肪萎縮癥、急性卟啉病、多囊卵巢綜合征等，此外，某些藥物如利尿劑、非選擇性β-受體阻滯劑、糖皮質(zhì)激素等也可引起繼發(fā)性高甘油三酯血癥。

血管生成素樣蛋白8(angiopoietin-likeprotein8，angptl8)是近年來發(fā)現(xiàn)的angptls家族成員，是一種與脂類代謝相關(guān)的分泌性蛋白因子，與angptls家族的angptl3、angptl4蛋白的n端具有同源性。研究表明，angptl8蛋白可通過影響脂蛋白脂酶(lpl)和甘油三酯酯酶(atgl)來影響tg代謝，其功能異常將導(dǎo)致人體脂代謝紊亂，并引起高甘油三酯血癥。研究證實(shí)，編碼該蛋白的angptl8基因位于染色體19p13.2上，與ldl-r相鄰，并嵌入dock6中。

國外進(jìn)行的多項(xiàng)研究表明，angptl8基因變異可導(dǎo)致血漿tg水平降低，hdl-c水平改變，ldl-c水平降低。2010年一項(xiàng)對(duì)之前46項(xiàng)總?cè)藬?shù)大于10萬人的歐洲人群脂質(zhì)相關(guān)的gwas(全基因組關(guān)聯(lián)分析)研究的mate分析結(jié)果表明，rs737337位于angptl8翻譯起始位點(diǎn)上游，其變異與hdl-c水平變化相關(guān)；2012年的一項(xiàng)在非裔美洲人和西班牙人群gwas研究表明，angptl8低頻突變r(jià)s2278426,c.194c>t，血漿hdl-c和ldl-c水平降低；2013年一項(xiàng)墨西哥人群(n＝4361)gwas研究表明，angptl8突變r(jià)s2278426,c.194c>t，血漿hdl-c和ldl-c水平降低；2014年一項(xiàng)56538例的歐洲和非洲人群(歐洲42208例和非洲14330例)gwas研究表明，angptl8突變r(jià)s145464906，c.361c>t，血漿tg水平降低，hdl-c水平升高。但是，上述研究的對(duì)象均為歐洲、美洲和非洲人群，截至目前，針對(duì)亞洲尤其是針對(duì)中國人群的angptl8基因變異位點(diǎn)相關(guān)研究仍非常缺乏，鑒于不同人種間相同基因中發(fā)生單一核苷酸變異的位點(diǎn)往往具有一定差異，因此，很有必要對(duì)中國人群的angptl8基因變異位點(diǎn)進(jìn)行深入研究，力爭(zhēng)尋找到相關(guān)位點(diǎn)并建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，并推廣應(yīng)用于國人原發(fā)性高甘油三酯血癥易感人群的篩查、預(yù)防和早期診斷和治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一個(gè)針對(duì)中國人群的原發(fā)性高甘油三酯血癥易感基因angptl8的變異位點(diǎn)，所述位點(diǎn)為位于angptl8基因5’端非編碼區(qū)中chromosome19-nc_000019.9區(qū)域11350305位點(diǎn)，其脫氧核糖核酸(dna)序列編號(hào)為rs577224723，所述位點(diǎn)的位置在seqidno:1所示的序列中。

angptl8基因詳細(xì)序列可參見登錄號(hào)：ng-031953.1，該基因5’端非編碼區(qū)rs577224723位點(diǎn)的核苷酸序列可參見網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

本發(fā)明人對(duì)angptl8基因的5’端非編碼區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序。

本發(fā)明旨在提供一種檢測(cè)上述原發(fā)性高甘油三酯血癥易感基因angptl8變異位點(diǎn)的方法。

本發(fā)明還提供了一種通過對(duì)易感基因的檢測(cè)來預(yù)測(cè)原發(fā)性高甘油三酯血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，即檢測(cè)angptl8基因5’端非編碼區(qū)rs577224723位點(diǎn)的基因型。該基因5’端非編碼區(qū)rs577224723位點(diǎn)發(fā)生c/a變異的基因型個(gè)體其原發(fā)性高甘油三酯血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于普通人群。

上述方法的具體步驟包括：(a)抽提樣品的基因組dna，擴(kuò)增獲得angptl8基因5’端非編碼區(qū)；(b)通過特異性引物擴(kuò)增獲得該基因包含5’端非編碼區(qū)rs577224723位點(diǎn)的區(qū)域，所述特異性引物序列如seqidno:2-3所示，擴(kuò)增產(chǎn)物為seqidno:4；(c)檢測(cè)步驟；(d)產(chǎn)物中基因變異位點(diǎn)rs577224723位點(diǎn)的基因型分析。

上述方法中涉及的抽提基因組dna、測(cè)序、擴(kuò)增等技術(shù)均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作方法。

本發(fā)明還涉及了angptl8基因rs577224723位點(diǎn)基因變異檢測(cè)在預(yù)測(cè)原發(fā)性高甘油三酯血癥試劑盒和原發(fā)性高甘油三酯血癥診斷及治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)原發(fā)性高甘油三酯血癥易感基因變異位點(diǎn)的試劑盒，其中包含擴(kuò)增angptl8基因rs577224723位點(diǎn)區(qū)域的特異性引物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，擴(kuò)增angptl8基因rs577224723位點(diǎn)區(qū)域的特異性引物序列如seqidno:2-3所示。

本發(fā)明通過深入研究，首次證明了angptl8基因變異位點(diǎn)rs577224723與高甘油三酯血癥的發(fā)生密切相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)了該變異位點(diǎn)新的預(yù)測(cè)功能：angptl8基因rs577224723位點(diǎn)c/a基因型的改變將導(dǎo)致高甘油三酯血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。其中相關(guān)性研究結(jié)果顯示，該基因的rs577224723位點(diǎn)在病例組中基因型主要變異為a，而在正常對(duì)照組中該基因型無變異，主要表現(xiàn)為c，該位點(diǎn)變異通過改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮生理作用。

本發(fā)明提供了一種高甘油三酯血癥易感性判斷方法，包括以下步驟：檢測(cè)受試個(gè)體的angptl8基因5’非編碼區(qū)rs577224723位點(diǎn)的基因型，根據(jù)該基因型變異與否判斷該個(gè)體患高甘油三酯血癥風(fēng)險(xiǎn)是否高于普通人群。

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品是否存在angptl8基因rs577224723位點(diǎn)變異的方法，包括以下步驟：(a)用angptl8基因5’端非編碼區(qū)特異性引物擴(kuò)增樣品的基因組dna，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中rs577224723位點(diǎn)的基因型。

上述angptl8基因5’端非編碼區(qū)rs577224723位點(diǎn)的基因型可用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)如southern印跡法、dna序列分析、pcr和原位雜交法等檢測(cè)突變。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并公開了一個(gè)與中國人群原發(fā)性高甘油三酯血癥易感性相關(guān)的angptl8基因新的變異位點(diǎn)，并提供了一種檢測(cè)原發(fā)性高甘油三酯血癥易感基因angptl8基因5’端非編碼區(qū)rs577224723位點(diǎn)變異的方法，包括檢測(cè)該位點(diǎn)的基因型。此外，本發(fā)明還公開了angptl8基因rs577224723位點(diǎn)基因變異檢測(cè)在預(yù)測(cè)原發(fā)性高甘油三酯血癥試劑盒和原發(fā)性高甘油三酯血癥診斷及治療藥物中的用途，并提供了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒中包含擴(kuò)增angptl8基因5’端非編碼區(qū)和擴(kuò)增rs577224723位點(diǎn)區(qū)域的特異性引物。本發(fā)明在一定程度上補(bǔ)充了國人原發(fā)性高甘油三酯血癥易感基因信息的缺乏，有利于原發(fā)性高甘油三酯血癥的早期篩查和診斷。同時(shí)，本發(fā)明變異位點(diǎn)基因型檢測(cè)方法及試劑盒操作簡便、快速高效、廉價(jià)經(jīng)濟(jì)、易于推廣，從而為原發(fā)性高甘油三酯血癥患病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)提供了簡捷的新途徑，有助于高甘油三酯血癥及相關(guān)心腦血管疾病的預(yù)防和治療。

附圖說明

圖1是利用本發(fā)明引物通過pcr擴(kuò)增后所得產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果截圖。顯示了rs577224723的一種變異基因型的測(cè)序結(jié)果，rs577224723位點(diǎn)位于angptl8基因5’端非編碼區(qū)中(chromosome19-nc_000019.9區(qū)域的11350305位點(diǎn))。其中a圖為正常對(duì)照組正向測(cè)序圖，b圖為原發(fā)性高甘油三酯血癥患者組正向測(cè)序圖。從圖中可以看出，正常對(duì)照組的c堿基在原發(fā)性高甘油三酯組中變異為a堿基。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.sambrook等著，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照實(shí)驗(yàn)器材制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1原發(fā)性高甘油三酯血癥相關(guān)基因篩查

研究對(duì)象：嚴(yán)格按照極端原發(fā)性高甘油三酯血癥的入組和排除標(biāo)準(zhǔn)入選病例和對(duì)照組各100例；收集相應(yīng)的臨床資料信息(基本信息，生化指標(biāo)，病史)及靜脈血4ml；dta抗凝管收取，暫時(shí)4℃保存。分離白細(xì)胞：將盛有血液的抗凝管放入離心管中，3000r/min離心10min，可見血液分為三層：下層為紅細(xì)胞，中間層為白細(xì)胞，上層為血漿，分離外周血白細(xì)胞，1.5mlep管中存放，然后置于-80℃保存。

一、提取外周血dna、測(cè)定濃度和純度

使用qiaampdnaminikit(購自qiagen,hilden,germany)，提取外周血基因組dna。

實(shí)驗(yàn)試劑：

無水乙醇(分析純)西隴化工股份有限公司

qiaampdnaminikitqiagen,hilden,germany

實(shí)驗(yàn)儀器：

提取方法：

取全血200μl，按照qiaampdnaminikit基因組抽提試劑盒說明書，提取基因組dna，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、用移液槍吸20μl蛋白酶放在1.5mlep管中，加入200μl血樣；

2、加入200μlbufferal至樣品，震蕩15s；

3、56℃金屬浴加熱10min；

4、加入200μl乙醇(96-100％)，震蕩混勻15s；

5、混合物加入吸附柱管中，8000rpm離心1min，把柱子放到新管子中，棄濾液；

6、加入500μlbufferaw1于吸附柱中，8000rpm離心1min，把柱子放到新管子中，棄濾液；

7、加入500μlbufferaw2，8000rpm離心1min，把柱子放到新管子中，棄濾液；

8、在離心管中加入500μl無水乙醇，8000rpm離心1min，棄濾液；

9、12000rpm空轉(zhuǎn)3min；

10、把吸附柱放在干凈的離心管中，開蓋室溫靜置5min，加入50μlbufferae，扣蓋室溫中靜置5min，12000rpm離心1min。

dna濃度及純度測(cè)定：

按照nanodrop2000儀器使用說明書檢測(cè)基因組dna濃度及純度。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、打開測(cè)定軟件；

2、加1.5μl蒸餾水至測(cè)量孔，放下檢測(cè)臂，然后抬起來用濾紙將測(cè)量孔和檢測(cè)臂的水擦干；

3、用移液槍吸取1.5μlbufferae至測(cè)量孔，放下檢測(cè)臂，點(diǎn)擊blank做空白對(duì)照；

4、抬起檢測(cè)臂，用濾紙將測(cè)量孔和檢測(cè)臂的水擦干，吸取1.5μl樣本至測(cè)量孔，放下檢測(cè)臂，點(diǎn)擊measure測(cè)量，記錄od260、od280值。dna樣本的濃度(μg/ml)＝od260*50；純度值od260/od280＞2.0，表明有rna污染；純度值od260/od280＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、有機(jī)溶劑等污染。

二、運(yùn)用sanger測(cè)序法對(duì)angptl8基因上的變異位點(diǎn)rs577224723進(jìn)行檢測(cè)主要試劑和儀器：

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、運(yùn)用pcr擴(kuò)增含目的位點(diǎn)的基因片段

引物序列：

正向引物：5’－ggatggttggttaccctagacac－3’

反向引物：5’－gacattcgcctgatgcaactatc－3’

2、pcr反應(yīng)體系

3、pcr反應(yīng)條件如下：

95℃10min預(yù)變性；

95℃30s變性—60℃30s退火—72℃30s延伸，共35個(gè)循環(huán)；

72℃10min延伸；4℃保存。

4、瓊脂糖凝膠電泳

取瓊脂糖1.8g，倒入三角燒杯，加入1xtbe緩沖液，定容至60ml，微波爐加熱溶解；2min后取出燒杯，加入eb溶液2μl，混勻，倒入固定有塑料齒梳的凝膠槽；30min后取出梳子和隔板，將成型的膠放入水平電泳槽中；吸取5μl酶切產(chǎn)物至薄膜手套表面，加入1μl6x上樣緩沖液，移液槍吹打混勻，將上述混合物加入到凝膠點(diǎn)樣孔中，最后加入5μldl500作為marker。打開開關(guān)，設(shè)置電壓120v，電泳30min后，將凝膠置入凝膠成像儀。

5、運(yùn)用e.z.n.a.gelextractionkit試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收目標(biāo)dna片段實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1)切取目標(biāo)片段的凝膠，稱重，加入等倍量bindingbuffer(如凝膠0.2g，則體積為0.2ml)，于65℃溫浴10min，使凝膠完全融化；

2)轉(zhuǎn)移上述混合液至hibinddna柱子上，10000rpm離心1min，棄去濾液；

3)加入bindingbuffer300μl，10000rpm離心1min，棄去濾液；

4)加入spwwashbuffer700μl，10000rpm離心1min，棄去濾液；

5)重復(fù)步驟4)一次；

6)13000rpm離心2min甩干殘留的液體；

7)加入50μl滅菌水在柱膜上洗脫dna，室溫放置5min，10000rpm離心1min，收集濾液即為目標(biāo)dna片段。

然后以回收的目標(biāo)dna片段為模板，建立測(cè)序pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

測(cè)序pcr反應(yīng)條件如下；

96℃10min預(yù)變性；

96℃10s變性—50℃5s退火—60℃4min延伸，共25個(gè)循環(huán)；

60℃7min延伸；4℃保存。

對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)前純化，步驟如下；

1)ep管中加入2μl125mmedta，2μl3mnaac和50μl無水乙醇，混勻，室溫放置15min，3000rpm離心30min，倒置ep管，甩去上清液；

2)加入70μl70％乙醇，3000rpm離心30min，倒置ep管，甩去上清液；

3)重復(fù)步驟2)一次；

4)室溫?fù)]發(fā)掉乙醇，加入10μlhidi溶解dna，95℃變性4min，迅速置冰上冷卻4min后，轉(zhuǎn)移至96孔板中；

5)在3130基因分析儀中進(jìn)行毛細(xì)電泳分析(結(jié)果如附圖1所示)。

三、統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)算基因位點(diǎn)的突變率，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

四、結(jié)果分析：在極端高脂組中發(fā)現(xiàn)有3例攜帶罕見突變angptl8基因：rs577224723；而血脂正常人群中不攜帶該變異基因。

在本發(fā)明中提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用做參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，以上對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式和實(shí)施例作了詳細(xì)說明，但是本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式和實(shí)施例，在本領(lǐng)域技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下作出各種變化。

sequencelisting

<110>首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所

<120>原發(fā)性高甘油三酯血癥易感基因angptl8的變異位點(diǎn)及其檢測(cè)方法和用途

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2325

<212>dna

<213>人體

<400>1

ataccttagaccctcagtcatgccagtgcctgctctgtgcctgctctgggccctggcaat60

ggtgacccggcctgcctcagcggcccccatgggcggcccagaactggcacagcatgagga120

gctgaccctgctcttccatgggaccctgcagctgggccaggccctcaacggtgtgtacag180

gaccacggagggacggctgacaaaggccaggaacagcctgggtctctatggccgcacaat240

agaactcctggggcaggaggtcagccggggccgggatgcagcccaggaacttcgggcaag300

cctgttggagactcaggtgggcaccgtagctgcgacactgtggggtggccaggagtccaa360

agaggagttcgtgtctagggtaaccaaccatcctggtttgcccaggactgaagggattcc420

tgggatacaagattttcagcgataaactcaggcaagtccttaggtacacaaagatgagtt480

ggacatcctactagtgacccactgtttattaagcagatggaggaggatattctgcagctg540

caggcagaggccacagctgaggtgctgggggaggtggcccaggcacagaaggtgctacgg600

gacagcgtgcagcggctagaagtccagctgaggagcgcctggctgggccctgcctaccga660

gaatttgaggtcttaaaggtaaggagctcccccaaccctagtgggctgagaccctgattt720

ccggccagaactcgcttctgcaccttgagtcccaaagacctcccagatcagcctcccagc780

tctgtggcctctaccctgcatgtccccagacaaaactcaagtccttttgtgtgcctcagt840

ttcccttttgtgtgcctcagttgcaaataagggcaacacctgatatctcacagtagggcc900

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