本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種肝癌的生物標(biāo)記物ensg00000248884及其應(yīng)用，具體地涉及ensg00000248884在肝癌診斷和治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，雖然目前治療手段多樣，如肝移植、手術(shù)切除、化療、放療等，但因其惡性程度高、進(jìn)展速度快、治療復(fù)雜等特點(diǎn)，總體療效不佳，預(yù)后差，死亡率高。近年來，肝癌分子生物學(xué)研究是迅速發(fā)展起來的一個(gè)嶄新領(lǐng)域，使人們在分子水平對腫瘤的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行多方面研究，因其而生的肝癌分子靶向治療已逐漸成為研究的熱點(diǎn)，個(gè)別肝癌靶向藥物(如索拉非尼)已進(jìn)入臨床應(yīng)用并取得了良好的療效，究其根本是從分子水平深入研究肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)理，并將特征性分子作為抗腫瘤靶點(diǎn)，從而為肝癌的臨床治療開辟了新的途徑。

基因組學(xué)研究表明，大約只有1％的基因可轉(zhuǎn)錄成有蛋白編碼功能的rna，而大部分則轉(zhuǎn)錄成無蛋白編碼功能的rna，即非編碼rna。其中，長鏈非編碼rna(longnon-codingrna，lncrna)是真核細(xì)胞中一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個(gè)核苷酸，但無或很少具有蛋白編碼功能的rna，曾被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物或“暗物質(zhì)”，不具有生物學(xué)功能。隨著lncrna功能學(xué)的進(jìn)展，越來越多的研究表明lncrna在人類疾病中發(fā)揮重要作用。目前，研究表明lncrna具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，如與細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附運(yùn)動(dòng)等有關(guān)，并可通過多種途徑如調(diào)節(jié)dna甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)、作為mirna的前體、mrna降解、磷酸化作用、蛋白修飾等發(fā)揮功能，正如同內(nèi)源性mirna研究已取得重要成果一樣，lncrna在疾病診斷和治療領(lǐng)域代表了另一類重要的分子來源，其研究前景巨大。

多項(xiàng)研究已證實(shí)lncrna在腫瘤領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，主要體現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等多個(gè)方面。目前，在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的異常表達(dá)的lncrna可涉及全身各個(gè)系統(tǒng)，分布較為廣泛，但是由于lncrna數(shù)量龐大，目前針對lncrna在癌癥領(lǐng)域中的研究仍處在起步階段。lncrna影響腫瘤發(fā)生和/或發(fā)展的機(jī)制尚有待進(jìn)一步揭示，眾多針對癌癥治療的潛在靶點(diǎn)也有待于研究者們不斷發(fā)現(xiàn)。因?yàn)閘ncrna在肝癌的發(fā)生機(jī)制中的角色尚未闡明，因此探尋lncrna肝癌的分子基礎(chǔ)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種診斷產(chǎn)品，為實(shí)現(xiàn)肝癌的早期診斷提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目的之二，提供一種分子標(biāo)記物，作為檢測或治療指標(biāo)應(yīng)用于臨床。

本發(fā)明的目的之三，提供一種治療手段和藥物組合物，實(shí)現(xiàn)肝癌的精準(zhǔn)分子治療。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測ensg00000248884的試劑在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品通過檢測樣本中ensg00000248884基因的表達(dá)水平來判斷患者是否患有肝癌。其中，ensg00000248884基因在肝癌患者中表達(dá)下調(diào)。

所述“樣本”包括細(xì)胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支氣管清洗液、尿、糞便等。優(yōu)選的，所述樣本為組織、血液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述樣本為組織。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括：通過rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測ensg00000248884基因的表達(dá)水平以診斷肝癌。

其中，所述用rt-pcr診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增ensg00000248884基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增ensg00000248884基因的引物；所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括：與ensg00000248884基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括與ensg00000248884基因的核酸序列雜交的探針。

進(jìn)一步，所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴(kuò)增ensg00000248884基因的引物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中所述引物如seqidno.2和seqidno.3所示。

本發(fā)明提供了一種診斷肝癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測樣本中ensg00000248884基因的表達(dá)水平來診斷肝癌。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒；其中，所述芯片包括基因芯片；所述試劑盒包括基因檢測試劑盒。所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測ensg00000248884基因轉(zhuǎn)錄水平的針對ensg00000248884基因的寡核苷酸探針；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測ensg00000248884基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑。

本發(fā)明中基因檢測試劑盒或基因芯片可用于檢測包括ensg00000248884基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與肝癌相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平，將肝癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測，可大大提高肝癌診斷的準(zhǔn)確率。

本發(fā)明提供了ensg00000248884在制備治療肝癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括ensg00000248884基因的促進(jìn)劑。

本發(fā)明提供了一種治療肝癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括ensg00000248884基因的促進(jìn)劑。

進(jìn)一步，所述藥物組合物還包括與所述促進(jìn)劑相配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。其中，藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料包括(但不限于)如緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽等。作為緩沖劑，能夠使用磷酸鹽、甘氨酸，山梨酸，山梨酸鐘，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)例如硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽，膠態(tài)二氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂等。作為乳化劑，能夠使用阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、西黃芪膠等。作為懸浮劑，能夠使用單硬脂酸甘油、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為穩(wěn)定劑，能夠使用丙二醇、二亞乙基亞硫酸鹽、抗壞血酸等。作為防腐劑，能夠使用疊氮化鈉、苯扎氯銨、對羥苯甲酸、氯丁醇等。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括離子交換劑如礬土，硬脂酸鋁，卵磷脂，半乳化藥物遞送系統(tǒng)(sedds)例如dα一生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鹽，在藥物劑型中使用的表面活性劑例如吐溫或其它類似聚合遞送基質(zhì)，血清蛋白例如人血清白蛋白，也可以使用環(huán)糊精例如α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、和γ-環(huán)糊精，或化學(xué)修飾的衍生物例如是羥基烷基環(huán)糊精，包括2-和3-羥基丙基-β-環(huán)糊精、或其它增溶衍生物來促進(jìn)本發(fā)明化合物的遞送。本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。

本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、填充劑、凝結(jié)劑與調(diào)和劑，如含水乳糖或無水乳糖、淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、硅酸、微晶纖維素、羥甲基纖維素鈉、淀粉甘醇酸鈉及其衍生物等。

本發(fā)明的藥物組合物還包含界面活性劑、乳化劑、擴(kuò)散劑、消泡劑、涂層材料等。任何藥學(xué)上或醫(yī)學(xué)上可接受的界面活性劑、乳化劑、擴(kuò)散劑、消泡劑等皆可被使用。

本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來調(diào)節(jié)制劑的ph以提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定性。本文所用術(shù)語非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達(dá)到目標(biāo)組織，本發(fā)明所述藥物組合物可以通過任何途徑給予受體。

本發(fā)明藥物組合物可以以任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對于口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還加入潤滑劑例如硬脂酸鎂。為了以膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無水玉米淀粉。當(dāng)口服施用水懸浮液和/或乳液時(shí)，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當(dāng)時(shí)，可將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過在聚合物、蠟等中將顆粒物質(zhì)包衣或包埋，也可制備所述制劑已延長或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的ensg00000248884的缺失或不足，通過提高ensg00000248884基因的表達(dá)，從而治療因ensg00000248884表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的肝癌。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療肝癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

在本發(fā)明中，術(shù)語“生物標(biāo)志物”是其在組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平與正?；蚪】导?xì)胞或組織的表達(dá)水平相比發(fā)生改變的任何基因。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明的實(shí)用性并不局限于對本發(fā)明的標(biāo)志物基因的任何特定變體的基因表達(dá)進(jìn)行定量。作為非限制性的實(shí)例，標(biāo)志物基因可具有seqidno.1指定的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cdna序列諸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cdna序列。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測定基因表達(dá)的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

在本發(fā)明中，術(shù)語“芯片”包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應(yīng)于ensg00000248884所示的部分或全部序列。

具體地，可根據(jù)本發(fā)明所述的lncrna，設(shè)計(jì)出適合的探針，固定在固相載體上，形成“寡核苷酸陣列”。所述的“寡核苷酸陣列”是指具有可尋址位置(即以區(qū)別性的，可訪問的地址為特征的位置)的陣列，每個(gè)可尋址位置均含有一個(gè)與其相連的特征性寡核苷酸。根據(jù)需要，可將寡核苷酸陣列分成多個(gè)亞陣。

所述固相載體包括塑料制品、微顆粒、膜載體等。所述塑料制品可通過非共價(jià)或物理吸附機(jī)制與抗體或蛋白抗原相結(jié)合，最常用的塑料制品為聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應(yīng)板；所述微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為微米，由于帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團(tuán)，易與抗體(抗原)形成化學(xué)偶聯(lián)，結(jié)合容量大；所述膜載體包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。

術(shù)語“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補(bǔ)堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

所述探針具有與靶點(diǎn)基因的特定的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這里，所謂“互補(bǔ)”，只要是雜交即可，可以不是完全互補(bǔ)。這些多核苷酸通常相對于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是dna，也可以是rna，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注冊商標(biāo)，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交聯(lián)化核酸)、ena(注冊商標(biāo)，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

在本發(fā)明中，針對ensg00000248884基因的寡核苷酸探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個(gè)堿基對或更長，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個(gè)堿基對，最長一般不超過30個(gè)堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個(gè)堿基對最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對，以免影響雜交效率。

在本發(fā)明中，所述ensg00000248884的促進(jìn)劑是指任何可提高ensg00000248884基因或表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性、上調(diào)ensg00000248884的表達(dá)、增加lncrnaensg00000248884的有效作用時(shí)間或促進(jìn)ensg00000248884基因的轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于上調(diào)ensg00000248884基因的表達(dá)有用的物質(zhì)，從而可用于預(yù)防或治療肝癌。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的ensg00000248884的促進(jìn)劑是一種含有ensg00000248884的表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體通常還含有啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。在本發(fā)明中，是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。表達(dá)載體向宿主細(xì)胞中的導(dǎo)入可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、deae葡聚糖法、顯微注射、病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、與細(xì)胞膜透過性肽的結(jié)合等周知的方法。

本發(fā)明的藥物組合物可以按藥劑學(xué)上有效的量進(jìn)行給藥，本發(fā)明的用語“藥劑學(xué)上有效的量”指的是以可適用于醫(yī)學(xué)治療或預(yù)防的合理的受惠/危險(xiǎn)比率足以治療或預(yù)防疾病的量，可根據(jù)包括疾病的嚴(yán)重程度、藥物的活性、患者的年齡、體重、健康、性別、患者對藥物的敏感度、所使用的本發(fā)明組合物的給藥時(shí)間、給藥途徑及排出比率、治療時(shí)間、與所使用的本發(fā)明的組合物配合或同時(shí)使用的藥物的要素及其它醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的要素來決定有效用量水平。本發(fā)明的藥物組合物可作為單獨(dú)的治療劑進(jìn)行給藥，或是與其它治療劑并用地進(jìn)行給藥，可以與以往的治療劑依次地或同時(shí)地進(jìn)行給藥。此外，可單次或多次地進(jìn)行給藥。重要的是，需要對上述要素均加以考慮，并且以無副作用的最少的量可取得最大效果的量進(jìn)行給藥。

術(shù)語“治療”是指不以治愈為目的，而是減緩(減少)靶定的病理狀況或病癥或防止復(fù)發(fā)。如果接受治療有效量的治療劑之后,患者成功地被“治療”，患者顯示出可觀測到的和/或可度量的一種或多種特定疾病的跡象和癥狀的減少或消失。例如，癌細(xì)胞數(shù)目顯著減少或癌細(xì)胞消失，減少腫瘤尺寸；抑制(即，在某種程度上減緩，及優(yōu)選地停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；某種程度上抑制腫瘤生長；使在一定程度上減少和/或減輕與特定癌癥相關(guān)聯(lián)的一種或多種癥狀的時(shí)間增加；減少的發(fā)病率和死亡率，以及改善生活質(zhì)量。疾病的跡象或癥狀的減輕能夠?yàn)榛颊吒兄Ｖ委熆梢詫?shí)現(xiàn)完全反應(yīng)—定義為癌癥的所有跡象消失，或部分反應(yīng)—腫瘤尺寸減小，優(yōu)選減小的比例超過50％、更優(yōu)選75％。如果患者感受到疾病穩(wěn)定，患者也被視為得到治療。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了ensg00000248884在肝癌患者組織中差異表達(dá)，通過檢測ensg00000248884的表達(dá)水平可以判斷患者是否患有肝癌或者患病風(fēng)險(xiǎn)的高低。

本發(fā)明提供了一種肝癌的精準(zhǔn)醫(yī)療手段，通過提高患者中ensg00000248884的轉(zhuǎn)錄水平，從而治療肝癌患者。

本發(fā)明提供了一種肝癌的分子標(biāo)記物，為肝癌的機(jī)理研究以及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測ensg00000245213在肝癌患者中的表達(dá)情況圖；

圖2是利用qpcr檢測ensg00000245213在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況圖；

圖3是利用qpcr檢測轉(zhuǎn)染ensg00000245213在肝癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖4是利用cck8檢測ensg00000245213對細(xì)胞增殖的影響圖；

圖5是利用利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測ensg00000245213表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響圖。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選與肝癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集10例肝癌患者的癌組織以及癌旁組織，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、rna樣品的制備

利用qiagen的組織rna提取試劑盒進(jìn)行組織rna的提取，按說明書的具體步驟進(jìn)行操作。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用lowrnainputlinearamplificationkit將mrna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，同時(shí)用cy3分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用說明書的步驟進(jìn)行雜交。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動(dòng)以100％和10％pmt各掃描1次，2次結(jié)果agilent軟件自動(dòng)合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用featureextraction進(jìn)行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用bioconductor程序包進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后ratio值為實(shí)驗(yàn)組和對照組。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：ratio≥4為上調(diào)基因，ratio≤0.25為下調(diào)基因。

6、結(jié)果

與癌旁組織相比，ensg00000248884基因在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于癌旁組織。

實(shí)施例2qpcr測序驗(yàn)證ensg00000248884基因的差異表達(dá)

1、對ensg00000248884基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本qpcr驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式肝癌組織和癌旁組織樣本各60例。

2、rna提取步驟同實(shí)施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmdntp，0.1mmdtt，30μmoligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

(3)qpcr擴(kuò)增檢驗(yàn)

引物序列：

ensg00000248884基因的引物序列為：

正向引物：5’-gcccaggatctacttcat-3’(seqidno.2)

反向引物：5’-acccgtttggatttgttt-3’(seqidno.3)

管家基因gapdh的引物序列為：

正向引物：5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’(seqidno.4)

反向引物：5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt--3’(seqidno.5)

采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。

配制以下反應(yīng)體系：sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl。各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35個(gè)循環(huán)。

以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對定量。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與癌旁組織相比，ensg00000248884基因在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，同rna-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例3ensg00000248884基因在肝癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株hepg2、huh7和正常肝細(xì)胞系hl-7702，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、rna的提取

1)胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打獲得的細(xì)胞經(jīng)離心、重懸、清洗后，以含10％fbs的dmem培養(yǎng)基重懸；

2)將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，添加培養(yǎng)基至2ml/孔，輕搖6孔板使細(xì)胞均勻重懸；

3)細(xì)胞貼壁生長48h，去培養(yǎng)基；

4)以1mltrizol試劑裂解細(xì)胞，反復(fù)吹打6孔板壁，盡量使細(xì)胞完全裂解；

5)轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液至1.5mldepc處理過的ep管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步驟同組織中rna提取過程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實(shí)施例2.

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常肝細(xì)胞系相比，ensg00000248884基因在肝癌細(xì)胞hepg2、huh7中表達(dá)均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，同rna-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例4ensg00000248884基因的過表達(dá)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株hepg2，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、ensg00000248884基因的過表達(dá)

2.1ensg00000248884基因表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)ensg00000248884的cdna序列(如seqidno.1所示)合成特異的pcr擴(kuò)增引物，在5’端引物和3’端引物分別添加kpni和xhoi兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。以肝癌患者血液提取和反轉(zhuǎn)錄得到的cdna作為擴(kuò)增模板，上述cdna序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶kpni和xhoi雙酶切后插入到經(jīng)kpni和xhoi雙酶切的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcdna3.0中，連接獲得的重組載體pcdna3.0-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2轉(zhuǎn)染

將肝癌細(xì)胞分為三組，分別為空白對照組(hepg2)、對照組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0空載體)、和ensg00000248884過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0-1)。使用脂質(zhì)體2000進(jìn)行載體的轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染方法按照說明書的指示進(jìn)行。pcdna3.0空載體和pcdna3.0-1的轉(zhuǎn)染濃度均為0.5μg/ml。

2.3ensg00000248884穩(wěn)定株的篩選

1)肝癌細(xì)胞hepg2細(xì)胞篩選濃度的確定

首先按照每孔5萬的細(xì)胞數(shù)鋪于6孔板內(nèi)，次日待細(xì)胞貼壁后換用含g418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，g418濃度梯度為500、600、700、800、900、1000和1100mg/l。以1周后6孔板內(nèi)的細(xì)胞剛好完全死亡的濃度為篩選濃度，最終確定最佳g418篩選濃度為1000mg/l。

2)ensg00000248884穩(wěn)定株的篩選

按照2.2轉(zhuǎn)染步驟hepg2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至24h，按1:16和1:32的比率傳代接種于直徑80mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后加入1000mg/l的g418，培養(yǎng)2周后，利用套環(huán)法及有限稀釋法將存活下來的細(xì)胞株接種于96孔板中獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆，同時(shí)改用維持濃度500mg/l的6418繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

3)ensg00000248884基因表達(dá)rt-pcr鑒定

按照實(shí)施例3的方法提取總rna并采用ensg00000248884的擴(kuò)增引物檢測ensg00000248884的表達(dá)情況。挑選ensg00000248884高表達(dá)細(xì)胞株。

2.3qrt-pcr檢測

采用實(shí)時(shí)定量pcr檢測上步中的陽性克隆細(xì)胞ensg00000248884表達(dá)水平高低具體步驟同實(shí)施例2，挑選高表達(dá)細(xì)胞株用于后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)研究。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、結(jié)果

如圖3所示，與空白對照組和轉(zhuǎn)染pcdna3.0空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcdna3.0-1的細(xì)胞中ensg00000248884的含量顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例5cck8檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3

2、cck8檢測細(xì)胞增殖

1)將對數(shù)增殖期的hepg2細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×10³個(gè)細(xì)胞；

2)實(shí)驗(yàn)分三組，分別是空白組、轉(zhuǎn)染pcdna3.0組和轉(zhuǎn)染pcdna3.0-1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；

3)分別在轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔cck8試劑；

4)2h后使用酶標(biāo)儀檢測a450的吸光值。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、結(jié)果

圖4所示的結(jié)果顯示：空白組同空載組無明顯差異，而轉(zhuǎn)染pcdna3.0-1組的細(xì)胞生長速度明顯低于轉(zhuǎn)染pcdna3.0空載體組的細(xì)胞生長速度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，上述結(jié)果表明ensg00000248884的表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長。

實(shí)施例6軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

1、用0.25％胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，輕輕吹打使之成為單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基重懸，適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10³個(gè)/ml。

3、制備兩個(gè)濃度分別為1.2％和0.7％的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃水浴中。

4、1.2％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于co2溫箱中備用。

5、在無菌試管中1:1混合0.7％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃度為5×10³個(gè)/ml的穩(wěn)定感染細(xì)胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)4個(gè)樣本。

6、待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％co2溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005％的龍膽紫染色90min。把平皿放置在倒置顯微鏡下觀察，每組細(xì)胞隨機(jī)選取10個(gè)低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細(xì)胞克隆數(shù)。

8、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，與其他組相比，轉(zhuǎn)染pcdna3.0-1的細(xì)胞組單細(xì)胞克隆集落形成數(shù)顯著降低。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>王冬國

<120>一種肝癌的生物標(biāo)記物ensg00000248884及其應(yīng)用

<160>5

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人源

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gcctgtttcctggcctccccagatgaggaaactgaggcacaaaaaggtgaagtcctgagc180

tcacagtcatgcaaccagcaggtggtgaaacacacctccaagctgcctgcctcctaagca240

tcaagctttgtggcccaggatctacttcatgctccaaatattcatggaccttcccaggac300

ctcaacaaaacaaaaccatgaagaaaaaccttgacatgaaccccaaaaaaacccagtcag360

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