本發(fā)明涉及奶牛新孢子蟲檢測領(lǐng)域，特別涉及奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的快速檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

新孢子蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的原生病原體，在全世界范圍內(nèi)流行，主要引起奶牛流產(chǎn)、死胎以及犬科動物的致命神經(jīng)系統(tǒng)疾病。感染新孢子蟲會導(dǎo)致奶牛體重和產(chǎn)奶量下降，從而過早被淘汰，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。1984年在挪威報(bào)道了第1例因狗感染新孢子蟲引起神經(jīng)肌肉病變，從而導(dǎo)致后肢癱瘓的病例，隨后確定犬科動物是新孢子蟲的終末宿主。該病原體的傳播途徑分為垂直傳播和水平傳播，而經(jīng)胎盤的垂直傳播是奶牛新孢子蟲主要傳播途徑。綜上，建立一種快速簡便的新孢子蟲檢測方法顯得尤為重要，用于環(huán)境評估，食品安全檢測，養(yǎng)殖場現(xiàn)場診斷等，進(jìn)而采取措施遏制傳播。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的快速檢測方法及其檢測試劑盒。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的快速檢測試劑盒。

所述試劑盒包括以下幾種成分：引物、探針混合液，凍干酶，反應(yīng)預(yù)混液，橫向流動試紙條和pbst；

所述引物、探針混合液中引物和探針的序列各自為：

上游引物：5'-tggtagcggtgagaggtgggatacgtggtt-3'；

下游引物：5'-biotin-gcactcgccagtcaacctacgtcttctgcc-3'；

探針：5'-fam-cgtcagggtgaggacagtgtgtcaatgata[thf]ttatcgagagttcag-/c3-spacer/-3'；

所述pbst的制備方法為：將1ml的tween-20溶于1000mlpbs中，混勻即可。

進(jìn)一步的，引物、探針混合液的制備方法為：將10μm上游引物2.1μl，10μm下游引物2.1μl，10μm探針0.6μl混合于4.8μl純水中。

進(jìn)一步的，所述引物和探針基于新孢子蟲nc-5基因設(shè)計(jì)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的快速檢測方法，所述檢測方法不以疾病的診斷和治療為目的，并使用上述的奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的快速檢測試劑盒，檢測方法包括以下幾個(gè)步驟：

(1)對新孢子蟲核酸樣品進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增；

擴(kuò)增時(shí)使用的引物、探針各自為：

上游引物：5'-tggtagcggtgagaggtgggatacgtggtt-3'；

下游引物：5'-biotin-gcactcgccagtcaacctacgtcttctgcc-3'；

探針：5'-fam-cgtcagggtgaggacagtgtgtcaatgata[thf]ttatcgagagttcag-/c3-spacer/-3'；

(2)將擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到橫向流動試紙條加樣端進(jìn)行檢測，判定新孢子蟲陽性或陰性。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)中重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)的體系為：新孢子蟲核酸樣品1μl，引物、探針混合液17μl，凍干酶5mg，反應(yīng)預(yù)混液32μl；最優(yōu)反應(yīng)條件為：37℃-39℃下反應(yīng)20分鐘。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)中將擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到橫向流動試紙條加樣端進(jìn)行檢測的具體方法為：取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物到98μlpbst中，混勻后吸取10μl溶液滴加到測流層析試紙條的加樣端，并將加樣端豎直插入裝有200μlpbst的離心管中，5分鐘后觀察結(jié)果；

進(jìn)一步的，所述pbst的制備方法為：將1ml的tween-20溶于1000mlpbs中，混勻即可。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了上述奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的快速檢測方法在檢測新孢子蟲中的應(yīng)用，其特征在于：所述檢測不以疾病的診斷和治療為目的。

作為優(yōu)選，所述奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸來源于新孢子蟲的所有基因型及所有蟲體發(fā)育階段。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的快速檢測方法及其檢測試劑盒，是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的，首先基于新孢子蟲nc-5基因設(shè)計(jì)了特定的引物和探針，該基因?qū)λ械男骆咦酉x基因型高度保守，而又對其他病原高度特異，再應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合橫向流動試紙條分析的方法制備快速檢測奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的試劑盒，該試劑盒具有特異性強(qiáng)、敏感度高、反應(yīng)迅速、操作簡便、結(jié)果判定簡便等優(yōu)點(diǎn)，且得到核酸樣品后整個(gè)反應(yīng)過程可在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行，不僅適用于臨床診斷，還適用于食品安全檢測、養(yǎng)殖場現(xiàn)場檢測、環(huán)境評估等多個(gè)領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的試劑盒的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖2為本發(fā)明的試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述：下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市售。

實(shí)施例1

本發(fā)明的奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的快速檢測試劑盒包括：

引物、探針混合液，重組酶聚合酶擴(kuò)增試劑盒(twistampnfokit，twistdx)提供的凍干酶，反應(yīng)預(yù)混液(29.5μlrehydrationbuffer和2.5μl280mmmagnesiumacetate混合液)，橫向流動試紙條(mileniahybridtech1strips,mileniabiotec)和pbst。

具體制備方法為：

(1)引物、探針混合液：本申請針對新孢子蟲的nc-5基因引物和探針，具體核苷酸序列如下：

上游引物：5'-tggtagcggtgagaggtgggatacgtggtt-3'；

下游引物：5'-biotin-gcactcgccagtcaacctacgtcttctgcc-3'；

探針：5'-fam-cgtcagggtgaggacagtgtgtcaatgata[thf]ttatcgagagttcag-/c3-spacer/-3'；

將10μm上游引物2.1μl，10μm下游引物2.1μl，10μm探針0.6μl混合于4.8μl純水中，得到引物、探針混合液。

(2)pbst的制備方法為：將1ml的tween-20溶于1000mlpbs中，混勻備用。

本發(fā)明的試劑盒的使用方法為：

重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)體系為：新孢子蟲核酸樣品1μl，引物、探針混合液17μl，凍干酶5mg，反應(yīng)預(yù)混液32μl；最優(yōu)反應(yīng)條件為：37℃–39℃下反應(yīng)20分鐘。

反應(yīng)后吸取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物與98μlpbst混勻，接著吸取10μl混合液滴加到橫向流動試紙條的加樣端，最后將試紙條豎直插入裝有200μlpbst的離心管中，5分鐘后觀察結(jié)果，如果試紙條為兩條杠，則為新孢子蟲陽性，如果為一條杠則為陰性。

實(shí)施例2具體應(yīng)用實(shí)施例

應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒快速檢測奶牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲核酸的方法如下：

(1)重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)：

吸取1μl核酸樣品，與準(zhǔn)備好的17μl的引物和探針混合液、32μl的反應(yīng)預(yù)混液一同加入到裝有5mg凍干酶的離心管中，混勻。在37℃–39℃下(可以捂在手中或腋窩下)反應(yīng)20分鐘。

(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：

反應(yīng)后吸取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物與200μlpbst混勻，接著吸取10μl混合液滴加到橫向流動試紙條的加樣端，最后將試紙條豎直插入裝有200μlpbst的離心管中，5分鐘后觀察結(jié)果，如果試紙條為兩條杠，則為新孢子蟲陽性，如果為一條杠則為陰性。

實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒的敏感性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)過程為：將新孢子蟲核酸進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中加入的新孢子蟲dna量分別為10⁶fg，10⁵fg，10⁴fg，10³fg，10²fg，10fg，1fg。反應(yīng)后按照前面提到的方法進(jìn)行橫向流動試紙條檢測，結(jié)果顯示該方法可以最少檢測到反應(yīng)體系中100fg的dna。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖1(注：對照條帶的顯現(xiàn)是為了顯示試紙條功能正常，檢測條帶的顯現(xiàn)表示陽性；nc為空白對照)。

實(shí)施例4本發(fā)明的試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)過程為：用弓形蟲，哈蒙球蟲，柱狀艾美爾球蟲，惡性瘧原蟲，環(huán)形泰勒蟲和雙芽巴貝斯蟲的dna與新孢子蟲dna進(jìn)行特異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該試劑盒只能檢測到新孢子蟲dna。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖2(注：對照條帶的顯現(xiàn)是為了顯示試紙條功能正常，檢測條帶的顯現(xiàn)表示陽性)。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。