一種用于診斷高甘油三酯血癥的檢測(cè)試劑板的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于診斷高甘油三酯血癥(HTG)的檢測(cè)試劑板，利用載脂蛋白A5(ApoA5)作為HTG診斷的生化指標(biāo)，制備抗ApoA5的單克隆抗體對(duì)，在一步法檢測(cè)試劑板上固定膠體金標(biāo)記的ApoA5單克隆抗體作為捕獲抗體；精確呈橫條狀分布于免疫層析膜上的未標(biāo)記ApoA5單克隆抗體用作檢測(cè)抗體，通過(guò)顯示免疫層析膜上的條紋，來(lái)檢測(cè)判定樣品中ApoA5的含量，從而應(yīng)用于HTG的病因診斷，以助冠心病和中風(fēng)等心血管疾病的有效防治。本發(fā)明提供的試劑板使用簡(jiǎn)便、快速，每份試劑單獨(dú)包裝，可存放于室溫下，便于保存。與膠體金顯色定量檢測(cè)儀配合使用，并與預(yù)設(shè)的Cutoff值進(jìn)行比較并報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)ApoA5膠體金快速定量檢測(cè)分析，避免膠體金顯色用肉眼判斷引起的漏判誤判，提高ApoA5檢測(cè)的靈敏性。
【專利說(shuō)明】一種用于診斷高甘油三酯血癥的檢測(cè)試劑板

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及載脂蛋白A5(Ap〇A5)作為高甘油三酯血癥（HTG)診斷的生化指標(biāo)， Ap〇A5單克隆抗體對(duì)的制備技術(shù)，膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)技術(shù)和利用Ap〇A5的 抗體來(lái)診斷高甘油三酯血癥（HTG)的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于診斷高甘油三酯血癥 (HTG)的檢測(cè)試劑板。 技術(shù)背景
[0002] 臨床上檢測(cè)血脂的項(xiàng)目有很多，各醫(yī)院普遍檢查的基本項(xiàng)目有總膽固醇（TC)、甘 油三酯（TG)、載脂蛋白（Apo)B、Apo AI、脂蛋白（a)[Lp(a)]等。調(diào)查資料研究表明，高甘油 三酯、高膽固醇、低的高密度脂蛋白-C(HDL-C)和高的低密度脂蛋白-C(LDL-C)共同構(gòu)成了 冠心病的危險(xiǎn)因素。載脂蛋白（Apo)異常與冠心病和中風(fēng)密切相關(guān)。盡早進(jìn)行正確診斷， 有利于早期防治這些嚴(yán)重的疾病。載脂蛋白檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)，有助于冠心病和中風(fēng)的有效 防治。
[0003] 血清ΑροΑΙ可以代表HDL水平，與HDL-C呈正相關(guān)，其臨床意義也大體相似。但是， HDL是一系列顆粒大小與組成不均一的脂蛋白，病理狀態(tài)下HDL亞類與組成往往會(huì)發(fā)生變 化，故4?^1的升降不一定與冊(cè)1^-(：變化完全成比例。4? 〇8100大約有90%的比例分布在 LDL中，所以血清ΑροΒ主要代表LDL水平，它與血清LDL-C水平呈明顯正相關(guān)，ΑροΒ水平高 低的臨床意義也與LDL-C相似。但是，在少數(shù)情況下，可出現(xiàn)高ΑροΒΙΟΟ血癥而LDL-C濃 度正常的情況，所以這兩種載脂蛋白可靠性和準(zhǔn)確性都不十分令人滿意。
[0004] ApoA5屬于ApoAI/CIII/AIV基因群，在肝臟表達(dá)，與HDL/VLDL有關(guān)。ApoA5基因啟 動(dòng)子的單核苷酸變異（SNP)直接影響甘油三酯水平。實(shí)驗(yàn)研究表明，在表達(dá)人類Ap 〇A5轉(zhuǎn) 基因的小鼠的血漿中甘油三酯的濃度下降為對(duì)照鼠的三分之一，而在缺少該基因的小鼠中 卻增加了 4倍。Ap〇A5作為高甘油三酯血癥的病因診斷指標(biāo)具有很高的敏感性和特異性。
[0005] 高水平甘油三酯可使小密低密度脂蛋白（sLDL)濃度升高，具有較強(qiáng)的致動(dòng)脈粥 樣硬化作用。甘油三酯水平越高，低密度脂蛋白中的膽固醇酯越多。人們已經(jīng)證實(shí)，動(dòng)脈粥 樣硬化斑塊中的膽固醇主要來(lái)自于低密度脂蛋白，低密度脂蛋白既是血漿中含膽固醇最多 的，也是致動(dòng)脈粥樣硬化性最強(qiáng)的脂蛋白。另外，流行病學(xué)研究表明，高水平甘油三酯使高 密度脂蛋白濃度下降，高密度脂蛋白濃度受甘油三酯水平的影響，兩者呈負(fù)相關(guān)。近來(lái)研究 表明，血甘油三酯水平異常與體內(nèi)凝血因子異常密切相關(guān)，血漿甘油三酯水平升高可以導(dǎo) 致體內(nèi)凝血因子水平升高，從而促進(jìn)血凝，并可使組織型纖溶酶原激活物抑制劑（PAI)合 成增加，抑制纖維蛋白溶解，形成高凝狀態(tài)，促進(jìn)冠心病的發(fā)生。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘油三酯 濃度上升lmmol/L，心血管意外發(fā)生率男性上升32 %，女性為76 %。在校正高密度脂蛋白的 影響后，危險(xiǎn)率男性上升14%，女性為37%。這些結(jié)果表明血清甘油三酯濃度升高是心血 管疾病的重要危險(xiǎn)因素。
[0006] 高甘油三酯血癥患者常同時(shí)有高血壓和胰島素抵抗。胰島素抵抗通常指患者有傾 向于非胰島素依賴糖代謝異常，該類患者常較早地形成冠狀動(dòng)脈疾病。通常將脂質(zhì)三聯(lián)癥、 高凝狀態(tài)、高血壓、胰島素抵抗稱為代謝綜合征。已證實(shí)高甘油三酯血癥患者常合并有代謝 綜合征中的其它異常。高甘油三酯血癥的臨床意義在于此。而作為直接影響甘油三酯水平 的指標(biāo)Ap〇A5顯得尤為重要，Ap 〇A5的單核苷酸多態(tài)性有望作為風(fēng)險(xiǎn)指示標(biāo)和降低血脂濃 度的治療靶點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明就是將Ap〇A5通過(guò)單克隆抗體對(duì)的制備技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用 于臨床實(shí)踐以達(dá)到高甘油三酯血癥的病因的快速診斷，以及冠心病和中風(fēng)等心血管疾病有 效防治的目的。
[0008] 三明治雙抗體技術(shù)是建立在單克隆抗體技術(shù)之上的生物【技術(shù)領(lǐng)域】較新的后抗體 技術(shù)。雙抗體夾心法應(yīng)用抗體對(duì)識(shí)別抗原的兩個(gè)位點(diǎn)來(lái)捕捉抗原，避免了抗體與抗原的同 一位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，減少了抗原決定簇的空間位阻現(xiàn)象，所以較一般的抗原捕捉法更敏感， 特異性更強(qiáng)，重復(fù)性更好，尤其適用于抗原含量很少的標(biāo)本的檢測(cè)。本發(fā)明結(jié)合此技術(shù)開(kāi)發(fā) 的針對(duì)ApoA5的抗體對(duì)，對(duì)檢測(cè)HTG病人血液中微量生化指標(biāo)（抗原）更突顯其重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種用于診斷高甘油三酯血癥的檢測(cè)試劑板，利用載脂蛋白 A5(Ap 〇A5)作為高甘油三酯血癥（HTG)診斷的生化指標(biāo)，制備Ap〇A5的單克隆抗體對(duì)以及相 應(yīng)的膠體金免疫層析快速檢測(cè)試劑板，檢測(cè)時(shí)間僅8 - 12分鐘，通過(guò)測(cè)定人血液中的ApoA5 的濃度，而對(duì)高甘油三酯血癥（HTG)進(jìn)行病因診斷，從而達(dá)到冠心病和中風(fēng)等心血管疾病 的有效防治。
[0010] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 一種用于診斷高甘油三酯血癥的檢測(cè)試劑板，包括膠體金標(biāo)記的Ap〇A5單克隆抗 體及未標(biāo)記的ApoA5單克隆抗體、羊抗鼠 IgG抗體、聚乙烯板、聚氯乙烯襯膜、濾膜、玻璃纖 維紙、聚酯膜、免疫層析膜和吸水紙組成。檢測(cè)試劑板水平面自下而上依次為：樣品吸收 區(qū)、金標(biāo)單抗區(qū)、固相化抗體區(qū)和吸水區(qū)，樣品吸收區(qū)鋪設(shè)的為在聚乙烯板及聚氯乙烯襯膜 上鋪設(shè)濾膜和玻璃纖維紙，吸水區(qū)為吸水紙，其特征在于：金標(biāo)單抗區(qū)為：將膠體金標(biāo)記的 Ap〇A5單克隆抗體均勻噴灑于單位面積的聚酯膜上；固相化抗體區(qū)為：將未標(biāo)記的Ap〇A5單 克隆抗體和羊抗鼠 IgG抗體固定在單位面積的免疫層析膜上。
[0012] 所述的膠體金標(biāo)記ApoA5單克隆抗體的制備方法：分別取適量半徑為20-60nm的 膠體金及相應(yīng)的ApoA5單克隆抗體，在pH7. 2-9. 2的條件下通過(guò)磁力攪拌振蕩使結(jié)合，加入 質(zhì)量濃度為2-4%牛血清白蛋白BSA作為穩(wěn)定劑，采用離心法除去未結(jié)合的單克隆抗體和 未穩(wěn)定的膠體金顆粒及凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金一 Ap〇A5單克隆抗體 復(fù)合物。
[0013] 所述抗ApoA5的抗體為單克隆抗體對(duì)。
[0014] 所述抗Ap〇A5單克隆抗體用純化的Ap〇A5免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾 臟細(xì)胞，融合該脾臟細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0 ;利用HAT選擇培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì) 胞，并利用ELISA方法篩選鑒定產(chǎn)生抗Ap〇A5抗體的細(xì)胞；進(jìn)行三次克隆化后得到分泌高 特異性的單克隆抗體的細(xì)胞株，保存所篩選到的產(chǎn)生與Ap 〇A5高特異性結(jié)合的單抗的細(xì)胞 株，通過(guò)小鼠腹水生產(chǎn)抗ApoA5的單抗。再利用Protein A-SePharose親和層析柱進(jìn)一步 純化腹水中抗ApoA5的單抗，ELISA及Western-Blot鑒定分離純化的單克隆抗體。
[0015] 抗Ap〇A5單抗隆抗體對(duì)的篩選，主要采用抑制法篩選高親和力的亞克隆，進(jìn)而在 多次克隆化和ELISA相加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制表位分析和親和力的測(cè)定，得到 不同表位的單抗細(xì)胞株，進(jìn)一步生產(chǎn)腹水并純化得到多量抗體，進(jìn)行單株標(biāo)記，采用ELISA 直接法進(jìn)行標(biāo)記抗體的工作濃度滴定，然后采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法進(jìn)行單標(biāo)抗體表位測(cè) 定，從而篩選出高效親和力的三明治抗體對(duì)。
[0016] 本發(fā)明所提供的用于診斷高甘油三酯血癥（HTG)檢測(cè)試劑板，是以Ap〇A5作為生 化指標(biāo)來(lái)診斷HTG。這包括制備上述Ap 〇A5的單克隆抗體對(duì)的方法，以及利用膠體金標(biāo)記 抗體和免疫層析方法來(lái)檢測(cè)血液或血清中的Ap〇A5的濃度。具體來(lái)說(shuō)，就是利用金標(biāo)記 抗ApoA5單抗作為第一抗體，用來(lái)捕捉抗原；精確呈橫條狀分布于免疫層析膜上的未標(biāo)記 Ap 〇A5單克隆抗體用來(lái)識(shí)別抗原，通過(guò)顯示免疫層析膜上的條紋，結(jié)合膠體金定量檢測(cè)儀， 來(lái)判定檢測(cè)樣品中的Ap 〇A5的含量，從而篩選和診斷HTG。
[0017] 與現(xiàn)有指標(biāo)和技術(shù)相比，本發(fā)明有突出的優(yōu)點(diǎn)和實(shí)用性：
[0018] 1、檢測(cè)特異性強(qiáng)而實(shí)用。Ap〇A5屬于ApoAI/CIII/AIV基因群，在肝臟表達(dá)，與HDL/ VLDL有關(guān)。Ap 〇A5基因啟動(dòng)子的單核苷酸變異（SNP)直接影響甘油三酯水平。載脂蛋白A5 作為高甘油三酯血癥的病因診斷指標(biāo)具有很高的敏感性和特異性。本發(fā)明避免了目前市場(chǎng) 上的同類產(chǎn)品只能單純表現(xiàn)結(jié)果，卻不能明確說(shuō)明病因的缺點(diǎn)。高甘油三酯血癥一經(jīng)查出 是Ap 〇A5基因突變?cè)蛞穑纯舍槍?duì)病因進(jìn)行相應(yīng)治療，從而從根本上解決高甘油三酯 血癥及其引發(fā)的相關(guān)疾病的預(yù)防和治療。
[0019] 2、檢測(cè)定量而快速。本發(fā)明根據(jù)膠體金顆粒在特定的波長(zhǎng)下，對(duì)光的吸收和散射 與膠體金顆粒的量相關(guān)這一特性，通過(guò)儀器中的光電傳感器檢測(cè)膠體金顆粒對(duì)光的吸收和 散射，從而獲得待檢樣本中的抗原含量，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)試劑由傳統(tǒng)的定性、半定量提升為全 定量產(chǎn)品。本系統(tǒng)整個(gè)檢測(cè)時(shí)間較國(guó)內(nèi)其他定量檢測(cè)大為縮短，從儀器的啟動(dòng)到采血到出 結(jié)果輸出，可在15分鐘內(nèi)完成，隨后醫(yī)生可對(duì)患者做出診斷及治療方案。
[0020] 本發(fā)明將兩項(xiàng)高科技技術(shù)（檢測(cè)試劑+定量?jī)x器）有效結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了 P0CT(Point-0f-Care Testing床邊檢測(cè)）快速"定量"的目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了測(cè)試數(shù)據(jù)的有效、準(zhǔn) 確統(tǒng)計(jì)分析和臨床應(yīng)用，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白，且可完全替代進(jìn)口。
[0021] 3、本發(fā)明改變了對(duì)HTG篩選和診斷必須由專業(yè)人員或?qū)Ｓ脙x器才能進(jìn)行檢測(cè)的 局限性。試劑板操作簡(jiǎn)單，樣本可為全血、血清或血漿，即可直接用指血檢測(cè)；膠體金定量檢 測(cè)儀攜帶方便、操作簡(jiǎn)便。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0023] 圖1為本發(fā)明的平面結(jié)構(gòu)區(qū)域圖。
[0024] 圖2為本發(fā)明的縱切面結(jié)構(gòu)圖。
[0025] 圖中：1、樣品吸收區(qū)；2、金標(biāo)單抗區(qū)；3、固相化抗體區(qū)；4、吸水區(qū)；5、底板和一層 PVC片材；6、固相化Ap 〇A5單抗免疫層析膜；7、金標(biāo)Ap〇A5單抗復(fù)合物的聚酯膜；8、樣品吸 收區(qū)，8a為一層玻璃纖維紙、8b為一層濾膜；9、一層吸水紙組成的吸水區(qū)。
[0026] 圖3為本發(fā)明的ApoA5濃度與膠體金顯色條紋強(qiáng)度的曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0028] 如圖1、圖2所示，一種用于診斷高甘油三酯血癥的檢測(cè)試劑板，包括膠體金標(biāo)記 的載脂蛋白A5(ApoA5)單克隆抗體及未標(biāo)記的ApoA5單克隆抗體、羊抗鼠IgG抗體、聚乙烯 板、聚氯乙烯襯膜、濾膜、玻璃纖維紙、聚酯膜、免疫層析膜和吸水紙組成。
[0029] 如圖1所示，檢測(cè)試劑板水平面自下而上依次為：樣品吸收區(qū)1、金標(biāo)單抗區(qū)2、 固相化抗體區(qū)3,和吸水區(qū)4 ;如圖2所示，由聚乙烯板及聚氯乙烯襯膜組成的底板和一層 PVC片材5,由一層玻璃纖維紙8a和一層濾膜8b組成的樣品吸收區(qū)8, 一層吸水紙組成的 吸水區(qū)9,其特征在于：金標(biāo)單抗區(qū)為：將膠體金標(biāo)記的Ap〇A5單克隆抗體均勻噴灑于單位 面積的聚酯膜上組成的金標(biāo)一 Ap〇A5單抗復(fù)合物的聚酯膜7 ;固相化抗體區(qū)為：將未標(biāo)記的 ApoA5單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體固定在單位面積的免疫層析膜上組成的固相化ApoA5 單抗免疫層析膜。
[0030] 實(shí)施例一，高甘油三酯血癥（HTG)診斷檢測(cè)試劑板的生產(chǎn)方法：
[0031] 1、ΑροΑ5的單克隆抗體對(duì)的制備
[0032] 用純化的ApoA5作為抗原分別免疫BALB/c小鼠，間隔21天免疫第二次，以后每間 隔10天免疫一次，共免疫3 - 4次，然后取出免疫小鼠的脾臟細(xì)胞，用PEG將該脾臟細(xì)胞與 小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0進(jìn)行融合，利用HAT選擇性培養(yǎng)基在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上篩選雜 交瘤細(xì)胞，用ELISA方法鑒定抗Ap 〇A5的細(xì)胞株，進(jìn)行三次克隆化后得到穩(wěn)定分泌高特異性 單克隆抗體的細(xì)胞株，在相同抗原包被板上采用ELISA抑制法，即參照組中加入細(xì)胞培養(yǎng) 上清，在抑制組加入細(xì)胞培養(yǎng)上清和抗原混合物，比較兩組0D值差異從而篩選出高親和力 的亞克隆。然后在間接ELISA實(shí)驗(yàn)上進(jìn)行相加法表位分析，即參照組中分別加入兩個(gè)單株 細(xì)胞培養(yǎng)上清，測(cè)定組中同時(shí)加入兩株細(xì)胞培養(yǎng)上清，比較兩組0D值（心、4和4 +2)，通過(guò) 下面公式計(jì)算：
[0033] AI= 2Al + 2 -1 X 100% Αι+Α.
[0034] 在比較計(jì)算結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行表位分析和親和力的測(cè)定，ΑΙ值小于50%為相加 陰性，即兩細(xì)胞株分泌的抗體識(shí)別抗原的表位相同，ΑΙ值大于50%為相加陽(yáng)性，表示兩細(xì) 胞株之間無(wú)競(jìng)爭(zhēng)，即兩細(xì)胞株分泌的抗體識(shí)別抗原的兩個(gè)不同的表位，從而初步得到針對(duì) 抗原不同表位的單抗細(xì)胞株。進(jìn)一步將得到的單抗細(xì)胞株分別注射入小鼠腹腔進(jìn)行腹水生 產(chǎn)，利用Protein A-Sepharose親和層析柱純化腹水得到多量單克隆抗體，用HRP酶對(duì)純化 的抗體進(jìn)行單株標(biāo)記，用ELISA直接法進(jìn)行標(biāo)記抗體的工作濃度滴定，然后用ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑 制法在參照組中加入酶標(biāo)抗體，在測(cè)定組中加入酶標(biāo)抗體和未標(biāo)記待測(cè)抗體混合物，比較 兩組0D值，參照組0D值大于測(cè)定組0D值的表示存在競(jìng)爭(zhēng)抑制，視為兩抗體識(shí)別抗原的表 位相同。反之，兩抗體不存在競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)視為兩抗體識(shí)別抗原的表位不同，從而最終篩選得 到高效親和力的三明治抗體對(duì)。
[0035] 2、膠體金標(biāo)記抗ApoA5單克隆抗體的方法
[0036] 分別取適量半徑為40nm的膠體金及相應(yīng)的ApoA5單克隆抗體，在pH8. 0的條件下 通過(guò)磁力攪拌振蕩使結(jié)合，加入質(zhì)量濃度為3%的牛血清白蛋白BSA作為穩(wěn)定劑，采用離心 法除去未結(jié)合的單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀 為膠體金一 Ap〇A5單克隆抗體復(fù)合物。
[0037] 3、將金標(biāo)抗體復(fù)合物噴涂于聚酯膜上
[0038] 用聚乙二醇洗滌膠體金一單克隆抗體復(fù)合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀， 純化后的沉淀用緩沖液溶解，用噴涂設(shè)備涂于聚酯膜上，烘干。
[0039] 4、免疫層析膜的包被
[0040] 用純化的抗ApoA5單克隆抗體對(duì)中的另一單抗溶液和羊抗鼠IgG抗體溶液用噴涂 設(shè)備于硝酸素纖維膜上劃線，線的長(zhǎng)度為3mm，每條線在3mm寬的硝酸素纖維膜上的滴加量 為5- 7ng。二種抗體由下至上分別為ApoA5和羊抗鼠IgG抗體，每條線間隔3mm。包被好 的免疫層析膜用質(zhì)量濃度為3 % BSA溶液進(jìn)行封閉。
[0041] 5、試劑板裝備
[0042] 塑料聚乙烯板作為支撐載體，上面粘有一層聚氯乙烯片材作為襯膜，由下至上由 一層濾膜和一層玻璃纖維組成的樣品吸收區(qū)，其次是三層吸附了膠體金一單抗復(fù)合物的聚 酯膜。然后是硝酸纖維膜，最上一層是吸水層，由一層濾紙組成，外面用特制膠帶包封。
[0043] 實(shí)施例二，HTG診斷檢測(cè)試劑板的使用方法：
[0044] 1、試劑板的使用
[0045] 對(duì)全血的檢測(cè)：用滴管取指血100ul滴入檢測(cè)板的孔中，8 - 12分鐘觀察結(jié)果。出 現(xiàn)兩條帶時(shí)為陽(yáng)性。只有一條帶時(shí)為陰性。一條帶都無(wú)時(shí)表示檢測(cè)板失效。
[0046] 對(duì)血清、血漿的檢測(cè)：用滴管取離心好的血清、血漿100ul垂直滴入檢測(cè)板的孔 中，8 - 12分鐘觀察結(jié)果。出現(xiàn)兩條帶時(shí)為陽(yáng)性。只有一條帶時(shí)為陰性。一條帶都無(wú)時(shí)表 不檢測(cè)板失效。
[0047] 2、上機(jī)定量檢測(cè)，分即時(shí)和全時(shí)間兩種方式：
[0048] 即時(shí)方式：血樣滴入試劑板后，即把試劑板插到儀器中，手動(dòng)啟動(dòng)應(yīng)用程序進(jìn)行 測(cè)試。
[0049] 全時(shí)間方式：血樣放到試劑板后，操作員自己定時(shí)15分鐘后。把血樣試劑板插到 儀器中，自動(dòng)啟動(dòng)應(yīng)用程序進(jìn)行測(cè)試。
[0050] 3、檢測(cè)流程：
[0051] 1)把血樣滴入試劑板，反應(yīng)后的測(cè)試樣品放入暗室；
[0052] 2)打開(kāi)測(cè)試程序并輸入相關(guān)信息然后點(diǎn)擊即時(shí)測(cè)試或全時(shí)間測(cè)試；
[0053] 3)系統(tǒng)分析，標(biāo)記并計(jì)算測(cè)試樣品試驗(yàn)數(shù)據(jù)；
[0054] 4)測(cè)試結(jié)果輸出。
[0055] 4、制定標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0056] 把含有0、31、63、125、250、5001^/1111的4?(^5標(biāo)準(zhǔn)抗原分別滴入試劑板，應(yīng)用本公 司生產(chǎn)的膠體金定量檢測(cè)儀（型號(hào)JH-2)，將試劑板放入暗室，打開(kāi)測(cè)試程序并輸入相關(guān)信 息然后點(diǎn)擊即時(shí)測(cè)試，記錄膠體金試劑板檢測(cè)線的顯色強(qiáng)度數(shù)據(jù)，以Ap 〇A5濃度（ng/ml)為 橫坐標(biāo)，條紋顯色強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0057] 產(chǎn)品批量生產(chǎn)時(shí)，每批次的產(chǎn)品都須制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，提供給產(chǎn)品使用者。
[0058] 5、測(cè)定血清中的ApoA5濃度
[0059] 把適當(dāng)倍數(shù)稀釋的待檢測(cè)血清滴入試劑板，應(yīng)用本公司生產(chǎn)的膠體金定量檢測(cè)儀 (型號(hào)JH-2)，將試劑板放入暗室，打開(kāi)測(cè)試程序并輸入相關(guān)信息然后點(diǎn)擊即時(shí)測(cè)試，記錄 膠體金試劑板檢測(cè)線的顯色強(qiáng)度數(shù)據(jù)，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算求得血清中Ap〇A5的濃度 值。如果設(shè)定為自動(dòng)模式，檢測(cè)儀將自動(dòng)記錄、計(jì)算，并打印報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。
[0060] 6、結(jié)果判定
[0061] 根據(jù)Ap〇A5作為高甘油三酯血癥（FHTG)病因診斷指標(biāo)的截?cái)嘀担╟ut off 值）215ng/ml，濃度低于該值的可判定為ApoA5缺乏，有高甘油三酯血癥的危險(xiǎn)；或可判定 Ap〇A5基因突變?yōu)楦吒视腿パY的主要病因。在膠體金定量檢測(cè)儀自動(dòng)模式下，Ap 〇A5的 檢測(cè)濃度值與預(yù)設(shè)的Cutoff值進(jìn)行比較并自動(dòng)報(bào)告高甘油三酯血癥的判定結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于診斷高甘油三酯血癥的檢測(cè)試劑板，包括膠體金標(biāo)記的載脂蛋白 A5(ApoA5)單克隆抗體及未標(biāo)記的ApoA5單克隆抗體、羊抗鼠IgG抗體、聚乙烯板、聚氯乙 烯襯膜、濾膜、玻璃纖維紙、聚酯膜、免疫層析膜和吸水紙組成。檢測(cè)試劑板水平面自下而 上依次為：樣品吸收區(qū)、金標(biāo)單抗區(qū)、固相化抗體區(qū)和吸水區(qū)，樣品吸收區(qū)鋪設(shè)的為在聚乙 烯板及聚氯乙烯襯膜上鋪設(shè)濾膜和玻璃纖維紙，吸水區(qū)為吸水紙，其特征在于：金標(biāo)單抗區(qū) 為：將膠體金標(biāo)記的Ap 〇A5單克隆抗體均勻噴灑于單位面積的聚酯膜上；固相化抗體區(qū)為： 將未標(biāo)記的ApoA5單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體固定在單位面積的免疫層析膜上。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于診斷高甘油三酯血癥檢測(cè)試劑板，其特征在于所述的膠體 金標(biāo)記ApoA5單克隆抗體的制備方法：分別取半徑為20-60nm的膠體金及相應(yīng)的ApoA5單 克隆抗體，在PH7. 2-9. 2的條件下通過(guò)磁力攪拌振蕩使結(jié)合，加入質(zhì)量濃度為2-4%牛血清 白蛋白BSA作為穩(wěn)定劑，采用離心法除去未結(jié)合的單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及凝 集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金一 Ap〇A5單克隆抗體復(fù)合物。
3. 如權(quán)利要求1所述的用于診斷高甘油三酯血癥檢測(cè)試劑板，其特征在于所述的檢測(cè) 試劑板與膠體金顯色定量檢測(cè)儀配合使用，并與預(yù)設(shè)的Cutoff值進(jìn)行比較并自動(dòng)報(bào)告檢 測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了 Ap〇A5膠體金快速定量檢測(cè)分析，避免了膠體金顯色用肉眼判斷引起的漏 判誤判，提高了 Ap〇A5檢測(cè)的靈敏性。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104215764SQ201410362304
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】錢金宏, 廖園園 申請(qǐng)人:武漢璟泓萬(wàn)方堂醫(yī)藥科技股份有限公司