本發(fā)明涉及富里酸提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及酒糟富里酸及其提取方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：酒糟是酒醅發(fā)酵完成后再經(jīng)蒸餾出酒而殘留的混合固形物，酒糟中有許多未利用的蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等成分。目前，我國酒廠產(chǎn)生的固體酒糟大都作為燒柴、飼料或者農(nóng)肥等來使用，然而這些利用并沒有做到物盡其用。鮮酒糟因?yàn)楹枯^高，所以在利用方面會(huì)提高干燥和運(yùn)輸?shù)瘸杀荆瑥亩鴮?dǎo)致大量酒糟被隨意丟棄或焚燒。鮮酒糟如果不及時(shí)加以處理，易發(fā)霉變質(zhì)，不僅浪費(fèi)了寶貴的資源，還會(huì)污染周圍環(huán)境。另外，由于釀酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生了復(fù)雜的生化變化，所以酒糟中也產(chǎn)生了大量的新成分，如核糖核酸、嘌呤、嘧啶和其他一些次級代謝等產(chǎn)物，為酒糟的高值化利用提供了條件。腐植酸中顏色最淺和分子量最低的組分稱為富里酸(fulvicacid，簡稱fa)，是人類已知的最好天然電解質(zhì)，因?yàn)槠涔δ芑鶊F(tuán)比較密集、溶解性好、滲透力強(qiáng)，所以在某些生物活性方面高于其他組分的腐植酸。富里酸的形成是由微生物的分泌物和植物性化學(xué)物質(zhì)相結(jié)合且在腐殖化(分解)過程中不斷進(jìn)行結(jié)構(gòu)重組而產(chǎn)生的一種分子結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜的有機(jī)物?，F(xiàn)有技術(shù)中，富里酸主要是通過從自然界中肥沃的堆肥土壤中的腐殖質(zhì)中進(jìn)行提取，含量極其稀少。目前，尚未有成功從酒糟中提取出富里酸的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種酒糟富里酸及其提取方法和應(yīng)用，本發(fā)明能夠成功的從酒糟中提取出酒糟富里酸，不僅拓展了富里酸的提取途徑，增大富里酸的來源和產(chǎn)量，同時(shí)以酒糟為原料，節(jié)約資源且減少了環(huán)境污染。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種提取酒糟富里酸的方法，包含以下步驟：調(diào)節(jié)酒糟水勻漿為堿性，得到堿性酒糟液；對所述堿性酒糟液進(jìn)行熱提取，對提取后的酒糟混合物進(jìn)行離心；調(diào)節(jié)所述離心得到的上清液的ph值為1～3，進(jìn)行沉淀處理；對所述沉淀處理得到的上清液進(jìn)行濃縮處理，得到酒糟富里酸。優(yōu)選的，所述酒糟水勻漿中酒糟和水的質(zhì)量比為1:(2.5～15)。優(yōu)選的，所述酒糟水勻漿中還添加有焦磷酸鈉；所述焦磷酸鈉在酒糟水勻漿中的濃度為0.1～10mmol/l。優(yōu)選的，所述熱提取在超聲條件下進(jìn)行，所述超聲的功率為220～260w；所述熱提取的溫度為35～45℃；所述熱提取的時(shí)間為10～30min。優(yōu)選的，所述離心的速率為3700～4100r/min，離心的時(shí)間為10～20min。優(yōu)選的，所述濃縮處理為減壓濃縮，所述減壓濃縮的溫度為50～60℃，壓力為-0.06～-0.08mpa。本發(fā)明提供了一種上述技術(shù)方案所述的提取方法得到的酒糟富里酸，表面呈多孔狀，為微晶態(tài)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供了一種上述技術(shù)方案所述的酒糟富里酸在抑制細(xì)菌和真菌中的應(yīng)用，所述細(xì)菌包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌；所述真菌為半知菌亞門類真菌。優(yōu)選的，所述真菌包括硫色鐮刀菌和互隔交鏈孢霉。本發(fā)明提供了一種上述技術(shù)方案所述的酒糟富里酸在制備抑制乳腺癌細(xì)胞mad-231藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種提取酒糟富里酸的方法。本發(fā)明首先調(diào)節(jié)酒糟為堿性，然后順次進(jìn)行熱提取、酸析、沉淀和濃縮處理，提取得到酒糟富里酸。由實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明提供的提取方法能夠成功的從酒糟中提取出酒糟富里酸，并且酒糟富里酸的得率為4.2～6.25％。此外，本發(fā)明得到的酒糟富里酸為微晶態(tài)物質(zhì)，可溶于水、酸和堿，微溶于乙醇，不溶于氯仿和丙酮出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象；除了能夠抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、硫色鐮刀菌和互隔交鏈孢霉，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、真菌為硫色鐮刀菌和互隔交鏈孢霉的最低抑菌濃度分別為1.605g/l、1.605g/l、1.284g/l、2.257g/l和3.210g/l；此外，還能夠抑制乳腺癌細(xì)胞mad-231增殖，可用于制備抑制乳腺癌細(xì)胞mad-231增殖的藥物。附圖說明圖1為固液比對酒糟富里酸得率的影響；圖2為ph值對酒糟富里酸得率的影響；圖3為超聲功率對酒糟富里酸得率的影響；圖4為超聲時(shí)間對酒糟富里酸得率的影響；圖5為超聲溫度對酒糟富里酸得率的影響；圖6為酒糟富里酸對細(xì)菌的抑制效果；圖7為酒糟富里酸對真菌的抑制效果。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種提取酒糟富里酸的方法，包含以下步驟：調(diào)節(jié)酒糟水勻漿為堿性，得到堿性酒糟液；對所述堿性酒糟液進(jìn)行熱提取，對提取后的酒糟混合物進(jìn)行離心；調(diào)節(jié)所述離心得到的上清液的ph值為1～3，進(jìn)行沉淀處理；對所述沉淀處理得到的上清液進(jìn)行濃縮處理，得到酒糟富里酸。本發(fā)明調(diào)節(jié)酒糟水勻漿為堿性，得到堿性酒糟液。本發(fā)明對所述酒糟的種類沒有任何的特殊要求，具體的可以為白酒糟或者紅酒糟。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述酒糟為甘肅金徽酒業(yè)集團(tuán)提供的白酒糟，水分含量為63.67wt％。在本發(fā)明中，所述酒糟水勻漿中酒糟和水的質(zhì)量比優(yōu)選為1:(2.5～15)，更優(yōu)選為1:(5～10)。本發(fā)明優(yōu)選向所述酒糟水勻漿中加入焦磷酸鈉，然后再進(jìn)行ph值的調(diào)整；所述焦磷酸鈉在酒糟水勻漿中的濃度優(yōu)選為0.1～10mmol/l，更優(yōu)選為4～5mmol/l。在本發(fā)明中，所述焦磷酸鈉能夠促進(jìn)富里酸在堿性環(huán)境中的溶出，提高酒糟富里酸的溶出效率并最終提高酒糟富里酸的得率。本發(fā)明優(yōu)選向酒糟水勻漿中加入焦磷酸鈉后再對其ph值進(jìn)行調(diào)整?，F(xiàn)有技術(shù)中的原料酒糟均為酸性，本發(fā)明采用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)酒糟水勻漿為堿性，具體的向酒糟水勻漿中加入堿性物質(zhì)進(jìn)行調(diào)整。在本發(fā)明中，所述堿性物質(zhì)優(yōu)選為堿金屬氫氧化物，更優(yōu)選以堿金屬氫氧化物水溶液的形式使用；所述堿金屬氫氧化物優(yōu)選為氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述堿金屬氫氧化物水溶液的濃度優(yōu)選為0.1～1.5mol/l，更優(yōu)選為0.5～1mol/l。在本發(fā)明中，所述堿性酒糟液的ph值優(yōu)選為8～13，更優(yōu)選為10～11。在本發(fā)明具體實(shí)施例中，酒糟水勻漿加入焦磷酸鈉后無明顯變化，加入堿液后顏色明顯加深，接近深棕色，且ph值越大顏色越深。得到所述堿性酒糟液后，本發(fā)明對所述堿性酒糟液進(jìn)行熱提取，對提取后的酒糟混合物進(jìn)行離心。在本發(fā)明中，所述熱提取具體的為：對堿性酒糟液進(jìn)行加熱處理。在本發(fā)明中，所述熱提取優(yōu)選為超聲熱提??；所述超聲的功率優(yōu)選為220～260w，更優(yōu)選為240～250w；所述熱提取的溫度優(yōu)選為35～45℃，更優(yōu)選為40℃；所述熱提取的時(shí)間優(yōu)選為10～30min，更優(yōu)選為15～25min。在本發(fā)明中，所述熱提取能夠更進(jìn)一步的促進(jìn)酒糟富里酸的溶出。所述熱提取后，本發(fā)明對提取后的酒糟混合物進(jìn)行離心。在本發(fā)明中，所述離心的離心速率優(yōu)選為3700～4100r/min，更優(yōu)選為3900～4000r/min；離心時(shí)間優(yōu)選為10～20min，更優(yōu)選為15min。所述離心后，本發(fā)明優(yōu)選對離心混合物進(jìn)行抽濾，得到上清液。在本發(fā)明中，所述抽濾的真空度優(yōu)選為-0.06～-0.08mpa，更優(yōu)選為-0.07mpa；所述抽濾在室溫下進(jìn)行。本發(fā)明調(diào)節(jié)所述離心得到的上清液的ph值為1～3，進(jìn)行沉淀處理。在本發(fā)明具體實(shí)施例中，本發(fā)明采用酸液調(diào)節(jié)所述上清液的ph值為1～3，具體的向所述上清液中逐漸滴加酸液進(jìn)行調(diào)整。在本發(fā)明中，所述酸液優(yōu)選為無機(jī)酸，更優(yōu)選為鹽酸、硝酸或硫酸；所述酸液的濃度優(yōu)選為0.1～1.5mol/l，更優(yōu)選為0.5～1mol/l。在本發(fā)明實(shí)施例中，向上清液中加入酸液后，顏色明顯變淺，接近黃棕色，且有絮狀物出現(xiàn)。在本發(fā)明中，對所述上清液進(jìn)行ph值調(diào)節(jié)之后沉淀處理即開始進(jìn)行，繼續(xù)將得到的酸性混合液進(jìn)行靜置沉淀即可。在本發(fā)明中，所述沉淀處理的溫度優(yōu)選為8～15℃，更優(yōu)選為10～12℃；時(shí)間優(yōu)選為10～15h，更優(yōu)選為12～13h。所述沉淀處理后，本發(fā)明對沉淀處理得到的上清液進(jìn)行濃縮處理，得到酒糟富里酸。本發(fā)明優(yōu)選對所述靜置沉淀后的混合物進(jìn)行離心，得到沉淀和上清液。在本發(fā)明實(shí)施例中，上述技術(shù)方案得到的沉淀作為酒糟廢棄物可按照現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)處理方式進(jìn)行處理，具體的如作為牛飼料使用。在本發(fā)明中，可具體由上述技術(shù)方案所述的離心條件獨(dú)立設(shè)置此處的所述離心方案，在此不再進(jìn)行贅述。在本發(fā)明中，所述濃縮處理優(yōu)選為減壓濃縮；所述減壓濃縮的溫度優(yōu)選為50～60℃，更優(yōu)選為55℃，壓力優(yōu)選為-0.06～-0.08mpa，更優(yōu)選為-0.07mpa。本發(fā)明對所述濃縮的時(shí)間沒有任何的特殊要求，優(yōu)選的濃縮至12～18倍濃度時(shí)停止即可，更優(yōu)選為15倍。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述濃縮處理能夠去除溶劑和溶劑中附帶的一些揮發(fā)性物質(zhì)，濃縮前的液體呈清亮的棕黃色，濃縮后變?yōu)樯钭厣诘母酄钗?。本發(fā)明優(yōu)選對所述濃縮處理得到的濃縮產(chǎn)物進(jìn)行干燥處理，得到干燥的酒糟富里酸。在本發(fā)明中，所述干燥處理優(yōu)選的包含順次進(jìn)行的常壓干燥過程和真空冷凍干燥過程。在本發(fā)明中，所述常壓干燥的溫度優(yōu)選為-30～-10℃，更優(yōu)選為-20℃，時(shí)間優(yōu)選為45～50h，更優(yōu)選為48h；所述真空冷凍干燥的真空度優(yōu)選為0～0.001mpa，更優(yōu)選為0～0.0001mpa；溫度優(yōu)選為-45～-35℃，更優(yōu)選為-40℃。在本發(fā)明實(shí)施例中，真空冷凍干燥后的酒糟富里酸為淺棕色粉末，類似于棕色泥土的顏色。本發(fā)明提供了一種上述技術(shù)方案所述的提取方法得到的酒糟富里酸，表面呈多孔狀，為微晶態(tài)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明得到的酒糟富里酸為無規(guī)則多孔狀物質(zhì)，最大的不規(guī)則長方形孔隙的尺寸約為860nm×100nm,最小的不規(guī)則長方形孔隙的尺寸約為80nm×20nm；圓形不規(guī)則孔的直徑尺寸約為20～140nm。本發(fā)明提供了一種上述技術(shù)方案所述的酒糟富里酸在抑制細(xì)菌和真菌中的應(yīng)用，所述細(xì)菌包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌；所述真菌為半知菌亞門類真菌，優(yōu)選的包括硫色鐮刀菌和互隔交鏈孢霉。在本發(fā)明中，酒糟富里酸對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為1.605g/l、1.605g/l和1.284g/l。在本發(fā)明中，酒糟富里酸對真菌為硫色鐮刀菌和互隔交鏈孢霉的最低抑菌濃度分別為2.257g/l和3.210g/l。本發(fā)明提供了一種上述技術(shù)方案所述的酒糟富里酸在制備抑制乳腺癌細(xì)胞mad-231藥物中的應(yīng)用。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的酒糟富里酸及其提取方法和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例1取定量的甘肅金徽酒業(yè)集團(tuán)提供的白酒糟(水分含量為63.67wt％)于250ml磨口錐形瓶中，加50ml蒸餾水搖勻，繼續(xù)加入1ml0.5mol/l的焦磷酸鈉后再用1mol/l的naoh調(diào)節(jié)ph值。充分搖勻后放入溫度為40℃水浴鍋中提取20min，以3900r/min離心15min，取上清液再抽濾(-0.07mpa，室溫)，用1mol/lhcl調(diào)節(jié)濾液ph至2。以10℃的溫度冷沉12h后以3900r/min速率離心15min，收集上清液即為dfa提取液。在55℃、-0.07mpa下進(jìn)行旋蒸濃縮，濃縮后在-20℃下冷凍48h，繼續(xù)放入冷凍干燥機(jī)中在-40℃、0.0001mpa下進(jìn)行干燥，得到酒糟富里酸(dfa)。實(shí)施例2以白酒糟和蒸餾水的質(zhì)量比為固液比，控制ph值為11，按照實(shí)施例1的方法提取酒糟富里酸。本實(shí)施例分別控制固液比為1:2.5、1:5、1:7.5、1:10、1:12.5和1:15，計(jì)算酒糟富里酸得率，結(jié)果如圖1所示，圖1為固液比對酒糟富里酸得率的影響。由圖1的結(jié)果可知，當(dāng)酒糟和水的質(zhì)量比為1:(2.5～15)時(shí)，酒糟富里酸的得率為4.1～5.3％，且隨著水量的增加，dfa的提取率也逐漸增加，當(dāng)固液比為1:7.5時(shí)，dfa得率最高，然后逐漸趨于平緩。實(shí)施例3按照實(shí)施例1的方法提取酒糟富里酸，控制固液比為1:7.5，分別控制堿性酒糟液的ph值為8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5，計(jì)算酒糟富里酸得率，結(jié)果如圖2所示，圖2為ph值對酒糟富里酸得率的影響。由圖2的結(jié)果可知，當(dāng)ph值為8～12.5時(shí)，酒糟富里酸的得率為4.9～5.65％。隨著ph值的增加，dfa的提取率先增加后降低，當(dāng)ph值為11時(shí)，dfa得率最高。當(dāng)ph值大于11時(shí)，dfa得率下降是由于堿溶物達(dá)到飽和之后，在酸沉?xí)r析出產(chǎn)生更多沉淀，從而影響了dfa的得率。實(shí)施例4按照實(shí)施例1的方法提取酒糟富里酸，同時(shí)控制ph值為11、固液比為1:7.5，平行控制熱提取條件為：40℃水浴鍋中提取20min；在40℃、240w的超聲波中提取20min。計(jì)算酒糟富里酸得率：其中正常熱提取條件下得率為4.16％，微波熱提取條件下的得率為5.21％。本實(shí)施例表明，超聲波提取利用超聲空穴破壞細(xì)胞壁從而增加溶劑穿透力，能夠輔助提取。實(shí)施例5按照實(shí)施例4的超聲方法提取酒糟富里酸，分別超聲功率為：240w、300w、360w、420w、480w、540w和600w，計(jì)算酒糟富里酸得率，結(jié)果如圖3所示，圖3為超聲功率對酒糟富里酸得率的影響。由圖3的結(jié)果可知，當(dāng)超聲功率為240～600w時(shí)，酒糟富里酸的得率為4.1～5.3％。隨著超聲功率的增加，dfa的提取率先增加后降低，當(dāng)超聲功率為360w時(shí)，dfa得率最高。當(dāng)超聲功率大于360w時(shí)，dfa得率下降是由于較高的超聲功率促進(jìn)了溶液中各成分的相互作用，發(fā)生聚合氧化等反應(yīng)從而降低提取率。實(shí)施例6按照實(shí)施例4的超聲方法提取酒糟富里酸，分別超聲時(shí)間為：10min、20min、30min、40min、50min、60min，計(jì)算酒糟富里酸得率，結(jié)果如圖4所示，圖4為超聲時(shí)間對酒糟富里酸得率的影響。由圖4的結(jié)果可知，當(dāng)超聲時(shí)間為10～60min時(shí)，酒糟富里酸的得率為5.5～5.95％。隨著超聲時(shí)間的增加，dfa的提取率先增加后降低，當(dāng)超聲時(shí)間為30min時(shí)，dfa得率最高。當(dāng)超聲功率大于30min時(shí)，dfa得率下降是由于隨著時(shí)間的延長，堿溶物發(fā)生降解、氧化或相互之間縮合等反應(yīng)的幾率也相應(yīng)增高，所以酸沉?xí)r會(huì)產(chǎn)生更多沉淀從而影響提取率，而且過長的超聲時(shí)間也可能使酒糟中的其他物質(zhì)溶出使dfa含更多雜質(zhì)，從而影響得率。實(shí)施例7按照實(shí)施例4的超聲方法提取酒糟富里酸，分別超聲溫度為：20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，計(jì)算酒糟富里酸得率，結(jié)果如圖5所示，圖5為超聲溫度對酒糟富里酸得率的影響。由圖5的結(jié)果可知，當(dāng)超聲溫度為20～60℃時(shí)，酒糟富里酸的得率為5.9～6.25％。隨著超聲溫度的增加，dfa的提取率先增加后降低，當(dāng)超聲溫度為45℃時(shí)，dfa得率最高。當(dāng)超聲溫度大于45℃時(shí)，dfa得率下降是由于較高的超聲溫度促進(jìn)了溶液中各成分之間的相互作用以及分解縮合氧化等反應(yīng)使提取率下降，或是高溫不利于dfa的穩(wěn)定，從而影響了提取率。實(shí)施例8按照實(shí)施例1的方法提取酒糟富里酸，控制固液比為1:7.5，堿性酒糟液的ph值為11，超聲功率為360w，超聲時(shí)間為30min，超聲溫度為45℃。菌種活化與菌懸液制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，瓊脂20g，氯化鈉5g，加水至1000ml，調(diào)節(jié)ph值7.3。121℃的條件下滅菌20min。pda培養(yǎng)基配制：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加水至1000ml，ph值自然。121℃的條件下滅菌20min。在無菌的條件下，用劃線的方法將供試菌種接入到斜面培養(yǎng)基上。大腸桿菌(escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)接入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，放入培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h；接入硫色鐮刀菌(fusariumsulphureum)和互隔鉸鏈孢霉(alternariaalternate)到pda培養(yǎng)基斜面上，放入培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48h，重復(fù)上述步驟2到3次，選出生長良好的菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在本實(shí)施例中，所述大腸桿菌(e.coli)、金黃色葡萄球菌(s.aureus)、枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、硫色鐮刀菌(f.sulphureum)和互隔交鏈孢霉(a.alternate)均由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。將3種供試細(xì)菌分別用200ml無菌水洗脫至已滅菌的三角瓶中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)其中含菌量，然后分別從中吸取1ml含菌液轉(zhuǎn)移至裝有9ml無菌水的試管中，依次稀釋至菌懸液含菌量為106cfu/ml，分別得到大腸桿菌(e.coli)、枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、金黃色葡萄球菌(s.aureus)的菌懸液。dfa對細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)：采用濾紙片法做細(xì)菌抑菌試驗(yàn)，將融化并冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)約20ml，待瓊脂凝固后每個(gè)平板加入0.2ml濃度為106cfu/ml的菌懸液，使用涂布平板法制成含菌平板。將滅菌后的濾紙片(5mm)浸泡于配置好的不同濃度的dfa溶液中10min后取出，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)用無菌鑷子放入蘸有同一濃度抑菌溶液的4片大小相同的濾紙片。對照組為蒸餾水浸泡的濾紙片，三次重復(fù)。將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h，之后用游標(biāo)卡尺使用十字交叉法測量抑菌圈直徑(mm)，并計(jì)算其平均值。以dfa濃度為橫坐標(biāo)，菌落直徑平均值為縱坐標(biāo)制作曲線圖，結(jié)果如表1和圖6所示，圖6為酒糟富里酸對細(xì)菌的抑制效果。由表1和圖6可知，dfa在所試濃度范圍內(nèi)對大腸桿菌(e.coli)、枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、金黃色葡萄球菌(s.aureus)的生長都有顯著抑制作用，隨著其濃度的提高，抑菌圈直徑明顯增大。三種細(xì)菌在dfa最小濃度下(10g/l)的生長已受到顯著抑制(p<0.05)；在dfa的所試濃度內(nèi)大腸桿菌(e.coli)的平均抑菌圈最大，當(dāng)dfa濃度為60g/l時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到了11.53mm，其次為金黃色葡萄球菌(s.aureus)和枯草芽孢桿菌(b.subtilis)。dfa對真菌的抑菌試驗(yàn)：取等量不同濃度的dfa溶液加入到pda培養(yǎng)基中，使最終培養(yǎng)基體積調(diào)整到20ml并倒入培養(yǎng)皿中。然后從培養(yǎng)7d的真菌菌落邊緣取直徑為5mm的菌塊，分別倒置培養(yǎng)在含有不同濃度dfa的pda培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置4個(gè)真菌瓊脂塊。放入28℃下培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑(mm)，并計(jì)算其平均值，并以dfa濃度為橫坐標(biāo)，菌落直徑平均值為縱坐標(biāo)制作曲線圖，結(jié)果如表1和圖7所示，圖7為酒糟富里酸對真菌的抑制效果。由表1和圖7可知，dfa對硫色鐮刀菌(f.sulphureum)和互隔鉸鏈孢霉(a.alternate)的生長產(chǎn)生顯著抑制，隨著其濃度的提高，兩種真菌的菌落直徑明顯減小。在沒有添加dfa的培養(yǎng)基中硫色鐮刀菌(f.sulphureum)的菌落直徑達(dá)到了16.01mm，而隨著dfa濃度的提高，其菌落直徑明顯減小，在dfa濃度為1g/l時(shí)即可顯著抑制硫色鐮刀菌(f.sulphureum)的生長(p<0.05)，且隨著濃度的不斷提高，菌落直徑一直在下降，當(dāng)濃度為3g/l時(shí)菌落直徑平均僅為5.08mm?；ジ翥q鏈孢霉(a.alternate)的生長活性相對較低，在無dfa的培養(yǎng)基中菌落直徑僅為9.54mm，而隨著dfa濃度的提高，其生長活性也在不斷下降，當(dāng)濃度高于0.5g/l時(shí)即可顯著抑制互隔鉸鏈孢霉(a.alternate)的生長(p<0.05)。在dfa所試濃度內(nèi)對硫色鐮刀菌(f.sulphureum)的抑制活性相對互隔鉸鏈孢霉(a.alternate)更高。表1酒糟富里酸的抑菌活性注：表1中數(shù)值為平均值a-e為失擬項(xiàng)p<0.05水平下的顯著水平最小殺菌濃度(mbc)的測定：分別將培養(yǎng)24h的三種供試細(xì)菌懸浮液濃度調(diào)整到106cfu/ml做細(xì)菌最小殺菌濃度實(shí)驗(yàn)。使用培養(yǎng)7d的硫色鐮刀菌(f.sulphureum)和互隔鉸鏈孢霉(a.alternate)做真菌最小抑菌濃度的實(shí)驗(yàn)，取兩種真菌的孢子，懸浮在含有0.05％吐溫-80的無菌水中，使用4層紗布過濾去除菌絲。將最終孢子濃度調(diào)整到106個(gè)/ml。將0.3ml各種菌懸液加入到含有不同濃度dfa溶液的pda培養(yǎng)基上，使用涂布棒涂布均勻。細(xì)菌在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，真菌在28℃下培養(yǎng)24h后觀察菌落生長狀態(tài)。以抑制99％以上的微生物的濃度作為該微生物的最小殺菌濃度，結(jié)果如表2所示。表2dfa的最小殺菌濃度菌種e.colis.aureusb.subtilisf.sulphureuma.alternatedfa濃度(g/l)1.6051.6051.2842.2573.210根據(jù)表2中dfa對五種菌的最小殺菌濃度可知，dfa對于細(xì)菌的抑制活性要明顯高于真菌，且對枯草芽孢桿菌的抑制活性最強(qiáng)。在1.284g/l時(shí)即可完全抑制枯草芽孢桿菌的生長，而金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的完全抑制濃度需達(dá)到1.605g/l。對于真菌，硫色鐮刀菌(f.sulphureum)的抑制活性強(qiáng)于互隔鉸鏈孢霉(a.alternate)。由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明提供了一種提取酒糟富里酸的方法。本發(fā)明首先調(diào)節(jié)酒糟為堿性，然后順次進(jìn)行熱提取、酸析、沉淀和濃縮處理，提取得到酒糟富里酸。由實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明提供的提取方法能夠成功的從酒糟中提取出酒糟富里酸，并且酒糟富里酸的得率為4.2～6.25％。此外，本發(fā)明得到的富里酸為微晶態(tài)物質(zhì)，可溶于水、酸和堿，微溶于乙醇，不溶于氯仿和丙酮出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象；除了能夠抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、硫色鐮刀菌和互隔交鏈孢霉，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、真菌為硫色鐮刀菌和互隔交鏈孢霉的最低抑菌濃度分別為1.605g/l、1.605g/l、1.284g/l、2.257g/l和3.210g/l；此外，還能夠抑制乳腺癌細(xì)胞mad-231增殖。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12