本發(fā)明涉及BRD4抑制劑及其在腫瘤治療藥物中的應(yīng)用，屬于腫瘤治療藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

溴含蛋白質(zhì)4(BRD4)是溴和額外的終端(BET)蛋白家族的成員，在細(xì)胞分裂和轉(zhuǎn)錄調(diào)控作為一個中央單元傳輸表觀遺傳記憶。除了BRD4，還有其他三個成員，如BRD2、BRD3和BRDT，他們可能調(diào)控許多細(xì)胞過程通過溴結(jié)構(gòu)域間的相互作用。BRD4是一種廣泛表達(dá)的核蛋白，分子量為200kDa，含有兩個串聯(lián)的溴結(jié)構(gòu)域(BD1和BD2)，在結(jié)構(gòu)上是保守的但具有不相同的功能和一個ET結(jié)構(gòu)域。最近，BRD4被報道參與致癌基因重排，導(dǎo)致高度致癌融合蛋白，從而在許多類型的癌癥的發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，如乳腺癌。BRD4調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是通過調(diào)節(jié)Sipa1酶的活性和調(diào)節(jié)ERα誘導(dǎo)的基因表達(dá)通過影響乳腺癌的RNA聚合酶II和組蛋白H2B單泛素化延伸相關(guān)的磷酸化。此外，BRD4調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)移預(yù)測基因信號中經(jīng)常出現(xiàn)；并能通過它的激活信號預(yù)測乳腺癌的進(jìn)展和/或生存。

自噬是一種進(jìn)化上保守的、多步驟的溶酶體降解過程，用于清除受損或多余的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。自噬機(jī)器包括超過36自噬相關(guān)基因(ATGs)，和UNC-51-樣激酶1(ULK1)，它是酵母菌Atg1的直接同源基因，是唯一的絲氨酸蘇氨酸激酶，是這些自噬相關(guān)基因中的啟動酶。ULK的復(fù)雜互合體，包括ULK1，mAtg13,FIP200和Atg101，這些是啟動自噬過程所必須的[17]。在自噬中，mTORC1和AMPK可以通過直接磷酸化對ULK1活性進(jìn)行負(fù)調(diào)控。AMPK-mTORC1-ULK1軸可能發(fā)揮關(guān)鍵作用在自噬體的形成和自噬的調(diào)控。AMPK mTORC1、ULK1的功能及其參與的許多病理生理過程如乳腺癌已得到闡明。自噬是一種生理機(jī)制，可以作為暫時的生存手段，因而被稱為保護(hù)性細(xì)胞自噬。相反，如果細(xì)胞應(yīng)激導(dǎo)致連續(xù)或過度誘導(dǎo)的自噬，細(xì)胞死亡或細(xì)胞自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡(ACD)將接踵而至。靶向小分子藥物誘導(dǎo)的自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡現(xiàn)在作為一個有前途的策略。因此，靶向AMPK-mTORC1-ULK1調(diào)制自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡是乳腺癌治療的新途徑。

最近，(+)JQ1作為第一個BRD4抑制劑，已經(jīng)在保護(hù)性細(xì)胞自噬方面得到驗證。例如，在急性髓系白血病(AML)中，AMPK-ULK1調(diào)節(jié)的保護(hù)自噬對BRD4抑制劑(+)JQ1產(chǎn)生了耐藥性。(+)JQ1也已被報道抑制保護(hù)細(xì)胞自噬從而增加NPM1和HEXIM1表達(dá)在AML細(xì)胞中?？梢?，長期用藥會伴隨腫瘤細(xì)胞的耐藥性，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。雖然(+)JQ1具有良好的活性，但是其缺乏專一性，是一種泛BET家族的抑制劑，不能夠?qū)Ｒ恍缘囊种艬RD4。此外，(+)JQ1的體內(nèi)藥效動力學(xué)性質(zhì)極差，成藥性很低，阻礙了其進(jìn)入臨床試驗。因此，需要開發(fā)一種新型的BRD4抑制劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種作為BRD4抑制劑的新化合物。

本發(fā)明提供結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中，R₁和R₂獨(dú)立地為氫或C1-C4烷基，且R₁和R₂不同時為氫；或者R₁和R₂連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)為

R₃為苯環(huán)或被取代的苯環(huán)；

n為0或1。

本發(fā)明還提供上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療乳腺癌藥物中的用途。

進(jìn)一步的，所述治療乳腺癌藥物優(yōu)選為BRD4抑制劑類藥物。

本發(fā)明還提供一種治療乳腺癌的藥物組合物，它包含有效劑量的上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，可以作為BRD4抑制劑，具有較明顯的抗乳腺癌治療效果。特別是化合物36，能夠?qū)Ｒ恍缘呐cBRD4的BD1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，在乳腺癌中它能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)BRD4-AMPK調(diào)節(jié)的自噬性細(xì)胞死亡，這是第一個被報道的同時靶向BRD4和BRD4-AMPK相互作用的小分子抑制劑，將為在治療乳腺癌治療中，開發(fā)具有新的結(jié)構(gòu)和PPIs作用的BRD4抑制劑提供了一個有效的范例。

附圖說明

圖1為分別用1.5或3μM的FL-411的處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞一定時間后，然后細(xì)胞用熒光顯微鏡檢測MDC熒光染色圖片。

圖2為分別用1.5或3μM的FL-411的處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞一定時間后，然后用電子顯微鏡檢測的圖片。

圖3為用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，然后用1.5或3μM的FL-411的處理，在熒光顯微鏡下檢測的圖片。

圖4為分別用1.5或3μM的FL-411的處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24小時，通過免疫組化檢測LC3B的表達(dá)。

圖5為分別用FL-411的處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞一定時間后，用免疫印跡法檢測Beclin-1，p62和LC3的表達(dá)。

圖6為在BafA1的存在下，用分別用FL-411的處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24小時，用免疫印跡法檢測p62和LC3的表達(dá)。

圖7為分別用1.5或3μM的FL-411的處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞一定時間后，再用FL-411處理之前加入3-MA，然后用MTT檢測細(xì)胞存活率。

圖8為分別用1.5或3μM的FL-411的處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞一定時間后，用免疫印跡法檢測AKT，p-AKT，mTOR，p-mTOR，p70S6K和p-p70S6K的表達(dá)量。

圖9為分別用1.5或3μM的FL-411的處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞一定時間后，用免疫印跡法檢測ULK1，p-ULK1，ATG13，p-ATG13，F(xiàn)IP200和ATG101的表達(dá)量。

圖10為用兩種特異性BRD4的siRNA和陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，用免疫印跡法檢測BRD4，c-Myc，AMPKα，p-AMPKα，ULK1，p-ULK1，p62和LC3的表達(dá)。

圖11為接種MCF-7或MDA-MB-231的小鼠每天用空白對照或不同濃度的FL-411處理一次。腫瘤體積用標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。

圖12為分析最后一天的腫瘤體積變化。*p<0.05,***p<0.001，與對照組作比較。

圖13為各組小鼠的腫瘤重量。*p<0.05,***p<0.001，與對照組作比較。

圖14為FL-411處理期間小鼠的體重變化。

圖15為免疫組化分析小鼠腫瘤中的增殖標(biāo)記物KI67和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3II。定量分析各組圖片陽性染色的百分比。腫瘤取自對照和FL-411(100mg/kg)處理組小鼠。***p<0.001，與對照組作比較。標(biāo)尺為200μm。

圖16為取MCF-7和MDA-MB-231異種移植小鼠的腫瘤組織，裂解。western blot分析BRD4,c-Myc,LC3,和caspase3的表達(dá)。

圖17為FL-411在斑馬魚模型中的抗腫瘤活力。CM-DIL標(biāo)記的MCF7細(xì)胞加入空白或12.5,25,50μM的FL-411處理，用熒光顯微鏡捕捉亮場和熒光圖片。

圖18為斑馬魚模型中的腫瘤熒光強(qiáng)度分析(mean±SEM)及各濃度FL-411處理48h后各組腫瘤體積的抑制率(**p<0.01,***p<0.001，與對照組作比較)。

具體實施方式

本發(fā)明提供如式Ⅰ所示的化合物：

其中，R₁和R₂獨(dú)立地為氫或C1-C4烷基，且R₁和R₂不同時為氫；或者R₁和R₂連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)為R₃為苯環(huán)或被取代的苯環(huán)；n為0或1。

作為其中一種實施方式，n為0；R₁和R₂獨(dú)立地為氫或C1-C4烷基，且R₁和R₂不同時為氫；或者R₁和R₂連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)為R₃為苯環(huán)或被取代的苯環(huán)。

以下為n為0的幾種優(yōu)選的實施方式。

一種是R₁和R₂連接形成R₃為苯環(huán)或被取代的苯環(huán)。

優(yōu)選R₁和R₂連接形成

更優(yōu)選R₁和R₂連接形成R₃為

第二種是R₁和R₂優(yōu)選獨(dú)立地為氫或C1-C4烷基，且R₁和R₂不同時為氫；R₃為苯環(huán)或被取代的苯環(huán)。

優(yōu)選R₁為氫；R₂為C1-C4烷基；R₃為

更優(yōu)選R₁為氫；R₂為R₃為

進(jìn)一步優(yōu)選R₁為氫；R₂為R₃為

第三種是R₁和R₂連接形成R₃為苯環(huán)或被取代的苯環(huán)。

更優(yōu)選R₁和R₂連接形成R₃為

第四種是R₁和R₂連接形成R₃為苯環(huán)或被取代的苯環(huán)。

優(yōu)選R₁和R₂連接形成R₃為

更優(yōu)選R₁和R₂連接形成R₃為

還有一種為R₁和R₂連接形成R₃為苯環(huán)或被取代的苯環(huán)。

優(yōu)選R₁和R₂連接形成R₃為

作為另一種實施方式，n為1；R₁和R₂獨(dú)立地為氫或C1-C4烷基，且R₁和R₂不同時為氫；或者R₁和R₂連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)為R₃為苯環(huán)或被取代的苯環(huán)。

優(yōu)選的，n為1，R₁和R₂連接形成R₃為

更優(yōu)選n為1，R₁和R₂連接形成R₃為

下面是本發(fā)明的化合物的一些優(yōu)選結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。所述鹽可以為硝酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽等。

本發(fā)明還提供上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療乳腺癌藥物中的用途。進(jìn)一步的，所述治療乳腺癌藥物優(yōu)選為BRD4抑制劑類藥物，用于乳腺癌的相關(guān)治療。

本發(fā)明還提供一種治療乳腺癌的藥物組合物，它是包含有效劑量的上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制劑?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法可將本發(fā)明化合物制成以下形式：片劑、膠囊劑、水性或油性溶液劑、混懸劑、乳劑、乳膏劑、軟膏劑、凝膠劑、噴鼻劑、栓劑、用于吸入的細(xì)小分散的粉劑或氣霧劑或噴霧劑、用于胃腸道外(包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或輸注)的無菌水性或油性溶液或混懸劑或無菌乳劑?？刹捎脽o菌水或水-丙二醇溶液作為溶劑來制備液體制劑，還可將活性組分配制在聚乙二醇水溶液中。用于口服給予的水性溶液可通過將活性組分溶解在水中并按需要加入合適的著色劑、矯味劑、穩(wěn)定劑和增稠劑來制備。口服使用的水性混懸劑可通過將細(xì)小分散的活性組分與粘性物質(zhì)一道分散在水中，所述粘性物質(zhì)如為天然合成膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素和其他藥劑領(lǐng)域已知的懸浮劑。

藥物組合物可為單位劑量形式。在這些形式中，將所述組合物分成含適量活性組分的單位劑量。該單位劑量形式可為包裝制劑，包裝中包括分隔量的制劑，例如盒裝片劑、膠囊劑和在管形瓶或安瓿中的粉劑。單位劑量形式還可為膠囊劑、扁囊劑或片劑或其可為適當(dāng)數(shù)量的任何這些包裝形式。

本發(fā)明的藥物組合物，其活性成分可僅為本發(fā)明的化合物，也可與其他抗乳腺癌化合物組合作為活性成分。

在治療乳腺癌的過程中，可采用本發(fā)明的藥物組合物與其他抗乳腺癌藥進(jìn)行聯(lián)合治療。

在治療乳腺癌時，可通過同時、序貫或單獨(dú)給予各種治療成分可實現(xiàn)這種聯(lián)合治療。此類組合產(chǎn)品應(yīng)用有效劑量范圍內(nèi)的本發(fā)明化合物和準(zhǔn)許劑量范圍內(nèi)的其他藥學(xué)活性劑。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式做進(jìn)一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。

實施例1化合物1～42的合成

中間體2a-e的合成通法：

取酮或醛(30.0mmol)，氰基乙酸乙酯(30.0mmol)，單質(zhì)硫(30.0mmol)溶于200ml無水乙醇中，再加入三乙胺(35.0mmol).The resulting was allowed to refluxed for 12h.反應(yīng)混合物升溫至回流，保溫反應(yīng)12小時左右。反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫過濾，用無水乙醇洗滌(30ml x 3)，合并濾液減壓除去溶劑，粗品經(jīng)過硅膠柱層析純化得到中間體，淺黃色固體。

中間體2a ¹H-NMR(400MHz,CDCl₃-d₆),δ(ppm):5.73(1H,s),4.18(2H,q,J＝7.1Hz),2.47(2H,m),1.53(2H,m),1.25(3H,t,J＝7.0Hz),0.87(3H,t,J＝7.2Hz).HRMS(ESI)⁺calculated forC₁₀H₁₅NO₂S,[M+H]⁺:m/z 214.0902,found 214.0910.

中間體2b ¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):5.85(2H,s),4.24(2H,m),2.84(2H,m),2.72(2H,m),2,30(2H,m),1.32(3H,t,J＝7.1Hz)；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₀H₁₄NO₂S,[M+H]⁺:m/z 212.0745,found 212.0752.

中間體2c ¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):5.73(2H,s),4.26(2H,q,J＝6.9Hz),2.94(2H,t,J＝5.3Hz),2.55(2H,t,J＝5.3Hz),1.79(2H,m),1.60(4H,m),1.32(3H,t,J＝7.2Hz).

中間體2d ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):5.92(2H,s),4.26(2H,q,J＝14.2,7.13Hz),2.87(1H,m),2.56(2H,m),2.12(1H,m),1.81(2H,m),1.33(4H,t,J＝7.1Hz),1.04(3H,d,J＝6.5Hz)；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₂H₁₈NO₂S,[M+H]⁺:m/z 240.1058,found 240.1067.

中間體2e ¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):5.98(2H,s),4.26(2H,m),3.37(2H,t,J＝2.0Hz),2.84(2H,m),2.66(2H,t,J＝5.9Hz),2,44(3H,s),1.33(3H,t,J＝7.1Hz).

化合物1～42的合成通法：

分別取上步制得的中間體(2.0mmol)溶于3ml鹽酸氣飽和的無水二氧六環(huán)中，再加入腈衍生物(2.2mmol)?；旌衔锛訜嶂?00℃保溫反應(yīng)6-12小時。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，用20ml飽和的碳酸氫鈉水溶液猝滅反應(yīng)。過濾收集析出的固體并用甲醇洗滌的類白色固體產(chǎn)物。

反應(yīng)試劑和反應(yīng)條件：(a)NCCH₂CO₂Et,S₈,EtOH,Et₃N,回流,12h；(b)腈,二氧六環(huán)/HCl,100℃,12h。

以下是核磁結(jié)果：

化合物1

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):7.85(2H,m),7.25(1H,t,J＝7.9Hz),6.88(1H,ddd,J＝8.4,2.7,1.0Hz),6.78(1H,br s),3.80(3H,s),2.71(2H,t,J＝7.3Hz),1.65(2H,m),0.94(3H,t,J＝7.3Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.6,155.2,150.5,149.1,131.7,124.3,123.9,123.0,120.4,118.4,118.0,112.4,55.1,31.6,23.6,11.4；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₆H₁₇N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 301.1011,found 301.1020.

化合物2

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):8.42(1H,t,J＝1.6Hz),8.26(1H,dt,J＝7.8,1.3Hz),7.49(1H,dq,J＝7.8,1.0Hz),7.32(1H,t,J＝7.8Hz),6.79(1H,br s),2.71(2H,t,J＝7.0Hz),1.65(2H,m),0.94(3H,t,J＝7.3Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):159.5,156.6,153.2,151.8,141.5,133.8,133.0,128.5,127.6,126.8,126.5,120.4,34.0,26.0,13.8；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₅H₁₄BrN₂OS,[M+H]⁺:m/z 349.0010,found 349.0017.

化合物3

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):8.09(2H,d,J＝8.3Hz),6.72(2H,t,J＝8.2Hz),2.69(2H,t,J＝7.4Hz),1.63(2H,q,J＝14.4,7.1Hz),0.93(3H,t,J＝7.5Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):159.5,156.6,153.2,151.8,141.5,133.8,133.0,128.5,127.6,124.8,113.8,111.6,34.0,26.0,13.8；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₅H₁₅N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 287.0854,found 287.0863.

化合物4

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):7.62(2H,dd,J＝8.4,1.3Hz),7.55(2H,d,J＝8.4Hz),7.41(4H,m),7.32(1H,m),6.81(1H,s),3.80(2H,s),2.70(2H,t,J＝7.0Hz),1.61(1H,m),0.91(3H,t,J＝7.5Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):162.1,152.6,152.6,150.7,145.6,141.5,132.3,132.3,130.8,130.8,130.6,130.6,130.0,128.8,128.8,126.5,120.3,120.3,39.8,33.9,26.1,13.9；HRMS(ESI)⁺calculated for C₂₂H₂₁N₂OS,[M+H]⁺:m/z 361.1375,found 361.1381.

反應(yīng)試劑和反應(yīng)條件：(a)NCCH₂CO₂Et,S₈,EtOH,Et₃N,回流,12h；(b)腈,二氧六環(huán)/HCl,100℃,12h。

化合物5

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.60(1H,s),7.71(2H,m),7.45(1H,dd,J＝8.8,6.1Hz),7.13(1H,d,J＝6.1Hz),3.86(3H,s),2.41(4H,m),2.95(2H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):161.6,155.5,151.2,150.7,146.4,142.7,132.7,125.5,124.0,121.4,113.2,112.6,56.1,29.4,28.6,28.4；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₆H₁₅N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 299.0854,found 299.0860.

化合物6

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.83(1H,s),8.33(2H,d,J＝8.1Hz),7.90(2H,d,J＝8.1Hz),2.96(4H,m),2.95(2H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):159.7,157.3,153.1,151.8,136.4,136.4,135.2,135.2,131.3,131.3,126.4,124.5,120.6,34.2,26.2,14.0；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₆H₁₂F₃N₂OS,[M+H]⁺:m/z 337.0622,found 337.0630.

化合物7 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.69(1H,s),8.34(1H,dd,J＝1.8,1.7Hz),8.12(1H,d,J＝8.0Hz),7.73(1H,d,J＝7.8Hz),7.47(1H,dd,J＝8.0,7.8Hz),2.93(4H,m),2.40(2H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):161.3,159.2,155.5,152.1,151.6,130.3,130.3,129.1,129.1,128.8,125.8,116.4,30.4,29.5,29.3；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₅H₁₂BrN₂OS,[M+H]⁺:m/z 346.9854,found 346.9863.

化合物8 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.54(1H,s),7.32(4H,m),7.25(1H,m),3.93(2H,s),2.88(4H,m),2.36(2H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):168.8,158.7,156.2,139.8,137.2,137.0,129.3,129.3,129.0,129.0,127.3,118.6,29.4,29.1,27.9；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₆H₁₅N₂OS,[M+H]⁺:m/z 283.0905,found 283.0914.

化合物9 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.70(1H,s),8.07(2H,d J＝8.6Hz),7.73(2H,d J＝8.6Hz),2.95(4H,m),2.41(2H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):161.3,159.2,155.5,152.1,151.6,130.3,130.3,129.1,129.1,128.8,125.8,116.4,30.4,29.5,29.3；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₅H₁₂BrN₂OS,[M+H]⁺:m/z 346.9854,found 346.9864.

化合物10 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.22(1H,s),8.99(1H,s),7.81(2H,s),2.92(4H,m),2.39(2H,m),2.23(6H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):162.8,156.7,155.6,146.4,144.0,136.5,131.1,130.9,130.9,129.6,125.0,116.5,30.8,30.1,29.9,16.5,16.5；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₇N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 313.1011,found 313.1020.

化合物11 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.61(1H,s),8.13(2H,m),7.55(3H,m),2.96(4H,m),2.41(2H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):162.9,157.3,151.8,133.6,133.6,129.3,129.3,128.1,128.1,126.9,121.6,117.0,29.8,29.0,28.8；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₅H₁₃N₂OS,[M+H]⁺:m/z 269.0749,found 269.0753.

化合物12 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.73(1H,s),8.32(2H,d,J＝8.0Hz),7.90(2H,d,J＝8.0Hz),3.28(2H,m),2.87(2H,m),1.87(2H,m),1.60(4H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.9,157.8,153.3,146.7,144.7,138.9,138.0,,128.3,127.1,126.5,123.8,122.8,121.1,31.3,29.2,26.8,26.8,25.8；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₈H₁₆F₃N₂OS,[M+H]⁺:m/z 365.0935,found 365.0942.化合物13 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):8.33(1H,m),8.15(1H,d,J＝7.8Hz),7.70(1H,d,J＝7.8Hz),7.44(1H,t,J＝7.8Hz),3.29(2H,m),2.83(2H,m),1.85(2H,m),1.61(4H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.1,155.6,149.0,146.7,141.4,141.2,133.8,132.8,128.4,127.3,126.8,125.0,33.7,31.6,29.2,28.8,28.1；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₆BrN₂OS,[M+H]⁺:m/z375.0167,found 375.0174.

化合物14 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.39(1H,s),9.71(1H,s),7.52(2H,m),7.30(1H,t,J＝7.5Hz),6.95(1H,d,J＝6.7Hz),3.29(2H,br s),2.84(2H,br s),1.85(2H,br s),1.64(4H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.6,158.3,158.3,156.4,149.0,146.3,141.0,134.2,126.8,125.8,123.0,116.5,33.6,31.4,29.1,28.7,28.1；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₇N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z313.1011,found 313.1020.

化合物15 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.20(1H,s),10.04(1H,s),8.00(2H,d,J＝8.8Hz),6.86(2H,d,J＝8.8Hz),3.27(2H,m),2.82(2H,m),1.85(2H,br s),1.62(4H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.4,157.6,155.8,149.3,147.0,141.4,132.5,132.5,125.3,125.3,125.1,124.9,34.0,31.8,29.4,29.0,28.4；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₇N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 313.1011,found 313.1019.

化合物16 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.61(1H,s),8.07(2H,d,J＝8.1Hz),7,75(2H,d,J＝8.1Hz),3.32(2H,m),2.88(2H,m),1.89(2H,br s),1.65(4H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.5,156.3,152.7,146.6,141.3,136.3,136.3,135.0,131.2,131.2,124.9,116.9,33.9,31.7,29.3,29.0,28.3；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₆BrN₂OS,[M+H]⁺:m/z 375.0167,found 375.0174.

化合物17 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.11(1H,s),8.97(1H,s),7.80(2H,s),3.28(2H,m),2.83(2H,m),2.23(6H,s),1.86(2H,br s),1.63(4H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):162.6,156.2,152.6,149.6,145.0,140.9,136.3,130.9,130.8,130.8,129.5,129.5,33.9,31.5,29.3,28.9,28.3,16.4,16.4；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₉H₂₁N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 341.1324,found 341.1331.

化合物18 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.52(1H,s),7.41-7.29(4H,m),7.25(1H,br s)3.91(2H,s),3.23(2H,br s),2.80(2H,br s),1.84(2H,s),1.59(4H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.8,152.4,151.9,131.9,131.9,131.8,131.8,131.6,131.6,129.8,129.8,116.6,39.7,33.6,31.1,29.0,28.7,28.0；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₈H₁₉N₂OS,[M+H]⁺:m/z 311.1218,found 311.1223.

化合物19 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):7.63(4H,m),7.44(4H,m),7.34(1H,m),3.92(2H,s),3.23(2H,m),2.77(2H,m),1.82(2H,m),1.56(4H,m)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.2,158.6,157.4,145.9,143.6,143.1,139.2,138.5,129.8,129.8,128.4,128.4,128.2,128.2,127.6,126.4,126.4,122.5,37.2,31.4,29.0,26.8,26.5,25.8；HRMS(ESI)⁺calculated for C₂₄H₂₃N₂OS,[M+H]⁺:m/z 387.1531,found 387.1540.

反應(yīng)試劑和條件：(a)NCCH₂CO₂Et,S₈,EtOH,Et₃N,回流,12h；(b)腈,二氧六環(huán)/HCl,100℃,12h。

化合物20 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.51(1H,s),7.73(1H,d,J＝7.9Hz),7.68(1H,t,J＝1.9Hz),7.42(1H,t,J＝8.2Hz),7.13(1H,dq,J＝8.2,0.7Hz),3.85(3H,s),3.13(1H,m),2.87(1H,dd,J＝16.5,4.9Hz),2.76(1H,m),2.36(1H,m),1.89(2H,m),1.41(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.6Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):163.0,160.0,157.0,151.2,142.0,135.1,134.1,126.7,125.4,124.5,122.8,114.6,57.5,34.5,31.3,31.1,26.5,21.6；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₈H₁₉N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 327.1167,found 327.1170.

化合物21¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.74(1H,s),8.33(2H,d,J＝8.4Hz),7.90(2H,d,J＝8.4Hz),3.13(1H,m),2.90(1H,dd,J＝17.8,5.5Hz),2.83(1H,m),2.40(1H,m),1.90(2H,m),1.40(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.5Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):159.9,156.3,151.4,142.8,135.3,130.9,130.9,129.7,129.6,129.2,126.3,125.0,123.6,34.7,31.4,31.1,26.5,21.7；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₈H₁₆F₃N₂OS,[M+H]⁺:m/z 365.0935,found 365.0941.

化合物22 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.60(1H,s),8.31(1H,s),8.13(1H,d,J＝8.0Hz),7.77(1H,d,J＝7.9Hz),7.48(1H,t,J＝8.0Hz),3.13(1H,m),2.88(1H,dd,J＝17.2,4.7Hz),2.80(1H,m),2.38 1H,m),1.90(2H,m),1.38(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.4Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):161.0,156.0,151.2,142.4,141.5,141.5,135.1,133.9,133.9,133.0,128.5,127.4,126.8,34.5,31.3,31.0,26.5,21.6；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₆BrN₂OS,[M+H]⁺:m/z 375.0167,found 375.0178.

化合物23 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.65(1H,m),8.10(2H,m),3.13(1H,m),2.89(1H,m),2.78(1H,m),2.39(1H,m),1.89(2H,m),1.38(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.7Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):159.9,156.2,154.5,153.7,151.8,148.8,146.1,142.9,135.2,124.9,122.1,115.8,34.7,31.4,31.1,26.6,21.7；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₄F₃N₂OS,[M+H]⁺:m/z 351.0779,found 351.0087.

化合物24 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.4(1H,s),9.73(1H,s),7.55(2H,m),7.30(1H,t,J＝7.7Hz),6.95(1H,ddd,J＝8.1,2.4,0.8Hz),3.12(1H,m),2.83(1H,dd,J＝16.6,4.7Hz),2.75(1H,m),2.36(1H,m),1.87(2H,m),1.38(1H,m),1.06(3H,d,J＝6.6Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):159.9,158.6,157.2,151.2,142.2,135.2,134.5,127.1,126.1,124.7,123.3,116.7,34.7,31.4,31.2,26.6,21.7；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₇N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 313.1011,found 313.1020.

化合物25 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.25(1H,s),10.15(1H,s),8.01(2H,d,J＝8.7Hz),6.87(2H,d,J＝8.7Hz),6.87(2H,d,J＝8.7Hz),3.11(1H,m),2.84(1H,m),2.75(1H,m),2.35(1H,m),1.88(2H,m),1.40(1H,m),1.06(3H,d,J＝6.5Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):165.2,160.0,156.5,151.3,141.1,134.9,132.6,132.6,123.7,119.9,119.9,117.4,34.4,31.3,31.1,26.4,21.6；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₇N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 313.1011,found 313.1022.

化合物26 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.59(1H,s),8.07(2H,d,J＝8.5Hz),7.73(2H,dt,J＝8.7,1.9Hz),3.13(1H,m),2.88(1H,dd,J＝16.6,4.8Hz),2.78(1H,m),2.33(1H,m),1.88(2H,m),1.39(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.6Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.3,156.7,151.5,142.2,136.4,136.4,135.2,135.1,131.2,131.2,124.6,124.3,34.6,31.4,31.1,26.5,21.7；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₆BrN₂OS,[M+H]⁺:m/z 375.0088,found 375.0093.

化合物27 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.12(1H,s),8.97(1H,s),7.79(2H,s),3.10(1H,m),2.83(1H,dd,J＝16.6,4.6Hz),2.73(1H,m),2.34(1H,m),2.22(6H,s),1.87(2H,m),1.37(1H,m),1.06(3H,d,J＝6.5Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):162.7,160.2,156.6,151.5,140.7,134.9,130.9,130.9,129.6,129.6,123.5,116.4,34.5,31.4,31.1,26.5,21.6,16.4,16.4；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₉H₂₁N₂O₂S,[M+H]⁺:m/z 341.1324,found 341.1330.

化合物28 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.57(1H,s),9.78(1H,s),7.52(2H,m),7.32(1H,t,J＝7.9Hz),6.98(1H,ddd,J＝8.1,2.4,0.6Hz),4.03(2H,s),3.11(4H,s),2.66(3H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):159.6,158.8,154.4,134.6,134.6,131.5,129.6,127.1,126.7,123.7,123.4,117.1,54.4,54.1,45.3,45.3,24.6；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₇N₂OS,[M+H]⁺:m/z 297.1062,found 297.1071.

化合物29 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.45(1H,s),7.31(4H,m),7.24(1H,m),3.90(2H,s),3.01(1H,m),2.77(1H,dd,J＝16.8,4.8Hz),2.69(1H,m),2.31(1H,m),1.84(2H,m),1.34(1H,m),1.03(3H,d,J＝6.6Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):161.8,159.4,150.5,141.7,134.9,132.3,132.3,132.1,131.9,131.9,130.1,124.7,40.1,34.5,31.4,31.1,26.5,21.6；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₈H₁₉N₂OS,[M+H]⁺:m/z 311.1218,found 311.1222.

化合物30 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):12.50(1H,s),7.64(4H,m),7.45(4H,m),7.34(1H,m),3.96(2H,s),3.06(1H,m),2.81(1H,dd,J＝16.6,4.7Hz),2.71(1H,m),2.32(1H,m),1.85(2H,m),1.35(1H,m),1.03(3H,d,J＝6.5Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):161.4,159.4,150.5,145.4,141.7,141.6,134.8,132.4,132.4,130.9,130.9,130.6,130.6,130.1,129.4,128.8,128.8,124.7,39.7,34.5,31.4,31.1,26.5,21.7；HRMS(ESI)⁺calculated for C₂₄H₂₃N₂OS,[M+H]⁺:m/z 387.1531,found 387.1540.

化合物31 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.57(1H,s),7.73(1H,d,J＝7.8Hz),7.69(1H,m),7.44(1H,dd,J＝8.5,7.8Hz),7.13(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz),3.85(3H,s),3.60(2H,s),2.99(2H,m),2.70(2H,m),2.39(3H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.1,158.6,156.3,141.8,134.0,133.4,131.4,129.4,128.9,128.4,127.0,123.4,54.5,54.3,45.4,45.4,24.7；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₈N₃O₂S,[M+H]⁺:m/z 328.1120,found 328.1131.

化合物32 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.83(1H,s),8.34(2H,d,J＝8.2Hz),7.96(2H,d,J＝8.2Hz),3.61(2H,s),2.99(2H,m),2.69(2H,m),2.39(3H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.0,159.8,154.7,134.4,134.4,131.6,129.4,127.0,126.3,123.3,123.3,115.0,115.0,57.7,54.4,45.4,24.6；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₅F₃N₃OS,[M+H]⁺:m/z 366.0888,found 366.0897.

化合物33 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.83(1H,s),8.40(1H,t,J＝1.8,1.7Hz),8.23(1H,ddd,J＝8.0,1.4,1.1Hz),7.58(1H,m),7.37(1H,dd,J＝8.0,7.8Hz),3.50(2H,s),2.96(2H,m),2.63(2H,m),2.37(3H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.7,158.4,158.4,140.3,140.0,131.1,129.5,129.5,129.3,126.5,123.8,123.3,54.6,54.4,45.4,24.7；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₆H₁₅BrN₃OS,[M+H]⁺:m/z 376.0119,found 376.0126.

化合物34 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.55(1H,s),8.12(2H,d,J＝8.0Hz),7.54(2H,d,J＝8.0Hz),3.12(2H,s),2.82(2H,m),2.38(2H,m),1.90(3H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.2,157.5,157.5,151.2,141.9,138.8,135.1,132.7,132.7,130.0,125.5,124.7,34.5,31.3,26.5,21.6；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₆H₁₆N₃O₂S,[M+H]⁺:m/z 314.0963,found 314.0973.

化合物35 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.05(2H,d,J＝8.7Hz),6.78(2H,d,J＝8.7Hz),3.49(2H,s),2.95(2H,m),2.63(2H,m),2.36(3H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):165.2,160.0,156.5,151.3,141.1,134.9,132.6,132.6,123.7,119.9,119.9,117.4,34.4,31.3,31.1,26.4；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₇H₁₈N₃O₂,[M+H]⁺:m/z 296.1399,found 296.1402.

化合物36 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.18(1H,s),8.99(1H,s),7.83(2H,s),3.56(2H,s),2.96(2H,m),2.67(2H,m),2.38(3H,s),2.23(6H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):160.3,159.9,158.9,154.0,131.5,131.5,131.5,129.9,129.9,128.2,122.1,115.8,54.4,54.2,45.4,24.5,16.5,16.5；HRMS(ESI)⁺calculated for C₁₈H₂₀N₃O₂S,[M+H]⁺:m/z 342.1276,found 342.1280.

化合物37 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.58(1H,s),7.63(4H,m),7.44(4H,m),7.35(1H,m),3.97(2H,s),3.52(2H,m),2.91(2H,m),2.67(2H,m)2.35(3H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):164.7,159.0,153.5,145.9,141.7,132.6,132.6,131.4,131.0,131.0,130.8,130.8,130.2,130.2,129.4,129.0,129.0,128.5,54.3,54.1,45.4,40.3,24.5；HRMS(ESI)⁺calculated for C₂₃H₂₂N₃OS,[M+H]⁺:m/z 388.1484,found 388.1494.

化合物38 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.58(1H,br s),7.74-7.69(2H,m),7.45-7.28(6H,m),7.13(1H,d,J＝7.0Hz),3.85(3H,s),3.72(2H,s),3.64(2H,s),2.98(2H,br s),2.79(2H,br s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):162.8,159.1,154.1,152.1,133.8,133.3,132.3,132.3,131.7,131.7,130.0,128.2,126.5,125.8,122.8,119.4,116.5,114.3,63.6,57.2,51.7,51.3,24.2；HRMS(ESI)⁺calculated for C₂₃H₂₂N₃O₂S,[M+H]⁺:m/z 404.1433,found 404.1434.

化合物39 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.19(1H,s),8.99(1H,s),7.81(2H,s),7.39-7.27(5H,m),3.72(2H,s),3.62(2H,s),2.96(2H,br s),2.79(2H,br s),2.22(6H,s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):164.0,157.7,156.6,151.7,131.6,130.6,130.6,130.0,130.0,129.6,129.3,129.3,127.7,127.7,126.5,126.4,119.9,113.6,61.9,50.0,49.6,22.4,14.3,14.3；

HRMS(ESI)⁺calculated for C₂₄H₂₄N₃O₂S,[M+H]⁺:m/z 418.1589,found 418.1597.

化合物40 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.57(1H,s),8.13(2H,d,J＝7.0Hz),7.59-7.50(3H,m),7.39-7.26(5H,m),3.72(2H,s),3.64(2H,s),2.98(2H,br s),2.79(2H,br s)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):162.2,159.2,159.2,153.7,152.1,139.1,133.3,132.5,132.5,132.3,132.3,131.7,131.7,130.0,130.0,129.3,125.0,122.7,63.7,51.7,51.4,24.2；HRMS(ESI)⁺calculated for C₂₂H₂₀N₃OS,[M+H]⁺:m/z 374.1327,found 374.1330.

化合物41 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.80(1H,s),8.33(2H,d,J＝8.2Hz),7.89(2H,d,J＝8.2Hz),7.39-7.26(5H,m),3.72(2H,s),3.65(2H,s),2.89(2H,t,J＝5.8Hz),2.72(2H,t,J＝5.8Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):164.0,157.9,155.7,155.4,137.5,131.1,130.1,130.1,129.5,129.5,128.8,128.4,128.4,128.2,126.8,126.0,123.9,121.2,120.6,61.3,49.6,49.3,22.0；HRMS(ESI)⁺calculated for C₂₃H₁₉F₃N₃OS,[M+H]⁺:m/z 442.1201,found 442.1210.

化合物42 ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.08(2H,d,J＝8.7Hz),7.39-7.26(5H,m),6.76(2H,d,J＝8.7Hz),3.68(2H,s),3.54(2H,s),2.89(2H,t,J＝5.8Hz),2.72(2H,t,J＝5.8Hz)；¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δ(ppm):164.2,157.4,156.6,151.6,131.5,131.0,131.0,130.4,130.4,129.8,129.8,129.5,126.5,126.3,120.0,118.7,118.7,118.0,61.8,49.9,49.8,22.3；HRMS(ESI)⁺calculated for C₂₂H₂₀N₃O₂S,[M+H]⁺:m/z 390.1276,found 390.1280.

試驗例1化合物1～42的BRD4抑制活性及自噬率活性

本實驗的目的是檢測本發(fā)明的化合物對體外BRD4抑制活性，及對細(xì)胞的自噬率活性，其結(jié)果見表1。

1、AlphaScreen檢測

所有的試劑稀釋在50毫米hepes、100mM NaCl，0.1％牛血清白蛋白，pH值為7.4，添加0.05％CHAPS允許平衡至室溫。配體濃度范圍配制為0～100μM，取4μL加入到384板中，再加入4μLBRD4(1)酶(250nM)，室溫密封孵育30分鐘，之后加入等摩爾的生物素肽H-SGRGK(Ac)GGK(Ac)GLGK-(Ac)GGAK(Ac)RHRK(Biotin)-OH。在弱光條件下，密封進(jìn)一步孵育30分鐘后加入4μL鏈霉親和素(25μ克/毫升)和4μl鎳螯合物受體珠(25μ克/毫升)。板箔密封，避光，室溫孵育60min，上板閱讀器讀取(PHERAstar FS BMG LABTECH)使用AlphaScreen 680勵磁/570發(fā)射濾波器組。IC₅₀計算用Prism 6.0。

2、細(xì)胞活性檢測

MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞在96孔平底微量滴定板的密度為5×104細(xì)胞/毫升。孵育24小時后，細(xì)胞用不同濃度的化合物處理。細(xì)胞存活實驗采用MTT法測定。5mg/mL MTT添加到每個孔中。孵育4小時后，移除溶媒，在加入150微升DMSO易溶解晶體。在570nm測定吸光度值。

3、自噬活性篩選

MCF-7細(xì)胞用5μM的化合物處理，孵育6小時。然后在37℃加入0.05mM MDC孵育30min。利用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

表1化合物1～42 BRD4抑制活性及自噬率活性

實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物對BRD4具有不同程度的抑制活性及自噬活性，其中，化合物5、化合物15、化合物17、化合物18、化合物35、化合物36的效果較好，最優(yōu)的，化合物36(記為FL-411)對BRD4具有較強(qiáng)的抑制活性及自噬活性。

試驗例2 FL-411誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡

我們觀察到FL-411能誘導(dǎo)大量的細(xì)胞質(zhì)空泡化在處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞時，這與自噬密切相關(guān)。因此，我們研究是否FL-411能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬。MDC是一種自噬泡的檢測探針，應(yīng)用于FL-411處理細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察并拍照發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生大量綠色熒光點(diǎn)(圖1)。隨后，我們在電鏡下觀察自噬的形態(tài)標(biāo)志，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生了廣泛的空泡(圖2)。細(xì)胞自噬被GFP-LC3的轉(zhuǎn)染和LC3免疫熒光所證實(圖3，圖4)。為了進(jìn)一步確證FL-411能夠誘導(dǎo)自噬，我們發(fā)現(xiàn)FL-411處理過的細(xì)胞Beclin-1表達(dá)增加，自噬底物p62/SQSTM1發(fā)生下調(diào)；同時自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ呈現(xiàn)時間依賴性的聚集(圖5)。接下來，我們使用了溶酶體抑制劑，BafA1，來驗證自噬流的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)在BafA1存在下LC3-II和p62/SQSTM1發(fā)生了明顯的聚集，表明自噬流被FL-411加強(qiáng)了(圖6)。為了進(jìn)一步確定FL-411誘導(dǎo)的自噬是細(xì)胞毒性和細(xì)胞保護(hù)作用，我們應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤，它能抑制細(xì)胞自噬體的形成通過抑制III型磷脂酰肌醇-3激酶。應(yīng)用MTT法評估了細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率顯著增加在用3-MA處理后(圖7)。以上結(jié)果表明FL-411又到了自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中。

試驗例3 FL-411誘導(dǎo)的自噬是通過BRD4-AMPK-mTOR-ULK信號通路

因為BRD4是很多酪氨酸激酶激活的反饋，包括PI3K/AKT。因此，我們研究了自噬信號的上游機(jī)制來闡明FL-411誘導(dǎo)的自噬。首先，我們檢測了AKT，p-AKT(Ser473)、p-Akt(Thr308)，mTOR和p-mTOR(ser2448)的表達(dá)在FL-411處理后。正如預(yù)期的那樣，F(xiàn)L-411能明顯降低p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)和p-mTOR(ser2448)的表達(dá)，同時Akt和mTOR的表達(dá)均不變(圖8)。因為ULK1復(fù)合體與自噬小體的形成密切相關(guān)。我們隨后檢查了ULK1，p-ulk1(ser317)、Atg13，p-atg13(ser318)和FIP200的表達(dá)。結(jié)果表明，在FL-411處理后，ULK1和Atg13磷酸化顯著增加；而ULK1，Atg13和FIP200略有下調(diào)；表明FL-411能夠通過ULK1復(fù)合體調(diào)節(jié)自噬(圖9)。為了探索FL-411誘導(dǎo)的自噬是否僅與BRD4抑制相關(guān)，我們使用了兩種特異性siRNA抑制BRD4的表達(dá)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)沉默BRD4能夠降低c-myc原癌基因的表達(dá)，這與FL-411處理效果一致。但是，不同于FL-411的處理，AMPKα和ULK1的表達(dá)和磷酸化及LC3-II聚集和p62降解在BRD4敲降后能夠被改變。這表明BRD4的沉默不能夠誘導(dǎo)自噬(圖10)。綜上，F(xiàn)L-411誘導(dǎo)的自噬是通過BRD4-AMPK-mTOR-ULK信號通路。

試驗例4 FL-411在體內(nèi)具有潛在治療作用通過靶向BRD4調(diào)控的自噬

為了評價FL-411體內(nèi)抗腫瘤活性，兩個乳腺腫瘤異種移植模型即MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞模型分別被使用。我們使用了三種不同劑量的FL-411體內(nèi)研究：25毫克/千克，50毫克/千克和100毫克/公斤。在所有的模型中，F(xiàn)L-411表現(xiàn)出明顯的腫瘤生長的抑制作用并呈劑量依賴性在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞模型的腫瘤生長抑制率分別為80％和76％(圖11，圖12)。我們觀察到在所有劑量組的腫瘤重量都顯著減少(圖13)。并且，F(xiàn)L-411顯示在所有治療組中對體重均無明顯影響(圖14)。為了檢查是否FL-411調(diào)節(jié)的體內(nèi)抑制腫瘤生長是與減少細(xì)胞增殖和增加自噬性細(xì)胞死亡相關(guān)。我們對腫瘤組織進(jìn)行了Ki-67和LC3的免疫組化分析。我們發(fā)現(xiàn)FL-411能夠顯著減少Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量并且增加自噬水平(圖15)。接下來，我們進(jìn)行了免疫印跡分析，進(jìn)一步明確FL-411體內(nèi)機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)FL-411能夠顯著LC3Ⅱ的積累和caspase3活化及抑制BRD4和c-Myc的表達(dá)。這基本與免疫組化分析結(jié)果和體外獲得的結(jié)果一致(圖16)。此外，我們利用斑馬魚異種移植模型，進(jìn)一步確證了FL-411的抗腫瘤作用。與對照組相比，我們發(fā)現(xiàn)所有三個劑量的FL-411明顯抑制腫瘤的生長(圖17，圖18)。綜上，這些結(jié)果表明FL-411在小鼠異種移植和斑馬魚模型中都具有良好的抗腫瘤活性。