本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種中藥提取物組合誘導(dǎo)增強(qiáng)型cik細(xì)胞的制備方法及其在cik功能活性方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，目前常規(guī)的手術(shù)和放化療等治療方法均不能徹底清除體內(nèi)的癌細(xì)胞，體內(nèi)回輸免疫活性細(xì)胞的過(guò)繼免疫治療法可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫力，從而成為腫瘤治療的重要輔助手段。免疫細(xì)胞治療包括nk、lak、cik、dc-cik、til等，其中，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-inducedkillercells，cik細(xì)胞）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種非常有前景的過(guò)繼免疫細(xì)胞，兼具t淋巴細(xì)胞的強(qiáng)大抗腫瘤活性和nk細(xì)胞非mhc限制性殺瘤功能，具有增值迅速、殺瘤活性光譜且高效、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，已成為了腫瘤免疫治療領(lǐng)域的一種新選擇。目前，cik作為一種過(guò)繼免疫治療細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中已被用于治療多類(lèi)實(shí)體瘤及非實(shí)體瘤。cik細(xì)胞毒性分子觸發(fā)機(jī)制使得cik對(duì)一系列腫瘤或新鮮分離的腫瘤組織具有潛在毒性，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓白血病以及b淋巴瘤細(xì)胞等。除了造血細(xì)胞癌，從病人或健康志愿者分離誘導(dǎo)產(chǎn)生的cik在體外也有同樣的強(qiáng)抗腫瘤活性，能殺傷多種實(shí)體瘤，如肝癌、胃癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等。研究表明，cik細(xì)胞在體外對(duì)正常骨髓細(xì)胞及脾細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性，但是殺傷腫瘤細(xì)胞特異性很強(qiáng)。cik細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤免疫治療中有著重要作用，但其治療效果與細(xì)胞輸注劑量、效應(yīng)細(xì)胞比例和對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性有著密切關(guān)系，而cik細(xì)胞的增殖和殺瘤活性依賴(lài)于多種細(xì)胞因子及外源因子的刺激，因此cik細(xì)胞在臨床上應(yīng)用受到其在體外增殖活性及體內(nèi)殺瘤活性的限制，研究如何提高其體外的增殖效率和毒性是首要解決的問(wèn)題。白術(shù)多糖(pam)是白術(shù)的主要活性成分，主要是由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖組成的雜多糖，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化及抗衰老、抗腫瘤、降血糖等作用。枸杞多糖（lbp）是枸杞的主要活性成分，實(shí)驗(yàn)證明枸杞多糖可通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)免疫功能及抗腫瘤目的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為培養(yǎng)出更具有高效殺瘤活性又能大量擴(kuò)增的cik細(xì)胞，本發(fā)明的目的在于提供一種中藥誘導(dǎo)增強(qiáng)型cik細(xì)胞的制備方法，該方法能促進(jìn)cik細(xì)胞體外增殖能力，使其能高效擴(kuò)增，同時(shí)又可以提高cik細(xì)胞體外殺傷腫瘤細(xì)胞的效率，且通過(guò)該方法可增強(qiáng)cik的免疫細(xì)胞活性。本發(fā)明提供了一種cik細(xì)胞培養(yǎng)基，包括：無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞因子和白術(shù)多糖和枸杞多糖。優(yōu)選地，所述無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括gt-t551無(wú)血清培養(yǎng)基。優(yōu)選地，還包括血清。所述血清在無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的體積百分含量約為10％。優(yōu)選地，所述細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-2（il-2）、抗cd3單克隆抗體(cd3mab)的一種或兩種。優(yōu)選地，所述的細(xì)胞因子包括培養(yǎng)基中終濃度為500ng/ml的抗cd3單克隆抗體及終濃度為1000u/ml的白介素-2。所述白術(shù)多糖在cik細(xì)胞培養(yǎng)液中的作用濃度為100μg/ml~200μg/ml，枸杞多糖在cik細(xì)胞培養(yǎng)液中的作用濃度為100μg/ml~200μg/ml。優(yōu)選地，其特征在于所述的白術(shù)與枸杞提取物是在cik細(xì)胞培養(yǎng)至第7-9天時(shí)加入，加入藥物的作用時(shí)間為72h。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：先從人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)成cik細(xì)胞。在cik細(xì)胞基本成熟后，向cik細(xì)胞培養(yǎng)液中加入白術(shù)和枸杞提取物來(lái)激活cik細(xì)胞活性與功能，通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)白術(shù)和枸杞提取物對(duì)cik細(xì)胞增殖、殺瘤及免疫活性方面的影響，所述的白術(shù)和枸杞提取物為白術(shù)多糖和枸杞多糖。進(jìn)一步的，本發(fā)明的中藥誘導(dǎo)增強(qiáng)型cik細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：1)外周血采集：請(qǐng)專(zhuān)業(yè)醫(yī)務(wù)采血人員通過(guò)靜脈采血方式采集健康自愿者血液20ml到含有肝素鈉抗凝劑的真空采血管中，反復(fù)顛倒采血管幾次。2）外周血單個(gè)核細(xì)胞（pbmcs）分離：將血液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，離心，轉(zhuǎn)移上層血漿，加入生理鹽水稀釋剩余血樣，采用醫(yī)用級(jí)人淋巴細(xì)胞分離液通過(guò)密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞，用rpmi-1640洗滌獲得的單個(gè)核細(xì)胞沉淀。3）pbmcs誘導(dǎo)培養(yǎng)成cik細(xì)胞：加入無(wú)血清gt-t551基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸打散細(xì)胞沉淀，再加入抗cd3單克隆抗體(cd3mab)至終濃度500ng/ml、白介素-2（il-2）終濃度為1000u/ml及體積分?jǐn)?shù)為10%的血清，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至t175瓶中，置于37℃、5%co2、90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天觀(guān)察cik細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞培養(yǎng)基顏色發(fā)黃，適當(dāng)補(bǔ)液。每3天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1.5-2.0×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度補(bǔ)加cik培養(yǎng)液或半量換液。4）加入白術(shù)多糖和枸杞多糖處理cik細(xì)胞：cik培養(yǎng)至7-9天時(shí)，在cik細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0ug/ml～200ug/ml濃度的白術(shù)多糖和枸杞多糖混合液，作用cik細(xì)胞72h。5）通過(guò)cck法檢測(cè)cik細(xì)胞的增殖活性及殺瘤活性，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cik細(xì)胞中cd3+cd56+、cd3+cd8+細(xì)胞百分含量。本發(fā)明提供了一種白術(shù)多糖和枸杞多糖在制備免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的cik細(xì)胞培養(yǎng)方法在cik細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加了白術(shù)多糖和枸杞多糖，白術(shù)多糖和枸杞多糖能夠提高cik細(xì)胞的增殖活性及殺瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明提供的cik細(xì)胞培養(yǎng)基，在cik細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)加入白術(shù)多糖和枸杞多糖作用72h，在其濃度為100μg/ml~200μg/ml實(shí)驗(yàn)組中，cik活細(xì)胞數(shù)顯著增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義（p<0.05)；在cik細(xì)胞培養(yǎng)至第9天時(shí)加入白術(shù)多糖和枸杞多糖作用72h，在其濃度為100μg/ml~200μg/ml實(shí)驗(yàn)組中，cik細(xì)胞殺瘤效果也明顯提高，約83.7%-88.8%；另外，白術(shù)多糖和枸杞多糖濃度為100μg/ml~200μg/ml實(shí)驗(yàn)組中cd3+cd56+、cd3+cd8+細(xì)胞百分含量也顯著增多，cd3+cd56+約占40.28%，cd3+cd8+細(xì)胞約占84.02%。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的cik細(xì)胞增殖活性曲線(xiàn)圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的cik細(xì)胞對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株hela殺傷率。圖3（a為對(duì)照組，b為實(shí)驗(yàn)組）為本發(fā)明實(shí)施例3的cik細(xì)胞中cd3+cd56+細(xì)胞百分含量流式結(jié)果。圖4（c為對(duì)照組，d為實(shí)驗(yàn)組）為本發(fā)明實(shí)施例3的cik細(xì)胞中cd3+cd8+細(xì)胞百分含量流式結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種中藥誘導(dǎo)增強(qiáng)型cik細(xì)胞的制備方法及其在cik細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明使用的試劑及儀器皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明：實(shí)施例11、密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（pbmcs），步驟為：1）外周血采集：請(qǐng)專(zhuān)業(yè)醫(yī)務(wù)采血人員通過(guò)靜脈采血方式采集健康自愿者血液30ml到含有肝素鈉抗凝劑的真空采血管中，反復(fù)顛倒采血管幾次。2）收集血清：將血液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，1000g離心10min，離心完成后形成上層血清和下層細(xì)胞兩相。收集上層血漿至新的離心管，做好標(biāo)記，56度水浴30min滅活，備用。3）樣品稀釋?zhuān)杭尤肷睇}水稀釋剩下的細(xì)胞層至體積為30ml，用移液管充分吹打均勻。4）梯度離心：取另一50ml離心管加入15ml人血淋巴細(xì)胞分離液，用10ml移液管將稀釋血樣緩緩轉(zhuǎn)移至分離液上方，形成上下兩相。22℃，390g離心30min。5）收集白膜層：離心完成后，離心管內(nèi)液相分為四層，從下往上分別為血漿(含血小板)、白膜層(即單個(gè)核細(xì)胞)、淋巴分離液、紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層，用10ml移液管或1ml移液器小心收集中間的白膜層至新50ml離心管。6）清洗：于收集了白膜層的離心管中加rpmi-1640至45ml，混勻，22℃，1000g離心10min，棄去上清。7）重復(fù)步驟6）一遍，并在離心前取20ul細(xì)胞懸液進(jìn)行苔盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)。2、pbmcs加入cik細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)：按細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)/ml加入無(wú)血清gt-t551基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸打散細(xì)胞沉淀，再加入抗cd3單克隆抗體(cd3mab)至終濃度500ng/ml、白介素-2（il-2）終濃度為1000u/ml及體積分?jǐn)?shù)為10%的血清。3、細(xì)胞種瓶：轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至t175瓶中，置于37℃、5%co2、90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，該天定為第0天（d0）。隔天觀(guān)察cik細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞培養(yǎng)基顏色發(fā)黃，適當(dāng)補(bǔ)液。每3天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1.5-2.0×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度補(bǔ)加cik培養(yǎng)液或半量換液。4、在cik細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)加入白術(shù)多糖和枸杞多糖混合液處理cik細(xì)胞，作用72h：1)cik細(xì)胞鋪板：將培養(yǎng)7天的cik細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2×105個(gè)/ml，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液100μl/孔，每孔2×104個(gè)細(xì)胞。2)加入白術(shù)多糖及枸杞多糖：設(shè)置對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組分為2組，每個(gè)組4個(gè)平行復(fù)孔，在鋪好cik細(xì)胞的孔中分別加入cik細(xì)胞培養(yǎng)基含終濃度為100μg/ml、200μg/ml白術(shù)多糖及枸杞多糖混合液各100μl/孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。5、cck-8法檢測(cè)細(xì)胞活性：培養(yǎng)72h后每孔加入10μlcck-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞在450nm處吸光值(吸光值的大小與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比)，記錄結(jié)果并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。6、cik細(xì)胞增殖活性結(jié)果分析。1)將對(duì)照組（生理鹽水）與實(shí)驗(yàn)組中2個(gè)不同濃度的白術(shù)多糖及枸杞多糖混合液處理cik細(xì)胞后，不同組cik細(xì)胞在od450的讀值如表1。相比對(duì)照組（生理鹽水），實(shí)驗(yàn)組1（100μg/ml）及實(shí)驗(yàn)組2（200μg/ml）的od值明顯提高，表明兩組的活細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增加，說(shuō)明100μg/ml及200μg/ml濃度的白術(shù)多糖及枸杞多糖混合液能明顯促進(jìn)cik細(xì)胞的增殖。實(shí)施例21、密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（pbmcs），步驟為：1）外周血采集：請(qǐng)專(zhuān)業(yè)醫(yī)務(wù)采血人員通過(guò)靜脈采血方式采集健康自愿者血液30ml到含有肝素鈉抗凝劑的真空采血管中，反復(fù)顛倒采血管幾次。2）收集血清：將血液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，1000g離心10min，離心完成后形成上層血清和下層細(xì)胞兩相。收集上層血漿至新的離心管，做好標(biāo)記，56度水浴30min滅活，備用。3）樣品稀釋?zhuān)杭尤肷睇}水稀釋剩下的細(xì)胞層至體積為30ml，用移液管充分吹打均勻。4）梯度離心：取另一50ml離心管加入15ml人血淋巴細(xì)胞分離液，用10ml移液管將稀釋血樣緩緩轉(zhuǎn)移至分離液上方，形成上下兩相。22℃，390g離心30min。5）收集白膜層：離心完成后，離心管內(nèi)液相分為四層，從下往上分別為血漿(含血小板)、白膜層(即單個(gè)核細(xì)胞)、淋巴分離液、紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層，用10ml移液管或1ml移液器小心收集中間的白膜層至新50ml離心管。6）清洗：于收集了白膜層的離心管中加rpmi-1640至45ml，混勻，22℃，1000g離心10min，棄去上清。7）重復(fù)步驟6）一遍，并在離心前取20ul細(xì)胞懸液進(jìn)行苔盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)。2、pbmcs加入cik細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)：按細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)/ml加入無(wú)血清gt-t551基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸打散細(xì)胞沉淀，再加入抗cd3單克隆抗體(cd3mab)至終濃度500ng/ml、白介素-2（il-2）終濃度為1000u/ml及體積分?jǐn)?shù)為10%的血清。3、細(xì)胞種瓶：轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至t175瓶中，置于37℃、5%co2、90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，該天定為第0天（d0）。隔天觀(guān)察cik細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞培養(yǎng)基顏色發(fā)黃，適當(dāng)補(bǔ)液。每3天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1.5-2.0×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度補(bǔ)加cik培養(yǎng)液或半量換液。4、在cik細(xì)胞培養(yǎng)至第9天時(shí)加入白術(shù)多糖和枸杞多糖混合液處理cik細(xì)胞，作用72h：1）cik細(xì)胞鋪板：取培養(yǎng)至9d的cik細(xì)胞數(shù)調(diào)整至3×106個(gè)/ml，于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液1ml/孔。2）加入白術(shù)多糖及枸杞多糖：設(shè)置對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組分為2組，每個(gè)組2個(gè)平行對(duì)照孔，在鋪好cik細(xì)胞的孔中分別加入cik細(xì)胞培養(yǎng)基含終濃度為100μg/ml、200μg/ml白術(shù)多糖及枸杞多糖混合液各1ml/孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。3）接種hela細(xì)胞：在cik細(xì)胞加入白術(shù)多糖和枸杞多糖作用48h后（11d），將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hela細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，于96孔板中接種細(xì)胞懸液100μl/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。4）cik殺傷hela細(xì)胞：cik細(xì)胞加入白術(shù)多糖和枸杞多糖作用72h后（d12）進(jìn)行cik殺傷hela細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。棄去hela舊的培養(yǎng)液，分別按效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞為20:1比例調(diào)整五組cik細(xì)胞（懸浮細(xì)胞）至相應(yīng)數(shù)目，按每孔100μlcik細(xì)胞懸液加入hela細(xì)胞孔中，每個(gè)比例4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)每個(gè)比例設(shè)對(duì)應(yīng)的單獨(dú)靶細(xì)胞和單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。5）cck-8法檢測(cè)殺傷活性：培養(yǎng)4h后每孔加入10μlcck-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h。5、細(xì)胞殺傷活力的檢測(cè)：培養(yǎng)4h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔在450nm處吸光值，記錄數(shù)據(jù)并按照以下公式計(jì)算殺傷率，殺傷率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組的od值-單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞組的od值)/單獨(dú)靶細(xì)胞組的od值]×l00%。6、細(xì)胞殺傷活力結(jié)果分析。1)將對(duì)照組（生理鹽水）與實(shí)驗(yàn)組中2個(gè)不同濃度的白術(shù)多糖及枸杞多糖混合液處理cik細(xì)胞，然后殺傷hela細(xì)胞，cik細(xì)胞的殺傷率如表2。組別效靶比殺傷率顯著性（p）對(duì)照組20:171.5%±1.1%實(shí)驗(yàn)組1（100μg/ml）20:183.7%±2%**p<0.01實(shí)驗(yàn)組2（200μg/ml）20:188.8%±2.2%***p<0.001相比對(duì)照組（生理鹽水），實(shí)驗(yàn)組1（100μg/ml）及實(shí)驗(yàn)組2（200μg/ml）的殺傷率顯著提高，說(shuō)明100μg/ml及200μg/ml濃度的白術(shù)多糖及枸杞多糖混合液能明顯提高cik細(xì)胞的殺瘤活性。實(shí)施例31、密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（pbmcs），步驟為：1）外周血采集：請(qǐng)專(zhuān)業(yè)醫(yī)務(wù)采血人員通過(guò)靜脈采血方式采集健康自愿者血液30ml到含有肝素鈉抗凝劑的真空采血管中，反復(fù)顛倒采血管幾次。2）收集血清：將血液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，1000g離心10min，離心完成后形成上層血清和下層細(xì)胞兩相。收集上層血漿至新的離心管，做好標(biāo)記，56度水浴30min滅活，備用。3）樣品稀釋?zhuān)杭尤肷睇}水稀釋剩下的細(xì)胞層至體積為30ml，用移液管充分吹打均勻。4）梯度離心：取另一50ml離心管加入15ml人血淋巴細(xì)胞分離液，用10ml移液管將稀釋血樣緩緩轉(zhuǎn)移至分離液上方，形成上下兩相。22℃，390g離心30min。5）收集白膜層：離心完成后，離心管內(nèi)液相分為四層，從下往上分別為血漿(含血小板)、白膜層(即單個(gè)核細(xì)胞)、淋巴分離液、紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層，用10ml移液管或1ml移液器小心收集中間的白膜層至新50ml離心管。6）清洗：于收集了白膜層的離心管中加rpmi-1640至45ml，混勻，22℃，1000g離心10min，棄去上清。7）重復(fù)步驟6）一遍，并在離心前取20ul細(xì)胞懸液進(jìn)行苔盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)。2、pbmcs加入cik細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)：按細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)/ml加入無(wú)血清gt-t551基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸打散細(xì)胞沉淀，再加入抗cd3單克隆抗體(cd3mab)至終濃度500ng/ml、白介素-2（il-2）終濃度為1000u/ml及體積分?jǐn)?shù)為10%的血清。3、細(xì)胞種瓶：轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至t175瓶中，置于37℃、5%co2、90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，該天定為第0天（d0）。隔天觀(guān)察cik細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞培養(yǎng)基顏色發(fā)黃，適當(dāng)補(bǔ)液。每3天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1.5-2.0×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度補(bǔ)加cik培養(yǎng)液或半量換液。4、在cik細(xì)胞培養(yǎng)至第9天時(shí)加入白術(shù)多糖和枸杞多糖混合液處理cik細(xì)胞，作用72h：1）cik細(xì)胞鋪板：調(diào)整培養(yǎng)至第9天的cik細(xì)胞數(shù)目至2×106個(gè)/ml，于6孔板中加入細(xì)胞懸液1ml/孔。2)白術(shù)多糖及枸杞多糖處理cik細(xì)胞：設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組在cik細(xì)胞孔中加入白術(shù)多糖枸杞多糖終濃度為200mg/ml的培養(yǎng)基1ml，對(duì)照組在cik細(xì)胞孔中加入等體積生理鹽水，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。5、收集細(xì)胞：收集懸浮細(xì)胞至1.5mlep管，500g離心5min，吸掉培養(yǎng)基。用pbs洗滌細(xì)胞兩遍，加入300μlpbs重懸細(xì)胞。6、抗體染色：加5μlfitc標(biāo)記的抗體至細(xì)胞懸液，輕輕混勻后放置于冰上，避光孵育15min。然后加入5μlpe標(biāo)記的抗體，輕輕混勻于冰上避光孵育10min。7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：抗體孵育1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。8、細(xì)胞表面抗原通過(guò)流式結(jié)果分析。1)將對(duì)照組（生理鹽水）與實(shí)驗(yàn)組的白術(shù)多糖及枸杞多糖混合液處理cik細(xì)胞后，cik細(xì)胞cd3+cd56+、cd3+cd8+表面抗原含量結(jié)果如表3。cik表明抗原對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組（200μg/ml）顯著性（p）cd3+cd56+29.61%40.28%**p<0.01cd3+cd8+78.51%84.02%*p<0.05相比對(duì)照組（生理鹽水），實(shí)驗(yàn)組（200μg/ml）的cd3+cd56+、cd3+cd8+細(xì)胞百分含量明顯要高，說(shuō)明200μg/ml濃度的白術(shù)多糖及枸杞多糖混合液能明顯促進(jìn)cik細(xì)胞中cd3+cd56+、cd3+cd8+細(xì)胞分化。當(dāng)前第1頁(yè)12