專利名稱：一種白術(shù)的保存方法以及再培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種白術(shù)的保存方法以及再培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
白術(shù)(Atrac tylodes macrocephala Koidz.)為菊科蒼術(shù)屬植物,其根莖入藥，為重要的藥用植物。由于市場需求高，人類的長期采挖以及環(huán)境破壞，導(dǎo)致白木野生資源較少，目前主要通過人工栽培以保證資源滿足市場的需求。我國大部分 地方均有引種栽培，習(xí)以浙江于潛、安徽皖南山區(qū)等為道地。目前，常利用白術(shù)種子或塊根莖在保存圃或繁種圃內(nèi)通過田間種植方式進(jìn)行保存和繁殖。利用種子繁殖，易發(fā)生變異，可能會出現(xiàn)品種退化、種質(zhì)混雜的現(xiàn)象；利用塊根繁殖，難以短期大量獲得種質(zhì)資源。而且以田間種植方式進(jìn)行的保存不僅占用耕地，還需耗費(fèi)大量人力物カ進(jìn)行栽培管理，干旱、洪澇、低溫、熱害、病蟲害等自然災(zāi)害還可能導(dǎo)致種質(zhì)資源丟失，因此采用田間方式不宣進(jìn)行長期保存。為保存種質(zhì)資源，國內(nèi)已開展白木的離體組織培養(yǎng)、快繁研究，獲得了適宜發(fā)芽、擴(kuò)繁、生根等培養(yǎng)的組織培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，可在短期內(nèi)獲得大量組培苗。但組織繼代培養(yǎng)，多次繼代也可能會導(dǎo)致遺傳變異，同時定期繼代需耗費(fèi)人力、物力。因此，目前仍需尋找最適的長期保存方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種白術(shù)的保存方法以及再培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了一種白術(shù)的保存方法，依次包括如下步驟(I)取白術(shù)組培苗的莖尖，在預(yù)培養(yǎng)液中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；所述預(yù)培養(yǎng)液為含0. 3mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基；(2)取完成步驟(I)的莖尖，在預(yù)處理液中進(jìn)行預(yù)處理；所述預(yù)處理液為含2. OmoI/L甘油和0. 4mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基；(3)取完成步驟(2)的莖尖，在玻璃化保護(hù)劑中進(jìn)行處理；所述玻璃化保護(hù)劑的制備方法為將3. 26mol甘油、2. 42molこニ醇、I. 9mol ニ甲基亞砜和0. 4mol蔗糖與MS液體培養(yǎng)基混勻至IL ；(4)將完成步驟(3)的莖尖投入液氮中保存。步驟(I)中，所述莖尖可為I. 5-2mm的莖尖。所述白術(shù)組培苗具體可為2個月苗齡的白術(shù)組培苗。步驟(I)中，所述預(yù)培養(yǎng)的條件可為25°C暗培養(yǎng)1-4天(具體可為3天)。步驟(2)中，所述預(yù)處理可為將完成步驟(I)的莖尖在所述預(yù)處理液中室溫浸泡30分鐘(優(yōu)選振蕩處理)。所述室溫具體可為20-30°C (如25°C)。步驟(3)中，所述處理可為將完成步驟(2)的莖尖在所述玻璃化保護(hù)劑中0°C浸泡60分鐘。所述步驟(4)包括如下步驟完成所述步驟(3)后，將含有莖尖的玻璃化保護(hù)劑滴加至鋁箔上，然后將鋁箔轉(zhuǎn)移至充滿液氮的凍存管中，然后將所述凍存管投入液氮中保存。每滴含有所述莖尖的玻璃化保護(hù)劑具體可為16微升。每滴含有所述莖尖的玻璃化保護(hù)劑具體可含有5個所述莖尖。本發(fā)明還保護(hù)ー種將以上任一所述方法保存后的白術(shù)進(jìn)行再培養(yǎng)的方法，包括如下步驟將以上任一所述方法保存后的白術(shù)進(jìn)行再培養(yǎng)，得到白術(shù)植株。所述再培養(yǎng)包括如下步驟將解凍后的白木莖尖先在含0. 3mol/L蔗糖的MS半固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)I天，然后在含0. 3mg/L6-BA、0. 02mg/L NAA和0. lmg/L GA3的MS固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)5-7天(莖尖返綠并有萌動跡象)，再然后轉(zhuǎn)移至MS固體培養(yǎng)基中正常光照培養(yǎng)。所述再培養(yǎng)方法還包括在進(jìn)行再培養(yǎng)之前將以上任一所述方法保存后的白木用含I. 2mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基洗滌的步驟。所述預(yù)培養(yǎng)的作用可以降低莖尖組織細(xì)胞自由含水量，増加可溶性糖等保護(hù)性物質(zhì)含量，從而提高莖尖的抗凍能力、減少或避免冷凍傷害，提高植株存活率。所述預(yù)處理的作用進(jìn)ー步降低莖尖組織細(xì)胞含水量，以避免轉(zhuǎn)入較高濃度的玻璃化保護(hù)劑中快速脫水。所述玻璃化劑的作用加入玻璃化劑，使莖尖組織細(xì)胞在降溫過程中達(dá)到玻璃化狀態(tài)，避免細(xì)胞內(nèi)形成冰晶損傷細(xì)胞膜。本發(fā)明提供了一種白術(shù)的超低溫保存方法以及在超低溫保存的基因上進(jìn)行再培養(yǎng)，最終獲得白術(shù)植株的方法。采用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行保存和再培養(yǎng)，植株再生率可達(dá)60%以上。本發(fā)明提供的方法成本低廉、操作簡便、植株再生率，避免了田間保存易受自然災(zāi)害影響而導(dǎo)致種質(zhì)變異或毀滅，以及組織培養(yǎng)保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險，是白術(shù)種質(zhì)資源離體保存的一條有效途徑。


圖I為組培苗的照片。圖2為莖尖的照片。圖3為滴加含有莖尖的PVS2玻璃化保護(hù)劑后的鋁箔條。圖4為轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中正常光照培養(yǎng)7天后的照片。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑公司購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。6-BA即6-(芐氨基)嘌呤，結(jié)構(gòu)式見式(I )。
權(quán)利要求
1.一種白術(shù)的保存方法，依次包括如下步驟 (1)取白術(shù)組培苗的莖尖，在預(yù)培養(yǎng)液中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；所述預(yù)培養(yǎng)液為含0.3mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基； (2)取完成步驟(I)的莖尖，在預(yù)處理液中進(jìn)行預(yù)處理；所述預(yù)處理液為含2.Omol/L甘油和0. 4mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基； (3)取完成步驟(2)的莖尖，在玻璃化保護(hù)劑中進(jìn)行處理；所述玻璃化保護(hù)劑的制備方法為將3. 26mol甘油、2. 42mol乙二醇、I. 9mol 二甲基亞砜和0. 4mol蔗糖與MS液體培養(yǎng)基混勻至IL ； (4)將完成步驟(3)的莖尖投入液氮中保存。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中，所述莖尖為I.5-2mm的莖尖。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于步驟(I)中，所述預(yù)培養(yǎng)的條件為25°C暗培養(yǎng)1-4天。
4.如權(quán)利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述預(yù)處理為將所述完成步驟(I)的莖尖在所述預(yù)處理液中室溫浸泡30分鐘。
5.如權(quán)利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述處理為將所述完成步驟(2)的莖尖在所述玻璃化保護(hù)劑中0°C浸泡60分鐘。
6.如權(quán)利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(4)包括如下步驟完成所述步驟(3)后，將含有莖尖的玻璃化保護(hù)劑滴加至鋁箔上，然后將鋁箔轉(zhuǎn)移至充滿液氮的凍存管中，然后將所述凍存管投入液氮中保存。
7.將權(quán)利要求I至6中任一所述方法保存后的白術(shù)進(jìn)行再培養(yǎng)的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求I至6中任一所述方法保存后的白術(shù)進(jìn)行再培養(yǎng)，得到白術(shù)植株。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述再培養(yǎng)包括如下步驟將解凍后的白術(shù)莖尖先在含0. 3mol/L蔗糖的MS半固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)I天，然后在含0. 3mg/L6_BA、0. 02mg/L NAA和0. lmg/L GA3的MS固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)5_7天，再然后轉(zhuǎn)移至至MS固體培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述方法還包括在進(jìn)行再培養(yǎng)之前將權(quán)利要求I至5中任一所述方法保存后的白術(shù)用含I. 2mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基洗滌的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白術(shù)的保存方法以及再培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供的保存方法包括如下步驟(1)取白術(shù)組培苗的莖尖，在預(yù)培養(yǎng)液中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；所述預(yù)培養(yǎng)液為含0.3mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基；(2)取完成步驟(1)的莖尖，在預(yù)處理液中進(jìn)行預(yù)處理；所述預(yù)處理液為含2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基；(3)取完成步驟(2)的莖尖，在玻璃化保護(hù)劑中進(jìn)行處理；所述玻璃化保護(hù)劑的制備方法為3.26mol甘油、2.42mol乙二醇、1.9mol二甲基亞砜和0.4mol蔗糖與MS液體培養(yǎng)基混勻至1L；(4)將完成步驟(3)的莖尖投入液氮中保存。本發(fā)明提供的方法成本低廉、操作簡便、植株再生率，是白術(shù)種質(zhì)資源離體保存的一條有效途徑。
文檔編號A01H4/00GK102763591SQ20121023268
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者盧新雄, 張金梅, 辛霞, 陳曉玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所