本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術：

動物細胞培養(yǎng)，尤其是干細胞培養(yǎng)一直是醫(yī)學疾病研究領域的基本實驗手段之一，干細胞既可以自我復制更新，也有潛力分化為其他類型的細胞，所以，其在疑難疾病的治療領域具有良好的應用前景。干細胞培養(yǎng)過程中需要依賴特殊的培養(yǎng)環(huán)境，要求達到干細胞貼壁培養(yǎng)或者增殖效果。

由于干細胞的培養(yǎng)通源于少數(shù)細胞的接種，初始接種量不多，所以，目前干細胞的培養(yǎng)主要采用的是含有胎牛血清和氨基酸的培養(yǎng)基，通過胎牛血清對干細胞的刺激，以達到使干細胞快速分裂分化的目的，然而應用這些細胞培養(yǎng)基擴增、分化干細胞需要經過一個漫長的過程，常常需要數(shù)周的時間，再者胎牛血清的提取需要經過復雜的工序，實驗成本高，因此有必要開發(fā)一種新的培養(yǎng)基，以快速促進細胞培養(yǎng)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基及其制備方法，不含動物血清，且大幅度的縮短的干細胞分化培養(yǎng)的時間，節(jié)約了實驗成本。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基，每升合成粘附培養(yǎng)基中含有以下組分：生物素0.08g、皮質酮20μg、l-肉毒堿2g、亞油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亞麻酸0.8g、d-葡萄糖13-17g、孕酮5μg、丙酮酸鈉1.2g、視黃醇乙酸酯0.08g、過氧化氫酶4g、葉酸0.9-1.2g、還原型谷胱甘肽0.8-1.3g、硫辛酸60-70μg、轉鐵蛋白2-3g、人胰島素6-8g、亞硒酸鈉0.1mg、香蕉皮提取物500-600ml、萘乙酸1.2-2g、維生素c0.8-1.5g；

所述香蕉皮提取物是香蕉皮115℃下焙炒10-20min后，再經含有維生素b12和維生素b1的溶液浸泡、過濾收集得到的濾液。

優(yōu)選的，上述用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基中，每升合成粘附培養(yǎng)基中含有以下組分：生物素0.08g、皮質酮20μg、l-肉毒堿2g、亞油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亞麻酸0.8g、d-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸鈉1.2g、視黃醇乙酸酯0.08g、過氧化氫酶4g、葉酸1g、還原型谷胱甘肽1.0g、硫辛酸65μg、轉鐵蛋白2.5g、人胰島素7g、亞硒酸鈉0.1mg、香蕉皮提取物550ml、萘乙酸1.5g、維生素c1.2g。

本發(fā)明還提供了一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基的制備方法，具體包括以下步驟：

步驟1，制備香蕉提皮取物

步驟1.1，收集新鮮的香蕉皮，115℃下焙炒10-20min，得到碳化香蕉皮；

步驟1.2，按以下配方制備浸泡液，其中每升浸泡液中含有以下組分：0.3-0.5g的維生素b12、1-2g的維生素b1，余量為蒸餾水；

步驟1.3，將所述碳化香蕉皮與浸泡液按照1:10的質量比例混合，超聲提取30-50min，然后經孔直徑為1-3μm的濾紙過濾，得到香蕉提皮取物；

步驟2，每升用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基按照以下步驟制備：

步驟2.1，稱取生物素0.08g、皮質酮20μg、l-肉毒堿2g、亞油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亞麻酸0.8g、d-葡萄糖13-17g、孕酮5μg、丙酮酸鈉1.2g、視黃醇乙酸酯0.08g、過氧化氫酶4g、葉酸0.9-1.2g、還原型谷胱甘肽0.8-1.3g、硫辛酸60-70μg、轉鐵蛋白2-3g、人胰島素6-8g、亞硒酸鈉0.1mg、香蕉皮提取物500-600ml、萘乙酸1.2-2g、維生素c0.8-1.5g；

步驟2.2，將步驟2.1中稱取的各組分混合后，震蕩攪拌，充分溶化各組分，然后將得到的溶液經孔直徑為0.22μm的濾菌膜過濾除菌，得到用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，上述用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基的制備方法中，所述超聲提取的超聲波頻率為20khz，功率為500w。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基包括以下有益效果：

(1)培養(yǎng)基中不含動物血清，而是選用了香蕉皮提取物和萘乙酸，我們對香蕉皮進行115℃焙炒處理后，使香蕉皮中的有機物發(fā)生碳化，從而有機成分的結構發(fā)生了變化，實驗證明其生成的物質能夠有效存細胞的分裂和分化，且培養(yǎng)時間大大縮短；

培養(yǎng)基中添加的萘乙酸原本是植物組織培養(yǎng)常用的物質，在此，我們首次將其用于動物干細胞的培養(yǎng)分化，其與香蕉皮提取物配合使用能夠縮短干細胞的分裂分化時間，效果良好。

(2)本發(fā)明使用的培養(yǎng)基在提高細胞培養(yǎng)效果的同時減少了培養(yǎng)基組分的用量，大大降低的物質成本和時間成本，在干細胞培養(yǎng)基領域具有顯著的應用前景。

附圖說明

圖1為采用實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的心臟肌球衍生細胞的×10倍顯微視圖；

圖2為采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的心臟肌球衍生細胞的×10倍顯微視圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但不應理解為本發(fā)明的限制。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，均按照本領域的常規(guī)方法和條件進行，或按照商品說明書選擇；下面實施例中，其余所有的試劑和原料購自sigma公司或者美國lifeinvitrogen公司。

實施例1

一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基，每升合成粘附培養(yǎng)基中含有以下組分：生物素0.08g、皮質酮20μg、l-肉毒堿2g、亞油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亞麻酸0.8g、d-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸鈉1.2g、視黃醇乙酸酯0.08g、過氧化氫酶4g、葉酸1g、還原型谷胱甘肽1.0g、硫辛酸65μg、轉鐵蛋白2.5g、人胰島素7g、亞硒酸鈉0.1mg、香蕉皮提取物550ml、萘乙酸1.5g、維生素c1.2g，具體按照以下步驟制備：

步驟1，制備香蕉提皮取物

步驟1.1，收集新鮮的香蕉皮，115℃下焙炒15min，得到碳化香蕉皮；

步驟1.2，按以下配方制備浸泡液，其中每升浸泡液中含有以下組分：0.3-0.5g的維生素b12、1-2g的維生素b1，余量為蒸餾水；

步驟1.3，將所述碳化香蕉皮與浸泡液按照1:10的質量比例混合，超聲提取40min，然后經孔直徑為1-3μm的濾紙過濾，得到香蕉提皮取物；

其中，所述超聲提取的超聲波頻率為20khz，功率為500w；

步驟2，每升用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基按照以下步驟制備：

步驟2.1，稱取生物素0.08g、皮質酮20μg、l-肉毒堿2g、亞油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亞麻酸0.8g、d-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸鈉1.2g、視黃醇乙酸酯0.08g、過氧化氫酶4g、葉酸1g、還原型谷胱甘肽1.0g、硫辛酸65μg、轉鐵蛋白2.5g、人胰島素7g、亞硒酸鈉0.1mg、香蕉皮提取物550ml、萘乙酸1.5g、維生素c1.2g；

步驟2.2，將步驟2.1中稱取的各組分混合后，震蕩攪拌，充分溶化各組分，然后將得到的溶液經孔直徑為0.22μm的濾菌膜過濾除菌，得到用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基。

實施例2

一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基，每升合成粘附培養(yǎng)基中含有以下組分：生物素0.08g、皮質酮20μg、l-肉毒堿2g、亞油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亞麻酸0.8g、d-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸鈉1.2g、視黃醇乙酸酯0.08g、過氧化氫酶4g、葉酸0.9g、還原型谷胱甘肽0.8g、硫辛酸60μg、轉鐵蛋白2g、人胰島素6g、亞硒酸鈉0.1mg、香蕉皮提取物600ml、萘乙酸2g、維生素c1.5g。制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于培養(yǎng)基的配方改為實施例2的配方。

實施例3

一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基，每升合成粘附培養(yǎng)基中含有以下組分：生物素0.08g、皮質酮20μg、l-肉毒堿2g、亞油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亞麻酸0.8g、d-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸鈉1.2g、視黃醇乙酸酯0.08g、過氧化氫酶4g、葉酸1.2g、還原型谷胱甘肽1.3g、硫辛酸70μg、轉鐵蛋白3g、人胰島素8g、亞硒酸鈉0.1mg、香蕉皮提取物500ml、萘乙酸1.2g、維生素c0.8g。制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于培養(yǎng)基的配方改為實施例3的配方。

實施例4

一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基，每升合成粘附培養(yǎng)基中含有以下組分：生物素0.08g、皮質酮20μg、l-肉毒堿2g、亞油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亞麻酸0.8g、d-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸鈉1.2g、視黃醇乙酸酯0.08g、過氧化氫酶4g、葉酸1.1g、還原型谷胱甘肽1.2g、硫辛酸62μg、轉鐵蛋白2.8g、人胰島素7.5g、亞硒酸鈉0.1mg、香蕉皮提取物580ml、萘乙酸1.8g、維生素c1.4g。制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于培養(yǎng)基的配方改為實施例4的配方。

實施例5

一種用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基，每升合成粘附培養(yǎng)基中含有以下組分：生物素0.08g、皮質酮20μg、l-肉毒堿2g、亞油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亞麻酸0.8g、d-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸鈉1.2g、視黃醇乙酸酯0.08g、過氧化氫酶4g、葉酸0.95g、還原型谷胱甘肽1.25g、硫辛酸68μg、轉鐵蛋白2.2g、人胰島素7.8g、亞硒酸鈉0.1mg、香蕉皮提取物520ml、萘乙酸1.65g、維生素c1.35g。制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于培養(yǎng)基的配方改為實施例5的配方。

需要說明的是，上述所有實施例僅給出了每升用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基的配制方法，實際應用過程中，根據(jù)用于細胞培養(yǎng)的合成粘附培養(yǎng)基的體積用量需要，按每升培養(yǎng)基中含有上述各組分的比例，稱取各組分，然后制備相應體積的培養(yǎng)基即可。

對比實驗：

實驗組處理方式如下：應用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基，研究整個心臟肌球衍生細胞分化過程，具體如下：

步驟1，預處理培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶

步驟1.1，纖維粘連蛋白預處理培養(yǎng)瓶

步驟1.1.1，從4℃冰箱取出纖維粘連蛋白，在瓶中加入5ml蒸餾水放入37℃水浴箱，充分溶解。

步驟1.1.2，目測瓶中沒有絮狀和顆粒，與雙蒸水混合，配置成20μg/ml液體。

步驟1.1.3，將混合液鋪滿培養(yǎng)瓶底，在co2恒溫培養(yǎng)箱放置至少1小時。

步驟1.1.4，使用前用pbs液沖洗兩次，放入實施例1的培養(yǎng)基備用。

步驟1.2，經多聚右旋賴氨酸氫溴酸鹽(pdl)預處理培養(yǎng)皿

步驟1.2.1，從4℃冰箱取出多聚右旋賴氨酸氫溴酸鹽，在瓶中加入10mldmem/f12培養(yǎng)基放入37℃水浴箱，充分溶解。

步驟1.2.2，目測瓶中沒有絮狀和顆粒，與dmem/f12培養(yǎng)基配制成500μg/ml混合液體a，以2ml為單位分裝后，放入-20℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟1.2.3，取2ml500μg/ml混合液體a，再次與dmem/f12培養(yǎng)基混合，配制濃度為20μg/ml的溶液并用一次性無菌過濾管過濾，得到混合液體b。

步驟1.2.4，用混合液體b覆蓋培養(yǎng)皿底物，放入co2恒溫培養(yǎng)箱放置，3-30天可以使用。

步驟1.2.5，使用時用pbs液沖洗兩次，放入實施例1的培養(yǎng)基備用。

步驟2，細胞培養(yǎng)

步驟2.1，大鼠心臟標本的取出：仰臥位，醫(yī)用酒精消毒胸腹部，于上腹部中部開口并斜行向上切斷肋骨，暴露整個心臟，注意避免損傷心臟組織。分離可見清晰心臟根部，取出完整心臟，立即放在置于濕冰上的盛有高鉀心臟停跳液的培養(yǎng)皿中。心臟標本反復洗滌三次備用。上述過程都在超凈工作臺內無菌條件下進行。

步驟2.2，用纖維粘連蛋白預處理培養(yǎng)皿(同步驟1.1)。

步驟2.3，將心臟標本剪切成為1-2mm³，用膠原酶1mg/ml消化30-60min。

步驟2.4，將組織塊按照兩兩間隔15-20mm放入100×20mm的纖維粘連蛋白預處理培養(yǎng)瓶中，用實施例1的培養(yǎng)基覆蓋組織塊，放入37℃，5％co2恒溫培養(yǎng)箱，30-45min后再加入實施例1的培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)。

步驟2.5，前2-3天內盡量避免移動培養(yǎng)瓶(靜置利于組織塊粘附培養(yǎng)盤和細胞鋪展貼壁)。以后每日輕柔操作下觀察，在組織塊鋪展出來的細胞接觸即收獲心臟外植體衍生細胞(edcs，explant-derivedcells)，放入經pdl預處理的肌球細胞，2m細胞加入約20mlcsp培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，大概收獲4次edcs。此過程中可以觀察到一般2-3天大鼠心臟標本中可見細胞從組織塊中長出，5天完成第一次收獲細胞。

實驗組的心臟肌球衍生細胞的顯微視圖如圖1所示。

對照組處理方式如下：與實驗組的步驟大體相同，區(qū)別在于：(1)步驟1.1.4和步驟1.2.5加入的是ddm培養(yǎng)液，其中每250mlddm培養(yǎng)液中含有以下組分：236.5ml的dmem-f12-glumax、2.5ml的n2添加劑、2.5ml的非必需氨基酸、2.5ml的丙酮酸鈉、2.5ml的青鏈霉素、0.5ml的巰基乙醇、3ml的胎牛血清；所述青鏈霉素的濃度為50u/ml，所述胎牛血清的濃度為500μg/ml；

(2)步驟2.4是用神經細胞培養(yǎng)基覆蓋組織塊，其中每250ml神經細胞培養(yǎng)基中含有以下組分組：239.5ml的dmem-f12-glumax、2.5ml的n2添加劑、2.5ml的非必需氨基酸、2.5ml的丙酮酸鈉、2.5ml的青鏈霉素、0.5ml的巰基乙醇；所述青鏈霉素的濃度為50u/ml，所述胎牛血清的濃度為500μg/ml；步驟2.5中12-13天完成第一次收獲細胞。

對照組的心臟肌球衍生細胞的顯微視圖如圖2所示。

通過對比圖1和圖2可以看出，實驗組和對照組最終得到的形態(tài)規(guī)則的神經細胞，說明實施例1的培養(yǎng)基和常規(guī)培養(yǎng)基可以達到相同的細胞分化效果，與此同時，實施例1的培養(yǎng)基可使細胞分化時間縮短2倍以上，大大降低的物質成本和時間成本。

另外，我們分別利用實施例1的培養(yǎng)基對人體心臟組織細胞(分離于心臟標本)、人體骨髓干細胞(分離于骨髓組織器官)、小鼠胚胎干細胞進行細胞增殖實驗。共設計以下分組：

實驗一組：將心臟組織細胞接種于實施例1的培養(yǎng)基中，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)，每隔6小時測定一次細胞密度并記錄；

實驗二組：將人體骨髓干細胞接種于實施例1的培養(yǎng)基中，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)，每隔6小時測定一次細胞密度并記錄；

實驗三組：將小鼠胚胎干細胞接種于實施例1的培養(yǎng)基中，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)，每隔6小時測定一次細胞密度并記錄；

對照一組：將心臟組織細胞接種于含10％胎牛血清的dmem/f12基本培養(yǎng)基中，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)，每隔6小時測定一次細胞密度并記錄；

對照二組：將人體骨髓干細胞接種于含10％胎牛血清的dmem/f12基本培養(yǎng)基中，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)，每隔6小時測定一次細胞密度并記錄；

對照三組：將小鼠胚胎干細胞接種于含10％胎牛血清的dmem/f12基本培養(yǎng)基中，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)，每隔6小時測定一次細胞密度并記錄；

結果如表1所示，由表1可知，使用實施例1培養(yǎng)基的實驗一組、實驗二組、實驗三組中細胞密度快速增殖，24h可達到40％左右，48h即可達到95％左右，而三個對照組在培養(yǎng)48h時只有40％左右，說明本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基可以有效縮短細胞增值時間。

類似的，本發(fā)明所有實施例，包括實施例2、實施例3、實施例4和實施例5均可達到上述效果，由于實驗結果類似，此處不再贅述。

表1不同干細胞、不同時間的細胞增殖效果

本領域的技術人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內。