本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種類(lèi)球紅細(xì)菌以及利用類(lèi)球紅細(xì)菌生產(chǎn)法尼醇的方法。

背景技術(shù)：

法尼醇(farnesol)是一種無(wú)環(huán)倍半萜醇，化學(xué)式c15h26o，痕量存在于巴西檀木、黃葵子、金合歡、香茅、檸檬草、麝香、茉莉及橙花的香精油中。長(zhǎng)期以來(lái)法尼醇作為一種香精成分廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)法尼醇還具有抑菌、抗炎和抗腫瘤等多種生物活性。除此之外法尼醇作為藥物成分可以顯著增加多種病原微生物(如金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、變形鏈球菌、禾谷鐮刀菌等)對(duì)藥物的易感性。

目前在國(guó)內(nèi)外法尼醇的生產(chǎn)和提取方法還是從植物中提取為主。例如，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn102675398a公開(kāi)了一種從羅漢果中提取羅漢果昔v和法尼醇的方法。干羅漢果經(jīng)破殼、減壓濃縮、陶瓷膜過(guò)濾、大孔樹(shù)脂吸附、梯度乙醇洗脫等步驟，將不同洗脫液進(jìn)行脫色，采用結(jié)晶重結(jié)晶的方法分別得到羅漢果昔v和法尼醇純品。由于在植物中的含量極少，導(dǎo)致法尼醇的提取和純化都非常困難，因此此類(lèi)方法的生產(chǎn)成本居高不下。

利用微生物合成并生產(chǎn)法尼醇是近幾年發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，微生物生產(chǎn)方法具有培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、提取和純化步驟少等優(yōu)勢(shì)，是目前工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)法尼醇等萜烯類(lèi)化合物的理想途徑。

中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn103571763a公開(kāi)了一株從白酒酒醅中篩到的釀酒酵母，這種釀酒酵母能夠自身從頭合成多種萜烯醇，該酵母除了能夠生產(chǎn)法尼醇之外還可以合成里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-沒(méi)紅藥醇等萜烯類(lèi)化合物，但是包括法尼醇在內(nèi)的多種萜烯類(lèi)化合物的產(chǎn)量均較低。

美國(guó)專(zhuān)利us6689593公開(kāi)了一種利用酵母或者大腸桿菌生產(chǎn)法尼醇的方法。該方法利用基因工程手段對(duì)酵母或大腸桿菌進(jìn)行改造，降低了微生物胞內(nèi)鯊烯合成酶的活性，同時(shí)過(guò)表達(dá)hmg-coa還原酶基因和焦磷酸法尼脂合成酶基因，從而強(qiáng)化了hmg-coa還原酶和焦磷酸法尼脂合成酶的活性。利用這種改造方法可以積累足夠多的焦磷酸法尼脂，能夠?qū)崿F(xiàn)法尼醇和香葉醇在微生物胞內(nèi)的合成。

綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外利用微生物生產(chǎn)法尼醇的報(bào)道很少。本領(lǐng)域內(nèi)仍然需要微生物合成法尼醇的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將來(lái)自于鼠疫耶爾辛桿菌yersiniapestisco92的磷酸酶pgpb基因轉(zhuǎn)化到類(lèi)球紅細(xì)菌能夠在胞內(nèi)表達(dá)，并產(chǎn)生具有活性的磷酸酶pgpb，從而可以直接催化類(lèi)球紅細(xì)菌mep途徑積累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。至少基于上述部分發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

本發(fā)明的一方面，提供基因工程化類(lèi)球紅細(xì)菌，其包含來(lái)自鼠疫耶爾辛桿菌yersiniapestisco92的磷酸酶pgpb基因，且所述磷酸酶pgpb基因能夠在所述類(lèi)球紅細(xì)菌的胞內(nèi)表達(dá)，形成具有活性的磷酸酶pgpb。

在示例性實(shí)施方案中，所述類(lèi)球紅細(xì)菌的胞內(nèi)包含焦磷酸法尼酯。優(yōu)選地，所述焦磷酸法尼酯通過(guò)在胞內(nèi)利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛為起始物質(zhì)合成二甲基丙烯焦磷酸酯(dmapp，異戊二烯焦磷酸異構(gòu)體)，進(jìn)而在法尼基焦磷酸合成酶的作用下生成。

在示例性實(shí)施方案中，所述類(lèi)球紅細(xì)菌為rhodobactersphaeroides2.4.1，其菌種編號(hào)atcc17023。

在示例性實(shí)施方案中，所述磷酸酶pgpb基因的堿基序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明的另一方面，提供基因工程化類(lèi)球紅細(xì)菌的制備方法，其包括：

構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化的步驟；和

通過(guò)細(xì)菌接合轉(zhuǎn)化所述重組質(zhì)粒至類(lèi)球紅細(xì)菌的步驟。

在示例性實(shí)施方案中，所述構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化的步驟包括：

使用pgpb-f(seqidno:2)和pgpb-r(seqidno:3)所示的引物從鼠疫耶爾辛桿菌yersiniapestisco92的基因組中克隆磷酸酶pgpb1基因；

以pbbr1mcs2載體為模板，使用pbbr1mcs2-f(seqidno:4)和pbbr1mcs2-r(seqidno:5)所示的引物克隆得到所述pbbr1mcs2載體的拼接片段，回收所述拼接片段；

使用吉布森組裝方法將所述pgpb基因和所述拼接片段混合，40～60℃反應(yīng)10～60分鐘，反應(yīng)完畢之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌t1細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒pbbr1mcs2-pgpb，將提取的質(zhì)粒pbbr1mcs2-pgpb轉(zhuǎn)化大腸桿菌s17-1，挑取能夠在含kan抗性的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌株，提取質(zhì)粒驗(yàn)證，獲得含有pbbr1mcs2-pgpb正確序列的大腸桿菌s17-1克隆作為供體菌。

在示例性實(shí)施方案中，細(xì)菌接合轉(zhuǎn)化所述重組質(zhì)粒至類(lèi)球紅細(xì)菌的步驟包括：

在含有kan抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述供體菌，在供體菌的od600在0.4-0.6之間時(shí)停止培養(yǎng)并收集菌體；

在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)受體菌類(lèi)球紅細(xì)菌，在受體菌的od600在0.3-0.6之間時(shí)停止培養(yǎng)并收集菌體；

將所述供體菌和受體菌分別用培養(yǎng)基稀釋重懸，并將供體菌和受體菌混合后均勻涂布到固體無(wú)抗性平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取平板上生長(zhǎng)的菌落洗滌重懸；

將重懸后的菌落涂布在含亞碲酸鉀和kan的平板上培養(yǎng)后，挑取黑色接合子，即為pbbr1mcs2-pgpb重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的類(lèi)球紅細(xì)菌菌落。

本發(fā)明的再一方面，提供法尼醇的生產(chǎn)方法，其包括使用本發(fā)明的類(lèi)球紅細(xì)菌的步驟。優(yōu)選地，進(jìn)一步包括類(lèi)球紅細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)步驟，和/或法尼醇的檢測(cè)步驟。

本發(fā)明通過(guò)將鼠疫耶爾辛桿菌yersiniapestisco92基因組中獲得的磷酸酶pgpb轉(zhuǎn)化到類(lèi)球紅細(xì)菌胞內(nèi)表達(dá)，磷酸酶pgpb可以直接催化類(lèi)球紅細(xì)菌mep途徑積累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。本發(fā)明利用類(lèi)球紅細(xì)菌來(lái)生產(chǎn)法尼醇，方法簡(jiǎn)單，且產(chǎn)物易于提取。

本發(fā)明通過(guò)基因工程手段改造類(lèi)球紅細(xì)菌生產(chǎn)法尼醇，對(duì)法尼醇以及其他萜烯醇類(lèi)化合物的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的多種示例性實(shí)施方式，該詳細(xì)說(shuō)明不應(yīng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的某些方面、特性和實(shí)施方案的更詳細(xì)的描述。

應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語(yǔ)僅僅是為描述特別的實(shí)施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對(duì)于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為具體公開(kāi)了該范圍的上限和下限以及它們之間的每個(gè)中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個(gè)較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。

除非另有說(shuō)明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說(shuō)明書(shū)中提到的所有文獻(xiàn)通過(guò)引用并入，用以公開(kāi)和描述與所述文獻(xiàn)相關(guān)的方法和/或材料。在與任何并入的文獻(xiàn)沖突時(shí)，以本說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容為準(zhǔn)。

本發(fā)明中，名詞術(shù)語(yǔ)既包括單數(shù)形式，也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另行明確指出。例如，“樣品”包括一種或多種樣品和為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的其等同物等等。本發(fā)明中所述的“至少之一”或“至少一種”不僅僅指包含“一個(gè)”或“一種”的情況，更重要的還包含“多個(gè)”或“多種”的情況。

本發(fā)明中，生產(chǎn)法尼醇的菌株優(yōu)選為類(lèi)球紅細(xì)菌。優(yōu)選地，類(lèi)球紅細(xì)菌為基因工程化菌株，其為通過(guò)基因重組技術(shù)改造的菌株。更優(yōu)選地，通過(guò)基因重組技術(shù)在例如不具有足夠或缺少磷酸酶pgpb活性的野生型或其它人工改造菌株中引入外來(lái)物種的基因等遺傳物質(zhì)來(lái)使其表達(dá)、產(chǎn)生或帶來(lái)增加量的磷酸酶pgpb活性的類(lèi)球紅細(xì)菌。在某些實(shí)施方案中，類(lèi)球紅細(xì)菌為在胞內(nèi)包含焦磷酸法尼酯或包含可轉(zhuǎn)化為焦磷酸法尼酯的物質(zhì)的細(xì)菌。作為可轉(zhuǎn)化為焦磷酸法尼酯的物質(zhì)包括丙酮酸、3-磷酸甘油醛、二甲基丙烯焦磷酸酯，以及用于催化上述物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的法尼基焦磷酸合成酶等，這些物質(zhì)可為細(xì)菌胞內(nèi)天然存在的，或通過(guò)人工操作引入的。在某些實(shí)施方案中，類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides2.4.1，其可購(gòu)自atcc(菌種編號(hào)atcc17023)。

本發(fā)明中所述的類(lèi)球紅細(xì)菌是一種原核光合細(xì)菌，屬于細(xì)菌域中紫色細(xì)菌群的α亞群，這種細(xì)菌廣泛分布于自然界之中。類(lèi)球紅細(xì)菌在不同條件下既可進(jìn)行光自養(yǎng)也可進(jìn)行光異養(yǎng)，具有廣泛的代謝方式，菌體不含毒素，且含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在工業(yè)上常用于輔酶q10的生產(chǎn)。

研究表明，類(lèi)球紅細(xì)菌胞內(nèi)2-甲基-d-赤蘚糖醇4-磷酸合成途徑(mep途徑)可以利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛為起始物質(zhì)合成二甲基丙烯焦磷酸酯(dmapp)，進(jìn)而在法尼基焦磷酸合成酶的作用下生成焦磷酸法尼酯(fpp)進(jìn)入其他代謝途徑。已知二甲基丙烯焦磷酸酯是合成萜烯類(lèi)化合物的前體。發(fā)明人意外的地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在類(lèi)球紅細(xì)菌胞內(nèi)過(guò)表達(dá)磷酸酶或焦磷酸酶時(shí)，過(guò)量的酶活性并未對(duì)細(xì)菌內(nèi)的其他代謝途徑產(chǎn)生較大影響，細(xì)菌活性保持正常，并且能夠在類(lèi)球紅細(xì)菌胞內(nèi)直接轉(zhuǎn)化焦磷酸法尼酯生成法尼醇，如下所示：

將來(lái)自于鼠疫耶爾辛桿菌yersiniapestisco92的磷酸酶pgpb基因轉(zhuǎn)化到類(lèi)球紅細(xì)菌能夠在胞內(nèi)表達(dá)，并產(chǎn)生具有活性的磷酸酶pgpb，從而可以直接催化類(lèi)球紅細(xì)菌mep途徑積累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。

本發(fā)明中，所述磷酸酶pgpb是指在類(lèi)球紅細(xì)菌內(nèi)具有活性的磷酸酶的任何酶。優(yōu)選地，所述磷酸酶pgpb來(lái)源于細(xì)菌，優(yōu)選地來(lái)源于與宿主細(xì)菌不同物種的細(xì)菌，例如，鼠疫耶爾辛桿菌。作為鼠疫耶爾辛桿菌的實(shí)例包括，但不限于yersiniapestisco92。在某些實(shí)施方案中，磷酸酶pgpb為全長(zhǎng)基因產(chǎn)生的酶。在某些實(shí)施方案中，磷酸酶pgpb為其截短形式、突變形式等，只要具有或保持其酶活性即可。磷酸酶pgpb可以在類(lèi)球紅細(xì)菌內(nèi)表達(dá)獲得，或者在體外表達(dá)并引入細(xì)菌內(nèi)。優(yōu)選直接在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生磷酸酶pgpb。在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生磷酸酶pgpb的情況下，其基因的堿基序列優(yōu)選如seqidno:1所示。

本發(fā)明的基因工程化類(lèi)球紅細(xì)菌的制備方法包括構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化的步驟和通過(guò)細(xì)菌接合轉(zhuǎn)化所述重組質(zhì)粒至類(lèi)球紅細(xì)菌的步驟。

在示例性實(shí)施方案中，所述構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化的步驟包括：

從鼠疫耶爾辛桿菌co92的基因組中克隆磷酸酶pgpb1基因；以pbbr1mcs2載體為模板，克隆得到所述pbbr1mcs2載體的拼接片段，回收所述拼接片段；將所述pgpb基因和所述拼接片段混合反應(yīng)，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌t1細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒pbbr1mcs2-pgpb，將其轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌株，提取質(zhì)粒驗(yàn)證，獲得供體菌。

在示例性實(shí)施方案中，細(xì)菌接合轉(zhuǎn)化所述重組質(zhì)粒至類(lèi)球紅細(xì)菌的步驟包括：在含抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述供體菌，在供體菌的od600在0.4-0.6之間，例如0.45-0.55，或0.50時(shí)停止培養(yǎng)并收集菌體；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)受體菌類(lèi)球紅細(xì)菌，在受體菌的od600在0.3-0.6之間，優(yōu)選0.4-0.5之間時(shí)停止培養(yǎng)并收集菌體；將供體菌和受體菌混合后均勻涂布到固體無(wú)抗性平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取平板上生長(zhǎng)的菌落洗滌重懸；將重懸后的菌落涂布在含亞碲酸鉀和kan的平板上培養(yǎng)后，挑取黑色接合子。

本發(fā)明的構(gòu)建pbbr1mcs2-pgpb重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化e.colis17-1(供體菌)的更具體的示例性步驟如下：

構(gòu)建pbbr1mcs2-pgpb重組質(zhì)粒，用基因組提取試劑盒提取鼠疫耶爾辛桿菌(yersiniapestis)co92的基因組。以基因組為模板，使用引物從基因組中克隆得到磷酸酶pgpb1基因；以pbbr1mcs2載體為模板，用引物克隆得到pbbr1mcs2載體的拼接片段。

將克隆得到的pgpb基因和pbbr1mcs2載體的拼接片段回收，將pgpb基因和pbbr1mcs2載體的拼接片段混合，50℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)完畢之后用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌t1細(xì)胞，lb培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pbbr1mcs2-pgpb備用。再次使用熱激法將提取出來(lái)的重組質(zhì)粒pbbr1mcs2-pgpb轉(zhuǎn)化大腸桿菌e.colis17-1(供體菌)，挑取能夠在含kan抗性的lb培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌株，提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。

本發(fā)明的細(xì)菌接合轉(zhuǎn)化重組載體pbbr1mcs2-pgpb至類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides2.4.1(受體菌)的更具體地示例性步驟如下：

將含有pbbr1mcs2-pgpb正確序列的e.colis17-1克隆與類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides2.4.1進(jìn)行細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pbbr1mcs2-pgpb。供體菌s17-1(含質(zhì)粒pbbr1mcs-2-pcak)在含有kan抗生素的lb液體培養(yǎng)基的搖瓶中過(guò)夜培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)接至新鮮的lb液體培養(yǎng)基，在供體菌完全達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(od600:0.4-0.6)的時(shí)候停止培養(yǎng)并收集菌體；受體菌類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides在lb液體培養(yǎng)基中接種過(guò)夜培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)接至新鮮的lb培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，控制培養(yǎng)時(shí)間直至受體菌完全處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)(od600:0.3-0.6)，停止培養(yǎng)并收集菌體。分別取2-5μl菌液，離心并用新鮮的lb培養(yǎng)基洗滌2次，供體菌和受體菌分別用50μl及100μl的lb培養(yǎng)基稀釋重懸。供體菌和受體菌按照一定比例混合后均勻涂布到固體無(wú)抗性lb平板上，培養(yǎng)20-24h至有明顯菌落出現(xiàn)，再將平板上的菌落用1ml預(yù)冷的溶液洗脫收集至ep管中；離心棄上清液，再次加入500μl預(yù)冷的溶液，吹吸混勻，重復(fù)洗滌1-2次；再重懸菌落后涂布在終濃度200mg/l亞碲酸鉀(k2teo3)和50mg/mlkan的雙抗性溶液平板上，待32℃培養(yǎng)3-5天后，挑取平板上的黑色接合子，即為pbbr1mcs2-pgpb重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的類(lèi)球紅細(xì)菌菌落。

本發(fā)明的法尼醇的生產(chǎn)方法包括使用本發(fā)明所述的類(lèi)球紅細(xì)菌的步驟。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)一步包括類(lèi)球紅細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)步驟，和/或法尼醇的檢測(cè)步驟。

本發(fā)明的類(lèi)球紅細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)步驟可示例性說(shuō)明如下：

將本發(fā)明的類(lèi)球紅細(xì)菌從保種管中取1-3μl接種至lb固體培養(yǎng)基上活化，然后將菌落轉(zhuǎn)接至25ml的lb種子培養(yǎng)基，32℃，220rpm培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后的菌液按10％的接種量轉(zhuǎn)接至含有50-250ml的類(lèi)球紅細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基，32℃，220rpm培養(yǎng)培養(yǎng)48h后停止發(fā)酵，收集菌體破碎后檢測(cè)法尼醇的含量。

本發(fā)明的法尼醇的含量的檢測(cè)步驟可示例性說(shuō)明如下：

首先取一定量的類(lèi)球紅細(xì)菌發(fā)酵液，8000rpm離心5min后棄上清，沉淀用乙酸乙酯重懸至5-10ml，用超聲破碎法將細(xì)胞破碎，12000rpm離心10min。加入2-4ml的癸烷，充分混勻后，吸取癸烷層溶液，12000rpm離心8min后取上清用氣質(zhì)(gc-ms)檢測(cè)法尼醇。gc-ms檢測(cè)條件：儀器型號(hào)為安捷倫6890n-5975c，19091jhp-5非極性毛細(xì)管柱(0.32mm×250μm×30m)；fid檢測(cè)器；載氣流量：1.0ml/min，恒定流量；分流比10：1；進(jìn)樣量1μl；進(jìn)樣口溫度260℃；檢測(cè)器溫度260℃；升溫程序：80℃保持1min，10℃/min升溫至250℃。250℃后運(yùn)行3min，溶劑延遲時(shí)間1min。

本發(fā)明中所述的具體方法、步驟以及其中所使用的試劑、材料等，除非另作說(shuō)明，否則均為本領(lǐng)域內(nèi)通常已知的，并且也容易地通過(guò)公開(kāi)出版物獲知或通過(guò)購(gòu)買(mǎi)獲得。具體出版物可參見(jiàn)，例如冷泉港的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第四版等公開(kāi)出版物等。

實(shí)施例1

通過(guò)在類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides2.4.1胞內(nèi)異源表達(dá)鼠疫耶爾辛桿菌磷酸酶pgpb，可以將類(lèi)球紅細(xì)菌mep途徑積累的法尼酯轉(zhuǎn)化為法尼醇，從而實(shí)現(xiàn)利用類(lèi)球紅細(xì)菌來(lái)生產(chǎn)法尼醇。具體步驟如下：

1.構(gòu)建pbbr1mcs2-pgpb重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化e.colis17-1(供體菌)：

使用gibsonassembly(neb公司，美國(guó))無(wú)縫連接的方法構(gòu)建pbbr1mcs2-pgpb重組質(zhì)粒。先用基因組提取試劑盒(全氏金公司，北京)提取鼠疫耶爾辛桿菌(yersiniapestis)co92的基因組。以基因組為模板，使用引物pgpb-f(seqidno:2)和pgpb-r(seqidno:3)從基因組中克隆得到磷酸酶pgpb1基因；以pbbr1mcs2載體為模板，用引物pbbr1mcs2-f(seqidno:4)和pbbr1mcs2-r(seqidno:5)克隆得到pbbr1mcs2載體的拼接片段。

使用基因回收試劑盒(omega公司，美國(guó))將克隆得到的pgpb基因和pbbr1mcs2載體的拼接片段回收，按照gibsonassembly的方法將pgpb基因和pbbr1mcs2載體的拼接片段混合，50℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)完畢之后將混合液42℃熱激1min轉(zhuǎn)化大腸桿菌t1細(xì)胞，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，將能夠在含kan抗性的lb培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌株挑選出來(lái)培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pbbr1mcs2-pgpb備用。再次使用熱激法將提取出來(lái)的重組質(zhì)粒pbbr1mcs2-pgpb轉(zhuǎn)化大腸桿菌e.colis17-1(供體菌)，挑取能夠在含kan抗性的lb培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌株，提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。

2.細(xì)菌接合轉(zhuǎn)化重組載體pbbr1mcs2-pgpb至類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides2.4.1(受體菌)：

將含有pbbr1mcs2-pgpb正確序列的e.colis17-1克隆與類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides2.4.1進(jìn)行細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pbbr1mcs2-pgpb。類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides2.4.1菌株購(gòu)自atcc(菌種編號(hào)atcc17023)，供體菌s17-1(含質(zhì)粒pbbr1mcs-2-pcak)在含有kan抗生素的lb液體培養(yǎng)基的搖瓶中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日以1:10的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至新鮮的lb液體培養(yǎng)基，控制時(shí)間繼續(xù)培養(yǎng)約1-2h左右，在供體菌完全達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(od600:0.4-0.6)的時(shí)候停止培養(yǎng)，收集菌體；受體菌類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides在lb液體培養(yǎng)基中30℃接種過(guò)夜培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)接至新鮮的lb培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，控制培養(yǎng)時(shí)間直至受體菌完全處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)(od600:0.3-0.6)，停止培養(yǎng)并收集菌體。分別取2-5μl菌液，離心并用新鮮的lb培養(yǎng)基洗滌2次，供體菌和受體菌分別用50μl及100μl的lb培養(yǎng)基稀釋重懸。供體菌和受體菌按照一定比例混合后均勻涂布到固體無(wú)抗性lb平板上，培養(yǎng)20-24h至有明顯菌落出現(xiàn)，再將平板上的菌落用1ml預(yù)冷的溶液1(細(xì)菌接合專(zhuān)用培養(yǎng)基)洗脫收集至0.5mlep管中；4℃8000rpm離心5min，棄上清液，再次加入500μl預(yù)冷的溶液1，吹吸混勻，重復(fù)洗滌1-2次；再用0.1ml的溶液1重懸菌落后涂布在終濃度200mg/l亞碲酸鉀(k2teo3)和50mg/mlkan的雙抗性溶液1平板上，待32℃培養(yǎng)3-5天后，平板上出現(xiàn)黑色接合子，即為pbbr1mcs2-pgpb重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的類(lèi)球紅細(xì)菌菌落。

(溶液1的成分：(nh4)2so40.8g/l，谷氨酸鈉0.10g/l，天冬氨酸0.04g/l，尼克酸1.0mg/l，維生素b10.50mg/l，生物素0.010mg/l，nacl2.5g/l，mgcl2·6h2o2.44g/l，cacl2·h2o0.3g/l，feso4·7h2o0.02g/l，(nh4)6mo7o24·4h2o0.2ml(1％solution)，配好后用鹽酸調(diào)ph4.5-4.9)

3.重組類(lèi)球紅細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)與法尼醇產(chǎn)量的檢測(cè)：

將含有pbbr1mcs2-pgpb重組質(zhì)粒的類(lèi)球紅細(xì)菌從保種管中取1-3μl接種至lb固體培養(yǎng)基上活化，然后將菌落轉(zhuǎn)接至25ml的lb種子培養(yǎng)基，32℃，220rpm培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后的菌液按10％的接種量轉(zhuǎn)接至含有50-250ml的類(lèi)球紅細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基，32℃，220rpm培養(yǎng)48h后停止發(fā)酵，收集菌體破碎后檢測(cè)法尼醇的含量。

類(lèi)球紅細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖7g/l，蛋白胨3.2g/l，nh4cl3.8g/l，fecl30.25g/l，mgso46g/l，玉米漿1.2g/l，na2hpo41.8g/l，nah2po42g/l，kcl2.4g/l，cuso40.06g/l，ca(hco3)27.2g/l，維生素b120g/l，核黃素3g/l，葉酸1g/l，煙酸胺25g/l。

法尼醇的含量的檢測(cè)方法為：首先取一定量的類(lèi)球紅細(xì)菌發(fā)酵液，8000rpm離心5min后棄上清，沉淀用乙酸乙酯重懸至5-10ml，用超聲破碎法將細(xì)胞破碎，超聲20s，停20s，處理時(shí)間10min，然后12000rpm離心10min。加入2-4ml的癸烷，充分混勻后，吸取癸烷層溶液，12000rpm離心8min后取上清用氣質(zhì)(gc-ms)檢測(cè)法尼醇。gc-ms檢測(cè)條件：儀器型號(hào)為安捷倫6890n-5975c，19091jhp-5非極性毛細(xì)管柱(0.32mm×250μm×30m)；fid檢測(cè)器；載氣流量：1.0ml/min，恒定流量；分流比10：1；進(jìn)樣量1μl；進(jìn)樣口溫度260℃；檢測(cè)器溫度260℃；升溫程序：80℃保持1min，10℃/min升溫至250℃。250℃后運(yùn)行3min，溶劑延遲時(shí)間1min。

經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表達(dá)外源磷酸酶pgpb的重組類(lèi)球紅細(xì)菌rhodobactersphaeroides2.4.1能夠產(chǎn)生法尼醇，產(chǎn)量為84.75±2.06mg/l，而未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的野生型類(lèi)球紅細(xì)菌則不能合成法尼醇。

本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單的基因工程改造方法可以使類(lèi)球紅細(xì)菌合成法尼醇。

sequencelisting

<110>福建師范大學(xué)

<120>基因工程化類(lèi)球紅細(xì)菌及其制備方法和法尼醇的生產(chǎn)方法

<130>yc12017040001-b

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>762

<212>dna

<213>yersiniapestis

<400>1

atgtataacatggcaaaacgagtcactatcggaacggttattttattattgccaacgtta60

gcgatatggctttccgattggcagtggcaaccagggggaaataacacgtggttaaaaggt120

tttttttgggtgacagaaacggtaactgcaccttggggcatactgaccagtgtgttgctt180

tgtagttggttcttgtggtgcttgcgggttcgctttaagcctgccgttgggctgtttgtg240

gtattaggcgcggtgattgttctcgggcaaggtgtaaaatcgttgattaaagagcaggta300

caggaacctcggccatttgttgcctggcttgaagccgagcatcatattaataatcgcctt360

ttctattctttaccgcgtgccgaacgcagtgagttagtcaggcagcagttacaagaccaa420

ttgattattcctgtgtggttgagccgtcactggcagtttgagaccgggttctctttcccg480

tcaggacatactgtatttgccgccacttgggcattattagccgttgggctgctatggcca540

cggcgacattataaaacggtcgttttactgatgttatgggcacaaggtgtgatggcgagc600

cgcttatttttaggtatgcactggccgcaggacctgattgccgcgacgctcatcagtggc660

gtcttggccgctgtggcgtgtggactcctccagcatgggttcggccttctggatatcccg720

caatcagaacaaaaagagagcgaaaaacgggggcatgagtaa762

<210>2

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cgtaacaggaggaattaaccatgtataacatggcaaaacgag42

<210>3

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggttaattcctcctgttacgcgc23

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gaattcggtgagctcggtctg21