專利名稱：一種解除銨阻遏的生物產(chǎn)氫基因工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種可以在高銨(銨離子)濃度 下進(jìn)行高效光合制氫的基因工程菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
作為一種清潔能源載體，生物法制氫有著廣闊的發(fā)展前景。在各種生物法制氫的 方式中，應(yīng)用紫色非硫細(xì)菌(purple non-sulfur bacteria)如類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)進(jìn)行光發(fā)酵制氫具有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，紫色非硫細(xì)菌可以利用多種小分子 有機(jī)物制氫，甚至包括暗發(fā)酵無法降解的乙酸，因此可以在制氫的同時(shí)處理發(fā)酵廢水。其 次，紫色非硫細(xì)菌可以徹底降解有機(jī)物到二氧化碳，因此利用同樣的底物，它的理論產(chǎn)氫量 大大高于暗發(fā)酵制氫。另外，利用光發(fā)酵產(chǎn)生的氫氣純度(75%-90%)比暗發(fā)酵的純度 (40%-60%)高很多，這使得隨后的純化更容易。還有，這種制氫方式可以直接利用太陽 能，而且不需要復(fù)雜的半導(dǎo)體太陽能板。以上的優(yōu)勢(shì)使光發(fā)酵制氫成為應(yīng)對(duì)化石能源危機(jī) 和日益增長(zhǎng)的有機(jī)廢物的可行方案之一。但光發(fā)酵制氫用于生產(chǎn)仍有一些問題有待解決。 其中之一，就是如何解除銨對(duì)制氫的抑制。紫色非硫細(xì)菌在光照下通過固氮酶催化產(chǎn)生氫氣。由于固氮酶的表達(dá)和活性會(huì) 受到銨的嚴(yán)格控制，因此在有豐富氮源時(shí)無法產(chǎn)生氫氣。許多報(bào)道指出，在添加銨2-3分 鐘后紫色非硫細(xì)菌的固氮酶就會(huì)被完全抑制，這種抑制完全解除需要將氮源消耗殆盡，往 往是一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的過程。有報(bào)道稱游離銨離子濃度達(dá)到14mM時(shí)類球紅細(xì)菌就會(huì)完全喪失 產(chǎn)氫能力。在光發(fā)酵制氫的研究中，為了避免銨阻遏現(xiàn)象，通常使用谷氨酸作為制氫培養(yǎng) 基的氮源。然而許多廢水中銨離子的濃度超過14mM。例如，味精廠廢水中銨離子的濃度為 55-533mM,焦化廢水為200mM，化肥廠廢水中銨離子的濃度高達(dá)897mM。高濃度的銨離子會(huì) 抑制紫色非硫細(xì)菌利用這些廢水中的有機(jī)物產(chǎn)氫。為了解決光發(fā)酵制氫過程的銨阻遏，已有很多科學(xué)家作過嘗試。他們采用與其他 厭氧微生物共培養(yǎng)或者兩步法先將培養(yǎng)基中的銨消耗掉然后進(jìn)行制氫。例如，在含有2. ImM 銨的豆腐廢水中，類球紅細(xì)菌與厭氧菌clostridiumbutyricum IFO 3847共培養(yǎng)可以產(chǎn)生 2. 2mL氫氣/mL廢水，而單獨(dú)使用類球紅細(xì)菌時(shí)產(chǎn)氫量為1. 9mL/mL廢水。Takabatake等人 發(fā)現(xiàn)紫色非硫細(xì)菌經(jīng)過96小時(shí)的生長(zhǎng)后會(huì)消耗掉培養(yǎng)基中ISmM的銨離子，然后開始產(chǎn)生 氫氣。但在以上這些嘗試中，銨抑制解除效果并不十分明顯。隨著對(duì)銨抑制機(jī)理的了解，科學(xué)家希望通過遺傳操作來獲得可以解除銨抑制的突 變體。nifA基因編碼nif基因的特異性轉(zhuǎn)錄激活因子，它控制著固氮酶的合成。許多解除 銨阻遏的遺傳改造與nifA的轉(zhuǎn)錄和活性有關(guān)。一株組成型過表達(dá)nifA的莢膜紅細(xì)菌突變 體可以在15mM銨離子濃度下介導(dǎo)nif基因的轉(zhuǎn)錄。NtrB/NtrC在莢膜紅細(xì)菌中被證實(shí)是 全局性調(diào)控nif基因的雙組分系統(tǒng)，PII蛋白介導(dǎo)該系統(tǒng)的激活。氮源缺乏條件下NtrB將 調(diào)控因子NtrC磷酸化進(jìn)而激活。相反，銨存在時(shí)，PII蛋白會(huì)介導(dǎo)NtrC的去磷酸化最終使 nifA的轉(zhuǎn)錄終止。莢膜紅細(xì)菌的PII蛋白突變體在20mM銨離子濃度下保持高水平的產(chǎn)氫活力。突變株的固氮酶活是野生型的4倍，產(chǎn)氫也有1.5倍的增強(qiáng)。但同樣的類球紅細(xì)菌 PII蛋白突變體在2mM銨離子濃度下只能產(chǎn)生野生型無銨條件氫氣量的1/6，還沒有試驗(yàn)結(jié) 果證實(shí)PII蛋白和NtrB/NtrC系統(tǒng)在類球紅細(xì)菌或其他光合細(xì)菌中也參與nif基因表達(dá)的 全局性調(diào)控。因此，這些光合細(xì)菌需要更有效的方法解除銨阻遏。綜上，本領(lǐng)域還有必要開發(fā)可徹底地解除銨阻遏的細(xì)菌，以高產(chǎn)地獲得氫能源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種解除銨阻遏的生物產(chǎn)氫基因工程菌及其構(gòu)建方法和 應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種解除銨阻遏的生物產(chǎn)氫基因工程菌，其不表達(dá)谷 氨酰胺合成酶(GS)。在一個(gè)優(yōu)選例中，通過基因敲除的方法使所述的基因工程菌不表達(dá)谷氨酰胺合成 酶。在另一優(yōu)選例中，所述的基因工程菌的基因組中，含有突變的glnA基因序列，其 不編碼谷氨酰胺合成酶(即不表達(dá)谷氨酰胺合成酶)。在另一優(yōu)選例中，所述的突變的glnA基因序列為內(nèi)部插入了卡那霉素抗性基因 序列的glnA基因序列。在另一優(yōu)選例中，所述的卡那霉素抗性基因序列插入在glnA基因序列的內(nèi)部的 stul位點(diǎn)上。在另一優(yōu)選例中，所述的突變的glnA基因序列為內(nèi)部插入了氯霉素抗性基因或 鏈霉素抗性基因序列g(shù)lnA的基因序列。在另一優(yōu)選例中，所述的卡那霉素抗性基因?yàn)榭敲顾乜剐曰虻钠?；更?yōu)選 地，為GenBank登錄號(hào)AY048743中所示序列的第51-1489位序列。在另一優(yōu)選例中，所述的基因工程菌是紫色非硫細(xì)菌。在另一優(yōu)選例中，所述的紫色非硫細(xì)菌選自類球紅細(xì)菌 (Rhodobactersphaeroides)、胃工細(xì)胃(Rhodobacter capsulutas)、^X 工 胃 (Rhodospirillumrubrum)或它們的變異型菌株。更佳地，所述的類球紅細(xì)菌是類球紅細(xì)菌 601。在本發(fā)明的第二方面，提供一種制備所述的基因工程菌的方法，包括(1)提供一打靶質(zhì)粒，所述的打靶質(zhì)粒中，含有突變的glnA基因序列，其不編碼谷 氨酰胺合成酶；(2)將(1)所述的打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入紫色非硫細(xì)菌內(nèi)，通過同源交換使得突變的glnA 基因序列整合到紫色非硫細(xì)菌的基因組；和(3)選擇發(fā)生了雙交換的紫色非硫細(xì)菌，即為所述的基因工程菌。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(2)中，通過接合轉(zhuǎn)移的方法將打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入紫色非硫細(xì) 菌內(nèi)。在另一優(yōu)選例中，通過轉(zhuǎn)化的方法將打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入紫色非硫細(xì)菌內(nèi)。在另一優(yōu)選例中，所述的突變的glnA基因序列為內(nèi)部插入了卡那霉素抗性基因 序列的glnA基因序列。
在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，先將打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，混合培養(yǎng)帶有打 靶質(zhì)粒的大腸桿菌和紫色非硫細(xì)菌，從而打靶質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入紫色非硫細(xì)菌中。在另一優(yōu)選例中，所述的大腸桿菌是大腸桿菌S17-1。在另一優(yōu)選例中，用于構(gòu)建打靶質(zhì)粒的質(zhì)粒選自pSUP202、pSUP203、pLOl、 pPHU281、pSZ21 ；更優(yōu)選的，所述的打靶質(zhì)粒是pSUP202。在另一優(yōu)選例中，在所述的打靶質(zhì)粒中，所述的插入了卡那霉素抗性基因序列的 glnA基因序列位于BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)內(nèi)。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，所述選擇發(fā)生了雙交換的紫色非硫細(xì)菌的方法是(a)將待選擇的菌涂布到添加篩選培養(yǎng)基(含有用于抗性篩選的抗生素)上，所述 的培養(yǎng)基為RCVBN，其中以1. 0-1. 6g/L(優(yōu)選1. 3-1. 5g/L ；更優(yōu)選1. 45g/L)谷氨酰胺代替 其中的硫酸銨；(b)培養(yǎng)所述的菌(優(yōu)選在30士3°C下培養(yǎng)96士24小時(shí))，能夠在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的 菌即為發(fā)生了雙交換的紫色非硫細(xì)菌。在另一優(yōu)選例中，所述的篩選培養(yǎng)基含有DL蘋果酸4g/L，磷酸氫二鉀和磷酸二 氫鉀緩沖液10mM，七水硫酸鎂200mg/L，谷氨酰胺1. 45g/L，二水氯化鈣75mg/L，乙二胺四乙 酸鈉20mg/L，生物素0. 01mg/L,維生素BIO. 5mg/L,尼克酸lmg/L，微量金屬元素貯液lmL/L， 瓊脂粉20g/L。在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中，用于篩選的抗生素是卡那霉素和利福平。更優(yōu) 選地，卡那霉素含量為30-80mg/L，利福平含量為30-80mg/L。在另一優(yōu)選例中，微量金屬元素貯液含有四水硫酸錳2. lg/L，硼酸2.8g/L，七水 硝酸銅0. 04g/L,七水硫酸鋅0. 24g/L，二水鉬酸鈉0. 75g/L。在另一優(yōu)選例中，應(yīng)用PCR方法、Southern雜交方法或GS酶活測(cè)定方法選擇發(fā)生 了雙交換的紫色非硫細(xì)菌(即glnA基因已敲除的細(xì)菌)。在本發(fā)明的第三方面，提供一種利用高氨離子濃度的底物(培養(yǎng)基)制備氫氣的 方法，包括在光照下，培養(yǎng)所述的基因工程菌，收集所產(chǎn)生的氫氣。在另一優(yōu)選例中，光照強(qiáng)度為5000士20001UX;或培養(yǎng)時(shí)，采用的培養(yǎng)基選自 RCVBN培養(yǎng)基、生物乙醇廢水，琥珀酸廠廢水，豆制品廢水。在另一優(yōu)選例中，底物(培養(yǎng)基)中銨(銨離子)濃度為O-IOOmM;更佳地為 2-60mM ；進(jìn)一步更佳地為5-40mM。在另一優(yōu)選例中，所述底物(培養(yǎng)基)中，谷氨酰胺的濃度為0. 3-0. 9mg/L(優(yōu)選 0. 3-0. 7mg/L)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1顯示了菌落PCR鑒定結(jié)果。其中，第一排1泳道是以打靶質(zhì)粒為模板，第二排 17泳道是以野生型菌株為模版；第一排12泳道和第二排5泳道是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。 雙交換的重組子顯示約2. 2kb的單一條帶，如第一排4、8、13、14、17、18泳道和第二排2、3、 6、13泳道；單交換有約2. 2kb和0. 75kb兩條條帶。
圖2顯示了以卡那霉素抗性基因?yàn)樘结?，泳?為野生型菌株，泳道2為發(fā)生雙交 換的基因工程菌，正確工程菌顯示5. Ikb的條帶。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明經(jīng)過深入的研究，首次開發(fā)出一種解除銨阻遏的生物產(chǎn)氫基因工程菌，該 基因工程菌的基因組中g(shù)lnA基因被敲除，因而不表達(dá)谷氨酰胺合成酶。本發(fā)明的基因工程 菌的固氮酶活性基本上不受高銨離子濃度抑制，可以在高濃度銨離子存在下高效進(jìn)行光發(fā) 酵制氫。本發(fā)明還提供了該基因工程菌的構(gòu)建方法。術(shù)語如本文所用，所述的“紫色非硫細(xì)菌(purple non-sulfur bacteria) ”是指一類 細(xì)菌，其在現(xiàn)有技術(shù)中經(jīng)常被用于光發(fā)酵生物法制氫，其在光照下通過固氮酶催化產(chǎn)生氫 氣。紫色非硫細(xì)菌包括但不限于類球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)、莢膜紅細(xì)菌 (Rhodobacter capsulutas)、深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)等，這些細(xì)菌具有相同 的產(chǎn)氫機(jī)制和特性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的紫色非硫細(xì)菌是類球紅細(xì)菌(包括現(xiàn) 有的類球紅細(xì)菌的各種野生型或突變株以及含有與類球紅細(xì)菌glnA基因有較高同源性 (如同源性高于80% ；更佳地高于90% ；最佳地高于95%)的GS編碼基因的菌株)；更優(yōu) 選類球紅細(xì)菌601，采用該菌株作為出發(fā)菌株制備的不表達(dá)GS的基因工程菌，其GS酶活可 被徹底地去除，銨阻遏的解除效果良好，且產(chǎn)氫性能更為穩(wěn)定高效。如本文所用，所述的“銨濃度”、“銨離子濃度”、“銨鹽濃度”可以互換使用，是指用 于培養(yǎng)產(chǎn)氫細(xì)菌的溶液(或發(fā)酵液，或培養(yǎng)液)中銨離子的濃度。除非另外說明，所述的 “高銨濃度”通常是指溶液(或發(fā)酵液，或培養(yǎng)液)中銨離子(或銨鹽)濃度高于15mM的情 況。如本文所用，所述的“同源交換”是指由兩條具有同源區(qū)的DNA分子，通過配對(duì)、鏈 的斷裂和再連接，而產(chǎn)生片斷交換(crossing over)的過程?！半p交換”是指基因組中相關(guān) 基因的雙鏈均被同源交換，即突變的glnA基因序列被交換到紫色非硫細(xì)菌中原glnA基因 序列的位置且該交換發(fā)生在glnA基因雙鏈上；“單交換”是指基因組中相關(guān)基因的一條鏈 被同源交換，而另一條鏈未發(fā)生交換。如本文所用，所述的“接合轉(zhuǎn)移”是細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移的一種方式，在細(xì)菌的細(xì)胞相 互接觸時(shí)遺傳信息由一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。如本文所用，所述的“不表達(dá)谷氨酰胺合成酶的菌株”是指一種菌株，其與相應(yīng)的 野生型菌株(即未敲除glnA基因的相同菌株)相比，谷氨酰胺合成酶的表達(dá)量(或酶活) 降低了 90%以上，更優(yōu)選地降低了 95%以上，最優(yōu)選地降低了 97%以上，如降低了 98%、 99%或100% (即完全不表達(dá)谷氨酰胺合成酶)。基因工程菌本發(fā)明提供了一種解除銨阻遏的生物產(chǎn)氫基因工程菌，所述的基因工程菌不表達(dá) 谷氨酰胺合成酶(GS)。更特別地，所述的基因工程菌的基因組中，glnA基因被敲除。谷氨酰胺合成酶為一種現(xiàn)有技術(shù)已知的酶，廣泛存在于動(dòng)植物、微生物中，是植物 和革蘭氏陰性微生物在氨同化過程中的關(guān)鍵酶。紫色非硫細(xì)菌的谷氨酰胺合成酶蛋白序列 與GenBank登錄號(hào)ABA79319所示的序列基本上相同，其基因序列(glnA基因)與GenBank登錄號(hào)CP001150所示的序列基本上相同或?yàn)楹?jiǎn)并的序列。目前本領(lǐng)域?qū)τ谠谧仙橇蚣?xì) 菌中谷氨酰胺合成酶的表達(dá)情況與生物產(chǎn)氫的關(guān)系還不夠明確。阻止谷胺酰胺合成酶表達(dá)或活性的方法是多種多樣的，例如可通過特異性結(jié)合谷 胺酰胺合成酶的抗體或配體來抑制其活性；或利用小RNA分子或反義核苷酸從轉(zhuǎn)錄水平上 抑制谷胺酰胺合成酶表達(dá)等等。而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)谷胺酰胺合成酶的編碼基因(glnA基 因)進(jìn)行突變是最優(yōu)選的方式。對(duì)于谷胺酰胺合成酶的編碼基因(glnA基因)進(jìn)行突變的方法是多種多樣的，如 存在于一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的點(diǎn)突變，或存在于一個(gè)或多個(gè)位置的插入突變，或存在于一個(gè) 或多個(gè)位置的缺失突變等；此外，近期sigma公司推出了一種基于二類內(nèi)含子的基因敲除 系統(tǒng)TargeTron Gene Knockout System，可用于進(jìn)行基因敲除。上述這些方式均可用于 本發(fā)明。作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，對(duì)谷胺酰胺合成酶的編碼基因(glnA基因)進(jìn)行 插入突變。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，插入突變可以最徹底地阻止glnA基因的表達(dá)，使得所述的基因 工程菌不表達(dá)谷胺酰胺合成酶。因此，本發(fā)明人嘗試了多種glnA基因突變方式后，優(yōu)選采 用插入突變的方式。能夠使得glnA基因不表達(dá)的基因突變方式均是可用的，例如可以在glnA基因內(nèi) 部插入至少一種其它基因(如氯霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因)，破壞其原有的編碼方 式，從而使得谷氨酰胺合成酶表達(dá)量下降。作為本發(fā)明的更優(yōu)選方式，所述的基因工程菌的 基因組中，glnA基因序列的內(nèi)部插入了卡那霉素抗性基因序列?？敲顾乜剐曰蚴且环N 本領(lǐng)域已知的基因，其全長(zhǎng)的基因序列與GenBank登錄號(hào)AY048743中459-1253位所示的 序列基本上相同。更優(yōu)選地，本發(fā)明采用的是卡那霉素抗性基因的片段，優(yōu)選GenBank登錄 號(hào)AY048743中所示序列的第51-1489位序列；或者GenBank登錄號(hào)AY048743中所示序列 的第459-1253位(全長(zhǎng)卡那霉素抗性基因)的序列，該長(zhǎng)度既適合于基因操作，且突變效 果良好，其在插入glnA基因序列的內(nèi)部后，完全地阻止了 glnA基因的表達(dá)。作為本發(fā)明的更優(yōu)選方式，所述的卡那霉素抗性基因序列插入在glnA基因序列 的內(nèi)部的stul位點(diǎn)上?；蚬こ叹臉?gòu)建本發(fā)明還提供了一種制備所述的基因工程菌的方法，包括構(gòu)建用以敲除銨同化 關(guān)鍵基因的打靶質(zhì)粒，將打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌，篩選發(fā)生同源交換(即銨同化關(guān)鍵基因被 敲除)的基因工程菌。較佳地，該方法包括(1)提供一打靶質(zhì)粒，所述的打靶質(zhì)粒中，含有 突變的glnA基因序列，其不編碼谷氨酰胺合成酶(即不表達(dá)谷氨酰胺合成酶)；(2)將(1) 所述的打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入紫色非硫細(xì)菌內(nèi)，通過同源交換使得突變的glnA基因序列整合到紫 色非硫細(xì)菌的基因組；和(3)選擇發(fā)生了雙交換的紫色非硫細(xì)菌，即為所述的基因工程菌。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于構(gòu)建打靶質(zhì)粒的質(zhì)粒選自pSUP202、pSUP203、pL01、 pPHU281、pSZ21 ；更優(yōu)選的，所述的打靶質(zhì)粒是pSUP202。外源DNA轉(zhuǎn)入紫色非硫細(xì)菌的方法主要有接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化或噬菌體轉(zhuǎn)染，這 些方式均可用于本發(fā)明。轉(zhuǎn)化的方法在1982年就被C. S. F0RNARI和S. KAPLAN建 立，最高可以達(dá)到每個(gè)存活細(xì)胞5X 10_6的轉(zhuǎn)化效率(Fornari CS, Kaplan S. 1982. Genetic-Transformation of Rhodopseudomonas-Sphaeroides byPlasmid DNA. Journal of Bacteriology 152(1) =89-97) 0噬菌體相關(guān)的技術(shù)應(yīng)用通常需要找到該物種專一性的噬菌體，例如在莢膜紅細(xì)菌中就有類似噬菌體的DNA轉(zhuǎn)移途徑(Marrs B. 1974. Genetic Recombination inRhodopseudomonas-Capsulata. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 71(3) 971-973 ；Solioz Μ,Yen HCiMarrs B.1975. Release and Uptake of Gene Transfer Agent by Rhodopseudomonas-Capsulata. Journal of Bacteriology 123(2) :651_657)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，接合轉(zhuǎn)移的方法是較為有效的。通過接合轉(zhuǎn)移的方法將打靶質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入紫色非硫細(xì)菌內(nèi)。所述的質(zhì)粒為一種自殺質(zhì)粒(suicide plasmid)，其具有接合轉(zhuǎn)移基 因。在構(gòu)建基因缺失工程菌時(shí)，需要選擇適當(dāng)?shù)淖詺①|(zhì)粒。自殺質(zhì)粒的復(fù)制需要一種特殊 的蛋白，大多數(shù)細(xì)菌不產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)，因此，當(dāng)進(jìn)入寄主細(xì)胞時(shí)，要么不能復(fù)制，被消除， 要么被整合入染色體上，和染色體一起復(fù)制。利用自殺質(zhì)粒的這個(gè)特點(diǎn)，將基因工程技術(shù)構(gòu) 建的基因缺失的DNA片斷，克隆入自殺質(zhì)粒，利用缺失基因兩端的同源片斷，定位自殺質(zhì)粒 的整合位點(diǎn)。利用同源性DNA片斷可發(fā)生重組的原理，構(gòu)建精確基因缺失菌株。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移時(shí)，先將打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到具有結(jié)合轉(zhuǎn)移 功能的大腸桿菌中，混合培養(yǎng)帶有打靶質(zhì)粒的大腸桿菌和紫色非硫細(xì)菌，從而打靶質(zhì)粒通 過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入紫色非硫細(xì)菌中。所述的大腸桿菌優(yōu)選的是大腸桿菌S17-1。本發(fā)明人在構(gòu)建所述基因工程菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，在選擇發(fā)生了雙交換的紫色非硫細(xì)菌 時(shí)，培養(yǎng)基的選擇較為關(guān)鍵。不合適的培養(yǎng)基易于產(chǎn)生假陰性的結(jié)果，導(dǎo)致篩選結(jié)果不穩(wěn)定 甚至根本篩選不到發(fā)生雙交換的陽性菌。因此，本發(fā)明人在試驗(yàn)了多種篩選培養(yǎng)基后，最后 確定采用經(jīng)改造的RCVBN培養(yǎng)基。該經(jīng)改造的RCVBN培養(yǎng)基與普通RCVBN培養(yǎng)基的不同點(diǎn) 在于以1. 0-1. 6g/L，優(yōu)選1. 3-1. 5g/L ；更優(yōu)選1. 45g/L的谷氨酰胺代替其中的lg/L硫酸 銨。所述的培養(yǎng)基中，還添加了抗性篩選成分，選出能夠在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌即為發(fā)生了雙 交換的紫色非硫細(xì)菌。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的篩選培養(yǎng)基含有DL蘋果酸4g/L，磷 酸氫二鉀和磷酸二氫鉀緩沖液10mM，七水硫酸鎂200mg/L，谷氨酰胺1. 45g/L，二水氯化鈣 75mg/L，乙二胺四乙酸鈉20mg/L，生物素0. Olmg/L，維生素BIO. 5mg/L，尼克酸lmg/L，微量 金屬元素貯液lmL/L，瓊脂粉20g/L。優(yōu)選地，所述的抗性篩選成分為卡那霉素和利福平；更 優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)基中，卡那霉素含量為30-80mg/L，利福平含量30-80mg/L。應(yīng)理解，由 于本發(fā)明的上述提示，在本領(lǐng)域人員可變通的范圍內(nèi)，可以適度地改變所述的培養(yǎng)基的配 方，這些變化均包含在本發(fā)明中。在選擇發(fā)生了雙交換的紫色非硫細(xì)菌時(shí)，其它培養(yǎng)條件可以是常規(guī)的紫色非硫細(xì) 菌培養(yǎng)條件。優(yōu)選地，在30士3°C下培養(yǎng)96士24小時(shí)，之后選擇能夠在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌。為了確認(rèn)所選擇獲得的基因工程菌為發(fā)生了雙交換的基因工程菌(即glnA基因 已敲除的細(xì)菌)，還可對(duì)其進(jìn)行鑒定。鑒定的方法包括但不限于PCR方法、Southern雜交 方法或GS酶活測(cè)定方法。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，構(gòu)建解除銨阻遏生物制氫基因工程菌方法的步 驟是(a)構(gòu)建用以敲除銨同化關(guān)鍵基因的打靶質(zhì)粒將銨同化基因glnA克隆到pMDlS-T 載體后，在基因內(nèi)部的stul位點(diǎn)插入卡那霉素抗性基因，然后將整個(gè)片斷使用BamHI和 HindIII切下后連入自殺質(zhì)粒；(b)將打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌，篩選發(fā)生同源交換的基因工程 菌應(yīng)用接合轉(zhuǎn)移技術(shù)把打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入類球紅細(xì)菌野生型，經(jīng)過同源交換后，帶有卡那霉素 抗性基因的片段會(huì)整合到類球紅細(xì)菌的基因組，使該工程菌具有卡那霉素抗性；(c)應(yīng)用PCR、Southern雜交或GS酶活驗(yàn)證基因已敲除。產(chǎn)氫方法本發(fā)明還提供了一種制備氫氣的方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明所述的基因工程菌，收集 所產(chǎn)生的氫氣。利用紫色非硫細(xì)菌來制備氫氣的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，本發(fā)明的改 進(jìn)在于采用基因工程技術(shù)獲得了新的紫色非硫細(xì)菌，其可抵抗銨的阻遏。因此，任何采用紫 色非硫細(xì)菌來制備氫氣的方法皆可用于本發(fā)明。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在光照條件下培養(yǎng)本發(fā)明所述的基因工程菌以產(chǎn)生氫 氣。更優(yōu)選地，光照強(qiáng)度為5000士20001UX。光發(fā)酵生產(chǎn)氫氣的方法是本領(lǐng)域人員熟知的，而各種用于生產(chǎn)氫氣的底物也被本 領(lǐng)域人員所熟知，例如可以是=RCVBN培養(yǎng)基，生物乙醇廢水，琥珀酸廠廢水，豆制品廢水。 所述的底物中可以含有高濃度的銨(銨離子)，如濃度為0-40mM。本產(chǎn)品的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明的基因工程菌的固氮酶活性不再受到高銨抑制，在高濃度銨(銨離子) 存在下，仍然可以高效進(jìn)行光發(fā)酵制氫。(2)本發(fā)明的基因工程菌中GS酶活性被徹底地去除，從而使得菌株在耐高濃度銨 離子的效果較好；克服了以往本領(lǐng)域技術(shù)人員難以獲得GS酶活性徹底去除的工程菌的技 術(shù)難題。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比或 份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、構(gòu)建用以敲除銨同化關(guān)鍵基因的打靶質(zhì)粒比較相關(guān)基因核苷酸序列，以類球紅細(xì)菌2. 4. IglnA的序列(參見GenBank登錄 號(hào)CP001150)設(shè)計(jì)特異性引物，序列如下引物 A :5，-GTGAGCGGACGGCAGCTGCC-3，(SEQ ID NO 1)；引物 B :5，-GGCATAGACCTCTTCCCACT-3，(SEQ ID NO :2)。以類球紅細(xì)菌 601 (Rhodobacter spohaeroides 601)(參見 Pemberton JM, Bowen ARS. 1981. High-Frequency Chromosome Transfer inRhodopseudomonas—Sphaeroides Promoted by Broad-Host-Range Plasmid RplCarrying Mercury Transposon Tn501. Journal of Bacteriology 147(1) :110_117)的基因組 DNA 為模板，經(jīng) PCR 擴(kuò)增得到 2. Ikb 的DNA片段，純化PCR產(chǎn)物，TA克隆連入pMD18-T載體(TAKARA)的相應(yīng)位點(diǎn)內(nèi)。然后將約 1. 5kb的卡那霉素抗性基因片段(即GenBank登錄號(hào)AY048743所示序列中的第51-1489 位)平端插入該質(zhì)粒上glnA基因內(nèi)部的唯一的stul位點(diǎn)(AGG丨CCT)。將得到的質(zhì)粒 經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，回收3. 6kb的片段，插入同樣雙酶切的自殺質(zhì)粒pSUP202 (參見 Simon R, Priefer U, Puhler A. 1983. A Broad Host RangeMobilization System for Invivo Genetic-Engineering-Transposon Mutagenesis inGram-Negative Bacteria. Bio-Technology 1(9) :784_791)，從而獲得glnA打靶質(zhì)粒。具體實(shí)施方法如下
0081]UPCR反應(yīng)體系0082]PCR緩沖液2μ 1 ；0083]DMSO2μ 1 ；0084]混合dNTP (各2mM)2μ 1 ；0085]引物A1μ 1 ；0086]引物B1μ 1 ；0087]模板0. 5μ 1 ；0088]Taq酶0. 5μ 1 ；0089]雙蒸水補(bǔ)足20 μ 1。0090]2、PCR反應(yīng)條件0091]1)95°C預(yù)變性5min ；0092]2) 94 0C45s ；0093]60 0C30s ；0094]72 0C2min ；0095]30個(gè)循環(huán)；0096]3) 72 0CIOmin00097]3、DNA片段的回收與純化0098]采用axygen DNA膠回收試劑盒進(jìn)行，步驟如下0099](1)通過電泳將目的片段與其他DNA盡可能分開，然后用干凈的手術(shù)刀割下含需
回收DNA的瓊脂塊，放入1. 5ml離心管中；(2)加入3倍凝膠體積的緩沖液DE-A，置于75°C水浴中，使膠徹底融化，加熱融膠 時(shí)，每2分鐘混勻一次；(3)加入0. 5倍緩沖液DE-A體積的緩沖液DE-B，混合均勻；(4)將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000g離心30s，棄濾液；(5)將制備管置回2mL離心管，加500 μ 1緩沖液Wl，12000g離心30s，棄濾液；(6)將制備管置回2mL離心管，加700 μ 1緩沖液W2，12000g離心30s，棄濾液。同 樣方法再用700 μ 1緩沖液W2洗滌一次12000g離心Imin ；(7)將制備管置回2mL離心管，12000g離心Imin ；(8)將制備管置于潔凈的1. 5mL離心管中，在制備膜中央加25-30 μ 1 Eluent或者 去離子水，室溫靜置lmin。12000g離心Imin洗脫DNA。4、連接反應(yīng)在10 μ 1反應(yīng)體系中，加入50ng載體DNA和5倍摩爾數(shù)的片段DNA，1 μ 1連接緩 沖液，IU的T4DNA連接酶，16°C連接過夜。5、感受態(tài)細(xì)胞的制備(所有步驟都在冰浴條件下制備)(1)接種大腸桿菌的單菌落于3ml LB試管中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(2) 接種至IOOmL新鮮LB三角瓶，37°C振蕩4小時(shí)至0D600達(dá)到0. 3-0. 5 ；
(3)4°C，4000rpm離心5分鐘，收集菌體，重新懸浮于20ml的IOOmMCaCl2,冰上放 置20分鐘；(4) 40C，4000rpm離心5分鐘，收集菌體，加2mlCaC12 (甘油)懸浮，放于冰上分裝， 100 μ L/管。6、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(1)加連接產(chǎn)物10μ 1于100μ 1感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰上放30min ；(2)42°〇熱處理9086(3，冰上放 5min ；(3)加 0. 8mlLB 液體，37°C振蕩 45_60min ；(4)涂布事先添加適當(dāng)抗性選擇平板，37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)。7、堿裂解法小量提取質(zhì)粒(1)取菌液1. 5ml倒入微量離心管中，12000rpm離心30秒鐘，到上清，使細(xì)菌沉淀
盡量干燥。(2)將細(xì)菌重懸于 100 μ L冰冷的 Solution I (50mM葡萄糖，25mM Tris HClpH8. 0， IOmM EDTA pH8. 0)中，用槍頭吹打均勻。(3)加入新配制的Solution 11(1% SDS, 0. 2M NaOH) 200 μ L，快速混勻，但不要振 蕩，放置冰中2分鐘。(4)加入 150 μ L 用冰預(yù)冷的 SolutionIII (60mL 5M KAc，11. 5mL 冰醋酸，補(bǔ)水至 IOOmL)，溫和震蕩，充分混勻，置于冰上3-5分鐘，離心5分鐘。(5)取上清加同體積的酚氯仿，振蕩混勻，離心2分鐘。(6)吸上清移至另一新管，加同體積的異丙醇，放置室溫10分鐘，離心5分鐘，棄上清。(7)加入Iml 70%乙醇洗一次，再用同體積的無水乙醇洗一次。(8)待乙醇揮發(fā)完畢后，加入50 μ L ΡΗ8. 0的含有RNase的TE緩沖液溶解。實(shí)施例2、將打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌，篩選發(fā)生同源交換的基因工程菌將構(gòu)建好的glnA打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17_l(參見Simon R，Priefer U， Puhler A. 1983. A Broad Host Range Mobilization System for InvivoGenetic-Engin eering-Transposon Mutagenesis in Gram-Negative Bacteria. Bio-Technology 1(9) 784-791)中，通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入類球紅細(xì)菌中。具體實(shí)施步驟如下1、大腸桿菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例1。2、質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移(1)將轉(zhuǎn)入打靶質(zhì)粒的大腸桿菌S17-1和類球紅細(xì)菌601分別在LB平板劃線；(2)待兩株菌同時(shí)生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各取少量菌落至同一 LB平板，用接種環(huán)混 合均勻后劃線至全板，30°C培養(yǎng)20h ；(3)取培養(yǎng)后的菌落少許至ImL無菌生理鹽水中，充分懸浮后梯度稀釋；(4)取IO-1UO-3UO-5稀釋度的菌液100 μ 1涂布至添加卡那霉素50mg/L和利福平 50mg/L的培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)96h ；在該步驟中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不同的培養(yǎng)基配方對(duì)于篩選結(jié)果影響很大，有些常規(guī) 用于篩選發(fā)生同源重組菌的培養(yǎng)基是不適用的。篩選所用的各種培養(yǎng)基成分如下
LB 每升含IOg胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5-10g氯化鈉，20g瓊脂粉。RCVBN 每升含DL蘋果酸4g，磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀緩沖液10mM，七水硫酸 鎂200mg，硫酸銨lg，二水氯化鈣75mg，乙二胺四乙酸鈉20mg，生物素0. Olmg,維生素B 10. 5mg，尼克酸lmg，微量金屬元素貯液lmL，pH7. 0，瓊脂粉20g。RCVBN(glutamate)(每升)同RCVBN，其中使用谷氨酸Ig代替硫酸銨lg。RCVBN(glutamine)(每升)同RCVBN，其中使用谷氨酰胺1. 45g代替硫酸銨lg。使用不同篩選培養(yǎng)基的結(jié)果見表1?？梢姡挥胁捎帽景l(fā)明人優(yōu)化的 RCVBN (glutamine)培養(yǎng)基，才能夠有效地篩選到發(fā)生雙交換的基因工程菌，而其它的培養(yǎng) 基均無法得到正確的結(jié)果。表1、不同培養(yǎng)基的篩選結(jié)果
權(quán)利要求
一種解除銨阻遏的生物產(chǎn)氫基因工程菌，其不表達(dá)谷氨酰胺合成酶。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌的基因組中，含有 突變的glnA基因序列，其不編碼谷氨酰胺合成酶。
3.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是紫色非硫細(xì)菌。
4.如權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述的紫色非硫細(xì)菌選自類球紅 細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulutas)、深紅紅螺菌 (Rhodospirillum rubrum)。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的基因工程菌的方法，包括(1)提供一打靶質(zhì)粒，所述的打靶質(zhì)粒中，含有突變的glnA基因序列，其不編碼谷氨酰 胺合成酶；(2)將(1)所述的打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入紫色非硫細(xì)菌內(nèi)，通過同源交換使得突變的glnA基因 序列整合到紫色非硫細(xì)菌的基因組；和(3)選擇發(fā)生了雙交換的紫色非硫細(xì)菌，即為權(quán)利要求1所述的基因工程菌。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，通過接合轉(zhuǎn)移的方法將打靶質(zhì) 粒轉(zhuǎn)入紫色非硫細(xì)菌內(nèi)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述選擇發(fā)生了雙交換的紫色 非硫細(xì)菌的方法是(a)將待選擇的菌涂布到添加篩選培養(yǎng)基上，所述的培養(yǎng)基為RCVBN，其中以 1. 0-1. 6g/L谷氨酰胺代替其中的硫酸銨；(b)培養(yǎng)所述的菌，能夠在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌即為發(fā)生了雙交換的紫色非硫細(xì)菌。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的篩選培養(yǎng)基含有DL蘋果酸4g/L，磷 酸氫二鉀和磷酸二氫鉀緩沖液10mM，七水硫酸鎂200mg/L，谷氨酰胺1. 45g/L，二水氯化鈣 75mg/L，乙二胺四乙酸鈉20mg/L，生物素0. Olmg/L,維生素BIO. 5mg/L,尼克酸lmg/L，微量 金屬元素貯液lmL/L，瓊脂粉20g/L。
9.一種利用高氨離子濃度的底物制備氫氣的方法，包括在光照下，培養(yǎng)權(quán)利要求1所 述的基因工程菌，收集所產(chǎn)生的氫氣。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，光照強(qiáng)度為5000 士 20001UX ；或培養(yǎng)時(shí)，采用的底物選自=RCVBN培養(yǎng)基、生物乙醇廢水，琥珀酸廠廢水，豆制品廢水；或底物中銨離子濃度為0-100mM。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種解除銨阻遏的生物產(chǎn)氫基因工程菌及其構(gòu)建方法，所述基因工程菌不表達(dá)谷氨酰胺合成酶，其通過在紫色非硫細(xì)菌中敲除glnA基因而獲得。本發(fā)明還涉及利用所述的基因工程菌生產(chǎn)氫氣的方法。本發(fā)明的基因工程菌可以在高濃度銨離子條件下高效地進(jìn)行光發(fā)酵制氫。本發(fā)明的基因工程菌中谷氨酰胺合成酶活性被徹底地去除，從而使得菌株在耐高濃度銨離子的效果較好，克服了以往本領(lǐng)域技術(shù)人員難以獲得GS酶活性徹底去除的工程菌的技術(shù)難題。
文檔編號(hào)C12P3/00GK101993849SQ200910056799
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者劉通, 周志華, 李欣峰 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院