本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：骨質(zhì)疏松(osteoporosis，op)是以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退化(松質(zhì)骨骨小梁變細(xì)、斷裂數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔、變薄)為特征的，以致骨的脆性增高以及骨折危險(xiǎn)增加的一種全身骨骼疾病。發(fā)病原因一般認(rèn)為與鈣及維生素缺乏、內(nèi)分泌失調(diào)、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)以及運(yùn)動(dòng)和光照不足有關(guān)。可發(fā)生于任何人群和任何年齡，多見于中老年人，尤其是絕經(jīng)期婦女。骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重后果是骨折，骨質(zhì)疏松性骨折可阻礙患者的康復(fù)進(jìn)程，增加醫(yī)療費(fèi)用，甚至加大死亡率。隨著人類壽命的延長(zhǎng)，骨質(zhì)疏松及其并發(fā)的骨質(zhì)疏松性骨折已成為嚴(yán)重的全球性公共健康問題，大約有30％～50％的女性和15％～30％的男性在生命的某些階段會(huì)遇到骨質(zhì)疏松引發(fā)的骨折。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松病人血液中的維生素k2的濃度明顯偏低，維生素k2的不足是誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)原因，日本已將維生素k2作為骨質(zhì)疏松病的治療藥物。常用的維生素k2活性體有mk-7，mk-4，mk-9，其生物活性均大幅高于維生素k1。在人體正常代謝中，在腸胃功能正常狀態(tài)時(shí)，腸道正常菌群參與下將維生素k1和或維生素k3、維生素k4轉(zhuǎn)化為維生素k2活性體后才被吸收利用。目前，國(guó)內(nèi)大部分是單純通過補(bǔ)充鈣、增加鈣從腸道到血液的攝入來(lái)預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，但長(zhǎng)期大量攝入鈣劑會(huì)導(dǎo)致鈣在血液及軟骨等中大量沉積而增加動(dòng)脈粥樣硬化、血壓升高、中風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、腎結(jié)石等疾病的發(fā)生。維生素k特別是維生素k2的補(bǔ)充可以規(guī)避以上風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)鈣在血液中的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化和有效利用。本發(fā)明的目的在于提供能夠高產(chǎn)維生素k2的活性成分mk7的菌株，提供該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法以及在預(yù)防骨質(zhì)疏松方面的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌及其應(yīng)用，旨在解決目前，國(guó)內(nèi)大部分是單純通過補(bǔ)充鈣、增加鈣從腸道到血液的攝入來(lái)預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，長(zhǎng)期大量攝入鈣劑會(huì)導(dǎo)致鈣在血液及軟骨等中大量沉積而增加動(dòng)脈粥樣硬化、血壓升高、中風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、腎結(jié)石等疾病發(fā)生的問題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌，該具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌命名為納豆芽孢桿菌blcc1-0053，已于2014年1月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為cctccm2014028。進(jìn)一步，該具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌生物學(xué)特性如下：菌體呈桿狀，很少成鏈，染色均勻；芽孢呈橢圓形，培養(yǎng)基上成圓形或不規(guī)則形；表面色暗，可起皺，成淡黃色或淡棕色；革蘭氏陽(yáng)性；通常在35～50℃能生長(zhǎng)，種子液最適溫度42℃，上罐發(fā)酵最適溫度45℃。本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌的應(yīng)用，該具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌的應(yīng)用包括以下步驟：步驟一，斜面培養(yǎng)：將凍干菌粉接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在35～45℃培養(yǎng)20～28h；步驟二，一級(jí)種子培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的斜面，在無(wú)菌條件下接種于50ml～100ml種子液體培養(yǎng)基中，在35～45℃條件下，靜置培養(yǎng)12～24h，制得一級(jí)種子液；步驟三，擴(kuò)大培養(yǎng)：以1～5％的接種量，將一級(jí)種子液接于500ml～1000ml種子液體培養(yǎng)基中，在35～45℃條件下，靜置培養(yǎng)12～24h，制得二級(jí)種子液；步驟四，發(fā)酵罐培養(yǎng)：以1～5％的接種量，將二級(jí)種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，120rpm培養(yǎng)12～24h，轉(zhuǎn)至40～50℃條件下，靜置培養(yǎng)5～7d；步驟五，發(fā)酵結(jié)束后，立即將發(fā)酵液離心并用清水清洗，如此反復(fù)2～3遍后冷凍干燥，粉碎，即為菌粉成品；或發(fā)酵結(jié)束后，立即噴霧干燥，即得菌粉成品；步驟六，發(fā)酵液與凍干菌粉前處理后，上樣，高效液相色譜法測(cè)定mk-7的含量。進(jìn)一步，在步驟二和步驟三中，種子液體培養(yǎng)基成分為：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化鈉0.5％，酵母膏0.5％，ph值7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：蛋白胨10％，丙三醇3％、nacl0.5％，k2hpo40.02％，ph7.0-7.2。進(jìn)一步，在步驟四中，種子液培養(yǎng)條件為35～45℃條件下，靜置培養(yǎng)12～24h；發(fā)酵培養(yǎng)條件為：37℃，120rpm搖床培養(yǎng)12～24h，轉(zhuǎn)至40～50℃條件下，靜置培養(yǎng)5～7d。進(jìn)一步，在步驟四中，發(fā)酵液前處理方法為：發(fā)酵液上清濃縮比例10-100：1，經(jīng)濃縮液同體積氯仿-正己烷混合溶液，體積比氯仿：正己烷＝4:1～1:1，浸提，冰水中超聲20～40min后磁力攪拌30min～2h，分液漏斗液-液分離，收集有機(jī)溶劑氮吹，正己烷復(fù)溶，0.22um濾膜過濾兩次后上樣進(jìn)行hplc檢測(cè)分析。進(jìn)一步，在步驟五中，凍干菌體前處理方法為：凍干菌體稱重，經(jīng)氯仿-正己烷混合溶液，體積比氯仿：正己烷比例為4:1～1:1，超聲溶解20～40min后靜置30min～2h，25℃，5000～10000rpm離心5～15min，氮?dú)獯蹈桑确?正己烷混合溶液復(fù)溶，0.22um濾膜過濾兩次后上樣進(jìn)行hplc檢測(cè)分析。進(jìn)一步，在步驟六中，hplc檢測(cè)mk-7含量，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相為甲醇：乙腈＝60％-80％：40％-20％；柱溫為20-40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm；流速為1.0ml/min；標(biāo)品溶劑為正己烷；標(biāo)品濃度為0.00176-0.088mg/ml。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果：成功篩選到具有產(chǎn)mk7能力的納豆芽孢桿菌菌株，并且確定了實(shí)用有效的發(fā)酵培養(yǎng)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示服用該菌粉能有效改善骨質(zhì)疏松狀況，有望開發(fā)為安全、無(wú)毒的預(yù)防骨質(zhì)疏松的新型保健產(chǎn)品。本發(fā)明的納豆芽孢桿菌能夠生產(chǎn)mk-7，產(chǎn)量高達(dá)3.68733mg/g，補(bǔ)充人體代謝所需要的vk2，從而達(dá)到預(yù)防與治療多種疾病的效果。附圖說明圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌的應(yīng)用流程圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的納豆芽孢桿菌blcc1-0053發(fā)酵6d后，菌體mk-7hplc分析示意圖；圖3是本發(fā)明提供的納豆芽孢桿菌blcc1-0053的顯微形態(tài)圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。本發(fā)明實(shí)施例的具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌：該菌種命名為納豆芽孢桿菌blcc1-0053(bacillusnattoblcc1-0053)，已于2014年1月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，武漢大學(xué)；其保藏編號(hào)為cctccm2014028；請(qǐng)求保藏的培養(yǎng)物名稱及注明的鑒別特征：納豆芽孢桿菌blcc1-0053(bacillusnattoblcc1-0053)；該培養(yǎng)物已于2014年1月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心收到，并登記入冊(cè)，根據(jù)要求，由2014年1月16日起保存三十年，在期滿前收到提供培養(yǎng)物樣品的請(qǐng)求后再延續(xù)保存五年，該培養(yǎng)物的存活性本保藏中心于2014年1月22日檢測(cè)完畢，結(jié)果為存活。其生物學(xué)特性如下：菌體呈桿狀，很少成鏈，染色均勻；芽孢呈橢圓形，培養(yǎng)基上成圓形或不規(guī)則形；表面色暗，可起皺，成淡黃色或淡棕色；革蘭氏陽(yáng)性；通常在35～50℃能生長(zhǎng)，種子液最適溫度42℃，上罐發(fā)酵最適溫度45℃。具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌，以凍干粉的形式應(yīng)用于防治骨質(zhì)疏松癥等疾病。如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的具有產(chǎn)mk-7能力的納豆芽孢桿菌的應(yīng)用包括以下步驟：s101：斜面培養(yǎng)：將凍干菌粉接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在35～45℃培養(yǎng)20～28h；s102：一級(jí)種子培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的斜面，在無(wú)菌條件下接種于50ml～100ml種子液體培養(yǎng)基中，在35～45℃條件下，靜置培養(yǎng)12～24h，制得一級(jí)種子液；s103：擴(kuò)大培養(yǎng)：以1～5％的接種量，將一級(jí)種子液接于500ml～1000ml種子液體培養(yǎng)基中，在35～45℃條件下，靜置培養(yǎng)12～24h，制得二級(jí)種子液；s104：發(fā)酵罐培養(yǎng)：以1～5％的接種量，將二級(jí)種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，120rpm培養(yǎng)12～24h，轉(zhuǎn)至40～50℃條件下，靜置培養(yǎng)5～7d；s105：發(fā)酵結(jié)束后，立即將發(fā)酵液離心并用清水清洗，如此反復(fù)2～3遍后冷凍干燥，粉碎，即為菌粉成品；或：發(fā)酵結(jié)束后，立即噴霧干燥，即得菌粉成品；s106：發(fā)酵液與凍干菌粉前處理后，上樣，高效液相色譜法(hplc)測(cè)定mk-7的含量。在步驟s102和s103中，種子液體培養(yǎng)基成分為：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化鈉0.5％，酵母膏0.5％，ph值7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：蛋白胨10％，丙三醇3％、nacl0.5％，k2hpo40.02％，ph7.0-7.2。在步驟s104中，種子液培養(yǎng)條件為35～45℃條件下，靜置培養(yǎng)12～24h；發(fā)酵培養(yǎng)條件為：37℃，120rpm搖床培養(yǎng)12～24h，轉(zhuǎn)至40～50℃條件下，靜置培養(yǎng)5～7d；在步驟s104中，發(fā)酵液前處理方法為：發(fā)酵液上清濃縮(比例10-100：1)，經(jīng)濃縮液同體積氯仿-正己烷混合溶液(體積比氯仿：正己烷＝4:1～1:1)浸提，冰水中超聲20～40min后磁力攪拌30min～2h，分液漏斗液-液分離，收集有機(jī)溶劑氮吹，正己烷復(fù)溶，0.22um濾膜過濾兩次后上樣進(jìn)行hplc檢測(cè)分析。在步驟s105中，凍干菌體前處理方法為：凍干菌體稱重，經(jīng)氯仿-正己烷混合溶液(體積比氯仿：正己烷比例為4:1～1:1)超聲溶解20～40min后靜置30min～2h，25℃，5000～10000rpm離心5～15min，氮?dú)獯蹈?，氯?正己烷混合溶液復(fù)溶，0.22um濾膜過濾兩次后上樣進(jìn)行hplc檢測(cè)分析。在步驟s106中，hplc檢測(cè)mk-7含量，其特征在于：檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相為甲醇：乙腈＝60％-80％：40％-20％；柱溫為20-40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm；流速為1.0ml/min；標(biāo)品溶劑為正己烷；標(biāo)品濃度為0.00176-0.088mg/ml。本發(fā)明的具體實(shí)施例：實(shí)施例1：納豆芽孢桿菌初篩1材料與方法：1.1實(shí)驗(yàn)菌株，納豆芽孢桿菌blcc1-0048、納豆芽孢桿菌blcc1-0053、納豆芽孢桿菌blcc1-0054；1.2發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：兩種培養(yǎng)基配方：種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.2％，蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，nacl0.5％，ph7.2-7.4；發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏5％，丙三醇5％，蛋白胨10％，k2hpo40.06％；培養(yǎng)條件：搖床培養(yǎng)37℃，24h，轉(zhuǎn)速120rpm，然后45℃靜置培養(yǎng)5d。1.3發(fā)酵結(jié)束后，離心分離發(fā)酵液及菌體，菌體冷凍干燥。1.4發(fā)酵菌體與發(fā)酵液中mk-7含量測(cè)定：稱取適量?jī)龈删w(約25mg)，經(jīng)氯仿：正己烷＝2:1(體積比)混合溶液浸提，冰水超聲30min后靜置2h，25℃，8000rpm離心10min，收集有機(jī)溶劑氮?dú)獯蹈桑确拢赫和椋?:1(體積比)混合溶液復(fù)溶，經(jīng)0.22um的濾膜過濾兩次后上樣進(jìn)行hplc檢測(cè)分析。發(fā)酵液上清濃縮(比例10-100∶1)，濃縮液同體積有機(jī)溶劑(氯仿：正己烷＝2:1)混合浸提，冰水超聲30min，磁力攪拌2h，分液漏斗液液分離，收集有機(jī)溶劑氮吹，正己烷復(fù)溶，膜過濾兩次后上樣進(jìn)行hplc檢測(cè)分析。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相為甲醇：乙腈＝60％：40％；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm；流速為1.0ml/min；標(biāo)品溶劑為正己烷；標(biāo)品濃度為0.088mg/ml。2結(jié)果與分析：三株納豆芽孢桿菌在兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d后，離心分離菌體與發(fā)酵液，經(jīng)過前期處理后，上樣進(jìn)行高效液相色譜分析(hplc)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表1所示：表1.三株納豆芽孢桿菌mk-7含量檢測(cè)結(jié)果由表1得知，芽孢桿菌菌株blcc10053在兩種培養(yǎng)基中發(fā)酵后，mk-7的含量最高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用芽孢桿菌菌株blcc10053作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)施例2：不同培養(yǎng)基條件下納豆芽孢桿菌發(fā)酵6d菌體mk-7含量的測(cè)定：1材料與方法：1.1實(shí)驗(yàn)菌株納豆芽孢桿菌菌株blcc10053；1.2發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：n1：丙三醇3％，蛋白胨10％，nacl0.5％，k2hpo40.02％，ph值7.0-7.2n2：葡萄糖0.2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1.0％，氯化鈉0.5％，ph值7.0-7.2n3：酵母膏2.5％，丙三醇2.5％，蛋白胨9.5％，k2hpo40.03％，ph值7.0-7.2培養(yǎng)條件：具體實(shí)驗(yàn)方案如表2所示，活化的納豆芽孢桿菌接入種子培養(yǎng)基中，42℃搖床培養(yǎng)16h，以5％的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)1d后轉(zhuǎn)入45℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5d。1.3發(fā)酵結(jié)束后，10000rpm離心分離發(fā)酵產(chǎn)物及菌體，菌體冷凍干燥。1.4發(fā)酵菌體中mk-7含量測(cè)定：稱取適量?jī)龈删w(約25mg)，經(jīng)氯仿：正己烷＝2:1(體積比)混合溶液浸提，冰水超聲30min后靜置2h，25℃，8000rpm離心10min，收集有機(jī)溶劑氮?dú)獯蹈?，氯仿：正己烷?:1(體積比)混合溶液復(fù)溶，經(jīng)0.22um的濾膜過濾兩次后上樣進(jìn)行hplc檢測(cè)分析。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相為甲醇：乙腈＝60％：40％；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm；流速為1.0ml/min；標(biāo)品溶劑為正己烷；標(biāo)品濃度為0.088mg/ml。2結(jié)果與分析：菌株納豆芽孢桿菌blcc10053在經(jīng)歷如表2所示的種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基交叉發(fā)酵后，離心分離菌體與發(fā)酵液，菌體經(jīng)過前期處理后，上樣進(jìn)行高效液相色譜分析(hplc)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表2所示。結(jié)果顯示選用2號(hào)培養(yǎng)基(n2)作為種子培養(yǎng)基，1號(hào)培養(yǎng)基(n1)作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，納豆芽孢桿菌blcc10053菌體mk-7產(chǎn)量最大。表2.納豆芽孢桿菌發(fā)酵6d菌體mk-7含量(mg/l)實(shí)施例3：不同發(fā)酵時(shí)間條件下納豆芽孢桿菌菌體mk-7含量：1材料與方法：1.1實(shí)驗(yàn)菌株納豆芽孢桿菌菌株blcc10053；1.2發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；種子培養(yǎng)基n2：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化鈉0.5％，酵母膏0.5％，ph值7.0-7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基n1：蛋白胨10％，丙三醇3％、nacl0.5％，k2hpo40.02％，ph7.0-7.2?；罨募{豆芽孢桿菌接入種子培養(yǎng)基中，42℃搖床培養(yǎng)16h，以5％的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)1d后轉(zhuǎn)入45℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3d，4d，5d，6d，7d。1.3發(fā)酵結(jié)束后，離心分離發(fā)酵產(chǎn)物及菌體，菌體冷凍干燥。1.4發(fā)酵菌體與發(fā)酵液中mk-7含量測(cè)定；稱取適量?jī)龈删w(約25mg)，經(jīng)氯仿：正己烷＝2:1(體積比)混合溶液浸提，冰水超聲30min后靜置2h，25℃，8000rpm離心10min，收集有機(jī)溶劑氮?dú)獯蹈?，氯仿：正己烷?:1(體積比)混合溶液復(fù)溶，經(jīng)0.22um的濾膜過濾兩次后上樣進(jìn)行hplc檢測(cè)分析。發(fā)酵液上清濃縮(比例10-100：1)，濃縮液同體積有機(jī)溶劑(氯仿：正己烷＝2:1)混合浸提，冰水超聲30min，磁力攪拌2h，分液漏斗液液分離，收集有機(jī)溶劑氮吹，正己烷復(fù)溶，膜過濾兩次后上樣進(jìn)行hplc檢測(cè)分析。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相為甲醇：乙腈＝60％：40％；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm；流速為1.0ml/min；標(biāo)品溶劑為正己烷；標(biāo)品濃度為0.088mg/ml。2結(jié)果與分析：隨著納豆芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，mk-7的含量增加，在8d時(shí)mk-7的含量有突增，每升發(fā)酵液中，菌體的mk-7含量(平均)為20.3680mg，發(fā)酵液中含量為0.8004mg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體見表3。表3.納豆芽孢桿菌不同發(fā)酵時(shí)間mk-7總含量(mg/l)實(shí)施例4：納豆芽孢桿菌中試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：活化的納豆芽孢桿菌blcc10053接入種子培養(yǎng)基中，42℃搖床培養(yǎng)16h，以5％的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)1d后轉(zhuǎn)入45℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6d。發(fā)酵結(jié)束后，8000rpm離心分離發(fā)酵液與菌體，菌體經(jīng)真空冷凍干燥后稱重，測(cè)定菌體中mk-7產(chǎn)量。中試發(fā)酵液共計(jì)16.7l，經(jīng)干燥得菌體165.62g，高效液相色譜(hplc)分析顯示菌體中mk-7含量為3.68733mg/g實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體見表4。表4.中試發(fā)酵菌體中mk-7含量平行樣樣品重量(g)上樣濃度(mg/l)mk-7(mg/g)10.025950.878023.9288020.028054.530293.8950230.026851.057543.8102640.026641.831393.14522平均3.68733以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12