本發(fā)明涉及一種用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠及其制備方法，屬于生物分離用介質(zhì)材料的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：凝膠是一種通過單體和交聯(lián)劑相互交聯(lián)構(gòu)成的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的材料。高分子水凝膠材料由于其獨特的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，在生物分離、分析、臨床診斷等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。然而傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠的性能較為單一，在一定程度上限制了其發(fā)展。目前，在改善水凝膠性能多見于機械性能方面，而關(guān)于復合水凝膠在生物分離、分析、臨床診斷等領(lǐng)域應(yīng)用的報道非常少，更少見到采用復合凝膠用于凝膠電泳的報道。聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物分離、分析、臨床診斷等領(lǐng)域。在電泳過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小逐漸呈梯度分開。為了增加凝膠對蛋白質(zhì)的分離能力，通常采用增加丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的濃度的方法。但是單純的增加濃度的方法往往會導致凝膠的力學性能變差，使得凝膠在電泳過程中容易破損甚至于不能完成整個電泳過程(一個完整的電泳過程包括凝膠的電泳、固定、染色和脫色，任何一步都會造成凝膠的破損，從而導致試驗的失敗。只有力學性能較好的凝膠才能在最大程度上避免這一點，即低濃度的凝膠。但是低濃度的凝膠的分辨率較差，不能滿足試驗的要求)。同時，即使增加丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的濃度，往往也只能分離分子量在30～250kda的蛋白質(zhì)。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述傳統(tǒng)交聯(lián)水凝膠分辨率還有待提高的問題，本發(fā)明提供了一種用于凝膠電泳的交聯(lián)結(jié)構(gòu)化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明提供了一種用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠，如式i所示：其中，a、b、c、d、e、f、g、h所代表的數(shù)值相同或不同，均為大于零或等于零的整數(shù)，且a、b、c、d、e、f、g、h不同時為零；r代表h或甲基；m為金屬離子。本發(fā)明在丙烯酰胺中加入的丙烯酸或甲基丙烯酸具有雙鍵結(jié)構(gòu)，能夠和丙烯酰胺發(fā)生聚合反應(yīng)，金屬離子與丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基發(fā)生反應(yīng)，同時丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基和丙烯酰胺的胺基發(fā)生反應(yīng)，由于金屬離子和丙烯酸或甲基丙烯酸均充當交聯(lián)點，可以改善復合凝膠的分辨率和力學性能。在改善力學性能的同時，復合凝膠由于存在交聯(lián)點，還能較好的提高對蛋白質(zhì)的分離能力，尤其是分子量小于30kda的蛋白質(zhì)，特別是多肽的分離。作為優(yōu)選方案，所述m為+2價金屬離子。作為優(yōu)選方案，所述+2價金屬離子為鈣離子、鎂離子或鋅離子。第二方面，本發(fā)明提供了一種如前述的用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠的制備方法，其包括如下步驟：將丙烯酰胺與第一交聯(lián)劑加入水中，混勻后依次加入單體、第二交聯(lián)劑、緩沖液、變性劑、引發(fā)劑和催化劑，形成混合水溶液，進行反應(yīng)，得到所述具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的復合凝膠。作為優(yōu)選方案，所述混合水溶液中，丙烯酰胺的質(zhì)量分數(shù)為4～20％、第一交聯(lián)劑的質(zhì)量分數(shù)為0.1～1％、第二交聯(lián)劑的質(zhì)量分數(shù)為0.01～2％、單體的質(zhì)量分數(shù)為0.05～3％、變性劑的質(zhì)量分數(shù)為0.5～2％、引發(fā)劑的質(zhì)量分數(shù)為0.5～3％、催化劑的體積分數(shù)為0.03～0.5％、緩沖液的體積分數(shù)為20～50％作為優(yōu)選方案，所述單體為丙烯酸或甲基丙烯酸，所述第一交聯(lián)劑為n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺，所述第二交聯(lián)劑為金屬可水溶性鹽，所述變性劑為十二烷基硫酸鈉，所述引發(fā)劑為過硫酸銨，所述催化劑為四甲基乙二胺，所述水為超純水。作為優(yōu)選方案，所述金屬可水溶性鹽為氯化鈣、氯化鎂或氯化鋅。作為優(yōu)選方案，所述反應(yīng)的時間為2～5h。作為優(yōu)選方案，所述緩沖液為1.5m的tris-hcl溶液，ph＝8.8。第三方面，本發(fā)明還提供了一種如前述的用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠在電泳分離法分離分子量小于30kda蛋白質(zhì)、尤其是多肽中的用途。傳統(tǒng)丙烯酰胺凝膠制備中反應(yīng)式如下反應(yīng)式a：本發(fā)明丙烯酰胺復合凝膠制備中反應(yīng)式(以丙烯酸單體和氯化鈣交聯(lián)劑為例)如下反應(yīng)式b：其中，a、b、c、d、e、f、g、h所代表的數(shù)值相同或不同，均為大于零或等于零的值，且a、b、c、d、e、f、g、h不同時為零。通過比較可知本發(fā)明復合凝膠含有多種交聯(lián)結(jié)構(gòu)單元，而傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠只有一種交聯(lián)結(jié)構(gòu)單元。本發(fā)明丙烯酰胺中加入的丙烯酸或甲基丙烯酸具有雙鍵結(jié)構(gòu)，能夠和丙烯酰胺發(fā)生聚合反應(yīng)。鈣離子與丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基發(fā)生反應(yīng)，同時丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基和丙烯酰胺的胺基發(fā)生反應(yīng)，由于+2價金屬離子和丙烯酸或甲基丙烯酸均充當交聯(lián)點，可以改善復合凝膠的分辨率和力學性能。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：1、通過在丙烯酰胺中加入丙烯酸或甲基丙烯酸和氯化鈣，可以改善復合凝膠的分辨率和力學性能；2、復合凝膠與傳統(tǒng)的凝膠相比，力學性能提高5～10倍(通常在8倍左右)，分辨率提高10～20倍；3、本發(fā)明提供的凝膠電泳用復合凝膠的制備方法，該方法簡單，原料選擇范圍大；4、可適用于分子量小于30kda蛋白質(zhì)的分離，尤其是多肽的分離。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：圖1為本發(fā)明復合凝膠與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠的對比效果圖；圖2為本發(fā)明復合凝膠與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠的對比效果圖；圖3為含有本發(fā)明交聯(lián)結(jié)構(gòu)的復合凝膠與傳統(tǒng)凝膠紅外譜圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1本實施例提供的一種用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠的制備方法，具體如下：將0.81g丙烯酰胺與0.02gn,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶解于4.6ml超純水中，充分攪拌后依次加入0.04g丙烯酸、0.002g氯化鈣、2.5mltris-hcl(ph8.8)、0.1mlsds(10％)、0.1mlaps(10％)、0.006mltemed，攪拌均勻并定容至10ml后，灌入制膠架上的玻片模具中，液封，經(jīng)2小時結(jié)束反應(yīng)，即可獲得用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠。實施例2本實施例提供的一種用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠的制備方法，具體如下：將0.8g丙烯酰胺與0.02gn,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶解于4.6ml超純水中，充分攪拌后依次加入0.04g丙烯酸、0.004g氯化鈣、2.5mltris-hcl(ph8.8)、0.1mlsds(10％)、0.1mlaps(10％)、0.006mltemed，攪拌均勻并定容至10ml后，灌入制膠架上的玻片模具中，液封，經(jīng)3小時結(jié)束反應(yīng)，即可獲得用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠。實施例3本實施例提供的一種用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠的制備方法，具體如下：將0.81g丙烯酰胺與0.02gn,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶解于4.6ml超純水中，充分攪拌后依次加入0.04g甲基丙烯酸、0.002g氯化鈣、2.5mltris-hcl(ph8.8)、0.1mlsds(10％)、0.1mlaps(10％)、0.006mltemed，攪拌均勻并定容至10ml后，灌入制膠架上的玻片模具中，液封，經(jīng)4小時結(jié)束反應(yīng)，即可獲得用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠。實施例4本實施例提供的一種用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠的制備方法，具體如下：將0.81g丙烯酰胺與0.02gn,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶解于4.6ml超純水中，充分攪拌后依次加入0.04g甲基丙烯酸、0.004g氯化鈣、2.5mltris-hcl(ph8.8)、0.1mlsds(10％)、0.1mlaps(10％)、0.006mltemed，攪拌均勻并定容至10ml后，灌入制膠架上的玻片模具中，液封，經(jīng)5小時結(jié)束反應(yīng)，即可獲得用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠。本發(fā)明的實施例在下述范圍內(nèi)均可實現(xiàn)技術(shù)效果：所述混合水溶液中，丙烯酰胺的質(zhì)量分數(shù)為4～20％、第一交聯(lián)劑的質(zhì)量分數(shù)為0.1～1％、第二交聯(lián)劑的質(zhì)量分數(shù)為0.01～2％、單體的質(zhì)量分數(shù)為0.05～3％、變性劑的質(zhì)量分數(shù)為0.5～2％、引發(fā)劑的質(zhì)量分數(shù)為0.5～3％、催化劑的體積分數(shù)為0.03～0.5％、緩沖液的體積分數(shù)為20～50％。實施例5本實施例提供的一種用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠的制備方法，具體如下：將0.81g丙烯酰胺與0.02gn,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶解于4.6ml超純水中，充分攪拌后依次加入0.04g甲基丙烯酸、0.004g氯化鋅、2.5mltris-hcl(ph8.8)、0.1mlsds(10％)、0.1mlaps(10％)、0.006mltemed，攪拌均勻并定容至10ml后，灌入制膠架上的玻片模具中，液封，經(jīng)5小時結(jié)束反應(yīng)，即可獲得用于電泳分離的交聯(lián)結(jié)構(gòu)復合凝膠。對比例1(傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠)將0.81g丙烯酰胺與0.02gn,n’-亞甲基雙丙烯酰胺溶解于4.6ml超純水中，充分攪拌后依次加入2.5mltris-hcl(ph8.8)、0.1mlsds(10％)、0.1mlaps(10％)、0.006mltemed，攪拌均勻并定容至10ml后，灌入制膠架上的玻片模具中，液封，經(jīng)3小時結(jié)束反應(yīng)，即可獲得凝膠電泳用傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠。圖3為全部組分都加入，其中p(am-co-aa)為復合凝膠，pam為傳統(tǒng)凝膠，p(am-aa)為不加氯化鈣的復合凝膠，不加氯化鈣的目的是為了驗證丙烯酸或甲基丙烯酸(因為丙烯酸和甲基丙烯酸為同一類物質(zhì)，所以以丙烯酸為例進行測試)上的羧基不但和鈣離子發(fā)生反應(yīng)，同時丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基和丙烯酰胺的胺基發(fā)生反應(yīng)。1288cm-1位置的峰的變化，結(jié)合圖上標出的各峰的變化，可以證明該交聯(lián)點已經(jīng)形成。注：單個峰值不能說明物質(zhì)的形成，只有當一個特定的峰值出現(xiàn)，加上整體的峰值的變化，才能證明物質(zhì)的形成。性能測試本實驗依照標準sds-page電泳的操作規(guī)程，對實施例1～4所得復合凝膠進行性能測試，檢測結(jié)果如下表：表1實施例1～4所得復合凝膠的分離性能檢測結(jié)果(標準樣品)蛋白分子量(kda)實施例1實施例2實施例3實施例426.6√√√√17√√√√14.2√√√√6.5√√√√3.5√√√√表2實施例1～4所得復合凝膠的分離性能檢測結(jié)果(實際樣本：唾液)蛋白名稱(分子量)實施例1實施例2實施例3實施例4igll5(23.4kda)√√√√zg16b(22.8kda)√√√√lcn1(19.4kda)√√√√lc1l1(18kda)√√√√pip(16.8kda)√√√√igkc(11.8kda)√√√√lac2(11.5kda)√√√√為了直觀的對比，本發(fā)明復合凝膠與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠進行了對比，以下為效果圖圖1：圖1a(對比例1)和圖1b(實施例2)均為復合凝膠對標準樣品的電泳圖，為了證實復合凝膠的力學性能的改善對電泳有較大的幫助，與傳統(tǒng)的改善分辨率不同，復合凝膠能夠?qū)⒎肿恿啃∮?0kda的蛋白分離開，而傳統(tǒng)的方法只能是大概的一個范圍的提高，如開始能夠分離到100kda的蛋白質(zhì)，增加丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的濃度，即使可以分離到30kda的蛋白質(zhì)，但是在30kda以下的蛋白會出現(xiàn)嚴重的彌散現(xiàn)象。如圖1a中分子量小于30kda的蛋白質(zhì)是分離不出的，因為標準樣品是5個蛋白，反映出來就是5條帶。圖2為本發(fā)明的復合凝膠與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠的對比效果，其中，p(am-co-aa)為c，pam為a，p(am-aa)為b。表3是對圖1的一個量化數(shù)據(jù)蛋白分子量傳統(tǒng)凝膠的灰度值復合凝膠的灰度值復合凝膠/傳統(tǒng)凝膠26.6kda-47.4-17kda-98.2-14.2kda-37.5-6.5kda-94.7-3.5kda-70.3-圖1a和圖1c分別為傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠(對比例1)和復合凝膠(實施例2)對標準蛋白marker的電泳圖；圖1b和圖1d分別為傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠(對比例1)和復合凝膠(實施例2)對實際樣本：唾液的電泳圖。圖1d中峰a是分子量為26kda的蛋白質(zhì)，峰b是分子量為17kda的蛋白質(zhì)，峰c是分子量為14kda的蛋白質(zhì)(傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠沒能分離出)。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。當前第1頁12