本發(fā)明涉及一種新的殺蟲蛋白及其核苷酸序列。
背景技術(shù)：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽性細菌，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有活性。
現(xiàn)有技術(shù)主要認為Bt之所以能夠具有殺蟲活性，主要是由于其體能能夠產(chǎn)生各種Cry蛋白、Cyt蛋白和Vip蛋白。
然而，鮮有報道Bt還能夠產(chǎn)生不同于以上三種蛋白的殺蟲活性物質(zhì)，特別是對某些鞘翅目(Coleoptera)害蟲，例如華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)具有優(yōu)良活性的殺蟲活性物質(zhì)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本申請之一提供了一種殺蟲蛋白，其具有如(I)和(II)中的至少一種的氨基酸序列：
(I)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；
(II)與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
通過(II)限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時，可以獲得具有與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請的保護范圍之內(nèi)。不過在不影響使用所述殺蟲蛋白的情況下，通過(II)限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時，獲得比如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時，也在本申請的保護范圍之內(nèi)。
在一個具體實施例中，優(yōu)選殺蟲蛋白的氨基酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在98％以上，且與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通過這種方式限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時，可以獲得具有與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請的保護范圍之內(nèi)。不過在不影響使用所述殺蟲蛋白的情況下，通過(II)限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時，獲得比如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時，也在本申請的保護范圍之內(nèi)。
在一個具體實施例中，優(yōu)選殺蟲蛋白的氨基酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在99％以上，且與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通過這種方式限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時，可以獲得具有與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請的保護范圍之內(nèi)。不過在不影響使用所述殺蟲蛋白的情況下，通過(II)限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時，獲得比如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時，也在本申請的保護范圍之內(nèi)。
在一個具體實施例中，優(yōu)選殺蟲蛋白的氨基酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在99.5％以上，且與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通過這種方式限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時，可以獲得具有與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請的保護范圍之內(nèi)。不過在不影響使用所述殺蟲蛋白的情況下，通過(II)限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時，獲得比如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時，也在本申請的保護范圍之內(nèi)。
在一個具體實施例中，所述殺蟲蛋白還可以為如(I)的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或多個氨基酸后，與具有如(I)的氨基酸序列的殺蟲蛋白具有相同功能的蛋白。通過這種方式限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時，可以獲得具有與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請的保護范圍之內(nèi)。不過在不影響使用所述殺蟲蛋白的情況下，通過(II)限定的殺蟲蛋白在與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時，獲得比如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時，也在本申請的保護范圍之內(nèi)。
本申請的殺蟲蛋白對害蟲的殺蟲活性，特別是對華北大黑鰓金龜?shù)臍⑾x活性顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的殺蟲蛋白的殺蟲活性，其可以彌補例如Cry8G蛋白在對華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)殺蟲活性較弱的不足。因此，其豐富了殺蟲蛋白資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的抗蟲效果，具有重要的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益。
本申請之二提供了一種核苷酸序列，所述核苷酸序列為編碼如本申請之一所述的殺蟲蛋白中任意一種的核苷酸序列。該核苷酸序列可以以其來源菌株為模板，或以克隆的全長DNA片段為模板，通過PCR擴增得到；也可以根據(jù)給定的序列人工合成。
在一個具體的實施例中，當(dāng)所述殺蟲蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示時，編碼所述殺蟲蛋白的所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本申請之三提供了一種組合物，其包括如本申請之一所述殺蟲蛋白的至少一種。
在一個具體的實施例中，當(dāng)所述殺蟲蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示時，編碼所述殺蟲蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本申請之四提供了一種含有本申請之二所述的核苷酸序列，且能產(chǎn)生本申請之一相應(yīng)的所述的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因微生物。
在一個具體的實施例中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因微生物包括芽胞桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、腸桿菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一種。
在一個具體的實施例中，優(yōu)選所述芽胞桿菌包括蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、萎縮芽胞桿菌(Bacillus atrophaeus)和蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)中的至少一種；所述假單胞菌包括熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)；所述腸桿菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)。
在一個具體實施例中，本申請的轉(zhuǎn)基因微生物的出發(fā)株(即在轉(zhuǎn)入本申請之二所述的核苷酸序列之前的微生物)為野生微生物和/或遺傳工程微生物。
其中，野生微生物是指從自然界中分離出的未經(jīng)過人工改造的微生物。
遺傳工程微生物是指將野生微生物人工改造的微生物。
本申請的轉(zhuǎn)基因微生物和/或遺傳工程微生物的物種并不因進行了轉(zhuǎn)基因修飾而改變，因此，轉(zhuǎn)基因微生物與發(fā)生轉(zhuǎn)基因之前的微生物(即作為受體微生物)為相同的物種。
在一個具體實施例中，如上的本申請二的所述的核酸序列能夠被連接在表達載體上。所述表達載體例如可以是能夠在大腸桿菌和蘇云金芽胞桿菌中穿梭的pSTK表達載體。
本申請之五提供了根據(jù)本申請之二所述的核苷酸序列在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物能夠產(chǎn)生如本申請之一所述的殺蟲蛋白；所述轉(zhuǎn)基因植物包括十字花科(Cruciferae)、茄科(Solanaceae)、傘形科(Umbelliferae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、天南星科(Araceae)、禾本科(Liliaceae)、豆科(Leguminosae)、蝶形花科(Papilionaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)和錦葵科(Malvaceae)中的至少一種。
在一個具體的實施例中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因植物包括蕓薹屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、煙草屬(Nicotiana)、蕃茄屬(Lycopersicon)、茄屬(Solanum)、辣椒屬(Capsicum)、胡蘿卜屬(Daucus)、芹屬(Apium)、歐芹屬(Petroselinum)、茴香屬(Foeniculum)、南瓜屬(Cucurbita)、黃瓜屬(Cucumis)、冬瓜屬(Benincasa)、絲瓜屬(Luffa)、西瓜屬(Citrullus)、甜瓜屬(Cucumis)、磨芋屬(Amorphophallus)蜀黍?qū)?Zea)、高梁屬(Sorghum)、狗尾巴草屬(Setaria)、稻屬(Oryza)、甘蔗屬(Saccharum)、小麥屬(Triticum)、大豆屬(Glycine)、苜蓿屬(Medicago)、甜菜屬(Beta)、萵苣屬(Lactuca)、向日葵屬(Helianthus)和秋葵屬(Abelmoschus esculentus)中的至少一種。
在一個具體的實施例中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因植物包括油菜(Brassica campestris)、大白菜(Brassica rapa)、小白菜(Brassica chinensis)、甘藍(Brassica oleracea)、蘿卜(Raphanus sativus)、番茄(Lycopersicon esculentum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanum melongena)、旱芹(Apium graveolens)、歐芹(Petroselinum crispum)、小茴香(Foeniculum vulgare)、西葫蘆(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、黃瓜(Cucumis sativus)、冬瓜(Benincasa hispida)、絲瓜(Luffa acutangula)、西瓜(Citrullus lanatus)、甜瓜(Cucumis melo)、磨芋(Amorphophallus rivieri)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italica)、水稻(Oryza sativa)、甘蔗(Saccharum officinarum)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago sativa)、甜菜(Beta vulgaris)、萵苣(Lactuca sativa)、向日葵(Helianthus annuus)和秋葵(Abelmoschus esculentus)中的至少一種。
轉(zhuǎn)基因植物的物種并不因進行了轉(zhuǎn)基因修飾而改變，因此，轉(zhuǎn)基因植物與發(fā)生轉(zhuǎn)基因之前的植物(即作為受體植物)為相同的物種。
本申請之六提供了一種制備如本申請之一所述的殺蟲蛋白的方法，其包括利用本申請之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，和/或利用本申請之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物來生產(chǎn)所述殺蟲蛋白。
在一個具體的實施例中，優(yōu)選還包括在利用所述轉(zhuǎn)基因微生物和/或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)所述殺蟲蛋白后，純化所述殺蟲蛋白使所述殺蟲蛋白的純度達到80％以上。
在一個具體的實施例中，更優(yōu)選在利用所述轉(zhuǎn)基因微生物和/或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)所述殺蟲蛋白后，純化所述殺蟲蛋白使所述殺蟲蛋白的純度達到90％以上。
在一個具體的實施例中，甚至是在利用所述轉(zhuǎn)基因微生物和/或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)所述殺蟲蛋白后，純化所述殺蟲蛋白使所述殺蟲蛋白的純度達到99％以上。
因此，本申請之七提供了根據(jù)本申請之一所述的殺蟲蛋白，本申請之三所述的組合物，本申請之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治鞘翅目(Coleoptera)中的至少一種害蟲中的應(yīng)用。
在一個具體的實施例中，優(yōu)選根據(jù)本申請之一所述的殺蟲蛋白，本申請之三所述的組合物，本申請之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治鰓金龜科(Melolonthidae)中的至少一種害蟲中的應(yīng)用。
在一個具體的實施例中，特別優(yōu)選根據(jù)本申請之一所述的殺蟲蛋白，本申請之三所述的組合物，本申請之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治鰓金龜屬(Holotrichia)中的至少一種害蟲中的應(yīng)用。
在一個具體的實施例中，最優(yōu)選根據(jù)本申請之一所述的殺蟲蛋白，本申請之三所述的組合物，本申請之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)中的應(yīng)用。
單克隆抗體的制備技術(shù)已經(jīng)較為成熟，因此，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)技術(shù)手段，可以制得本申請之一所述的殺蟲蛋白的單克隆抗體。在制備單克隆抗體過程中，選用的抗原可以是本申請之一所述的殺蟲蛋白的全長序列，也可以是本申請之一所述的殺蟲蛋白的部分氨基酸序列。所述抗原的純品可以通過本申請之六提供的制備如本申請之一所述的殺蟲蛋白的方法來獲得；所述抗原，特別是當(dāng)其為部分氨基酸序列時，也可以通過人工合成的方式獲得。因此，本申請之八提供了根據(jù)本申請之一所述的殺蟲蛋白的單克隆抗體。優(yōu)選所述單克隆抗體為僅特異識別所述殺蟲蛋白的單克隆抗體。
在本申請中沒有特殊說明的情況下，本申請中的術(shù)語均屬于現(xiàn)有技術(shù)中所指的通用術(shù)語。
具體實施方式
以下通過優(yōu)選的實施例的形式對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
1)液體LB：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，pH 7.0，15磅滅菌15min。用于培養(yǎng)大腸桿菌。
2)固體LB：在液體LB培養(yǎng)基中加1.3％瓊脂，15磅滅菌15min。用于培養(yǎng)大腸桿菌。
3)抗生素：氨芐青霉素水溶液100mg/ml，用時稀釋500倍-20℃保存。其中pET21b質(zhì)粒載體具有氨芐青霉素抗性。
蛋白電泳檢測
120V預(yù)電泳約10-20min，取蛋白樣品40μL，加入10μL 5×加樣緩沖液，混勻，再將上清和沉淀分別梯度稀釋，煮沸5-10min，12000rpm離心5min，取10L上清點樣。80V恒壓電泳至樣品濃縮呈直線，150V恒壓電泳至指示的溴酚藍到達凝膠底部。
脫色：電泳后取出凝膠，電泳后取出凝膠并用蒸餾水沖洗，加入50mL溶液I，微波爐中加熱30s，60rpm振蕩10min。
染色：倒掉溶液I后加入溶液II(每50mL溶液II加200L溶液III)微波爐加熱30s，60rpm振蕩15min以上。
倒掉溶液II，加入無菌水，凝膠成像系統(tǒng)照相保存。
觀察結(jié)果，根據(jù)蛋白條帶著色程度比較目的蛋白表達情況，用凝膠成像系統(tǒng)照相保存。
表1為SDS聚丙烯酰氨凝膠的制備表。
表1SDS聚丙烯酰氨凝膠的制備表
實施例1新基因的篩選及克隆
Bt基因組提取
S1：5mL 1M Tris-HCL，1mL 0.5M EDTA，171.15g蔗糖，pH7.0，定容至500mL，115℃20min滅菌。
S2：10％SDS 4mL+ddH2O 6mL，pH4.8-5.2。
S3：5M異硫氰酸胍，1M NaAc。
TE：10mM Tris-HCL 3mL，1mM EDTA 600ul，pH8.0，定容至300mL。
1)將蘇云金芽胞桿菌261-1菌株劃線接種于LB培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)過夜；
2)盡可能刮取平板上全部菌體于1.5ml EP管中，用150μl S1充分懸?。?/p>
3)加入100mg石英砂，組織破碎儀上破碎1分鐘；
4)加入200μl S2，充分混勻；
5)加入400μl S3，充分混勻，12000rpm離心10分鐘；
6)將最上層上清轉(zhuǎn)移至1.5EP管中，加入等體積異丙醇，混勻后-20℃靜置20分鐘；
7)12000rpm離心10分鐘，棄上清；
8)70％無水乙醇清洗沉淀，室溫晾干；
9)加100μl TE溶液溶解沉淀；
10)0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組質(zhì)量和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
以261sip01_F(無縫BamH I)ATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGATGCATTCTATTAAACGATAT(SEQ ID No.3)和261sip01_R(無縫BamH I)TGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCAATTAATGGTTCATTATTTTTCAT(SEQ ID No.4)為引物，以261-1菌株基因組為PCR模板，進行PCR擴增。擴增循環(huán)：94℃預(yù)變性10min；94℃變性1min；62℃退火1min；72℃延伸；30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照Axygen公司的DNA回收試劑盒的操作說明進行PCR產(chǎn)物回收。對pET-21b進行BamH I酶切后，與PCR純化產(chǎn)物進行DNA片段連接。然后，取10μL連接產(chǎn)物，加至100μL DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30min；42℃熱激90s，冰浴5min，加入800μL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h；取200μL菌液涂于相應(yīng)抗性(氨芐青霉素抗性)LB平板，37℃培養(yǎng)12-18h，篩選出含有陽性質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子，其中陽性質(zhì)粒被命名為pET-261sip01。
經(jīng)測序分析，261sip01(SEQ ID No.1)基因長度1197bp，其編碼蛋白為261sip01，共399個氨基酸(SEQ ID No.2)，表達45kDa蛋白。
然后提取pET-261sip01重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到表達菌株Rosetta(DE3)。將261sip01在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進行IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，261sip01基因在可溶組分和不可溶組分中均表達；其中表達約45kDa左右蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符。陰性對照(即不含有261sip01基因，但含有pET-21b載體的大腸桿菌Rosetta(DE3))在可溶和不可溶性組分中都沒有相應(yīng)蛋白的表達條帶。
實施例2
蛋白的表達與定量分析
將攜帶261sip01基因的大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株以1％的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600值達到0.5-1.0之間時，加入誘導(dǎo)物50mM IPTG，在150rpm，20℃低溫下誘導(dǎo)12h。然后在4℃下，8000rpm離心3min。離心收集菌體，加入50mM Tris·Cl(pH 8.0)懸??；破碎菌體(利用超聲波常規(guī)完全破碎)，將超聲破碎后的菌液在4℃下12,000rpm離心15min；然后收集上清液。按照如下方法對所述上清液進行SDS-PAGE定量分析：制備以下5種不同濃度梯度的BSA：0.8μg/μL、0.4μg/μL、0.2μg/μL、0.1μg/μL、0.05μg/μL，并將目標(biāo)蛋白進行梯度稀釋，使其終濃度介于0.8-0.05μg/μL，目標(biāo)蛋白和5種不同濃度的BSA(蛋白定量試劑盒：DC Protein Assay)上樣量均為10μL，進行蛋白電泳檢測。以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準蛋白制作蛋白濃度標(biāo)準曲線，測定大腸桿菌Rosetta(DE3)重組菌株中總蛋白的濃度。結(jié)合ImageMaster VDS軟件分析SDS-PAGE中目的蛋白所占比例，計算目的蛋白，即得到上清液中的261sip01的濃度。
對比例1
以克隆到pET21b上的cry8G(SEQ ID No.5)基因在大腸桿菌Rosetta(DE3))中相同條件下的表達產(chǎn)物為生物活性測定分析的陽性對照。Cry8G(SEQ ID No.6)蛋白的表達同實施例2。其中，該蛋白的表達產(chǎn)物主要分布于沉淀中，即主要以包涵體的形式存在，因此，在進行后續(xù)的生物活性測定時使用的沉淀產(chǎn)物。而在進行定量分析和后續(xù)的生物活性測定之前，首先要將包涵體進行常規(guī)溶解，后續(xù)定量分析同實施例2。
實施例3
活性分析
華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)由滄州農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所提供。
(1)將土豆切成細絲在陽光下晾曬至失水約60％-90％，同時將過篩后的土在陽光下暴曬2-3小時；
(2)將晾曬過的土豆絲在配制好的系列稀釋的上清液(加入終濃度0.1％的洗滌劑)中浸泡30s；
(3)然后將土豆絲分裝于六孔板中；
(4)按每100g土加18mL溶液的比例用浸泡過土豆絲的上清液拌土，并將拌好的土分裝于六孔板中；
(5)將健康的5日齡華北大黑鰓金龜?shù)挠紫x接種于六孔板中，每孔接1頭試蟲，每30頭作為一個處理，每個處理做三次重復(fù)，接完蟲后嚴格密封，防止幼蟲爬出；
(6)放置25℃生化培養(yǎng)箱中，光周期為16h：8h，濕度50％左右，每天觀察土豆絲是否發(fā)霉(為的是避免土豆發(fā)霉)，是否有水蒸氣凝結(jié)(為的是避免含水量過高)，并在調(diào)整生化培養(yǎng)箱內(nèi)的水分，保持箱內(nèi)濕度；
(7)7天后調(diào)查各個處理的死、活蟲數(shù)，計算死亡率、存活率、校正死亡率和LC50。
其中，對試蟲進行LC50測定之前，首先使用如上的生物活性測定方法經(jīng)過初篩初步確定殺蟲的濃度范圍，然后再測定一系列的濃度梯度下的殺蟲活性，進而計算出LC50。在某一特定濃度下的死亡率和校正死亡率計算公式如下：
根據(jù)生測數(shù)據(jù)采用SPSS(V13.0)軟件計算致死中濃度(LC50)。其結(jié)果見表2。
表2
由表2的結(jié)果可知，本申請的261sip01殺蟲蛋白對華北大黑鰓金龜?shù)幕钚燥@著地優(yōu)于已知的Cry類殺蟲蛋白Cry8G。將本申請的261sip01殺蟲蛋白用于防治華北大黑鰓金龜不但提供了一種新的殺蟲蛋白，而且還可以顯著地降低生產(chǎn)成本，從而帶來更為可觀的經(jīng)濟效益。
雖然本發(fā)明已經(jīng)參照其優(yōu)選地具體實施方式進行了描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解在沒有脫離本發(fā)明的真正的精神和范圍的情況下，可以進行的各種改變。例如，可以對本發(fā)明的主體、精神和范圍進行多種改變以適應(yīng)特定的情形、材料、材料組合物或方法步驟。所有的這些改變均包括在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。并且利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許的變動或修飾均等同于等效實施案例，均屬于技術(shù)方案范圍內(nèi)。
LHA1760149 核 苷 酸 和 氨 基 酸 序 列 表
<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所
<120> 一種新的殺蟲蛋白及其核苷酸序列
<130> LHA1760149
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1197
<212> DNA
<213>蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）
<223> 261sip01
<400> 1
ATGCATTCTATTAAACGATATAAAAAAATGGGAATTGTTGTTCCACTGGCTTGTTTATTAGGTACAGGTTTTACATTTGTGAATCAGCCAATTCATGCCGCTGCGGCAGTTACAACTAATGCTACAGTTACTAATAATGCTTCAGCAGAGTTTAAGGAAGTTGATTTAAATACTTTACGTGGAGATCTATACGAAAGATATTTTACATTATTATTAACAAAACCTGAATTAATTGGTGGAGAAGCTGCTTGGAAATCATGGGGTGATGATTCAAAAGCGAATTATAATATAAAGTATAATATGACTCAGTGGGTTGAAAATTTAAAACAGGGAAATTATAAATATTTTGAAGAGACTTGGGGGGGATTTGGTTCGTTAGCAAGACATATTGGTCAAATAAATGCATTTTTAGATTGGAATCCTCAATATAGTAATACAACTAAAAATTATGATTTAAAAGCAATACCAGGAGATATAAATCATGATTCAATAGAAGTATATAAATATACTAATCCCGCAAATTCTGTGGAACAAAAGTTTTTAACAGATGCAAAAGATGTTGAAATCGGACATACATTCACAGAAACTCATACTACTGGGGGGAAATTCGGATATAATGCTGCAACTACATTTAAAGTAGGTGTACCATTAAATCAAGCTACAACAACACATACGTTTACATTTGAAGCAAATTATAATTATACAAATACACATACAAAAACAGATAAAGAAACAAAACATTATCCATCTCAAACAGTAATTTGTAAACCTGGTTATACTACAAAATTAACAATTGATAAATCTACAGCAACTTATACTGGAGATTTGGAGTTTGATATTGGAGCAAGTGCAGAAGAGTTAATAACTAAAATTAATGCGAATATTAAGGATCTACCTAATCATACAAACAAGAATTATAAAGGACCTAAAACTACAATAAAAGCAGATTCAGAAGAATTCTTGTATAATTTATATAAATATTCAGGATATGATCTTCCATCATATATAACATTAGATGATGAGCATAAAACCGTGTCATTTGGAAAAGTAAAAAGTACCTATAGTGGTGTAACAGGTACAGCAAGTGAAATGATATTAGAATTGATACCAATTGATCCAAAAGATACAACAAAGAAACCAATAAAAATGCTTTTCAAAGAATATCAACAAAAAATGAAAAATAATGAACCATTAATT；
<210> 2
<211>399
<212> PRT
<213>蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）
<223> 261sip01
<400> 2
MHSIKRYKKMGIVVPLACLLGTGFTFVNQPIHAAAAVTTNATVTNNASAEFKEVDLNTLRGDLYERYFTLLLTKPELIGGEAAWKSWGDDSKANYNIKYNMTQWVENLKQGNYKYFEETWGGFGSLARHIGQINAFLDWNPQYSNTTKNYDLKAIPGDINHDSIEVYKYTNPANSVEQKFLTDAKDVEIGHTFTETHTTGGKFGYNAATTFKVGVPLNQATTTHTFTFEANYNYTNTHTKTDKETKHYPSQTVICKPGYTTKLTIDKSTATYTGDLEFDIGASAEELITKINANIKDLPNHTNKNYKGPKTTIKADSEEFLYNLYKYSGYDLPSYITLDDEHKTVSFGKVKSTYSGVTGTASEMILELIPIDPKDTTKKPIKMLFKEYQQKMKNNEPLI；
<210>3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 261sip01_F
<400> 3
ATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGATGCATTCTATTAAACGATAT；
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>261sip01_R
<400> 4
TGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCAATTAATGGTTCATTATTTTTCAT；
<210> 5
<211> 3468
<212> DNA
<213>蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）
<223> cry8G
<400> 5
ATGAGTCCGAATAATCAGAACGAATATGAAATTATAGATGCGTCATCACCTACTTCTGTATCTAATAACTCAGTGAAATACCCTTTAGCAAGTGATCAAACGACCACATTACAAAATATGAACTATAAAGATTATCTGAGAATGTCTGAGGGAGAGAATCCTGAATTATTTGGAAATCCAGAGACGTTTATTAGTGCGCAGGATGCGGTTGGAACTGGGATTGATATTGTGAGTAAACTACTAGGTAGTTTAGGGGTTCCACTTGTTGGGCAAGCCGCAACGGCACTTAAATGGATTATAGGTAAATTGTGGCCTTCTTCAGGAAACCCGTGGGATGATTTGATGACGGCAGTAGAAGAACTCATAAATCAAAAAATAGAAGCATATGCAAGAAGTAAGGCACTTGCTGAATTGGGTGTTTCGGGAAGAGCTGTAAAATCCTATCAAACCGCACTTGAAGAGTGGCAAAAAAACCCGAATAACGCGCGAAGCGCAGCACTTGTAAGGGAAAGATTTTCAGATGCAGAACATACATTGCGTACTCAAATGAGTTTATTTACCGTTCGTGGTTATGAAATTCCGCTTTTAGCAACATATGCACAAGCTGCCAATTTGCATTTGTTTGTAATGAAGGATATTCAAATTTACGGGAGAGAATGGGGATATACTCAGGGAGATATTAACCTTTTCTATCGAGAACAAGTAGAATTTACAGGGGAATACTCTGATTATTGTGTTAAGTGGTACAATGCTGGCTTAGATAAATTAAGAGGCTCGACTGCTCTACAATGGATTAACTATAATCGTTTCCGCAGAGAAATGACAGTGATGGCACTGGATATAGTTGCATTATTCCCAAATTATGACATACGCATGTATCCAATGAAAACAACCGCAGAATTAACGCGAAGAATTTATACAGATCCGCTTGGTTATACGGGAAGTGGGTCTAACACGCCACCATGGTATAATTATGGATATTCTTTCTCATGGATAGAAAATAATGCCGTGCCAGCACCTGGATTGTTCCAGTGGTTACAAGGAATTGGGATTTATACTAAATTTGCTCGTATAACTCCATTTTATGCGAACTATTGGTCAGGACATACTGTATTTTATAAATTTACTAACGATTCTACTGAGAGACGTGTTCAGTATGGAGATACAGATACTCCAGAATTAGATAGTTCTTCCTTTGAAAATGTTGACATTTATAAGGTTTCAGCATCAGTTGGTTCGTACAAAAGTAATACCGTACTATTACCAACTTTTAAAGCTACTTTTGAGGGGGTAAATCAAAATAATCAGTTAAAGACCTTTAGGTATCAAAAAGAATCTAATGTCCCAAGTCAAACGAAAAACTCAACCACAGAGCTGCCTGTTCAGTTATCAACTCCGCCTACTTACGGAGATTCTGAACAGTACAGTCATAGACTAGCCTATGTTTTTGATGCCCCAATCGATTCATATACAGGCATATATCGCATGTATGGATTTGCCCCTATTCTTGGTTGGACACATATTAGTGTAAGTCGTGACAATAGGATTGATCCAGATAAAATTACTCAAATTCCAGCTGTAAAGGCATATGCTGAGGGTCTTGCTAATTATATCAAAGATCCGGGGTTTACAGGAGGAGATTTATTAGCTTTAGGTAGAAACTCAAATACTTCATTGATTGTCAATTTTTCGAAGCCTCAAACATACCGTATTCGTATTCGTTATGCTGCTAGTAAAACTTCGTATTTTCAACTACGTGGGCTGCATAATATAGCTCAGTCTCAGCGTTTCGAAGCGACGTATTCTAATAAAAATGAAAACGATTTGACATTTAACGATTTTAAATATGTAGAAATTCAAAAAACTGTTTCAATAGACAATCCATCAGAAAGTCGTAGTATAAGTATATACACTCAATCAGATACAGAATACTTATTATGGACAAATCGAATTCATCCCAGTAGATGCAACATTTGGAGCGGAACAAGACCTAGATGTGGCAAAGAAAGCGGTGAATGGCTTGTGTACCAATACAAAAGATGCCTTACAGACAAGTGTAACGGATTATCAAGTCAATCAAGCGGCAAACTTAGTAGAATGCCTATCGATGAGTTATACCCAAATGAAAAACGCATGTTATGGGATGCAGTGAAAGAGGCGAAACGACTTGTTCAGGCACGTAACTTACTCCAAGATACAGGCTTTAATGTAATAAATGGAGAAAACGGATGGACGGGAAGTACGGGAATTGAGGTTGTGGAAGGGGATGTTCTGTTTAAAGATCGTTCGCTTCGTTTGCCAAGTGCGAGAGAGATTGATACAGAAACATATCCAACGTATCTCTATCAACAAATAGATGAATCGCTTTTAAAACCATATACAAGATATAGACTAAGAGGTTTTATAGGAAGTAGTCAAGATTTAGAGATTAAATTAATACGTCATCGGGCAAATCAAATTGTCAAAAATGTACCGGATAACCTCTTGCCAGATGTACGCCCTGTCAATTCTTGTGGTGGAGTCGATCGCTGCAGTGAACAACAGTATGTAGACGCGAATTTAGCACTCGAAAACAATGGAGAAAATAGAAATATGTCTTCTGATTCCCATGCATTTTCTTTCCATATGGATACAGGTGAAATAGATTTAAATGAAAATACAGGTATTTGGGTCGTATTTAAAATTCCGACAACAAATGGATACGCAACATTAGGAAACCTTGAATTGGTAGAAGAGGGGCCATTATCAGGAGACGCACTAGAACGCTTGCAAAGAGAAGAACAGCAGTGGAAGCTTCAAAGAACCAAAAGACGTGAAGAGACGGATAGAAAATATATGGCAGCAAAACAAGCCATTGATCGTTTATTCGCAGATTATCAAGACCAACAACTCAATTCTGGTGTAGAAATGTCAGATTTGCTTGCAGCTCAAAACCTTGTACAGTCCATTCCTTATGTGTATAACGAAATGTTCCCAGAAATCCCTGGAATGAACTATACAAATTTCACAGAGTTAACAAACAGACTCCAACAAGCATGGAATTTGTATGATCTTCGAAATGCTATACCAAATGGAGATTTTCGAAATGGATTAAGTGATTGGAATGCAACATCAGATATAAATGTGCAACAACTAAACGATACATCTGTCCTTGTCATTCCAAACTGGAATTCTCAAGTGTCACAACAATTTACAGTTCAACCGAATTATAGATATGTATTACGTGTCACAGCGAGAAAAGAGGGAGCAGGAGACGGATATGTGATCATCCGTGATGGTACAAATCAGACAGAAACACTCGCATTTAATACATGTGATAATGATGCAGGTGTTTTATCTACTAATCAAGCTAGCTATATCACAAAAACAGTGGAATTCACGCCATCTACAGAGCAAGTTTGGATTGACATGAGTGAGACCGAAGGTGTATTCAACATAGAAAGTGTAGAACTCGTGTTAGAAGAAGAG；
<210> 6
<211> 1156
<212> PRT
<213>蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）
<223> Cry8G
<400> 6
MSPNNQNEYEIIDASSPTSVSNNSVKYPLASDQTTTLQNMNYKDYLRMSEGENPELFGNPETFISAQDAVGTGIDIVSKLLGSLGVPLVGQAATALKWIIGKLWPSSGNPWDDLMTAVEELINQKIEAYARSKALAELGVSGRAVKSYQTALEEWQKNPNNARSAALVRERFSDAEHTLRTQMSLFTVRGYEIPLLATYAQAANLHLFVMKDIQIYGREWGYTQGDINLFYREQVEFTGEYSDYCVKWYNAGLDKLRGSTALQWINYNRFRREMTVMALDIVALFPNYDIRMYPMKTTAELTRRIYTDPLGYTGSGSNTPPWYNYGYSFSWIENNAVPAPGLFQWLQGIGIYTKFARITPFYANYWSGHTVFYKFTNDSTERRVQYGDTDTPELDSSSFENVDIYKVSASVGSYKSNTVLLPTFKATFEGVNQNNQLKTFRYQKESNVPSQTKNSTTELPVQLSTPPTYGDSEQYSHRLAYVFDAPIDSYTGIYRMYGFAPILGWTHISVSRDNRIDPDKITQIPAVKAYAEGLANYIKDPGFTGGDLLALGRNSNTSLIVNFSKPQTYRIRIRYAASKTSYFQLRGLHNIAQSQRFEATYSNKNENDLTFNDFKYVEIQKTVSIDNPSESRSISIYTQSDTEYLLWTNRIHPSRCNIWSGTRPRCGKESGEWLVYQYKRCLTDKCNGLSSQSSGKLSRMPIDELYPNEKRMLWDAVKEAKRLVQARNLLQDTGFNVINGENGWTGSTGIEVVEGDVLFKDRSLRLPSAREIDTETYPTYLYQQIDESLLKPYTRYRLRGFIGSSQDLEIKLIRHRANQIVKNVPDNLLPDVRPVNSCGGVDRCSEQQYVDANLALENNGENRNMSSDSHAFSFHMDTGEIDLNENTGIWVVFKIPTTNGYATLGNLELVEEGPLSGDALERLQREEQQWKLQRTKRREETDRKYMAAKQAIDRLFADYQDQQLNSGVEMSDLLAAQNLVQSIPYVYNEMFPEIPGMNYTNFTELTNRLQQAWNLYDLRNAIPNGDFRNGLSDWNATSDINVQQLNDTSVLVIPNWNSQVSQQFTVQPNYRYVLRVTARKEGAGDGYVIIRDGTNQTETLAFNTCDNDAGVLSTNQASYITKTVEFTPSTEQVWIDMSETEGVFNIESVELVLEEE。