本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及小分子多肽Prdx5截短體及其載體和應用。

背景技術：

長久以來抗腫瘤藥物是被廣泛關注和研究的熱點問題之一。目前對腫瘤或癌癥的治療，通常是采用手術治療結合放療和化療的綜合療法。放射線和化療藥導致細胞凋亡，從而殺傷腫瘤細胞。高劑量的放療和化療藥物可以破壞或消滅癌細胞，但同時也損害正常細胞，使患者免疫功能下降，對人體造成一系列毒副作用。

多肽藥物是目前生物醫(yī)藥領域中極具發(fā)展前景的嶄新領域，以其高效、安全、特異性強等特點逐漸用于癌癥的預防和治療?；虻墓δ茏罱K要通過其表達產物——蛋白質來實現(xiàn)，生物體的一切活動或功能都離不開蛋白質的物質基礎。發(fā)現(xiàn)和鑒定具有重要功能的蛋白質，可為新藥的開發(fā)帶來決定性的影響。

基于腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療預后的機制研究中，除了傳統(tǒng)的原癌抗癌基因外，目前關于活性氧（reactive oxidative species，ROS）在腫瘤生物學中的作用是一個熱點的研究領域。ROS 在各類細胞中不斷的產生和清除，發(fā)揮著其正常及病理的功能作用。Nrf2在維持細胞的ROS相對穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮著重要的作用，ROS 可通過Keap1第151 位半胱氨酸的氧化修飾，改變Keap1的構象從而釋放Nrf2，使得Nrf2脫離泛素降解狀態(tài)，進而入核并結合于下游多個基因的啟動子區(qū)域的抗氧化反應元件，調節(jié)抗氧化靶基因NQO1、GSTs及HMOX1等轉錄表達，降低ROS的水平。

許多實驗研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織（包括肺癌，肝癌，乳腺癌，卵巢癌等）中Nrf2和Prdx5基因高表達，同時又發(fā)現(xiàn)其高表達導致現(xiàn)有的抗腫瘤藥物無效。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種小分子多肽Prdx5截短體，具有抗腫瘤功能，滿足生物醫(yī)藥使用需求。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述小分子多肽Prdx5截短體的表達載體。本發(fā)明還有一目的是提供上述小分子多肽Prdx5截短體的應用。

技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

小分子多肽Prdx5截短體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的小分子多肽Prdx5截短體的編碼基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的小分子多肽Prdx5截短體的編碼基因的載體。

所述的小分子多肽Prdx5截短體在制備抗腫瘤藥物中的應用。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明研制開發(fā)出靶向作用在Nrf2上的新型小分子多肽Prdx5截短體，該多肽分子量小，穿透性能好；可在原核表達系統(tǒng)中表達，生產成本低；具有很好的穩(wěn)定性，能在一定范圍內耐受酸堿度和溫度的變化。

附圖說明

圖1是Nrf2和Prdx5全長蛋白的相互作用及免疫沉淀結果圖；

圖2是小分子多肽Prdx5截短體的編碼基因載體質粒圖；

圖3是Prdx5與Nrf2相互作用的結構域圖；

圖4是干擾小分子多肽Prdx5截短體表達后對細胞轉移的影響結果圖。

具體實施方案

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。

實施例1

材料：Protein A/G beads，細胞裂解液，Nrf2抗體，Prdx5抗體，IgG。

方法：細胞予預冷的0.01M PBS洗滌2次；加入1mL PBS后，細胞刮冰上刮取細胞，移至1.5mL離心管中，1000g×5min離心收集細胞；加入配置好的500μL細胞裂解液置于輪轉儀上4℃輪轉30min徹底裂解細胞，12000g 4℃離心10min，將上清液轉移至新EP管。預澄清 加入20μL混勻的Protein A/G beads，在DNA混合儀上轉動1小時，900g 離心5min（4℃），將上清液轉移至新離心管，棄珠子。取40-60μL上清液作為Input，加入等量2×SDS loading buffer，沸水煮5-10min，離心后凍存。其余部分平分為兩等分，分別加入等量（1μg）Normal IgG 或相應抗體, 在DNA混合儀上轉動2小時（4℃）。在每個離心管中各加入30μL 混勻的Protein A/G beads 繼續(xù)轉動2小時。然后900g 離心5min（4℃），棄上清。加入1mL洗滌緩沖液洗滌珠子。900g離心5min（4℃），共洗滌3次。最后將40-60μL 2×SDS loading buffer加入洗好的珠子中，沸水煮5-10min，離心后凍存。連同Input樣品一起進行Western blot檢測。

結果如圖1所示：在組織IP和細胞IP中均存在Nrf2和Prdx5全長蛋白的相互作用。

實施例2

本發(fā)明提供一種能抑制Nrf2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽。該小分子多肽由自行設計的基因編碼，經(jīng)聚合酶鏈反應（PCR）合成后插入表達質粒。將表達載體轉入大腸桿菌BL21，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃下誘導表達。破菌取上清，應用OMEGA公司的DNA抽提試劑盒獲得純化的目的DNA，命名為Prdx5；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，對應的編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。具體構建過程如下：

1）表達載體的構建：設計引物，經(jīng)PCR法連接，通過限制性內切酶Hind III和Kpn I雙酶切后，插入p3XFLAG-Myc-CMV質粒，如圖2所示。構建的表達載體經(jīng)酶切鑒定正確。

材料：E.coli BL21/DE3工程菌株為本室凍存；T4 DNA連接酶為Gibco BRL公司產品；限制性內切酶為Biolab公司產品；Taq DNA聚合酶為Promega公司產品；質粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物技術公司；Ni離子親和層析介質購自本元正陽公司；胎牛血清（FCS）、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基為Hyclone 公司產品。

方法：①表達載體的構建

基因片段的PCR引物由上海桑尼公司合成，引物序列如下：

上游引物：5’ -CCAAGCTTACCATGTCCAAGACACACCTGCC-3’；

下游引物：5’ -GGGGTACCGAAAGCTGTGAGATGATATTGGGTGCC-3’。

PCR反應體系為：H₂O 22μL，上游引物1μL，下游引物1μL，PCMV-N-FLAG-PRDX5質粒 1μL，Taq DNA聚合酶25μL。

PCR反應條件為：94℃ 變性4min，55℃退火，72℃引物延伸。

在基因片段兩端設計了Kpn I和Hind III兩個限制性酶切位點，雙酶切連入p3XFLAG-Myc-CMV質粒。

連接體系為：H₂O 10μL，T4連接酶 buffer1μL，T4連接酶2μL，F(xiàn)ragment1μL。

另設對照組，不加fragment，以H₂O補足體積。PCR機中連接過夜。

用連接產物轉化JM109感受態(tài)菌。轉化步驟為：1）100μL感受態(tài)菌置于冰水，加入DNA 0.5μL，靜置30分鐘； 2）42℃水浴2分鐘；3）冰浴5分鐘；4）加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃下，150 RPM震蕩培養(yǎng)50分鐘。5）將轉化菌接種于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板，置37℃孵箱培養(yǎng)過夜。6）挑選陽性克隆4個，分別接種于LB液體培養(yǎng)基，置37℃搖床震蕩培養(yǎng)。

②載體的鑒定：1）用試劑盒提取陽性克隆質粒DNA。2）用Hind III和Kpn I雙酶切鑒定質粒DNA，送上海桑尼生物技術公司測序。雙酶切體系為：H₂O 14μL，Green buffer 2μL，DNA 2μL，Hind III 1μL，Kpn I 1μL，37℃水浴4小時。2）在大腸桿菌中誘導表達：轉化大腸桿菌BL21/DE3，挑取單菌落接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12h。3）純化：收集轉化菌，加入solution I 250 uL，離心機13000R離心10min；加入solution II 250 uL，反復顛倒20次，呈拉絲狀后離心機13000R離心10min；加入solution III 350 uL，離心機13000R離心10min；加入DNA washing buffer 750 uL，離心機13000R離心1min；最后應用OMEGA公司的DNA抽提試劑盒獲得純化的目的DNA。

? 截短IP：將Prdx5截短體的表達載體轉入肺癌細胞中，進行細胞免疫共沉淀，具體步驟同實施例1。

結果如圖3所示：Prdx5截短體與SOX2蛋白之間的相互作用。其中除了Prdx5全長蛋白（wt）能與SOX2蛋白相互作用外，Prdx5截短突變體（2）也能與SOX2蛋白發(fā)生相互作用。

實施例3

材料：H1299細胞，無血清培養(yǎng)基，PBS，6孔板，marker筆，直尺，槍頭。

方法：①先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×10⁵個細胞，具體數(shù)量因細胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細胞3次，去處劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37度5%CO₂培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，6，12，24小時取樣，拍照。

②將轉染Prdx5截短體的細胞和轉染空載標簽的細胞分別加入到六孔板中，方法同上。

結果如圖4所示，野生型H1299細胞（左）和轉染空載的H1299細胞（中）所表現(xiàn)出來的轉移情況要明顯強于轉染Prdx5截短體的H1299細胞（右），說明Prdx5的截短體能抑制腫瘤細胞的轉移。

SEQUENCE LISTING

<110> 南通大學

<120> 小分子多肽Prdx5及其載體和應用

<130> 100

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 小分子多肽Prdx5

<400> 1

Ser Lys Thr His Leu Pro Gly Phe Val Glu Gln Ala Glu Ala Leu Lys

1 5 10 15

Ala Lys Gly Val Gln Val Val Ala Cys Leu Ser Val Asn Asp Ala Phe

20 25 30

Val Thr Gly Glu Trp Gly Arg Ala His Lys Ala Glu Gly Lys Val Arg

35 40 45

Leu Leu Ala Asp Pro Thr Gly Ala Phe Gly Lys Glu Thr Asp Leu Leu

50 55 60

Leu Asp Asp Ser Leu Val Ser Ile Phe Gly Asn Arg Arg Leu Lys Arg

65 70 75 80

Phe Ser Met Val Val Gln Asp Gly Ile Val Lys Ala Leu Asn Val Glu

85 90 95

Pro Asp Gly Thr Gly Leu Thr Cys Ser Leu Ala Pro Asn Ile Ile Ser

100 105 110

Gln Leu

<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 小分子多肽Prdx5

<400> 2

tccaagacac acctgccagg gtttgtggag caggctgagg ctctgaaggc caagggagtc 60

caggtggtgg cctgtctgag tgttaatgat gcctttgtga ctggcgagtg gggccgagcc 120

cacaaggcgg aaggcaaggt tcggctcctg gctgatccca ctggggcctt tgggaaggag 180

acagacttat tactagatga ttcgctggtg tccatctttg ggaatcgacg tctcaagagg 240

ttctccatgg tggtacagga tggcatagtg aaggccctga atgtggaacc agatggcaca 300

ggcctcacct gcagcctggc acccaatatc atctcacagc tt 342

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 引物序列

<400> 3

ccaagcttac catgtccaag acacacctgc c 31

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物序列

<400> 4

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