本發(fā)明涉及一種戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物及方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

戈氏梭菌(Clostridium ghonii)為革蘭氏陽(yáng)性菌，嚴(yán)格厭氧菌，可存在土壤、水中沉積物、動(dòng)物和人腸道中。目前戈氏梭菌的研究主要集中于利用其趨腫瘤內(nèi)低氧特性(僅可在腫瘤乏氧區(qū)大量繁殖)，并分泌多種水解酶和誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤組織生長(zhǎng)的作用，進(jìn)行細(xì)菌溶瘤藥物一類新藥的研發(fā)。

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104473973A(申請(qǐng)?zhí)?01410803072.X)公開(kāi)了一株馴化戈氏梭菌MW-DCG-HNCv-18菌株在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。該發(fā)明還公開(kāi)了馴化戈氏梭菌MW-DCG-HNCv-18菌株和多西他賽為藥效成分聯(lián)用的藥物。該發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)MW-DCG-HNCv-18菌株對(duì)非小細(xì)胞肺癌具有特異性抑制作用，對(duì)非小細(xì)胞肺癌抑制效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有已知的其他類似菌株，并通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)其與多西他賽注射液聯(lián)用時(shí)，對(duì)非小細(xì)胞肺癌抑制效果更加突出，為治療非小細(xì)胞肺癌提供了新的途徑。

此外美國(guó)專利文獻(xiàn)141397,293、歐洲專利文獻(xiàn)13780960.4、澳大利亞專利文獻(xiàn)2013252495等均公開(kāi)了戈氏梭菌臨床前抗腫瘤作用的有效性，顯示出較好的藥物開(kāi)發(fā)前景。但是，戈氏梭菌體內(nèi)組織分布的高特異性、高靈敏性的快速檢測(cè)仍是未解決的難題，也是臨床檢測(cè)的難點(diǎn)。

目前，主要采用染色鏡檢、生理生化反應(yīng)和16S rRNA測(cè)序和組織切片革蘭氏染色進(jìn)行細(xì)菌分布研究和臨床檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果仍存在步驟復(fù)雜、特異性不強(qiáng)、靈敏度不高、易誤判的問(wèn)題。

采用PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的體內(nèi)分布和臨床檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果易判的特點(diǎn)。但由于戈氏梭菌目前尚未檢測(cè)獲得其基因組序列，且對(duì)該菌株研究較少，相關(guān)研究?jī)H限于菌株整體應(yīng)用，對(duì)于其分子水平的研究較少，從而限制了PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物及方法。該引物可用于戈氏梭菌的PCR檢測(cè)，具有檢測(cè)時(shí)間短，成本低，檢測(cè)結(jié)果特異性高，靈敏度強(qiáng)，結(jié)果易判斷，實(shí)用性強(qiáng)。

本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

戈氏梭菌硫氧還蛋白編碼基因Trx，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

戈氏梭菌硫氧還蛋白(Thioredoxin,Trx)是一類高度保守的低分子量蛋白質(zhì)，廣泛分布于植物、細(xì)菌、酵母和動(dòng)物中，在許多還原反應(yīng)中作為氫供體，參與氧化還原反應(yīng)。但發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，戈氏梭菌硫氧還蛋白的編碼基因Trx與Clostridium Novyi、Clostridium beijerinckii、Clostridium sporogenes等親緣關(guān)系接近的其他梭菌屬厭氧菌硫氧還蛋白基因序列相似度不高，分別僅為25.23％、34.60％和33.38％，這為利用該基因進(jìn)行戈氏梭菌的特異性檢測(cè)創(chuàng)造了條件。

一種戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物，該引物為一對(duì)，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

正向引物F：5’-ATGGCTAAAACAATAAATACAGGGA-3’ SEQ ID NO.1

反向引物R：5’-TTATAAATGAGCTTCTACTTTTGCT-3’ SEQ ID NO.2

利用上述戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)的方法，步驟如下：

(1)提取組織樣品中的RNA；

(2)將步驟(1)提取獲得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得cDNA；

(3)以步驟(2)制得的cDNA為模板，上述戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物為特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

(4)取步驟(3)制得的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果在315bp處出現(xiàn)條帶，則組織樣品中含有戈氏梭菌，如果檢測(cè)結(jié)果中未在315bp處出現(xiàn)條帶，則組織樣品中不含戈氏梭菌。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，PCR擴(kuò)增體系如下，總體積20μL：

最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至20μL。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，PCR擴(kuò)增程序如下：

94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，所述電泳檢測(cè)為采用質(zhì)量百分比為1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

上述步驟(1)中的組織樣品中的RNA提取及步驟(2)中的反轉(zhuǎn)錄均可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)；如RNA提取可采用Trizol法進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄可采用TaKaRa公司生產(chǎn)的TaKaRa PrimeScript^TMRT-PCR kit(RR014A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

有益效果

本發(fā)明首次公開(kāi)了戈氏梭菌硫氧還蛋白的編碼基因Trx不同于Clostridium Novyi、Clostridium beijerinckii、Clostridium sporogenes等親緣關(guān)系接近的其他梭菌屬厭氧菌硫氧還蛋白基因序列高度保守的規(guī)律，并根據(jù)該發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)出戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物，解決了PCR技術(shù)進(jìn)行戈氏梭菌體內(nèi)分布和臨床檢測(cè)的技術(shù)難題；本發(fā)明檢測(cè)的靶點(diǎn)具有特異性，檢測(cè)結(jié)果特異，易于判定；為戈氏梭菌抗腫瘤藥物研發(fā)、臨床戈氏梭菌快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例中PCR檢測(cè)方法特異性評(píng)估實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果圖；

圖中：泳道1為腸，泳道2為胃，泳道3為大腸桿菌，泳道M為Marker(D2000)，泳道4為肺，泳道5為戈氏梭菌，泳道6為戈氏梭菌芽孢，泳道7為滅菌雙蒸水；

圖2為實(shí)施例中PCR檢測(cè)方法靈敏度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果圖；

圖中：泳道M為Marker(D2000)，泳道1為戈氏梭菌的陽(yáng)性對(duì)照，泳道2為初始模板cDNA的10¹倍稀釋液PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道3為初始模板cDNA的10²倍稀釋液PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道4為初始模板cDNA的10³倍稀釋液PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道5為初始模板cDNA的10⁴倍稀釋液PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道6為初始模板cDNA的10 ⁵倍稀釋液PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道7為滅菌雙蒸水。

圖3為實(shí)施例中PCR檢測(cè)方法特異性檢測(cè)戈氏梭菌和Clostridium Novyi凝膠電泳結(jié)果圖；

圖中：泳道1為戈氏梭菌，泳道2為Clostridium Novyi，泳道M為Marker(D2000)，泳道3為滅菌雙蒸水。

具體實(shí)施方法

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件例如Sambrook等分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York：Cold Spring Habor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例中所述戈氏梭菌來(lái)源于澳大利亞國(guó)家計(jì)量研究院，菌株保藏號(hào)V12/001485。

實(shí)施例中所述Clostridium Novyi來(lái)源于ATCC，菌種保藏號(hào)編號(hào)ATCC7659。

實(shí)施例1戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物的開(kāi)發(fā)

發(fā)明人通過(guò)前期對(duì)戈氏梭菌全基因組測(cè)序和對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，該菌含有編碼硫氧還蛋白的基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

利用DNAMAN軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌硫氧還蛋白基因序列與Clostridium Novyi、Clostridium beijerinckii、Clostridium sporogenes等親緣關(guān)系接近的其他梭菌屬厭氧菌硫氧還蛋白基因序列相似度不高，分別僅為25.23％、34.60％和33.38％，這不同于梭菌屬厭氧菌硫氧還蛋白基因序列高度保守的規(guī)律。根據(jù)編碼戈氏梭菌硫氧還蛋白的基因序列的高特異性設(shè)計(jì)并合成特異擴(kuò)增戈氏梭菌的引物。

實(shí)施例2

步驟一，設(shè)計(jì)并合成戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物，核苷酸序列如下所示：

F：5’-ATGGCTAAAACAATAAATACAGGGA-3’； SEQ ID NO.1

R：5’-TTATAAATGAGCTTCTACTTTTGCT-3’； SEQ ID NO.2

步驟二，RNA模板制備

將戈氏梭菌接種于6ml RCM液體培養(yǎng)基(購(gòu)自BD公司)中，于37℃厭氧工作站中培養(yǎng)12h后，取1m L菌液，6000r/min離心5min，棄盡上清，加入100μL滅菌雙蒸水，用移液器輕輕吹打，重懸菌體；將菌液放入液氮充分預(yù)冷的研缽中研磨至粉末，加入1mL Trizol進(jìn)行RNA提取。

步驟三，RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA

按照TaKaRa PrimeScript^TMRT-PCR kit(RR014A)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得cDNA模板，測(cè)定cDNA模板濃度。

步驟四，戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)方法建立

PCR檢測(cè)體系為：

2×Taq MasterMix 10μL，10μM的正向引物F 1Μl，10μM的反向引物R 1μL，cDNA模板1μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至20μL；

PCR檢測(cè)程序?yàn)椋?/p>

94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。

步驟五，PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳判定

所述判斷具體為：質(zhì)量百分比濃度為1.5％凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，紫外燈照射下觀察電泳結(jié)果，如果出現(xiàn)315bp的擴(kuò)增條帶，則說(shuō)明樣本中含有戈氏梭菌；反之，則樣本中不含戈氏梭菌。

實(shí)施例3PCR檢測(cè)方法特異性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

按實(shí)施例2所述方法制備cDNA模板與PCR檢測(cè)，對(duì)戈氏梭菌、大腸桿菌、胃、腸等樣本中的細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

特異性檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，圖1結(jié)果顯示只有戈氏梭菌在315bp處有特異性條帶，而其它泳道均未出現(xiàn)特異性條帶。

PCR檢測(cè)方法靈敏度評(píng)價(jià)試驗(yàn)

接種戈氏梭菌于6mL RCM液體培養(yǎng)基中，置于37℃厭氧工作站中培養(yǎng)12h后，取1ml菌液，用無(wú)菌1×PBS緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋后，平板法計(jì)數(shù)，細(xì)菌濃度為10⁸CFU/mL。取1mL菌液按實(shí)施例提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并檢測(cè)cDNA濃度，以滅菌雙蒸水稀釋cDNA，稀釋倍數(shù)為10¹-10⁵，以梯度稀釋的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖2所示。由圖2可知，在泳道6可以看到清晰條帶，其相對(duì)應(yīng)檢測(cè)細(xì)菌濃度為50CFU/mL，從而證明本申請(qǐng)所述方法具有較高的靈敏度。

實(shí)施例4

取戈氏梭菌和與戈氏梭菌遺傳關(guān)系較近的Clostridium Novyi，分別按照實(shí)施例2所述方法制備cDNA模板與PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

由圖3結(jié)果可以看出僅戈氏梭菌經(jīng)PCR檢測(cè)后在315bp處擴(kuò)增出能夠體現(xiàn)戈氏梭菌硫氧還蛋白基因的特異條帶，而以Clostridium Novyi經(jīng)PCR檢測(cè)后未在315bp處擴(kuò)增出特異條帶。以上結(jié)果說(shuō)明本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物可以有效將與戈氏梭菌親緣關(guān)系接近的菌檢測(cè)區(qū)分。

應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東新創(chuàng)生物科技有限公司

<120> 一種戈氏梭菌特異性PCR檢測(cè)引物及方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggctaaaa caataaatac aggga 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttataaatga gcttctactt ttgct 25

<210> 3

<211> 315

<212> DNA

<213> Clostridium ghonii

<400> 3

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