本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及氮運(yùn)輸基因OsNPF2.4b能夠促進(jìn)水稻有效穗的提高。

背景技術(shù)：

植物通過(guò)吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等來(lái)獲得氮素；氮的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠銨根運(yùn)輸?shù)鞍?AMT)、硝酸根運(yùn)輸?shù)鞍?NRT)、氨基酸運(yùn)輸?shù)鞍?AAT)、肽運(yùn)輸?shù)鞍?PTR)等運(yùn)輸?shù)鞍讈?lái)完成(Williams L,Miller A.Transporters responsible for the uptake and partitioning of nitrogenous solutes.Annu Rev Plant Biol and Plant Mol Biol,2001,52:659-688.)。銨通過(guò)植物AMT吸收后再通過(guò)谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再進(jìn)一步形成其它氨基酸(Sonoda Y,Ikeda A,Saiki S,et al.Feedback regulation of the ammonium transporter gene family AMT1by glutamine in rice.Plant Cell Physiol,2003,44:1396-1402.)。植物可通過(guò)高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(HATS)的NRT2和低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(LATS)的NRT1吸收環(huán)境中的硝酸鹽，由硝酸還原酶(NR)和亞硝酸還原酶(NiR)還原形成銨，再進(jìn)一步形成氨基酸(Paungfoo-Lonhienne C,Lonhienne T G,Rentsch D,et al.Plants can use protein as a nitrogen source without assistance from other organisms.PNAS,2008,105:4524-4529.)。

NRT1/PTR家族(NRT1/PTR family,NPF)是指能夠介導(dǎo)2-3個(gè)氨基酸殘基的小分子肽及硝酸根等物質(zhì)進(jìn)行跨膜運(yùn)輸?shù)牡鞍?Rentsch D,Schmidt S,Tegeder M.Transporters for uptake and allocation of organic nitrogen compounds in plants.FEBS Let,2007,581:2281-2289)。NRT1/PTR家族成員參與了植株生長(zhǎng)發(fā)育，及種子形成過(guò)程中蛋白質(zhì)的積累和萌發(fā)中蛋白降解后小分子多肽形式轉(zhuǎn)運(yùn)(Martre P,Porter J R,Jamieson P D,et al.Modeling grain nitrogen accumulation and protein composition to understand the sink/source regulations of nitrogen remobilization for wheat.Plant Physiol,2003,133:1959-1967)。

水稻NPF家族部分成員能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高生物量和產(chǎn)量。在水稻中超表達(dá)OsNPF8.20基因能夠增加銨的吸收，提高分蘗數(shù)(Fang ZM,Xia KF,Yang X,et al.Altered expression of the PTR/NRT1homologue OsPTR9affects nitrogen utilization efficiency,growth and grain yield in rice.Plant Biotech J,2013,11:446-458)。OsNPF6.5基因編碼硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠影響硝酸根的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和同化等各個(gè)環(huán)節(jié)，并影響水稻分蘗數(shù)(Hu B,Wang W,Ou S,et al.Variation in NRT1.1B contributes to nitrate-use divergence between rice subspecies.Nature Genetics,2015,47:834-838)。OsNPF7.2對(duì)硝酸根有低親和運(yùn)輸，能夠在高濃度硝酸根下影響植株根生長(zhǎng)(Hu R,Qiu D,Chen Y,et al.Knock-down of a tonoplast localized low-affinity nitrate transporter OsNPF7.2affects rice growth under high nitrate supply.Frontiers in plant science,2016,7)。近期有研究表明，超表達(dá)高親和硝酸根運(yùn)輸基因OsNRT2.3b能促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，提高氮利用效率，增加產(chǎn)量(Fan X,Tang Z,Tan Y,et al.Overexpression of a pH-sensitive nitrate transporter in rice increases crop yields.PNAS,2016,113:7118-7123)。

本發(fā)明涉及的OsNPF2.4b是水稻NPF基因家族基因OsNPF2.4經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后加工剪接形成的一個(gè)短的轉(zhuǎn)錄本形式。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)OsNPF2.4b基因?qū)λ居行氲挠绊懹兄匾淖饔?，可?yīng)用于植物水稻氮利用效率的提高，水稻株型改良和產(chǎn)量提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種促進(jìn)水稻分蘗數(shù)和有效穗數(shù)提高的氮運(yùn)輸基因OsNPF2.4b及其應(yīng)用。

本發(fā)明的第一方面，提供一種促進(jìn)水稻分蘗數(shù)和有效穗數(shù)提高的氮運(yùn)輸基因OsNPF2.4b，該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

應(yīng)該理解為，在不影響OsNPF2.4b蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。

因此，本發(fā)明的水稻OsNPF2.4b基因編碼的蛋白質(zhì)還包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有同等活性的水稻OsNPF2.4b基因編碼的蛋白質(zhì)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供基因OsNPF2.4b的cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO.2。

應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子而得到基因OsNPF2.4b的cDNA的核苷酸序列。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種包括上述cDNA多核苷酸的正義序列或反義序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明的第二方面，提供基因OsNPF2.4b在水稻選育中的應(yīng)用，所述水稻選育為提高水稻分蘗數(shù)、有效穗數(shù)，從而提高產(chǎn)量。

本發(fā)明的第三方面，提供一種促進(jìn)水稻有效穗數(shù)提高的氮運(yùn)輸基因OsNPF2.4b轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)試劑盒，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以待檢轉(zhuǎn)基因水稻cDNA為模板，利用所述引物對(duì)擴(kuò)增，檢測(cè)OsNPF2.4b基因的表達(dá)量，所述引物對(duì)為：

F2：5'-GTTTGGGTGTGCAGGGAACG-3'(SEQ ID NO.5)，

R2：5'-TAGCGGCCGAGGTAGGCGTC-3'(SEQ ID NO.6)。

若轉(zhuǎn)基因植株OsNPF2.4b基因的表達(dá)量與對(duì)照中花11相比顯著升高，則說(shuō)明是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)如下：

本發(fā)明以水稻氮運(yùn)輸基因OsNPF2.4b為對(duì)象，從水稻中花11中克隆了OsNPF2.4b的cDNA序列。通過(guò)構(gòu)建OsNPF2.4b的超表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中，得到OsNPF2.4b基因的超表達(dá)植株，種植水稻田中，超表達(dá)植株的分蘗數(shù)和有效穗數(shù)與對(duì)照野生型中花11相比顯著提高。同時(shí)構(gòu)建了OsNPF2.4b基因的干擾載體，將干擾載體導(dǎo)入中花11中，得到OsNPF2.4b基因的干擾植株，種植于水稻田中，其分蘗數(shù)和有效穗數(shù)與中花11相比顯著降低。這些結(jié)果表明，通過(guò)提高OsNPF2.4b基因表達(dá)，可以促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，增加分蘗數(shù)和有效穗數(shù)；OsNPF2.4b基因在水稻產(chǎn)量提高方面有應(yīng)用價(jià)值，可以通過(guò)分子育種應(yīng)用于水稻品種改良中。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

(1)本發(fā)明克隆的OsNPF2.4b基因提高表達(dá)后可以在低氮下使水稻分蘗數(shù)和有效穗增加，說(shuō)明OsNPF2.4b基因?qū)μ岣咚旧锪亢彤a(chǎn)量有較明顯作用，因此，通過(guò)基因工程技術(shù)提高OsNPF2.4b基因的表達(dá)能夠提高植物生物量和產(chǎn)量。這不僅有助于通過(guò)減少氮肥使用培育高產(chǎn)水稻，還可以通過(guò)分子育種進(jìn)行植物的品種改良。

(2)OsNPF2.4b基因的成功克隆，進(jìn)一步證實(shí)了NPF家族基因不同剪接形式在氮運(yùn)輸過(guò)程中的重要作用，對(duì)闡明NPF轉(zhuǎn)運(yùn)家族的生物學(xué)功能有重要的意義，另外對(duì)進(jìn)一步了解植物氮代謝途徑，提高氮吸收效率有極大的推動(dòng)作用。

(3)盡管目前已克隆到了一些氮營(yíng)養(yǎng)途徑中影響植物生長(zhǎng)的基因，但對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。而本發(fā)明克隆的OsNPF2.4b基因能夠提高水稻的產(chǎn)量，對(duì)確定植物增產(chǎn)的關(guān)鍵因素有極大的推動(dòng)作用。

附圖說(shuō)明

圖1是大田種植下對(duì)照中花11、OsNPF2.4b基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和OsNPF2.4b基因干擾植株2個(gè)株系的整株表型圖；

圖2是對(duì)照中花11、OsNPF2.4b基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和OsNPF2.4b基因干擾植株2個(gè)株系中基因相對(duì)表達(dá)量的分析，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，所有材料數(shù)值均與對(duì)照相比，具有差異顯著的表示為*；

圖3是對(duì)照中花11、OsNPF2.4b基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和OsNPF2.4b基因干擾植株2個(gè)株系中有效穗數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，所有材料數(shù)值均與對(duì)照相比，具有差異顯著的表示為*。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。若未特別指明，下述實(shí)施例所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；所用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，并可按照已描述的重組技術(shù)(參見(jiàn)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)完成；所用的材料、試劑等，均可從商業(yè)途徑得到。

【實(shí)施例1】OsNPF2.4b基因超表達(dá)植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物對(duì)：

F1：5'-GGTACCATGGAGGTGTGGGGGGTTTGGGTG-3'(Kpn I)，(SEQ ID NO.3)

R1：5'-TCTAGACTTGCATCTCAGTTGGCGGCT-3'(Xba I)；(SEQ ID NO.4)通過(guò)PCR擴(kuò)增OsNPF2.4b基因的cDNA后，通過(guò)Kpn I和Xba I酶切后連入pCAMBIA-1306載體，構(gòu)建出OsNPF2.4b基因的超表達(dá)載體OsNPF2.4b-p1306。采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常水稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長(zhǎng)高約10cm時(shí)，將50株水稻轉(zhuǎn)基因小苗浸泡于500mL蒸餾水制備的濃度為50mg/L的潮霉素溶液48小時(shí)，之后葉子為綠色并舒張、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株；而葉子枯黃并卷曲的植株為陰性植株，隨即死亡。陽(yáng)性植株單株種植并收種，直至T2代鑒定出在上述潮霉素溶液中無(wú)任何葉子枯黃并卷曲的為純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到OsNPF2.4b基因超表達(dá)植株。將超表達(dá)植株和中花11對(duì)照的種子在培養(yǎng)皿上用蒸餾水浸種3天并培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)入水稻營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)15天，營(yíng)養(yǎng)液配方參考國(guó)際水稻所配方，后轉(zhuǎn)入大田中種植。由圖1可見(jiàn)在大田種植下，OsNPF2.4b基因超表達(dá)植株與對(duì)照中花11植株相比生物量提高，具體表現(xiàn)為分蘗數(shù)和有效穗增加，并達(dá)到差異顯著。

取OsNPF2.4b基因超表達(dá)植株葉片，提取RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)OsNPF2.4b基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示(圖2)超表達(dá)植株OsNPF2.4b基因的表達(dá)量與對(duì)照中花11相比顯著升高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物對(duì)為：

F2：5'-GTTTGGGTGTGCAGGGAACG-3'(SEQ ID NO.5)，

R2：5'-TAGCGGCCGAGGTAGGCGTC-3'(SEQ ID NO.6)。

生殖期統(tǒng)計(jì)OsNPF2.4b超表達(dá)植株和對(duì)照的有效穗數(shù)，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株的有效穗數(shù)顯著高于中花11對(duì)照，如圖3所示。

【實(shí)施例2】OsNPF2.4b基因干擾植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物對(duì)：

F3：5'-GGTACCGTTTGGGTGTGCAGGGAACG-3'(Kpn I)(SEQ ID NO.7)，

R3：5'-GGATCCACATGAACAGCACCGCGAACTG-3'(BamH I)(SEQ ID NO.8)，

F4：5'-ACTAGTGTTTGGGTGTGCAGGGAACG-3'(Spe I)(SEQ ID NO.9)，

R4：5'-GAGCTCACATGAACAGCACCGCGAACTG-3'(Sac I)(SEQ ID NO.10)；

各自PCR擴(kuò)增出OsNPF2.4b基因的cDNA片段，通過(guò)上述相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后連入pTCK303載體，構(gòu)建出OsNPF2.4b基因的干擾表達(dá)載體OsNPF2.4b-pTCK303。采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將干擾表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長(zhǎng)高約10cm時(shí)，將50株水稻轉(zhuǎn)基因小苗浸泡于500mL蒸餾水制備的濃度為50mg/L的潮霉素溶液48小時(shí)，之后葉子為綠色并舒張、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株；而葉子枯黃并卷曲的植株為陰性植株，隨即死亡。陽(yáng)性植株單株種植并收種，直至T2代鑒定出在上述潮霉素溶液中無(wú)任何葉子枯黃并卷曲的為純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到OsNPF2.4b基因干擾植株。將干擾植株和對(duì)照的種子在培養(yǎng)皿上用蒸餾水浸種3天并培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)入水稻營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)15天，營(yíng)養(yǎng)液配方參考國(guó)際水稻所配方。后轉(zhuǎn)入大田中種植。由圖1可見(jiàn)，OsNPF2.4b基因干擾植株與對(duì)照中花11植株相比生物量和有效穗減少。

取OsNPF2.4b基因干擾植株葉片，提取RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)OsNPF2.4b基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示(圖2)干擾植株OsNPF2.4b基因的表達(dá)量與對(duì)照中花11相比顯著降低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物對(duì)為：

F2：5'-GTTTGGGTGTGCAGGGAACG-3'，

R2：5'-TAGCGGCCGAGGTAGGCGTC-3'。

生殖期統(tǒng)計(jì)OsNPF2.4b干擾植株和對(duì)照的有效穗數(shù)，發(fā)現(xiàn)干擾植株的有效穗數(shù)顯著低于中花11對(duì)照，如圖3所示。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢生物工程學(xué)院

<120> 促進(jìn)水稻有效穗數(shù)提高的氮運(yùn)輸基因OsNPF2.4b及其應(yīng)用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 552

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 1

Met Glu Val Trp Gly Val Trp Val Cys Arg Glu Arg Asp Val Arg Glu

1 5 10 15

Ala Gly Asp Ala Gly Asp Val Gly Glu Pro Ala Gly Val Pro Asp Ala

20 25 30

Gly Val Pro His Ala Glu Arg Gly Arg Gly Asp Ala Ala Gln Arg Pro

35 40 45

Gln Arg His His Gln Pro Arg Pro His His Arg Arg Leu Pro Leu Arg

50 55 60

Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Arg Pro Arg His Arg Leu Arg Arg Leu

65 70 75 80

Pro His Arg His Val Leu Ala Asp Asp Asp Gly Arg Arg Gly Arg Ala

85 90 95

Ala Pro Gly Gly Val Arg Gly Gly Gly Asp Val Leu Glu Gly Asp Val

100 105 110

Gly Ala Val Arg Gly Ala Val His Val Val Arg Val Pro Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gly Gly Asp Pro Ala Val Gln His Ala Val Arg Arg Arg Pro Val

130 135 140

Arg Pro Pro His Gly Val Arg Gln Ala Arg His Gln Gln Leu Leu Gln

145 150 155 160

Leu Val Leu Leu His Leu His Leu Arg His Ala Arg Leu Arg His Arg

165 170 175

His His Leu Arg Pro Glu Gln Arg Gln Leu Ala His Arg Pro Arg His

180 185 190

Pro His Arg Ala His Ala Pro Arg Leu Arg Pro Leu Leu His Gly His

195 200 205

Gln Ala Leu Arg Pro Arg His Pro Arg Gly Leu Pro Leu His Gln His

210 215 220

Arg Pro Gly Val Arg Arg Arg Gly Glu Glu Ala Val Ala Gln Ala Ala

225 230 235 240

Gln Gly Pro Gln Ala Gly Pro Val Arg Pro Ala Ala His Gln Arg His

245 250 255

Arg His Gln Ala Gly Ala His Gly Pro Val Pro Val Pro Arg Gln Gly

260 265 270

Gly His Arg Val Arg Pro Arg Arg Arg Ala Arg Arg Gly Arg Arg Ala

275 280 285

Val Glu Pro Val Glu Ala Val Gln Arg Ala Ala Gly Gly Gly Gly Glu

290 295 300

Val Pro His Pro His Arg Ala Arg Leu Val His Gly Asp His Leu Leu

305 310 315 320

Arg Arg Arg Arg Ala Ala Val Asp Leu Arg Gly Val Val Arg Ala Ala

325 330 335

Val Arg Pro Thr Pro Arg Pro Glu Leu Pro Asp Pro Arg Gly Val Val

340 345 350

His Gly Val Arg His Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Pro His Leu Arg

355 360 365

Pro Pro Pro Arg Ala Ala Pro Pro Gln Gly His Gly Gln Gly Arg Gly

370 375 380

Pro His Pro Pro Ala Ala Ala Gly Asp Arg Asp Arg Ala Val Asp Gly

385 390 395 400

Gly Asp Gly Asp Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro Glu Ala Ala His Arg

405 410 415

Ala Asp Ala Ala Asp Ala Gly Asp Asp His His Arg Gly Arg His Leu

420 425 430

Gly His Val Gln Pro Val Asp Gly Ala Ala Ala His Gly Ala Gly Ala

435 440 445

Leu Gly Gly Val Gln Pro His Gln Pro Asp Arg Val Leu Leu Gln Gly

450 455 460

Asp Pro Gly Ala His Ala Glu Arg Gly Arg Arg Ala Arg Leu Leu Gln

465 470 475 480

Pro Gly Ala Gly Glu Leu Pro Gln Trp Val Pro Arg His His Arg Ala

485 490 495

Pro Asp His Arg Arg Arg Glu Gln Leu Ala Gly Ala Gly Pro Gln Gln

500 505 510

Gly Glu Ala Arg Pro Leu Leu Leu Asp Asp Arg Arg His Arg His Leu

515 520 525

Gln His His Leu Leu His Asp Leu Arg Gln Val Val Gln Val Gln Gly

530 535 540

Gly Ser Arg Gln Leu Arg Cys Lys

545 550

<210> 2

<211> 1659

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 2

atggaggtgt ggggggtttg ggtgtgcagg gaacgagacg ttcgagaagc tggggacgct 60

ggggacgtcg gcgaacctgc tggtgtacct gacgcaggtg ttccacatgc ggagcgtgga 120

cgcggcgacg ctgctcaacg gcctcaacgg caccaccagc ctcgccccca tcatcggcgc 180

cttcctctcc gacgcctacc tcggccgcta cctcgccctc gccatcgcct ccgtcgcctc 240

cctcatcggc atgttcttgc tgacgatgac ggccgccgcg gacgggctgc acccggcgga 300

gtgcggggtg ggggagacgt gctcgaaggc gacgtcgggg cagttcgcgg tgctgttcat 360

gtcgttcgcg ttcctggtgc tggggtcggc ggggatccgg ccgtgcagca tgccgttcgg 420

cgccgaccag ttcgaccccc acacggagtc cggcaagcgc ggcatcaaca gcttcttcaa 480

ctggtactac ttcaccttca cctccgccat gctcgtctcc gccaccgtca tcatctacgt 540

ccagagcaac gtcagctggc ccatcggcct cggcatcccc accgcgctca tgctcctcgc 600

ctgcgtcctc ttcttcatgg gcaccaggct ctacgtccgc gtcacccccg agggctcccc 660

cttcaccagc atcgtccagg tgttcgccgc cgcggcgagg aagcggtcgc tcaagcagcc 720

caaggacccc aagcaggacc tgttcgaccc gccgcacacc agcgccatcg tcaccaagct 780

ggcgcacacg gaccagttcc ggtgcctcga caaggcggcc atcgtgtccg gccccgacga 840

cgtgcgcgcc gggggcgccg cgccgtcgaa cccgtggagg ctgtgcagcg tgcagcaggt 900

ggaggaggtg aagtgcctca tccgcatcgt gcccgtctgg tccacgggga tcatctacta 960

cgtcgccgtc gtgcagcagt cgacctacgt ggtgttgtcc gcgctgcagt ccgaccgaca 1020

cctcggccgg agcttccaga tccccgcggc gtcgttcacg gtgttcgcca tgctggcgca 1080

gacgctgtgg atccccatct acgaccgcct cctcgtgccg cgcctccgca gggtcacggg 1140

caaggacgag ggcctcaccc tcctgcagcg gcaggggatc gggatcgcgc tgtcgacggt 1200

ggcgatggtg atgtcggccg tggtggagga ccggaggcgg cacatcgcgc tgacgcagcc 1260

gacgctgggg acgaccatca ccgggggcgc catctcggcc atgtccagcc tgtggatggt 1320

gccgcagctc atggtgctgg ggctctcgga ggcgttcaac ctcatcagcc agatcgagtt 1380

ctactacaag gagatcccgg agcacatgcg gagcgtggcc ggcgcgctcg ccttctgcaa 1440

cctggcgctg gggaactacc tcagtgggtt cctcgtcacc atcgtgcacc ggaccaccgg 1500

cgccgggagc aactggctgg cgcaggacct caacaagggg aggctcgacc tcttctactg 1560

gatgatcgcc ggcatcggca tcttcaacat catctacttc atgatctgcg ccaagtggta 1620

caggttcaag ggggcagccg ccaactgaga tgcaagtga 1659

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggtaccatgg aggtgtgggg ggtttgggtg 30

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<213> 人工序列

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tctagacttg catctcagtt ggcggct 27

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gtttgggtgt gcagggaacg 20

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<213> 人工序列

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tagcggccga ggtaggcgtc 20

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ggtaccgttt gggtgtgcag ggaacg 26

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ggatccacat gaacagcacc gcgaactg 28

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actagtgttt gggtgtgcag ggaacg 26

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gagctcacat gaacagcacc gcgaactg 28