本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)、納米醫(yī)藥、超分子化學(xué)及藥物控制釋放技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種具有腫瘤特異性還原降解釋藥的環(huán)糊精-喜樹(shù)堿類前藥的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥又名為惡性腫瘤，已成為威脅人類生存健康的主要原因，是全球第二大死亡原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2015年癌癥造成約880萬(wàn)人死亡，占全球死亡率的六分之一。由于診斷和治療資源的匱乏，其中約70％的癌癥死亡發(fā)生在中低收入國(guó)家。治療癌癥、提高癌癥病人的生存率和生活質(zhì)量成為了一個(gè)世界性的難題。目前，化療手段仍然是癌癥治療的主要方法之一。然而，大多數(shù)化療藥物，比如喜樹(shù)堿(camptothecin)、紫杉醇(paclitaxel)等，在水中溶解度有限，穩(wěn)定性差，而且對(duì)人體正常組織具有嚴(yán)重的副作用。納米藥物由于其獨(dú)特的性質(zhì)被科學(xué)家們廣泛的用于癌癥研究和治療。納米藥物可以有效提高抗癌藥物在生理環(huán)境中的分散性和穩(wěn)定性，延長(zhǎng)納米藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間，提高藥物在腫瘤組織中的富集。相比較于傳統(tǒng)的小分子化療藥物，納米藥物可以有效提高抗腫瘤活性，降低對(duì)正常組織的毒副作用。因此，設(shè)計(jì)有效的納米載藥體系一直是藥物控制釋放領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)。

喜樹(shù)堿(camptothecin，cpt)是一種細(xì)胞毒性喹啉類生物堿，能抑制dna拓?fù)洚悩?gòu)酶i(topoi)，在臨床前研究中具有顯著的抗腫瘤活性。但由于其自身水溶性差，生理環(huán)境下易水解失活以及嚴(yán)重的毒副作用，喜樹(shù)堿沒(méi)能在臨床試驗(yàn)中獲得成功。通過(guò)對(duì)喜樹(shù)堿改性，目前已有幾個(gè)喜樹(shù)堿類似物藥物通過(guò)了美國(guó)食品和藥物管理局(fda)批準(zhǔn)用于結(jié)腸癌的治療，如伊立替康(irinotecan)和拓?fù)涮婵?topotecan)。另一方面，這些藥物中的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)(lactoneform)在血液循環(huán)過(guò)程中容易水解成羧基結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致藥效急劇下降。因此非常有必要開(kāi)發(fā)出一種具有腫瘤選擇性釋放的納米藥物來(lái)投遞喜樹(shù)堿。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的是提供一種喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥，在水溶液中可以通過(guò)環(huán)糊精與喜樹(shù)堿之間的輸水相互作用力自組裝形成納米粒子，實(shí)現(xiàn)降低對(duì)正常組織毒性的同時(shí)提高抗腫瘤活性。

本發(fā)明的另一目的是提供制備所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供所述的前藥在制備癌癥治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

首先，本發(fā)明提供一種喜樹(shù)堿-環(huán)糊精前藥，它是喜樹(shù)堿或其衍生物和環(huán)糊精形成的超分子前藥，其結(jié)構(gòu)如式(i)所示：

其中，n1取1-3的整數(shù)，即所述的環(huán)糊精可以選用α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或者γ-環(huán)糊精的一種；

r¹為中的一種；

r²為中的一種；

r³為中的一種；

r⁴為喜樹(shù)堿或其衍生物基團(tuán)；

x為s或者-ch2-中的一種；

n2、n3和n4為重復(fù)單元數(shù)，均取0-10的整數(shù)；優(yōu)選0-5的整數(shù)；進(jìn)一步優(yōu)選0-2的整數(shù)。

本發(fā)明優(yōu)選的方案中，所述的式(i)中的r⁴來(lái)自式(ii)-式(v)所示結(jié)構(gòu)中的一種；進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自式(ii)或式(iii)所示的結(jié)構(gòu)；最優(yōu)選來(lái)自式(ii)所示的結(jié)構(gòu)：

式(ii)為喜樹(shù)堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，式(iii)為7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式，式(iv)為伊立替康的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，式(v)為拓?fù)涮婵档幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式。

本發(fā)明的方案中，所述的r¹優(yōu)選為中的一種；最優(yōu)選

本發(fā)明的方案中，所述的r²優(yōu)選為中的一種；最優(yōu)選

本發(fā)明的方案中，所述的r³最優(yōu)選

本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方案中，所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥是喜樹(shù)堿和β-環(huán)糊精形成的超分子前藥，即所述式(i)中的n1＝2；r¹為中的一種；r²為r³為r⁴為喜樹(shù)堿基團(tuán)；x為s或-ch2-；n2＝1，n3＝0，n4＝0。

本發(fā)明最優(yōu)選的所述喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥，是結(jié)構(gòu)如下式(vi)～(xiii)所示的任意一種：

本發(fā)明還提供一種制備喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥的方法，是以喜樹(shù)堿類為原料，在有機(jī)溶劑中，通過(guò)與帶有相應(yīng)基團(tuán)的原料反應(yīng)，制成喜樹(shù)堿類前藥中間體，最后所述中間體再和環(huán)糊精反應(yīng)制備得到所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥。

本發(fā)明的一種具體制備方法包括以下步驟：

1)在有機(jī)溶劑中，在?；呋瘎┐嬖谙率褂萌鈿饣罨矘?shù)堿類內(nèi)酯環(huán)上的羥基，再加入過(guò)量的2,2'-二硫代二乙醇或1,6-己二醇反應(yīng)，得到中間體醇；

2)在有機(jī)溶劑中，對(duì)步驟1)得到的中間體醇進(jìn)行活化，使中間體醇直接轉(zhuǎn)化為活化酯；

或者，

在有機(jī)溶劑中，先在催化劑存在下使用丁二酸酐將步驟1)得到的中間體醇轉(zhuǎn)化為羧酸封端的中間體酸，再在活化劑存在下對(duì)所述中間體酸進(jìn)行羰基活化得到活化酯；

3)步驟2)得到的活化酯再和環(huán)糊精衍生物在有機(jī)溶劑中混合，并加入催化劑攪拌反應(yīng)，得到所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟1)所述的有機(jī)溶劑可以選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)或二甲基甲酰胺中的任意一種；優(yōu)選二氯甲烷。步驟1)所述的酰化催化劑可以選自4-(二甲基氨基)吡啶、三乙胺或n,n-二異丙基乙胺中的任意一種；優(yōu)選4-(二甲基氨基)吡啶。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟1)所述的喜樹(shù)堿類優(yōu)選喜樹(shù)堿或7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿；最優(yōu)選喜樹(shù)堿。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟2)所述的中間體醇的活化，優(yōu)選使用羰基咪唑或炔丁酸與所述的中間體醇在二甲亞砜中反應(yīng)。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟2)所述的中間體酸的羰基活化，優(yōu)選使用n-羥基琥珀酰亞胺與所述的中間體酸在無(wú)水二氯甲烷中反應(yīng)。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟2)所述的催化劑可以選自4-(二甲基氨基)吡啶、三乙胺或n,n-二異丙基乙胺中的任意一種，優(yōu)選4-(二甲基氨基)吡啶；步驟2)所述的活化劑優(yōu)選1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟3)所述的環(huán)糊精衍生物選自α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精或它們的衍生物中的任意一種；優(yōu)選β-環(huán)糊精或其衍生物中的任意一種；進(jìn)一步優(yōu)選6-乙氨基-β-環(huán)糊精、6-丁氨基-β-環(huán)糊精、6-己氨基-β-環(huán)糊精或6-疊氮-β-環(huán)糊精中的任意一種。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟3)所述的有機(jī)溶劑選自二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中的任意一種；優(yōu)選二甲基甲酰胺；步驟3)所述的催化劑選自三乙胺、4-(二甲基氨基)吡啶或n,n-二異丙基乙胺中的任意一種，優(yōu)選三乙胺。

本發(fā)明所述制備方法優(yōu)選的一種實(shí)施方式中，制備了式(vi)、(xi)和(xii)所示的前藥，其合成路線如下：

具體包括如下步驟：在4-(二甲基氨基)吡啶的存在下，在二氯甲烷中，使用三光氣活化喜樹(shù)堿的羥基，然后與過(guò)量的2,2'-二硫代二乙醇反應(yīng)，制備得到中間體醇1；然后在無(wú)水二氯甲烷中在4-二甲氨基吡啶存在下使用丁二酸酐將中間體醇1轉(zhuǎn)化為中間體酸2；最后，在無(wú)水二氯甲烷中，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽存在下將中間體酸2用n-羥基琥珀酰亞胺活化轉(zhuǎn)化為活化酯3，再在dmf中，在三乙胺存在下，用活化酯3分別與6-乙氨基-β-環(huán)糊精4、6-丁氨基-β-環(huán)糊精11或6-己氨基-β-環(huán)糊精13攪拌反應(yīng)制備得到式(vi)、(xi)或(xii)所示的前藥，記作cd-s-s-cpt-1、15和16。

本發(fā)明所述制備方法優(yōu)選的另一種實(shí)施方式中，制備了式(vii)所示的前藥cd-c-c-cpt，其合成路線如下：

具體包括如下步驟：

在4-(二甲基氨基)吡啶的存在下，在二氯甲烷中，使用三光氣活化喜樹(shù)堿的羥基，然后與過(guò)量的1,6-己二醇反應(yīng)，制備得到中間體醇5；然后在無(wú)水二氯甲烷中在4-二甲氨基吡啶存在下使用丁二酸酐將中間體醇5轉(zhuǎn)化為中間體酸6；最后，在無(wú)水二氯甲烷中，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽存在下將中間體酸6用n-羥基琥珀酰亞胺活化轉(zhuǎn)化為活化酯7，再在dmf中，在三乙胺存在下，用活化酯7與6-乙氨基-β-環(huán)糊精4攪拌反應(yīng)制備得到式(vii)所示的前藥cd-c-c-cpt。

本發(fā)明所述制備方法優(yōu)選的再一種實(shí)施方式中，制備了式(viii)～(x)和(xiii)所示的前藥，其合成路線如下：

具體包括如下步驟：

將所述的中間體醇1溶于二甲亞砜中，分別加入羰基咪唑或炔丁酸，室溫下攪拌反應(yīng)得到活化酯9或17，所得的活化酯9或17溶于二甲亞砜中，加入6-乙氨基-β-環(huán)糊精4、6-丁氨基-β-環(huán)糊精11、6-己氨基-β-環(huán)糊精13或者6-疊氮-β-環(huán)糊精19，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，可分別得到式(viii)～(x)或(xiii)所示的前藥，記作10、13、14或20。

本發(fā)明的前藥可以直接單獨(dú)用作癌癥治療藥物，也可以進(jìn)一步制成其他藥物學(xué)上可接受的劑型用于癌癥治療。因此，本發(fā)明還提供所述喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥在藥物學(xué)上可接受的制劑。

本發(fā)明優(yōu)選的方案中，所述的制劑是含有本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥的納米顆粒制劑。

所述的納米顆粒制劑既包括所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥分子在水溶液中自組裝形成的納米顆粒，也包括所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥分子與其他聚合物一起組裝制備得到的納米顆粒。

本發(fā)明還提供所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥在制備癌癥治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明優(yōu)選的一種應(yīng)用方案中，使用高分子聚合物對(duì)本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥進(jìn)行自組裝，制備得到納米顆粒。所述的高分子聚合物選自聚乙二醇-喜樹(shù)堿、含有環(huán)糊精的嵌段聚合物或含有喜樹(shù)堿的嵌段聚合物中的任意一種。

本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，將本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥與聚乙二醇-喜樹(shù)堿或含有環(huán)糊精的嵌段聚合物以一定比例溶于水，攪拌或者超聲一定時(shí)間制得納米顆粒。

本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，將本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥分子與含有喜樹(shù)堿的嵌段聚合物以一定比例一起溶于水和丙酮的混合溶劑中，攪拌或者超聲一定時(shí)間揮發(fā)掉有機(jī)溶劑，制得納米顆粒。

本發(fā)明優(yōu)選的另一種應(yīng)用方案中，使用兩親性高分子對(duì)所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥進(jìn)行物理包裹，制備得到納米顆粒。

本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用聚乙二醇-b-聚乳酸作為藥用載體對(duì)所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥進(jìn)行物理包裹；具體是將本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥和聚乙二醇-b-聚乳酸以一定比例一起溶于有機(jī)溶劑(如四氫呋喃)，然后滴入正在攪動(dòng)或者超聲的水溶液中，然后揮發(fā)掉有機(jī)溶劑，制得納米顆粒。

本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用聚乙二醇-b-聚磷酯作為藥用載體對(duì)所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥進(jìn)行物理包裹；具體是將本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥和聚乙二醇-b-聚磷酯以一定比例一起溶于有機(jī)溶劑(如四氫呋喃)，然后滴入正在攪動(dòng)或者超聲的水溶液中，然后揮發(fā)掉有機(jī)溶劑，制得納米顆粒。

本發(fā)明的再一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯作為藥用載體對(duì)所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥進(jìn)行物理包裹；具體是將本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精前藥和聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯以一定比例一起溶于有機(jī)溶劑(如四氫呋喃)，然后滴入正在攪動(dòng)或者超聲的水溶液中，然后揮發(fā)掉有機(jī)溶劑，制得納米顆粒。

在本發(fā)明中，我們創(chuàng)新性地把喜樹(shù)堿類連接在環(huán)糊精上，制備出一種新穎的超分子化療藥物。這一藥物在水溶液中可以通過(guò)環(huán)糊精與喜樹(shù)堿之間的輸水相互作用力自組裝形成納米粒子。所述的納米粒子可以有效被腫瘤細(xì)胞攝取，并且具有載藥效率高、載藥量大的優(yōu)點(diǎn)，而且喜樹(shù)堿包結(jié)在環(huán)糊精的輸水空腔中，可以大大提高喜樹(shù)堿的水溶性，同時(shí)有效抑制喜樹(shù)堿自身的水解，這一特性可以大大提高這一超分子藥物的抗腫瘤活性。更重要的是喜樹(shù)堿和環(huán)糊精之間的二硫鍵可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(gsh)的作用下斷開(kāi)釋放出具有高抗癌活性的未經(jīng)修飾的喜樹(shù)堿，實(shí)現(xiàn)降低對(duì)正常組織毒性的同時(shí)提高抗腫瘤活性。截止目前，這一新穎的設(shè)計(jì)還未被國(guó)內(nèi)外報(bào)道，具有非常高的創(chuàng)新價(jià)值。

本發(fā)明合成的喜樹(shù)堿類-環(huán)糊精超分子化療藥物cd-s-s-cpt具有如下特點(diǎn)：

(1)有效提高喜樹(shù)堿在生理環(huán)境中的溶解度和分散性；

(2)有效提高喜樹(shù)堿在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性，防止水解；

(3)喜樹(shù)堿被化學(xué)修飾后，在二硫鍵斷裂前對(duì)細(xì)胞的毒性?。?/p>

(4)由于喜樹(shù)堿和環(huán)糊精用二硫鍵連接，因此該前藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)的還原性谷胱甘肽敏感，接觸谷胱甘肽后能迅速釋放喜樹(shù)堿；

(5)本發(fā)明合成的超分子藥物也可以很容易的被生物相容性高分子包裹制備出其他高載藥量的納米藥物；

(6)最后，前藥的合成簡(jiǎn)單，可以大批量生產(chǎn)，納米顆粒制備容易，非常有潛力用于臨床轉(zhuǎn)化。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1制備的cpt-s-s-oh的¹hnmr譜圖(300mhz，cd2cl2)。

圖2為實(shí)施例2制備的cpt-s-s-cooh的¹hnmr譜圖(300mhz,cdcl3)。

圖3為實(shí)施例3制備的cd-s-s-cpt的¹hnmr譜圖(300mhz,dmso-d6)。

圖4為實(shí)施例4制備的cpt-c-c-oh¹hnmr譜圖(300mhz，cd3cl)。

圖5為實(shí)施例5制備的cpt-c-c-cooh¹hnmr譜圖(300mhz,cdcl3)。

圖6為超分子前藥cd-s-s-cpt制備得到的納米顆粒的透射電鏡照片。

圖7為超分子前藥cd-s-s-cpt與甲基聚乙二醇-喜樹(shù)堿制備得到的納米顆粒的透射電鏡照片。

圖8為藥物從實(shí)施例3的cd-s-s-cpt納米顆粒隨時(shí)間釋放的曲線圖。

圖9為實(shí)施例3的前藥cd-s-s-cpt和喜樹(shù)堿的隨時(shí)間水解的曲線圖。

圖10為細(xì)胞毒性對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，均屬本發(fā)明保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：cpt-s-s-oh(1)的制備

室溫?cái)嚢柘?，?-二甲氨基吡啶(2.10g，17.2mmol)加入到喜樹(shù)堿(2.00g，5.74mmol)的二氯甲烷溶液中。繼續(xù)攪拌30分鐘后，緩慢加入三光氣(0.633g，2.12mmol)。攪拌1小時(shí)后，逐滴加入2,2'-二硫代二乙醇(17.2g，117mmol)，反應(yīng)液室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將混合物用飽和食鹽水(100ml)洗滌三次，分液得到的二氯甲烷有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。使用預(yù)填充的二氧化硅柱通過(guò)快速色譜分離純化產(chǎn)物。產(chǎn)量：2.12g(產(chǎn)率為70％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.46(s，1h)，8.22(d，j＝8.3hz，1h)，7.99(dd，j＝8.2,1.1hz，1h)，7.86(ddd，j＝6.9,6.5hz，1h)，7.70(ddd，j＝8.1,6.9,1.2hz，1h)，7.42(s，1h)，5.64(d，j＝18hz，1h)，5.36(m，1h)4.37(t，j＝6.0hz，2h)，3.93-3.81(m，2h)，3.03-2.82(m，4h)，2.19(tdd，j＝14.0,12.3,7.5hz，3h)1.01(t，j＝7.5hz，3h)。圖1為cpt-ss-oh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實(shí)施例2：cpt-s-s-cooh(2)的制備

在攪拌下將實(shí)施例方法1制備的cpt-s-s-oh(300mg，0.552mmol)溶于無(wú)水二氯甲烷中，分別加入丁二酸酐(1.00g，10.0mmol)和少量4-二甲氨基吡啶(21.0mg，0.172mmol),反應(yīng)液室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。溶液選干后，用水(100ml)洗滌固體三次，真空干燥得到產(chǎn)物cpt-s-s-cooh(產(chǎn)率為88％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.44(s，1h)，8.32(d，j＝8.4hz，1h)，7.95(d，j＝8.2hz，1h)，7.84(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.69(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.43(s，1h)，5.71(d，j＝17.3hz，1h)，5.39(d，j＝17.3hz，1h)，5.32(s，2h)，4.46-4.25(m，4h)，3.00-2.86(m，4h)，2.79-2.61m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計(jì)算值628.12，實(shí)測(cè)值629.10(m+h)⁺。圖2為cpt-s-s-cooh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實(shí)施例3：cd-s-s-cpt的制備

將按實(shí)施例2方法制備的cpt-s-s-cooh(628mg，1.00mmol)溶于100ml無(wú)水二氯甲烷中。分別加入n-羥基琥珀酰亞胺(0.575g，5.00mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc.hcl，1.91g，10.0mmol)，室溫下攪拌1天。有機(jī)溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去，混合物用冷凍的甲醇洗滌3次(100ml)。得到的白色固體(363mg，0.500mmol)溶于dmf中(20ml)，分別加入6-乙氨基-β-環(huán)糊精(1.18g，1.00mmol)和三滴三乙胺，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(100ml)，水洗三次(50ml)，固體抽干得到產(chǎn)品cd-s-s-cpt(產(chǎn)率74％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.45(s，1h)，8.33(d，j＝8.4hz，1h)，7.94(d，j＝8.2hz，1h)，7.85(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.71(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.43(s，1h)，5.71(d，j＝6hz，1h)，5.39(d，j＝6hz，1h)，5.32(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.83-3.68(m，28h)，3.51-3.25(m，14h),3.00-2.86(m，4h)，2.89(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計(jì)算值1787.72，實(shí)測(cè)值1788.86(m+h)⁺。圖3為cd-s-s-cpt的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實(shí)施例4：cd-c-c-oh(5)的制備

室溫?cái)嚢柘?，?-二甲氨基吡啶(2.10g，17.2mmol)加入到喜樹(shù)堿(2.00g，5.74mmol)的二氯甲烷溶液中。繼續(xù)攪拌30分鐘后，緩慢加入三光氣(0.633g，2.12mmol)。攪拌1小時(shí)后，逐滴加入1,6-己二醇(11.8g，100mmol)，反應(yīng)液室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將混合物用飽和食鹽水(100ml)洗滌三次，分液得到的二氯甲烷有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。使用預(yù)填充的二氧化硅柱通過(guò)快速色譜分離純化產(chǎn)物。產(chǎn)量：1.78g(產(chǎn)率為63％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.41(s，1h)，8.23(d，j＝8.7hz，1h)，7.95(dd，j＝8.2,1.1hz，1h)，7.85(ddd，j＝6.9,6.5hz，1h)，7.68(ddd，j＝8.1,6.9,1.2hz，1h)，7.36(s，1h)，5.70(d，j＝17.3hz，1h)，5.39(d，j＝1h)，5.30(s，2h)，4.21-4.05(m，2h)，3.59(dd，j＝10.1,6.1hz，2h)，2.43-2.01(m，2h)，1.74-1.65(m，3h)，1.59-1.47(m，2h)，1.45-1.32(m，4h)，1.00(t，j＝7.5hz，3h)。圖4為cpt-c-c-oh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實(shí)施例5：cpt-c-c-cooh(6)的制備

在攪拌下將按實(shí)施例4方法制備的cpt-c-c-oh(492mg，1.00mmol)溶于無(wú)水二氯甲烷中，分別加入丁二酸酐(1.00g，10.0mmol)和少量4-二甲氨基吡啶(21.0mg，0.172mmol),反應(yīng)液室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。溶液選干后，用水(100ml)洗滌固體三次，真空干燥得到產(chǎn)物cpt-c-c-cooh。產(chǎn)量485mg(產(chǎn)率為82％)。esi-msm/z：計(jì)算值592，實(shí)測(cè)值591(m-h)^-。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.42(s，1h)，8.28(d，j＝8.7hz，1h)，7.95(d，j＝8.3hz，1h)，7.85(ddd，j＝1h)，7.68(ddd，j＝8.1,6.9,1.1hz，1h)，7.38(d，j＝5.1hz，1h)，5.70(d，j＝17.3hz，1h),5.39(d,j＝17.3hz，1h)，5.31(s，2h)，4.23-3.99(m，4h)，2.74-2.56(m，4h)，2.37-2.07(m，2h)，1.61(ddd，j＝12.9,6.6hz，5h)，1.44-1.23(m，7h)，1.00(t，j＝7.5hz，3h)。圖5為cpt-c-c-cooh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實(shí)施例6：cd-c-c-cpt的制備

將按實(shí)施例5方法制備得到的cpt-c-c-cooh(1.18g，2.00mmol)溶于200ml無(wú)水二氯甲烷中。分別加入n-羥基琥珀酰亞胺(1.15g，10.0mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc.hcl，3.82g，20.0mmol)，室溫下攪拌1天。有機(jī)溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去，混合物用冷凍的甲醇洗滌3次(每次用量100ml)。得到的白色固體溶于dmf中(40ml)，分別加入6-乙氨基-β-環(huán)糊精(1.18g，1.00mmol)和三滴三乙胺，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(每次100ml)，水洗三次(每次20ml)，固體抽干得到產(chǎn)品cd-c-c-cpt(產(chǎn)率68％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.43(s，1h)，8.30(d，j＝8.7hz，1h)，7.93(d，j＝8.3hz，1h)，7.84(ddd，j＝1h)，7.66(ddd，j＝8.1,6.9,1.1hz，1h)，7.39(d，j＝5.1hz，1h)，5.71(d，j＝17.3hz，1h),5.40(d,j＝17.3hz，1h)，5.32(s，2h)，4.92(m，7h),4.21-4.00(m，4h)，3.85–3.64(m，28h),3.53–3.21(m，14h),2.86(t，j＝6hz，2h)，2.76-2.53(m，4h)，2.39-2.05(m，2h)，1.62(ddd，j＝12.9,6.6hz，5h)，1.45-1.22(m，7h)，1.01(t，j＝7.5hz，3h)。esi-msm/z：計(jì)算值1751.67，實(shí)測(cè)值1752.73(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

實(shí)施例7：前藥分子10，13和14的制備

將按實(shí)施例1方法制備得到的cpt-s-s-oh(528mg，1.00mmol)溶于50ml二甲亞砜中。分別加入羰基咪唑(1.62g，10.0mmol)，室溫下攪拌1天。反應(yīng)液倒入冰甲醇中，得到的白色沉淀用乙醚洗滌三次(每次50ml)。所得的產(chǎn)品溶于二甲亞砜中(40ml)，加入6-乙氨基-β-環(huán)糊精(1.18g，1.00mmol)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(每次100ml)，水洗三次(每次10ml)，固體抽干得到產(chǎn)品10(產(chǎn)率57％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.43(s，1h)，8.32(d，j＝8.4hz，1h)，7.91(d，j＝8.2hz，1h)，7.83(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.70(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.45(s，1h)，5.70(d，j＝6hz，1h)，5.38(d，j＝6hz，1h)，5.34(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.83-3.68(m，28h)，3.51-3.25(m，14h),2.89(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計(jì)算值1731.66，實(shí)測(cè)值1732.77(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

同樣的方法下，我們分別采用6-丁氨基-β-環(huán)糊精或6-己氨基-β-環(huán)糊精替代所述的6-乙氨基-β-環(huán)糊精后，可以分別制備出另外兩種超分子前藥13和14。

化合物13：¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.43(s，1h)，8.32(d，j＝8.4hz，1h)，7.91(d，j＝8.2hz，1h)，7.83(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.70(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.45(s，1h)，5.70(d，j＝6hz，1h)，5.38(d，j＝6hz，1h)，5.34(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.82-3.66(m，28h)，3.50-3.27(m，14h),2.87(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.52(m，2h),1.38(m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計(jì)算值1759.71，實(shí)測(cè)值1760.80(m+h)⁺。

化合物14：¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.43(s，1h)，8.32(d，j＝8.4hz，1h)，7.91(d，j＝8.2hz，1h)，7.83(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.70(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.45(s，1h)，5.70(d，j＝6hz，1h)，5.38(d，j＝6hz，1h)，5.34(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.82-3.66(m，28h)，3.50-3.27(m，14h),2.87(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.50(m，2h),1.36(m，2h)，1.27(m，4h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計(jì)算值1787.77，實(shí)測(cè)值1788.79(m+h)⁺。證明了制備該化合物成功。

實(shí)施例8：前藥分子15和16的制備

將按實(shí)施例2方法制備的cpt-s-s-cooh(628mg，1.00mmol)溶于100ml無(wú)水二氯甲烷中。分別加入n-羥基琥珀酰亞胺(0.575g，5.00mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc.hcl，1.91g，10.0mmol)，室溫下攪拌1天。有機(jī)溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去，混合物用冷凍的甲醇洗滌3次(100ml)。得到的白色固體(363mg，0.500mmol)溶于dmf中(20ml)，分別加入6-丁氨基-β-環(huán)糊精(2.41g，2.00mmol)和三滴三乙胺，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(100ml)，水洗三次(50ml)，固體抽干得到產(chǎn)品15(產(chǎn)率66％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.44(s，1h)，8.35(d，j＝8.4hz，1h)，7.94(d，j＝8.2hz，1h)，7.85(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.71(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.43(s，1h)，5.71(d，j＝6hz，1h)，5.40(d，j＝6hz，1h)，5.32(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.83-3.68(m，28h)，3.51-3.25(m，14h),3.00-2.86(m，4h)，2.89(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.52(m，2h),1.38(m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計(jì)算值1815.78，實(shí)測(cè)值1816.81(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

同樣的方法下，采用6-己氨基-β-環(huán)糊精替代6-丁氨基-β-環(huán)糊精后，我們可以制備出化合物16(產(chǎn)率63％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.46(s，1h)，8.33(d，j＝8.4hz，1h)，7.96(d，j＝8.2hz，1h)，7.84(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.71(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.44(s，1h)，5.71(d，j＝6hz，1h)，5.38(d，j＝6hz，1h)，5.32(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.83-3.68(m，28h)，3.51-3.25(m，14h),3.00-2.86(m，4h)，2.89(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61(m，2h)，1.54(m，2h),1.37(m，2h)，1.26(m，4h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計(jì)算值1843.83，實(shí)測(cè)值1844.90(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

實(shí)施例9：前藥分子20的制備

將按實(shí)施例1方法制備的cpt-s-s-oh(628mg，1.00mmol)溶于100ml無(wú)水二氯甲烷中。分別加入炔丁基酸(840mg，10.0mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc.hcl，3.82g，20.0mmol)，室溫下攪拌1天。有機(jī)溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去，混合物用冷凍的甲醇洗滌3次(100ml)。得到的白色固體溶于dmf中(20ml)，分別加入6-疊氮-β-環(huán)糊精(2.32g，2.00mmol)，cuso4·5h2o，(24.9mg,0.100mmol)，抗壞血酸鈉(198mg，1.00mmol)，鼓氮?dú)?0分鐘，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(100ml)，水洗三次(50ml)，固體抽干得到產(chǎn)品20(產(chǎn)率71％)。esi-msm/z：計(jì)算值1754.65，實(shí)測(cè)值1755.71(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

實(shí)施例10：超分子前藥cd-s-s-cpt制備納米顆粒

取實(shí)施例3方法制備的cd-s-s-cpt(2.00mg)溶于磷酸緩沖液中(pbs,4ml,ph＝7.4)，超聲20分鐘后得到澄清溶液。從透射電鏡照片(圖6)中可以看出cd-s-s-cpt可以自組裝形成直徑約為40nm的納米粒子。這些納米粒子的穩(wěn)定性非常高，可以在溶液中保存三個(gè)月不發(fā)生任何沉淀。同樣，按照實(shí)施例6-9的方法制備的一系列其他超分子前藥也可以自組裝后形成高穩(wěn)定性的納米粒子。

另外，本發(fā)明的方法制備的一系列超分子前藥還可以與聚合物混合使用，制備出聚合物納米顆粒。舉例來(lái)說(shuō)，取實(shí)施例3制備的cd-s-s-cpt(5.00mg)，甲基聚乙二醇-喜樹(shù)堿(25.0mg)溶于磷酸緩沖液中(pbs,12ml,ph＝7.4)，超聲30分鐘后得到澄清溶液。從透射電鏡照片(圖7)中可以看出所得的納米粒子直徑約為80nm。這些納米粒子的穩(wěn)定性非常高，可以在溶液中保存三個(gè)月不發(fā)生任何沉淀。同樣的，cd-s-s-cpt等本發(fā)明的一系列前藥分子可以與含有環(huán)糊精的嵌段聚合物或者含有喜樹(shù)堿的嵌段聚合物通過(guò)主客體相互作用制備出粒徑約為100nm的納米粒子。這些納米粒子具有很高的穩(wěn)定性，可以長(zhǎng)時(shí)間保存在pbs溶液中不發(fā)生沉淀。

實(shí)施例11：藥物釋放實(shí)驗(yàn)

通過(guò)透析法測(cè)量喜樹(shù)堿的釋放。簡(jiǎn)言之，用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)將實(shí)施例3方法制備的cd-s-s-cpt配制一定濃度的納米粒子溶液(1.00mg/ml)，然后將5ml的cd-s-s-cpt溶液轉(zhuǎn)移到預(yù)浸漬的透析袋(mwco：1kda)中，并分別用pbs溶液或者含有不同濃度的gsh溶液(1.00mm，5.00mm，10.0mm)透析48小時(shí)。通過(guò)hplc(條件：30％乙腈，含0.1％tfa，1ml/min，uv檢測(cè)器，250nm)監(jiān)測(cè)透析袋中cpt的濃度，繪制出不同條件下喜樹(shù)堿藥物分子的釋放曲線。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖8)不加gsh的條件下喜樹(shù)堿釋放非常緩慢。在gsh的存在下，喜樹(shù)堿釋放顯著加快。另一方面，隨著gsh濃度的提高，喜樹(shù)堿釋放速度也變快。這一結(jié)果證明cd-s-s-cpt可以在gsh的存在下，通過(guò)gsh與雙硫鍵反應(yīng)釋放出喜樹(shù)堿。

同樣，按照實(shí)施例7-9的方法制備的一系列其他超分子前藥也與上述cd-s-s-cpt一樣，制備成納米粒子溶液后，在gsh的存在下，具有與cd-s-s-cpt類似的喜樹(shù)堿釋放效果。

實(shí)施例12：cd-s-s-cpt和喜樹(shù)堿的水解實(shí)驗(yàn)

用20ml二甲亞砜(dmso)和ph為7.4的pbs緩沖液的混合溶液(體積比為1:1)分別溶解喜樹(shù)堿和實(shí)施例3方法制備的cd-s-s-cpt(喜樹(shù)堿濃度保持在1mg/ml)配成溶液，室溫?cái)嚢?。每隔一定時(shí)間，通過(guò)hplc(條件：30％乙腈，含0.1％tfa，1ml/min，uv檢測(cè)器，250nm)監(jiān)測(cè)喜樹(shù)堿溶液和cd-s-s-cpt溶液中喜樹(shù)堿分子內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的百分?jǐn)?shù)，繪制出不同時(shí)間下喜樹(shù)堿分子的水解曲線(圖9)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果顯示(圖9)在環(huán)糊精包結(jié)下cd-s-s-cpt中喜樹(shù)堿水解大大下降，證明了這一超分子藥物相比較于喜樹(shù)堿本身可以有效抑制藥物水解，有利于提高其藥效；本發(fā)明的其他一系列前藥分子也基于相同的原理能有效抑制藥物水解。

實(shí)施例:13：體外細(xì)胞毒性測(cè)試

將人結(jié)腸癌細(xì)胞hct116接種在96孔板的mccoy's5a培養(yǎng)基(10％胎牛血清和1％青霉素)中。將細(xì)胞在37℃下在含有5％co2的潮濕氣氛中孵育。接種后24小時(shí)用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。測(cè)試制劑選擇喜樹(shù)堿、cd-s-s-cpt和cd-c-c-cpt，將每種制劑溶解于pbs中并使用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋。對(duì)于每個(gè)孔，加入100μl具有不同指定藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)基。通過(guò)加入100μl培養(yǎng)基產(chǎn)生陰性對(duì)照。將細(xì)胞孵育48小時(shí)后，用含有0.5mg/ml3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(mtt)的100μl培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。孵育4小時(shí)后，除去含有mtt的培養(yǎng)基，用pbs小心洗滌3次。然后，加入dmso(100μl)，在bioteksynergyh4讀數(shù)器中測(cè)量在570nm的波長(zhǎng)下吸光度。使用graphpadprism5進(jìn)行ic50值的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

如圖10顯示，喜樹(shù)堿的ic50為0.14μm，cd-s-s-cpt為0.17μm，兩者對(duì)hct116細(xì)胞都具有很好的細(xì)胞毒性。證明本發(fā)明的超分子化療藥物中，cd-s-s-cpt的喜樹(shù)堿和環(huán)糊精具有很強(qiáng)的抗癌活性；cd-c-c-cpt的ic50為1.92μm，表明含有二硫鍵的前藥分子細(xì)胞毒性比非二硫鍵的高很多，說(shuō)明二硫鍵斷裂并且釋放喜樹(shù)堿是維持藥物毒性的關(guān)鍵所在。基于相同的原理，本發(fā)明的其他一系列二硫鍵連接的前藥分子也具有很強(qiáng)的抗癌活性。