本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及苯并噻唑甲酰胺類(lèi)化合物及其作為表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑應(yīng)用和制備方法。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)期以來(lái)，屬于世界性難題的腫瘤治療一直是醫(yī)藥研究領(lǐng)域面臨的一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步闡明和抗腫瘤作用靶點(diǎn)的不斷發(fā)現(xiàn)，蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,ptk)已經(jīng)成為效果顯著且前景廣闊的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)之一。

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)，是一種同時(shí)具有膜外配體受體結(jié)合域及細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性域的跨膜蛋白。egfr家族主要包括四類(lèi)成員：egfr/erbb-1、her-2/erbb-2、her-3/erbb-3和her-4/erbb-4。egfr廣泛分布在哺乳類(lèi)動(dòng)物的上皮細(xì)胞膜，其基因定位于7號(hào)染色體p12-p14區(qū)段，是一種由1186個(gè)氨基酸所組成的相對(duì)分子量約為170kd的跨膜糖蛋白。它包括：由621個(gè)氨基酸殘基組成的n端胞外區(qū)(ecd)，具有配體結(jié)合位點(diǎn)，細(xì)分為i、ii、iii、iv四個(gè)亞區(qū)；由23個(gè)氨基酸殘基組成的具有α螺旋結(jié)構(gòu)的跨膜區(qū)(tm)，其通過(guò)一個(gè)脯氨酸與胞外區(qū)相連；由542個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的c端胞內(nèi)區(qū)，具有一個(gè)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，包含近膜區(qū)(jm)、酪氨酸激酶區(qū)(tk)、c-末端等三個(gè)亞區(qū)。

egfr信號(hào)通路包括配體誘導(dǎo)胞外區(qū)構(gòu)象變化、跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞內(nèi)區(qū)形成激酶活性與下游信號(hào)激活、信號(hào)滅活四部分。配體與egfr結(jié)合后形成二聚體，同時(shí)結(jié)合1個(gè)atp分子，促使胞內(nèi)域相互作用形成激酶活性，并完成胞內(nèi)域酪氨酸殘基的磷酸化。egfr二聚體化和磷酸化后，激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)并成為親和位點(diǎn)，與多種參與有絲分裂的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子發(fā)生高親和作用。這些系統(tǒng)將有絲分裂信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而有效調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)及細(xì)胞增殖、存活、黏附、遷移和分化等。

目前大量的研究表明，人類(lèi)許多實(shí)體腫瘤與egfr和/或其一級(jí)配體中的任一個(gè)過(guò)度表達(dá)或行為失調(diào)密切相關(guān)。sebastian等報(bào)道了egfr信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與腫瘤的關(guān)系，研究結(jié)果表明，至少有33％-50％的人類(lèi)表皮腫瘤與egfr相關(guān)，它是表皮腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。egfr在多種腫瘤細(xì)胞中均存在高表達(dá)現(xiàn)象，頭頸癌中為90％-95％，子宮頸癌中為90％，乳腺癌中為82％-90％，腎癌中為76％-89％，食道癌中為43％-89％。而在卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞中，egfr同樣呈現(xiàn)高水平表達(dá)現(xiàn)象。由于egfr及其配體在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，針對(duì)egfr的抗腫瘤治療成為近年來(lái)腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。

目前，表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermalgrowthfactorreceptor-tyrosinekinaseinhibitors,egfr-tki)主要分為兩大類(lèi)：(1)egfr單克隆抗體，代表藥物有西妥昔單抗、帕尼單抗等；(2)小分子egfr-tki，代表藥物有吉非替尼、阿法替尼等。

egfr-tki類(lèi)藥物，尤其是以吉非替尼和阿法替尼等為代表的小分子egfr-tki靶向治療藥物，在人類(lèi)腫瘤治療領(lǐng)域應(yīng)用已經(jīng)取得了顯著成果。然而，該類(lèi)藥物的研制與開(kāi)發(fā)也面臨著諸多挑戰(zhàn)：由于腫瘤細(xì)胞基因突變而造成的耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重；多靶點(diǎn)抑制作用和高選擇性抑制作用之間應(yīng)該尋求平衡；在臨床前實(shí)驗(yàn)中準(zhǔn)確預(yù)測(cè)化合物毒性、藥動(dòng)學(xué)特征等。這些問(wèn)題亟待科學(xué)家去解決，從而提高新藥研發(fā)效率和避免浪費(fèi)資源。因此，研制高效低毒、結(jié)構(gòu)新穎的小分子egfr-tki具有重大理論意義和實(shí)際意義。

本發(fā)明所述化合物作為全新結(jié)構(gòu)類(lèi)型的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，具有結(jié)構(gòu)類(lèi)型新穎，藥效作用與現(xiàn)有藥物相當(dāng)或優(yōu)于現(xiàn)有藥物的特點(diǎn)，可用于治療或預(yù)防與表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)引起的相關(guān)疾病如小細(xì)胞肺癌，鱗癌，腺癌，大細(xì)胞癌，結(jié)腸直腸癌、乳腺癌，卵巢癌，腎細(xì)胞癌，具有良好的應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種如式i所示的化合物、其前體藥物和藥物活性代謝物以及其藥學(xué)上可接受的鹽，并提供了其在制備預(yù)防和治療egfr信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。

其中

r1、r2可以獨(dú)立地選自h，c1-c4烷基，芐基或取代芐基，取代或未取代的c1-c4烷氧基苯基；或r1、r2與它們相連的氮原子一起組成5-6元芳基或雜環(huán)基，所述雜環(huán)基除了所連接的氮原子外，還可以含有1-3個(gè)n、o或s的雜原子；所述取代基為c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、鹵素；

ar可以獨(dú)立地選自取代或未取代的5-6元芳基，取代或未取代的c1-c4烷氧基苯基，取代或未取代的芐基，所述取代基為c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、鹵素；

本發(fā)明優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)的化合物、其前體藥物和藥物活性代謝物以及其藥學(xué)上可接受的鹽，

r1、r2可以獨(dú)立地選自h，c1-c4烷基，芐基或取代芐基，取代或未取代的c1-c4烷氧基苯基；或r1、r2與它們相連的氮原子一起組成6元芳基或雜環(huán)基，所述雜環(huán)基除了所連接的氮原子外，還可以含有1個(gè)o原子；所述取代基為c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、鹵素；

ar可以獨(dú)立地選自取代或未取代的5-6元芳基，取代或未取代的c1-c4烷氧基苯基，取代或未取代的芐基；

本發(fā)明優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，

r1、r2可以獨(dú)立地選自h，c1-c4烷基；或與它們相連的氮原子一起組成1-哌啶基，1-吡咯烷基，4-嗎啉基，2-(4-嗎啉基)乙基，3-(4-嗎啉基)丙基，芐胺基或取代芐胺基，苯胺基或取代苯胺基，或2-(2-甲氧基苯氧基)乙胺；

ar可以獨(dú)立地選自取代或未取代的5-6元芳基，取代或未取代的c1-c4烷氧基苯基，取代或未取代的芐基；

本發(fā)明優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，

r1、r2可以獨(dú)立地選自h，c1-c4烷基；或與它們相連的氮原子一起組成1-哌啶基，1-吡咯烷基，4-嗎啉基，2-(4-嗎啉基)乙基，3-(4-嗎啉基)丙基，芐胺基或取代芐胺基，苯胺基或取代苯胺基，或2-(2-甲氧基苯氧基)乙胺；

ar可以獨(dú)立地自苯基或取代苯基，呋喃基，芐基或取代芐基，苯氧甲基或取代苯氧甲基，或取代氨基烷基。

本發(fā)明優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，

r1、r2可以獨(dú)立地選自h，c1-c4烷基；或與它們相連的氮原子一起組成1-哌啶基，1-吡咯烷基，4-嗎啉基，2-(4-嗎啉基)乙基，3-(4-嗎啉基)丙基，芐胺基，苯胺基，4-氟苯胺基，4-氯苯胺基，4-甲基苯胺基，4-甲氧基苯胺基，或2-(2-甲氧基苯氧基)乙胺；

ar可以獨(dú)立地選自苯基、4-氟苯基，4-氯苯基，4-甲基苯基，4-甲氧基苯基，2-呋喃基，(2-甲氧基苯氧基)甲基，3,4-二甲氧基芐基，(4-嗎啉基)甲基，或2-(4-嗎啉基)乙基。

“藥物可接受的鹽”指保留了式i化合物的生物效力和性質(zhì)，并與合適的非毒性有機(jī)或無(wú)機(jī)酸或有機(jī)或無(wú)機(jī)堿形成的常規(guī)酸加成鹽或堿加成鹽。酸加成鹽的實(shí)例包括醋酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，檸檬酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊丙酸鹽，二葡萄糖酸鹽，十二烷基硫酸鹽，乙磺酸鹽，富馬酸鹽，葡庚糖酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，氫氯酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基乙磺酸鹽，乳酸鹽，馬來(lái)酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，硝酸鹽，草酸鹽，撲酸鹽，果膠酯酸鹽，過(guò)硫酸鹽，3-苯基丙酸鹽，苦味酸鹽，新戊酸鹽，丙酸鹽，琥珀酸鹽，硫酸鹽，酒石酸鹽，硫氰酸鹽，甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。堿鹽包括銨鹽，堿金屬鹽，例如鈉和鉀鹽，堿土金屬鹽，例如鈣和鎂鹽，有機(jī)堿的鹽，例如二環(huán)己胺鹽，n-甲基-d-葡糖胺鹽，和氨基酸的鹽，例如精氨酸，賴(lài)氨酸等，而且，堿性含氮基團(tuán)可以用這樣的試劑季銨化，例如低級(jí)烷基鹵化物，如甲基，乙基，丙基和丁基的氯，溴和碘化物；硫酸二烷基酯，如硫酸二甲酯，二乙酯，二丁酯和二戊酯；長(zhǎng)鏈鹵化物，如癸基，月桂基，肉豆蔻基和硬脂?；穆龋搴偷饣?；芳烷基鹵化物，如芐基和苯乙基的溴化物等。優(yōu)選用于生成酸加成鹽的酸包括鹽酸和醋酸。

“藥學(xué)上可接受的”如藥學(xué)上可接受的載體、賦型劑、前體藥物等，指藥理學(xué)上可接受的、并對(duì)給藥具體化合物的患者基本上無(wú)毒性。

“藥學(xué)活性代謝物”指藥學(xué)上可接受并有效的式i化合物的代謝產(chǎn)物。

本發(fā)明也涉及抑制表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的藥用組合物，該組合物含有式i化合物或衍生物或其藥學(xué)上適用的酸加成鹽以及藥學(xué)上適用的載體。

本發(fā)明化合物可以通過(guò)不同的方法給患者服用，例如以膠囊劑或片劑口服，以無(wú)菌溶液劑或混懸劑給藥，并且在某些情況下，可以以溶液劑形式靜脈注射?？梢詫⒈景l(fā)明的游離堿化合物以其藥學(xué)上適用的酸加成鹽形式進(jìn)行配制和服用。

具體實(shí)施方式

如下反應(yīng)流程概括了制備本發(fā)明化合物的合成步驟。

以下述實(shí)例詳細(xì)敘述本發(fā)明。但是，應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明不限于具體敘述的下述實(shí)例。

實(shí)施例1n-芐基-6-(2-二乙胺基-2-氧代乙氧基)苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl01)的合成

步驟a：l-半胱氨酸乙酯鹽酸鹽的合成

將l-半胱氨酸(24.20g,0.20mol)與乙醇300ml置于500ml茄形瓶中，冰水浴條件下緩慢滴加氯化亞砜(22ml,0.30mol)，滴加完畢后室溫條件下繼續(xù)反應(yīng)3h，加熱回流反應(yīng)12h。反應(yīng)液涼至室溫，蒸除溶劑得白色粉末36.42g，收率98.1％。

步驟b：s-(2,5-二羥基苯基)半胱氨酸乙酯的合成

將l-半胱氨酸乙酯鹽酸鹽(22.28g,0.12mol)和甲醇60ml置于1000ml茄形瓶中，攪拌使其溶解。冰水浴條件下滴加對(duì)苯醌(6.48g,0.060mol)和甲醇150ml配制的溶液，滴加完畢后室溫條件下繼續(xù)反應(yīng)3h，蒸除溶劑得產(chǎn)物粗品13.81g，收率89.6％，未經(jīng)純化，直接用于下一步反應(yīng)。

步驟c：6-羥基苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯的合成

將上步制得的s-(2,5-二羥基苯基)半胱氨酸乙酯粗品(13.81g,0.054mol)和異丙醇360ml置于1000ml茄形瓶中，攪拌下依次滴加1mk3fe(cn)6水溶液300ml和4mnaoh水溶液20ml，滴加完畢后室溫條件下繼續(xù)反應(yīng)14h。反應(yīng)液抽濾，濾液以乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后蒸除反應(yīng)溶劑，所得棕色油狀物經(jīng)硅膠柱層析分離(v(石油醚):v(乙酸乙酯)＝3:1)得到黃色粉末6.41g，收率53.4％,m.p.:176-177℃(lit.:178-180℃)；esi-ms,m/z:calcd.223.03(m⁺)；found224.1([m+h]⁺),246.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ7.98(d,j＝9.0hz,1h),7.39(d,j＝2.3hz,1h),7.12(dd,j＝9.0,2.4hz,1h),4.46(q,j＝7.0hz,2h),1.41(t,j＝7.1hz,3h)。

步驟d：6-(2-取代胺基-2-氧代乙氧基)苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯的合成

合成通法：將氯乙酰基取代胺0.020mol、6-羥基苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯(2.23g,0.010mol)、無(wú)水碳酸鉀(13.81g,0.10mol)、碘化鉀(0.16g,0.0010mol)及丙酮50ml置于100ml茄形瓶中，加熱回流反應(yīng)16h，反應(yīng)液趁熱濾除碳酸鉀，蒸除溶劑得產(chǎn)物粗品，乙醇重結(jié)晶。

(1)6-(2-二乙胺基-2-氧代乙氧基)苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯的合成

按照合成通法，得到白色固體3.32g，收率98.8％,m.p.:139-140℃；esi-ms,m/z:calcd.336.11(m⁺)；found337.1([m+h]⁺),359.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.10(d,j＝9.1hz,1h),7.72(d,j＝2.5hz,1h),7.25(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),4.93(s,2h),4.42(q,j＝7.1hz,2h),3.30(q,j＝7.0hz,4h),1.36(t,j＝7.1hz,3h),1.17(t,j＝7.1hz,3h),1.11(t,j＝7.1hz,3h)。

(2)6-[2-(1-哌啶基)-2-氧代乙氧基]苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯的合成

按照合成通法，得到黃色固體3.01g，收率86.5％,m.p.:87-89℃；esi-ms,m/z:calcd.348.11(m⁺)；found349.1([m+h]⁺),371.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.11(d,j＝9.1hz,1h),7.44(d,j＝2.5hz,1h),7.22(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),4.79(s,2h),4.53(q,j＝7.1hz,2h),3.56(t,j＝5.1hz,2h),3.54(t,j＝5.1hz,2h),1.65–1.61(m,6h),1.47(t,j＝7.1hz,3h)。

(3)6-[2-(4-嗎啉基)-2-氧代乙氧基]苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯的合成

按照合成通法，得到黃色固體2.92g，收率83.4％,m.p.:181-183℃；esi-ms,m/z:calcd.350.09(m⁺)；found351.1([m+h]⁺),373.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.10(d,j＝9.0hz,1h),7.43(d,j＝2.3hz,1h),7.22(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),4.64(s,2h),4.57(q,j＝7.0hz,2h),3.68–3.59(m,8h),1.47(t,j＝7.1hz,3h)。

(4)6-(2-芐基-2-氧代乙氧基)苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯的合成

按照合成通法，得到黃色固體3.64g，收率98.4％,m.p.:152-154℃；esi-ms,m/z:calcd.370.10(m⁺)；found371.1([m+h]⁺),393.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.14(d,j＝9.1hz,1h),7.39(d,j＝2.4hz,1h),7.36–7.33(m,5h),7.19(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),4.64(s,2h),4.55–4.54(m,4h),1.48(t,j＝7.1hz,3h)。

(5)6-[2-(4-氟芐基)-2-氧代乙氧基]苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯的合成

按照合成通法，得到黃色固體2.81g，收率72.4％,m.p.:141-143℃；esi-ms,m/z:calcd.388.09(m⁺)；found389.1([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.15(d,j＝9.1hz,1h),7.39(d,j＝2.5hz,1h),7.27–7.24(m,2h),7.20(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),7.05–7.02(m,2h),4.65(s,2h),4.56–4.53(m,4h),1.49(t,j＝7.1hz,3h)。

(6)6-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙氧基]苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯的合成

按照合成通法，得到黃色固體3.83g，收率89.1％,m.p.:151-152℃；esi-ms,m/z:calcd.430.12(m⁺)；found431.1([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.34(d,j＝9.0hz,1h),6.96(d,j＝2.7hz,1h),6.91(dd,j＝9.0,2.7hz,1h),6.91–6.82(m,4h),4.43(s,2h),4.12(t,j＝5.0hz,2h),3.83(s,3h),3.75(t,j＝5.4hz,2h),3.48-3.41(m,2h),1.72(t,j＝7.2hz,3h)。

步驟e：n-芐基-6-(2-二乙胺基-2-氧代乙氧基)苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl01)的合成

將6-(2-取代胺基-2-氧代乙氧基)苯并[d]噻唑-2-甲酸乙酯0.030mol、芐胺(0.96g,0.0090mol)及乙醇20ml置于100ml茄形瓶中，加熱回流反應(yīng)12h，反應(yīng)液涼至室溫并將其傾入250ml水中，攪拌1h，抽濾得黃色固體，經(jīng)硅膠柱層析分離(v(石油醚):v(乙酸乙酯)＝1:1)得到白色粉末0.64g，收率：53.8％。m.p.:146-148℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3422.8,3347.7,2932.2,1665.3,1632.0,1523.6,1554.6,1259.9,1213.0,1060.2,1030.6,945.7,827.4,699.0；esi-ms,m/z:calcd.397.15(m⁺)；found398.1([m+h]⁺),420.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.90(d,j＝9.0hz,1h),7.39–7.35(m,5h),7.32(d,j＝2.0hz,1h),7.21(dd,j＝9.1,2.1hz,1h),4.77(s,2h),4.68(d,j＝5.8hz,2h),3.41(q,j＝7.1hz,4h),1.24(t,j＝7.0hz,3h),1.15(t,j＝7.1hz,3h)。

實(shí)施例2：n-芐基-6-[2-(1-哌啶基)-2-氧代乙氧基]苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl02)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到粉色固體0.92g，收率：74.8％。m.p.:198-199℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3429.8,2921.8,2852.9,1649.8,1521.6,1495.8,1384.4,1249.8,1216.9,1122.7,1085.8,956.0,829.1,730.0,694.4；esi-ms,m/z:calcd.409.15(m⁺)；found410.1([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.91(d,j＝9.0hz,1h),7.45(d,j＝2.5hz,1h),7.40–7.34(m,5h),7.21(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),4.78(s,2h),4.68(d,j＝6.0hz,2h),3.59(t,j＝5.1hz,2h),3.48(t,j＝5.1hz,2h),1.68–1.55(m,6h)。

實(shí)施例3：n-芐基-6-[2-(4-嗎啉基)-2-氧代乙氧基]苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl03)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.77g，收率：62.6％。m.p.:186-188℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3421.4,3277.0,2923.5,2845.7,1666.0,1637.9,1496.5,1436.6,1359.1,1253.8,1210.2,1114.7,1001.5,838.4,827.6,697.5；esi-ms,m/z:calcd.411.13(m⁺)；found412.1([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.92(d,j＝9.0hz,1h),7.45(d,j＝2.3hz,1h),7.38–7.34(m,5h),7.19(dd,j＝9.0,2.4hz,1h),4.79(s,2h),4.68(d,j＝6.0hz,2h),3.67–3.65(m,8h)。

實(shí)施例4：n-芐基-6-{2-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙胺基]-2-氧代乙氧基}苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl04)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.81g，收率：55.1％。m.p.:139-141℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3438.8,2920.5,1651.4,1548.3,1508.0,1384.2,1254.4,1227.3,1124.3,1071.8,1022.1,824.6,735.9,698.6；esi-ms,m/z:calcd.491.15(m⁺)；found492.2([m+h]⁺),514.2([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.92(d,j＝9.0hz,1h),7.40(d,j＝2.5hz,1h),7.39–7.35(m,5h),7.17(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),6.89–6.86(m,4h),4.69(d,j＝6.0hz,2h),4.60(s,2h),4.13(t,j＝5.0hz,2h),3.82(s,3h),3.78-3.73(m,2h)。

實(shí)施例5：6-(2-二乙胺基-2-氧代乙氧基)-n-(4-氟芐基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl05)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到黃色固體0.59g，收率：47.2％。m.p.:152-153℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3425.9,3349.2,2935.9,1665.7,1630.7,1511.6,1437.9,1384.3,1259.4,1211.8,1162.2,1059.4,1035.2,947.4,829.1,765.7,645.5；esi-ms,m/z:calcd.415.14(m⁺)；found416.1([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.90(d,j＝9.0hz,1h),7.43(d,j＝1.7hz,1h),7.35(dd,j＝8.6,5.4hz,2h),7.21(dd,j＝9.1,1.8hz,1h),7.04(t,j＝8.0hz,2h),4.77(s,2h),4.64(d,j＝5.9hz,2h),3.42(q,j＝7.2hz,4h),1.24(t,j＝6.7hz,3h),1.15(t,j＝7.1hz,3h)。

實(shí)施例6：6-[2-(1-哌啶基)-2-氧代乙氧基]-n-(4-氟芐基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl06)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.84g，收率：65.6％。m.p.:151-153℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3422.8,3333.9,2919.3,2850.6,1656.0,1508.8,1431.0,1250.9,1215.5,1085.2,1006.0,847.0,825.1,753.5,673.2；esi-ms,m/z:calcd.427.14(m⁺)；found428.1([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.91(d,j＝9.0hz,1h),7.45(d,j＝2.5hz,1h),7.36(dd,j＝8.6,5.4hz,2h),7.21(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),7.04(t,j＝8.7hz,2h),4.78(s,2h),4.64(d,j＝6.0hz,2h),3.59(t,j＝5.0hz,2h),3.48(t,j＝5.1hz,2h),1.60–1.55(m,6h)。

實(shí)施例7：6-[2-(4-嗎啉基)-2-氧代乙氧基]-n-(4-氟芐基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl07)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.51g，收率：39.5％。m.p.:184-185℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3422.6,2928.2,2851.6,1671.2,1635.5,1509.9,1440.0,1384.4,1227.2,1206.4,1117.5,1001.0,951.5,825.0,767.0,708.8；esi-ms,m/z:calcd.429.12(m⁺)；found430.1([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.91(d,j＝9.0hz,1h),7.45(d,j＝2.4hz,1h),7.35(dd,j＝8.5,5.4hz,2h),7.18(dd,j＝9.0,2.4hz,1h),7.03(t,j＝8.6hz,2h),4.79(s,2h),4.63(d,j＝6.1hz,2h),3.69–3.60(m,8h)。

實(shí)施例8：6-{2-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙胺基]-2-氧代乙氧基}-n-(4-氟芐基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl08)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.72g，收率：47.1％。m.p.:144-146℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3422.7,2921.1,1651.1,1509.7,1384.3,1254.8,1225.5,1124.0,1072.0,1024.0,825.6,735.7,699.8；esi-ms,m/z:calcd.509.14(m⁺)；found510.1([m+h]⁺),532.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.92(d,j＝9.0hz,1h),7.41(d,j＝2.1hz,1h),7.36(dd,j＝8.6,5.4hz,2h),7.18(dd,j＝9.0,2.2hz,1h),7.05(t,j＝8.6hz,2h),6.91–6.85(m,4h),4.65(d,j＝6.0hz,2h),4.60(s,2h),4.13(t,j＝4.9hz,2h),3.82(s,3h),3.78–3.71(m,2h)。

實(shí)施例9：6-(2-二乙胺基-2-氧代乙氧基)-n-(呋喃-2-甲基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl09)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到黃色固體0.41g，收率：35.3％。m.p.:144-146℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3381.3,2919.1,1677.9,1660.8,1535.7,1490.4,1223.9,1076.7,1010.9,967.0,940.8,837.4,816.4,738.8,618.8；esi-ms,m/z:calcd.387.13(m⁺)；found388.1([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.92(d,j＝8.8hz,1h),7.64(d,j＝2.3hz,1h),7.39(d,j＝8.7hz,1h),7.21(dd,j＝8.9,2.4hz,1h),6.36–6.30(m,2h),4.77(s,2h),4.67(d,j＝5.1hz,2h),3.41(q,j＝7.1hz,4h),1.23(t,j＝7.0hz,3h),1.14(t,j＝6.7hz,3h)。

實(shí)施例10：6-[2-(1-哌啶基)-2-氧代乙氧基]-n-(呋喃-2-甲基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl10)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.81g，收率：67.5％。m.p.:196-198℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3426.6,2927.1,2853.3,1653.1,1529.7,1498.4,1384.4,1251.5,1221.3,1127.3,1084.8,1008.4,962.8,829.1,753.0；esi-ms,m/z:calcd.399.13(m⁺)；found400.1([m+h]⁺),422.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.93(d,j＝9.0hz,1h),7.44(d,j＝2.5hz,1h),7.39(d,j＝8.7hz,1h),7.21(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),6.35–6.33(m,2h),4.78(s,2h),4.67(d,j＝5.9hz,2h),3.58(t,j＝5.1hz,2h),3.43(t,j＝5.1hz,2h),1.68–1.63(m,6h)。

實(shí)施例11：6-[2-(4-嗎啉基)-2-氧代乙氧基]-n-(呋喃-2-甲基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl11)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.72g，收率：60.0％。m.p.:188-190℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3422.6,2919.0,2850.2,1640.8,1497.3,1384.1,1255.3,1208.7,1112.1,1000.6,828.3,745.0；esi-ms,m/z:calcd.401.10(m⁺)；found402.1([m+h]⁺),424.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.94(d,j＝9.0hz,1h),7.45(d,j＝2.5hz,1h),7.39(d,j＝8.5hz,1h),7.19(dd,j＝9.1,2.6hz,1h),6.35–6.33(m,2h),4.79(s,2h),4.67(d,j＝5.9hz,2h),3.69–3.65(m,8h)。

實(shí)施例12：6-(2-芐胺基-2-氧代乙氧基)-n-(呋喃-2-甲基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl12)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.79g，收率：62.7％。m.p.:166-168℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3413.3,2921.4,1659.0,1530.7,1442.6,1384.2,1226.0,1069.5,1006.6,969.4,917.1,834.0,731.7,698.0；esi-ms,m/z:calcd.421.11(m⁺)；found422.1([m+h]⁺),444.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.95(d,j＝9.0hz,1h),7.40(d,1h),7.34(d,j＝7.9hz,1h),7.31–7.27(m,5h),7.16(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),6.36–6.33(m,2h),4.68(d,j＝5.9hz,2h),4.64(s,2h),4.56(d,j＝5.9hz,2h)。

實(shí)施例13：6-[2-(4-氟芐基)-2-氧代乙氧基]-n-(呋喃-2-甲基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl13)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.76g，收率：57.6％。m.p.:185-186℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3421.8,2919.1,1656.9,1640.5,1533.2,1509.5,1384.2,1222.2,1065.6,1014.3,870.6,844.2,827.4,744.0；esi-ms,m/z:calcd.439.10(m⁺)；found440.1([m+h]⁺),462.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.95(d,j＝9.0hz,1h),7.40(dd,j＝1.7hz,1h),7.26–7.24(m,3h),7.16(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),7.01(t,j＝8.7hz,2h),6.36–6.33(m,2h),4.68(d,j＝5.9hz,2h),4.63(s,2h),4.53(d,j＝6.0hz,2h)。

實(shí)施例14：6-{2-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙胺基]-2-氧代乙氧基}-n-(呋喃-2-甲基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl14)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.81g，收率：56.3％。m.p.:144-146℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3444.9,2921.7,1664.9,1646.6,1527.5,1509.1,1384.4,1257.4,1225.5,1122.7,1070.7,1018.2,847.2,821.9,742.5；esi-ms,m/z:calcd.481.13(m⁺)；found482.2([m+h]⁺),504.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.93(d,j＝9.0hz,1h),7.40(d,j＝2.7hz,1h),7.39(d,j＝8.7hz,1h),7.18(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),6.89–6.85(m,4h),6.36–6.34(m,2h),4.68(d,j＝5.9hz,2h),4.60(s,2h),4.12(t,j＝5.0hz,2h),3.82(s,2h),3.77–3.68(m,2h)。

實(shí)施例15：6-(2-二乙胺基-2-氧代乙氧基)-n-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙基]-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl15)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.86g，收率：62.8％。m.p.:141-143℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3435.5,2965.8,1688.8,1651.5,1533.8,1454.8,1257.7,1218.4,1124.3,1077.6,1026.7,826.2,799.0,730.4；esi-ms,m/z:calcd.457.17(m⁺)；found458.2([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.95(d,j＝9.0hz,1h),7.43(d,j＝2.4hz,1h),7.22(dd,j＝9.0,2.4hz,1h),6.99–6.93(m,4h),4.77(s,2h),4.23(t,j＝5.1hz,2h),3.93(s,3h),3.88(dd,j＝10.7,5.4hz,2h),3.44–3.40(m,4h),1.24(t,j＝7.0hz,3h),1.15(t,j＝7.1hz,3h)。

實(shí)施例16：6-[2-(1-哌啶基)-2-氧代乙氧基]-n-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙基]-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl16)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.68g，收率：48.2％。m.p.:136-137℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3460.5,2936.4,2856.6,1651.0,1529.1,1507.8,1439.8,1252.5,1218.1,1123.7,1086.8,865.5,752.5；esi-ms,m/z:calcd.469.17(m⁺)；found470.2([m+h]⁺),492.2([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.95(d,j＝9.0hz,1h),7.44(d,j＝2.5hz,1h),7.21(dd,j＝9.0,2.3hz,1h),7.00–6.93(m,4h),4.78(s,2h),4.23(t,j＝5.2hz,2h),3.93(s,3h),3.88(dd,j＝10.8,5.4hz,2h),3.58–3.49(m,6h),1.67–1.61(m,6h)。

實(shí)施例17：6-[2-(4-嗎啉基)-2-氧代乙氧基]-n-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙基]-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl17)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.87g，收率：61.7％。m.p.:193-194℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3423.4,2920.1,1677.1,1657.8,1527.9,1507.4,1433.1,1254.5,1217.8,1121.8,1030.8,864.2,797.9,748.4,702.9；esi-ms,m/z:calcd.471.15(m⁺)；found472.1([m+h]⁺),494.2([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.96(d,j＝9.0hz,1h),7.45(d,j＝2.5hz,1h),7.20(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),6.99–6.92(m,4h),4.79(s,2h),4.23(q,j＝5.0hz,2h),3.92(s,3h),3.90–3.86(m,2h),3.69–3.61(m,8h)。

實(shí)施例18：6-(2-芐胺基-2-氧代乙氧基)-n-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙基]-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl18)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.94g，收率：63.9％。m.p.:176-178℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3428.6,3306.5,2923.9,1692.5,1651.7,1536.2,1500.3,1435.4,1384.4,1253.1,1226.2,1117.3,1028.3,856.4,836.7,753.4,701.3；esi-ms,m/z:calcd.491.15(m⁺)；found492.2([m+h]⁺),514.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.97(d,j＝9.0hz,1h),7.41(d,j＝2.5hz,1h),7.35–7.27(m,5h),7.16(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),7.01–6.93(m,4h),4.64(s,2h),4.57(d,j＝5.9hz,2h),4.24(t,j＝5.1hz,2h),3.93(s,3h),3.88(dd,j＝10.7,5.5hz,2h)。

實(shí)施例19：6-[2-(4-氟芐基)-2-氧代乙氧基]-n-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙基]-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl19)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.56g，收率：36.6％。m.p.:147-149℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3420.4,2919.9,1656.1,1535.0,1508.3,1384.0,1254.9,1219.2,1123.2,1079.8,1021.8,843.1,743.9；esi-ms,m/z:calcd.509.14(m⁺)；found510.1([m+h]⁺),532.1([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.96(d,j＝9.0hz,1h),7.39(d,j＝2.5hz,1h),7.26–7.23(m,2h),7.15(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),7.03–7.00(m,2h),6.98–6.91(m,4h),4.63(s,2h),4.52(d,j＝6.0hz,2h),4.23(t,j＝5.1hz,2h),3.92(s,3h),3.88(dd,j＝10.4,5.2hz,2h)。

實(shí)施例20：6-(2-二乙胺基-2-氧代乙氧基)-n-(3,4-二甲氧基苯乙基)-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl20)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到粉色固體0.61g，收率：43.3％。m.p.:169-170℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3323.3,2927.1,1657.7,1543.7,1515.5,1430.7,1262.7,1236.2,1137.7,1076.7,1025.2,861.7,819.6,767.1,700.3；esi-ms,m/z:calcd.471.18(m⁺)；found472.2([m+h]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.91(d,j＝9.0hz,1h),7.43(d,j＝2.4hz,1h),7.21(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),6.84(d,j＝8.0hz,1h),6.80(d,j＝1.8hz,1h),6.78(t,j＝1.7hz,1h),4.77(s,2h),3.87(s,3h),3.86(s,3h),3.72(dd,j＝13.4,6.9hz,2h),3.46–3.38(m,4h),2.91(t,j＝7.1hz,2h),1.24(t,j＝7.0hz,3h),1.15(t,j＝7.1hz,3h)。

實(shí)施例21：6-(2-二乙胺基-2-氧代乙氧基)-n-[3-(4-嗎啉基)丙基]-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl21)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到黃色固體0.81g，收率：62.3％。m.p.:70-72℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3423.5,2923.4,2853.0,1666.2,1526.9,1460.9,1383.8,1256.9,1221.6,1113.1,1075.8,856.5,810.4,738.5；esi-ms,m/z:calcd.434.20(m⁺)；found435.2([m+h]⁺),457.2([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.95(d,j＝9.0hz,1h),7.44(d,j＝2.5hz,1h),7.21(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),4.77(s,2h),3.92(t,j＝4.3hz,4h),3.62(dd,j＝11.8,5.7hz,2h),3.46–3.37(m,4h),2.64–2.55(m,6h),1.88–1.81(m,2h),1.24(t,j＝7.1hz,3h),1.15(t,j＝7.1hz,3h)。

實(shí)施例22：6-(2-芐胺基-2-氧代乙氧基)-n-[3-(4-嗎啉基)丙基]-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl22)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.73g，收率：52.1％。m.p.:172-174℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3422.3,2920.8,2806.2,1664.5,1528.0,1441.2,1384.4,1253.2,1225.8,1115.3,1071.8,987.7,930.0,833.0,742.2；esi-ms,m/z:calcd.468.18(m⁺)；found469.2([m+h]⁺),491.3([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.97(d,j＝9.0hz,1h),7.40(d,j＝2.5hz,1h),7.34–7.28(m,5h),7.16(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),4.64(s,2h),4.57(d,j＝6.0hz,2h),3.92(t,j＝4.0hz,4h),3.62(dd,j＝11.6,5.6hz,2h),2.68–2.53(m,6h),1.89–1.83(m,2h)。

實(shí)施例23：6-[2-(4-氟芐基)-2-氧代乙氧基]-n-[3-(4-嗎啉基)丙基]-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl23)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.82g，收率：56.2％。m.p.:160-161℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3330.3,2924.7,2855.1,1699.6,1653.9,1545.0,1510.2,1435.5,1254.6,1223.4,1115.4,1068.1,986.4,849.5,814.2,770.3；esi-ms,m/z:calcd.486.17(m⁺)；found487.3([m+h]⁺),509.2([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.96(d,j＝9.0hz,1h),7.40(d,j＝2.5hz,1h),7.25–7.23(m,2h),7.15(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),7.02–6.99(m,2h),4.63(s,2h),4.53(d,j＝6.0hz,2h),3.91(t,j＝4.6hz,4h),3.62(dd,j＝11.6,5.6hz,2h),2.63–2.52(m,6h),1.86–1.79(m,2h)。

實(shí)施例24：6-{2-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙胺基]-2-氧代乙氧基}-n-[3-(4-嗎啉基)丙基]-苯并[d]噻唑-2-甲酰胺(化合物zl24)的合成

參照實(shí)施例1的合成方法，得到白色固體0.57g，收率：36.1％。m.p.:156-158℃；ir:(kbr,cm^-1):υ3424.6,2923.0,1656.7,1506.6,1384.7,1256.7,1225.3,1122.6,1076.2,1050.6,1018.1,827.5,733.2；esi-ms,m/z:calcd.528.20(m⁺)；found529.2([m+h]⁺),551.2([m+na]⁺)；¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.95(d,j＝9.0hz,1h),7.39(d,j＝2.5hz,1h),7.26–7.24(m,2h),7.17(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),7.03–6.98(m,2h),4.62(s,2h),4.51(d,j＝6.0hz,2h),3.94(t,j＝4.6hz,4h),3.64–3.58(m,2h),2.63–2.52(m,6h),1.86–1.79(m,2h)。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。

藥理實(shí)施例

實(shí)施例25：受試化合物對(duì)a549、hela、sw480、hepg2及hl7702細(xì)胞增殖的抑制活性初篩實(shí)驗(yàn)方法。

1.實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞系：a549、hela、sw480、hepg2及hl7702細(xì)胞，以6000/孔的密度鋪于96孔板，每孔100ul，24h后使用。

編號(hào)zl01-zl24目標(biāo)化合物：以dmso溶解，用培養(yǎng)液稀釋配制為50μm、20μm、10μm、5μm、2μm五個(gè)不同濃度保存于-20℃待用，dmso在培養(yǎng)液中的終濃度低于0.1％。

陽(yáng)性對(duì)照藥：5-氟尿嘧啶(5-fu)。

mtt：以pbs溶解為5mg/ml，保存于-20℃。

2.實(shí)驗(yàn)方法

利用mtt方法，選取a549、hela、sw480、hepg2及hl7702細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)供試樣品的抗腫瘤增值活性。細(xì)胞株在dulbecco氏改進(jìn)的eagle培養(yǎng)基(dmem)上進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基包含10％小牛血清(fbs)。當(dāng)細(xì)胞增殖至80-90％時(shí)使其合并隨后進(jìn)行不超過(guò)20代的傳代培養(yǎng)，然后在下一步處置前使它們適應(yīng)環(huán)境達(dá)到24h。將這些細(xì)胞置于96孔板上(8×104/ml)，然后在含有5％co2的濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng)過(guò)夜并控溫在37℃。24h過(guò)后加入不同濃度的發(fā)明代表性化合物。再經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)，向其中加入mtt(5mg/ml)并繼續(xù)培養(yǎng)4h。移除培養(yǎng)基質(zhì)，將晶體溶解于dmso中，利用酶標(biāo)儀(tecanspectra,wetzlar,德國(guó))在490nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。根據(jù)公式：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝(1-藥物組od值/對(duì)照組od值)×100％，計(jì)算相應(yīng)濃度下的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，以受試化合物的不同濃度及對(duì)細(xì)胞的抑制率作對(duì)數(shù)曲線(xiàn)，計(jì)算受試化合物相對(duì)應(yīng)的ic50值。按照上述方法測(cè)定本發(fā)明代表性化合物，結(jié)果示于表1：

表1

實(shí)施例26：受試化合物對(duì)egfr激酶活性的體外抑制效果實(shí)驗(yàn)方法。

(1)實(shí)驗(yàn)材料

野生型及各種突變型(t790m,l858/t70m)egfr，待測(cè)化合物均為細(xì)胞增殖抑制活性較好的化合物。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

將一系列梯度濃度的受試化合物，在室溫條件下與特定濃度的酶溶液共同孵育5min，之后加入適量的酶反應(yīng)底物、atp，啟動(dòng)酶反應(yīng)過(guò)程，30min后，向酶反應(yīng)體系中加入適量的反應(yīng)終止液和檢測(cè)液，孵育1h后，在moleculardevice公司的flexstationiii多功能酶標(biāo)儀上，測(cè)定特定化合物濃度下的酶活力，并計(jì)算不同濃度的化合物對(duì)酶活力的抑制活性，之后根據(jù)四參數(shù)方程，對(duì)不同濃度化合物下酶活力的抑制活性進(jìn)行擬合，計(jì)算出ic50值。按照上述方法測(cè)定本發(fā)明代表性化合物，結(jié)果示于表2：

表2

制劑實(shí)施例

下列制劑實(shí)施例僅舉例說(shuō)明本發(fā)明的保護(hù)范圍，但不以任何方式構(gòu)成限定。

實(shí)施例27：明膠膠囊

硬明膠膠囊的制備采用：

可以根據(jù)所提供的合理變化來(lái)改進(jìn)上述制劑。

實(shí)施例28：片劑

片劑的制備采用

將上述組分混合并壓制成片劑。

實(shí)施例29：片劑

每片中含有2.5-1000mg活性組分的片劑制備如下：

使活性成分、淀粉和纖維素通過(guò)美國(guó)45號(hào)目篩并徹底混合。將聚乙烯吡咯烷酮溶液與所得粉末混合，隨后經(jīng)美國(guó)14號(hào)目篩。將生成的顆粒在50-60℃下干燥并經(jīng)美國(guó)18號(hào)目篩。將預(yù)先經(jīng)過(guò)美國(guó)60號(hào)目篩的羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂和滑石粉加入到上述顆粒中，隨后混合，在壓片機(jī)上壓制得到片劑。

實(shí)施例30：混懸液

每5ml含有0.1-1000mg藥物的混懸液制備如下：

令藥物經(jīng)美國(guó)45號(hào)目篩并與羧甲基纖維素鈉和糖漿混合形成平滑的糊劑。將苯甲酸溶液、矯味劑和著色劑用一些水稀釋并在攪拌下加入上述糊劑。隨后加入足量的水以達(dá)到所需的體積。

實(shí)施例31：組合片劑

使活性成分、淀粉和纖維素通過(guò)美國(guó)45號(hào)目篩并徹底混合。將聚乙烯吡咯烷酮溶液與所得粉末混合，隨后經(jīng)美國(guó)14號(hào)目篩。將生成的顆粒在50-60℃下干燥并經(jīng)美國(guó)18號(hào)目篩。將預(yù)先經(jīng)過(guò)美國(guó)60號(hào)目篩的羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂和滑石粉加入到上述顆粒中，隨后混合，在壓片機(jī)上壓制得到片劑。

對(duì)于上述說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地理解本發(fā)明的必要特征，不背離本發(fā)明的精神和范圍，本發(fā)明可進(jìn)行各種改變和改進(jìn)以適應(yīng)不同的應(yīng)用和條件。