本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于實時核酸序列依賴性擴增(Nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)技術(shù)和分子信標熔解曲線技術(shù)的人乳頭瘤病毒E6/E7基因檢測技術(shù)。

背景技術(shù)：

人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)屬乳頭多瘤空泡病毒科，是一種嗜上皮性病毒。它對表皮和粘膜鱗狀上皮具有特殊嗜性，為無包膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，具有高度的特異性，且在人和動物中分布廣泛。HPV基因組共由3個基因區(qū)組成，包括早期區(qū)(Early Region，E區(qū))、晚期區(qū)(Late Region，L區(qū))和與非編碼區(qū)(Uncoding Region，UCR)或上游調(diào)控區(qū)(URR)。E區(qū)按順序為E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7個基因，參與病毒DNA的復制、轉(zhuǎn)錄、編碼病毒蛋白、維持細胞內(nèi)病毒的高拷貝數(shù)的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，與病毒細胞轉(zhuǎn)化功能及致癌性有關(guān)。L區(qū)主要有編碼衣殼蛋白的L1和編碼次要衣殼蛋白的L2。L1高度保守，特異性強；L2編碼的衣殼蛋白較小，但變異多。UCR含有HPV基因組DNA的復制起點和調(diào)控HPV病毒的轉(zhuǎn)錄與復制表達所必需的元件。

人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)經(jīng)過完全測序后可歸類成120多種基因型，其中有50余種定向感染人體生殖道皮膚及粘膜的復層鱗狀上皮，導致尖銳濕疣糜爛，甚至可能引起癌癥的發(fā)生。根據(jù)其是否可以引起癌變，HPV亞型可分為“低危”型和“高?！毙?，前者主要引起良性的生殖器疣和低度的宮頸上皮壞死(CIN)；后者的感染是引發(fā)宮頸癌的主要致病因素。在大多數(shù)情況下，免疫系統(tǒng)能在HPV造成傷害之前將其清除，95％以上的生殖道HPV感染能在3-5年內(nèi)痊愈，但也有少數(shù)HPV感染不能被清除，經(jīng)過多年的一系列的病變發(fā)展為宮頸癌。研究發(fā)現(xiàn)，中國婦女HPV感染率的年齡組分布曲線呈現(xiàn)出兩個高峰(20-24歲和40-44歲)，HPV的感染正日益普遍的影響著中國婦女的生活質(zhì)量和身心健康。

宮頸癌是危害女性健康的第二大惡性腫瘤，而高危型HPV的持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件。HPV的感染使得宮頸癌的相對危險性增加了250倍，而從高危型HPV的持續(xù)感染到一般的宮頸癌前病變最終發(fā)展為宮頸癌大約需要5-10年。事實上，約99.7％的宮頸癌都是由高危型HPV造成，尤其是HPV 16、18、31、33、35的反復或持續(xù)感染所致。因此，高危HPV病毒是目前最為明確的致癌病毒，有針對性地對高危型HPV進行全面檢測，對宮頸癌的早期診斷和治療具有重要的意義。

臨床上HPV分型檢測是應(yīng)用分子生物學的方法檢測病毒的核酸，主要集中在以靶序列擴增為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)(如熒光-PCR法)和以信號放大為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)(如雜交捕獲法)。國內(nèi)市場上HPV核酸檢測試劑盒檢測的靶序列主要針對HPV的L1基因序列和全基因組序列，這些方法是以病毒基因組DNA作為靶序列，檢測樣本載有的病毒類型及負荷量。實際上宮頸細胞的病變程度不僅與病毒類型以及負荷量相關(guān)，也與致癌基因的活動程度密切相關(guān)。HPV E6/E7信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)是病毒癌基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它在宮頸組織中表現(xiàn)出癌基因的活性，HPV E6/E7mRNA水平與病變的嚴重程度相關(guān)。研究表明，與HPV DNA檢測相比，HPV E6/E7mRNA檢測可能是一種更有效的方式，為感染高危型HPV的婦女提供了更準確的風險預(yù)測。

2006年歐洲生殖器感染及腫瘤研究組織認為HPV E6/E7mRNA檢測可以作為HPV相關(guān)的分子標記物之一進行研究。而隨著分子生物學與生物信息學的快速發(fā)展和有機結(jié)合，基于核酸擴增的技術(shù)也得到了快速的發(fā)展。如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)是一種檢測RNA的簡便、準確的常規(guī)技術(shù)。但是，基于PCR的技術(shù)是終點法分析，需要反復升降溫的循環(huán)擴增和PCR后的凝膠電泳分析結(jié)果，耗時較長，且靈敏度仍有待提高。接著無需電泳分析的實時熒光RT-PCR成為更快捷的一種核酸擴增和RNA檢測技術(shù)。該技術(shù)利用熒光探針實現(xiàn)對靶核酸的特異性檢測，利用熒光信號的積累實現(xiàn)實時監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)的全過程從而能實時分析檢測結(jié)果。由于實時熒光RT-PCR仍需要有反轉(zhuǎn)錄步驟和變性、退火及延伸等三個溫度點進行幾十次升降溫循環(huán)，每個溫度點和時間也需精確設(shè)定，整個反應(yīng)仍需耗時2-2.5小時以上。

近年來，一種新型的核酸擴增技術(shù)—等溫擴增技術(shù)實現(xiàn)在恒溫條件下的檢測。如DNA環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA，LAMP)應(yīng)用的比較廣泛，也有相關(guān)專利申請，但LAMP技術(shù)需要使用4條引物，一共識別靶DNA的6個不同區(qū)域，雖然提高了特異性，但針對變異大的病毒核酸分子在設(shè)計上非常困難。而另一種快速等溫擴增技術(shù)，核酸序列依賴性擴增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技術(shù)克服了以往核酸擴增的不足，更為簡便高效，尤其適用于RNA的檢測。與PCR的區(qū)別在于，NASBA是在AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶等三種酶的共同協(xié)作下，在41-42℃，由一對引物指導的連續(xù)均一的體外特異核苷酸序列等溫擴增酶促過程。其中一條引物其5’端具有被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列。在NASBA基礎(chǔ)

上結(jié)合分子信標(molecular beacon)探針可以建立實時NASBA等溫擴增技術(shù)。該技術(shù)具有以下優(yōu)點：(1)等溫擴增：反應(yīng)在同一恒溫體系條件下進行；(2)快速高效、靈敏度高：實時NASBA反應(yīng)是一種無需升降溫的連續(xù)快速擴增，也不需要反轉(zhuǎn)錄過程，整個反應(yīng)時間短、單鏈RNA產(chǎn)物積累迅速，可以在60-90分鐘內(nèi)完成檢測，并使模板RNA擴增109倍以上，靈敏度甚至可以達到檢測拷貝數(shù)為個位的模板RNA，比常規(guī)PCR方法更加敏感；(3)特異性高、實時檢測：反應(yīng)不需高溫變性，即使有雙鏈DNA污染也不會被擴增，而通過分子信標探針的檢測進一步提高了特異性和靈敏度，也實現(xiàn)了實時檢測和結(jié)果分析；(4)設(shè)計簡單：只需設(shè)計1對引物和1條探針來識別靶RNA的一段區(qū)域內(nèi)序列，對于檢測變異度高的病毒核酸來說，設(shè)計上相對LAMP技術(shù)更為容易。

高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(HRM)是近年來興起的一種檢測基因突變、進行基因分型和SNP檢測的新工具，可以迅速的檢測出核酸片段中單堿基的突變。HRM技術(shù)因其速度快，操作簡便，高通量，靈敏性特異性高，對樣品無污染等優(yōu)點而被迅速的應(yīng)用在生命科學、醫(yī)學、農(nóng)學、畜牧業(yè)等領(lǐng)域的研究工作中。其中，主要的研究方向集中在基因未知突變以及SNP的掃描、已知突變及SNP的基因分型、動植物、微生物等物種的物種鑒定以及品種鑒定、法醫(yī)鑒定、親子鑒定、HLA的配型和甲基化的研究等方面。HRM技術(shù)的主要原理是基于核酸分子物理性質(zhì)的不同。不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何雙鏈DNA分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。HRM技術(shù)的基本原理就是根據(jù)熔解曲線的不同來對樣品來進行區(qū)分。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，提供基于實時等溫擴增的用于人乳頭瘤病毒E6/E7基因檢測的試劑盒及其檢測方法，以彌補現(xiàn)有檢測方法的不足。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種基于實時等溫擴增的用于人乳頭瘤病毒E6/E7基因檢測的引物及探針，包括如下引物對和分子信標探針探針：

(1)檢測HPV16的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，檢測HPV16的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)檢測HPV18的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示，檢測HPV18的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(3)檢測HPV31的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示，檢測HPV31的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

(4)檢測HPV33的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示，檢測HPV33的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(5)檢測HPV35的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14示，檢測HPV35的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

(6)檢測HPV39的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17示，檢測HPV39的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

(7)檢測HPV45的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20示，檢測HPV16的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

(8)檢測HPV51的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23示，檢測HPV51的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

(9)檢測HPV52的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25～26示，檢測HPV52的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；

(10)檢測HPV56的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.28～29示，檢測HPV16的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；

(11)檢測HPV58的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31～32示，檢測HPV16的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；

(12)檢測HPV59的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.34～35示，檢測HPV59的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；

(13)檢測HPV66的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.37～38示，檢測HPV66的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；

(14)檢測HPV68的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.40～41示，檢測HPV68的分子信標探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。

所述分子信標探針的5’端和3’端的4個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的30～40個堿基是與HPV病毒E6/E7ORF反義鏈互補的特異性序列。

作為優(yōu)選，

檢測HPV16、HPV18、HPV33、HPV39分子信標探針5’端為吲哚二羧菁Cy5標記；

檢測HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58分子信標探針5’端為羧基熒光素FAM標記；

檢測HPV31、HPV35、HPV59、HPV66、HPV68分子信標探針5’端為六氯熒光素HEX標記。

一種基于實時等溫擴增的用于人乳頭瘤病毒E6/E7基因檢測的試劑盒，包括4×實時NASBA反應(yīng)液和5×酶混合液，所述4×實時NASBA反應(yīng)液中溶解有權(quán)利要求1所述的引物對和分子信標探針，其濃度分別為0.8μM。

作為優(yōu)選，所述4×實時NASBA反應(yīng)液的配方如下：Tris-HCl 160mM、MgCl₂ 48mM、KCl 280mM、DTT 20mM、DMSO 60％(v/v)、dNTP 4mM、NTPs 8mM、甜菜堿200mM、權(quán)利要求1所述的引物對和分子信標探針0.8μM，4×實時NASBA反應(yīng)液的pH為8.0。

其中，所述的5×酶混合液的配方如下：RevertAid反轉(zhuǎn)錄酶2U/μL、T7RNA聚合酶10U/μL、BSA 0.55mg/ml、RNA酶抑制劑5U/μL。

作為優(yōu)選，該試劑盒包括陽性對照、陰性對照和空白對照。

其中，所述陽性對照為人乳頭瘤病毒含有E6/E7基因片段的假病毒，如SEQ ID NO.43～56所示。

其中，陰性對照為在核酸提取時與標本同時平行提取的無菌生理鹽水。

其中，所述空白對照為無核酸酶的純水。

上述基于實時等溫擴增的用于人乳頭瘤病毒E6/E7基因檢測的引物及探針在人乳頭瘤病毒E6/E7基因檢測中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

有益效果：

本發(fā)明所述檢測試劑盒經(jīng)試驗反復驗證和優(yōu)化，具有以下優(yōu)點：

(1)等溫擴增：避免了普通PCR對溫度循環(huán)的特殊要求所帶來的種種不便；

(2)特異性強：通過精心設(shè)計并結(jié)合臨床樣本篩查優(yōu)化選擇出的特異性正向引物、反向引物和分子信標探針，根據(jù)產(chǎn)物與探針的特異性結(jié)合可以確保檢測的特異性；

(3)靈敏高效：由于NASBA自身的擴增特點，使得檢測靈敏度進一步提高；

(4)擴增效率高：可以在60～90分鐘內(nèi)完成檢測，并使模板RNA擴增約109倍。

附圖說明

圖1 HPV16與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖2 HPV18與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖3 HPV31與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖4 HPV33與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖5 HPV35與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖6 HPV39與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖7 HPV45與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖8 HPV51與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖9 HPV52與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖10 HPV56與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖11 HPV58與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖12 HPV59與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖13 HPV66與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

圖14 HPV68與Tm值的對應(yīng)關(guān)系。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

下面提供具體實施例進一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用不限于實施例。

實施例1：本發(fā)明實時NASBA檢測高危型HPV E6/E7mRNA的試劑盒的組成及主要組成成分如下：

實施例2：實時NASBA引物和探針的設(shè)計

首先從美國NCBI的基因庫下載14種高危型HPV全基因組DNA序列，同時找到E6/E7基因序列并結(jié)合軟件Oligo 7.56(Molecular Biology Insights,Inc.USA)進行引物和探針的設(shè)計。設(shè)計思想是：綜合考慮對14種高危型HPV E6/E7基因檢測的特異性和通用性(在病毒核酸變異位點用簡并堿基處理)、引物和探針設(shè)計應(yīng)遵循的普遍性原則(如Tm值、3’末端自由能、GC含量、避免出現(xiàn)內(nèi)部結(jié)構(gòu)及形成二聚體等)，以及反向引物加上能被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列后的影響等。對于設(shè)計出的引物和探針合成回來后，以構(gòu)建的質(zhì)粒為模板通過qPCR實驗和NASBA實驗進行篩選驗證，最后本發(fā)明選出最優(yōu)的引物和探針，序列如下。

實施例3：陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的制備

1、陽性質(zhì)控品的制備

采用市售商品化核酸提取試劑盒提取感染單型HPV病毒標本中的病毒RNA，進行PCR擴增?；厥諗U增的目的條帶，將其與經(jīng)改造的pET32-MS3his載體進行連接反應(yīng)，4℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞，抗性篩選、搖菌、PCR鑒定陽性者，提取重組質(zhì)粒，測序驗證。獲得含目的片段的克隆菌液通過IPTG誘導劑進行誘導表達，收集誘導完的菌液進行超聲破碎分離上清和沉淀，收集的上清為假病毒溶液，即陽性質(zhì)控品。

2、陰性對照品的制備

配制0.9％的生理鹽水，進行121℃高壓滅菌20min，滅菌生理鹽水即為陰性質(zhì)控品。

實施例4：樣本處理與RNA提取

1、樣本處理

取5ml宮頸脫落細胞和生殖泌尿道分泌物，12000rpm離心2min，收集沉淀，并用滅菌生理鹽水洗滌2次，最后加入250μl滅菌生理鹽水，吹打懸浮沉淀；

2、RNA提取

通過型號為NP968的天隆科技核酸自動提取儀及其配套的試劑盒，對臨床標本、陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控同時進行RNA的提取，提取獲得的RNA即為模板核酸。核酸自動提取儀的運行程序如下：

實施例5：HPV E6/E7基因?qū)崟rNASBA檢測試劑盒的檢測

1、實時NASBA擴增反應(yīng)

每個反應(yīng)管中分別加入5μL待測樣本核酸模板、5μL 4×實時NASBA反應(yīng)液和6μL經(jīng)滅菌的超純水，瞬時離心后置于羅氏LightCycler480上，運行程序參數(shù)為：65℃，5min；41℃，5min。運行結(jié)束后，取出反應(yīng)管并向其中加入4μL 5×酶混合液，瞬時離心后置于羅氏LightCycler480上，運行程序參數(shù)為：41℃，2h；40-80℃，melting curve；37，1sec。熒光通道同時選擇Cy5、Fam、VIC三種通道。

2、結(jié)果判定

14種高危型別HPV擴增的特異性片段與所設(shè)計的分子信標探針雜交，收集熒光信號，通過相應(yīng)的Tm值及熒光信號判斷HPV的型別。每種型別HPV所對應(yīng)的的Tm值范圍如下表所示：

實施例6：HPV E6/E7基因?qū)崟rNASBA檢測試劑盒的靈敏度分析

將陽性質(zhì)控提取的模板RNA依次做10倍梯度稀釋，選取低濃度的9個梯度進行實驗，每個濃度梯度各取5μL作為模板用于擴增，9個濃度梯度的拷貝數(shù)分別為：1×10⁸至1×10⁰。按照實施例四進行實時NASBA擴增及檢測。本發(fā)明實時NASBA試劑盒對14種高危型HPV病毒的RNA模板都可成功檢測到1×10²拷貝/ul。

實施例7：HPV E6/E7基因?qū)崟rNASBA檢測試劑盒的特異性分析

1.樣本：選擇一組HPV病毒DNA的臨床陽性樣本，分別感染14種高危型中的一種，以及分別感染HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44五種低危型HPV病毒。陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控、空白對照(H2O)，均由試劑盒提供。

2.方法：使用本發(fā)明所述實時NASBA檢測試劑盒，采用實施例五所述方法對以上臨床樣本進行檢測，觀察該試劑盒是否會發(fā)生非特異性的檢測結(jié)果。

3.結(jié)果：根據(jù)實時NASBA擴增的熒光圖譜分析，本發(fā)明所述試劑盒僅對14種高危型人乳頭瘤病毒的檢測為陽性，對5種低危型人乳頭瘤病毒以及陰性對照、空白對照的檢測均為陰性，證明該方法有較好的特異性。結(jié)果見附圖1～14。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州迪安生物技術(shù)有限公司 杭州迪安醫(yī)學檢驗中心有限公司

<120> 一種基于實時等溫擴增的用于人乳頭瘤病毒E6/E7基因檢測的試劑盒及其應(yīng)

用

<130> SG20170228

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

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<220>

<223> N35R

<400> 14

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcacatttac aacaggacgt tac 53

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N35P

<400> 15

gcgcagcaaa accagacacc tccaattata atattgtaac gtccgcgc 48

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N39F

<400> 16

ttaggagagt cagaggatga aa 22

<210> 17

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N39R

<400> 17

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggttacactt acaacacgaa cac 53

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N39P

<400> 18

gcgccaacat caactactag ccagacggga cgaaccacag cgtcgcgc 48

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45F

<400> 19

gtagggaaac acaagtatag ca 22

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45R

<400> 20

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcaacaggtc aacaggatct aat 53

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45P

<400> 21

gcgcggaaac actgcaagaa attgtattgc atttggaacc tcaggcgc 48

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N51F

<400> 22

tgtcatagat gtcaaagacc ac 22

<210> 23

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N51R

<400> 23

aattctaata cgactcacta tagggagaag gggctttatt acacttgggt ttc 53

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N51P

<400> 24

gcgccggggc aatgcgctaa ttgctggcaa cgtacacgac aacggcgc 48

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N52F

<400> 25

cgtggagaca aagcaactat aa 22

<210> 26

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N52R

<400> 26

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtaattgctc atagcagtgt agg 53

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N52P

<400> 27

gcgcgatctg caacctgaaa caactgacct acactgctat gagcgcgc 48

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56F

<400> 28

atgaggatga ggatgaagta ga 22

<210> 29

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56R

<400> 29

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcaaacttac actcacaaca agg 53

<210> 30

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56P

<400> 30

gcgcggagcg gccacagcaa gctagacaag ctaaacaaca tacggcgc 48

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N58F

<400> 31

ctgaaccaac tgacctattc tgc 23

<210> 32

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N58R

<400> 32

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggctgtggcc ggttgtgctt g 51

<210> 33

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N58P

<400> 33

gcgcgtgaca gctcagacga ggatgaaata ggcttggacg ggcgcgc 47

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N59F

<400> 34

acgagcaatt acctgactcc gac 23

<210> 35

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N59R

<400> 35

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggttgtgacg ctgtggttca g 51

<210> 36

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N59P

<400> 36

gcgcgatgaa ccagatggag ttaatcatcc tttgctacta gctagcgc 48

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N66F

<400> 37

catacgagta gacaagctac ag 22

<210> 38

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N66R

<400> 38

aattctaata cgactcacta tagggagaag gggtacgtga attaggtaac act 53

<210> 39

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N66P

<400> 39

gcgcggatga aatagaccat ttgctggagc ggccacagca agcgcgc 47

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N68F

<400> 40

gttaatcacc accaacatca ac 22

<210> 41

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N68R

<400> 41

aattctaata cgactcacta tagggagaag gttagtgagt ccataaacag cag 53

<210> 42

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N68P

<400> 42

gcgccaacta gtagtagaag cgtcgcggga gaacctgcgg aagcgcgc 48

<210> 43

<211> 305

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段1

<400> 43

taggtgtatt aactgtcaaa agccactgtg tcctgaagaa aagcaaagac atctggacaa 60

aaagcaaaga ttccataata taaggggtcg gtggaccggt cgatgtatgt cttgttgcag 120

atcatcaaga acacgtagag aaacccagct gtaatcatgc atggagatac acctacattg 180

catgaatata tgttagattt gcaaccagag acaactgatc tctactgtta tgagcaatta 240

aatgacagct cagaggagga ggatgaaata gatggtccag ctggacaagc agaaccggac 300

agagc 305

<210> 44

<211> 291

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段2

<400> 44

gcctgcggtg ccagaaaccg ttgaatccag cagaaaaact tagacacctt aatgaaaaac 60

gacgatttca caacatagct gggcactata gaggccagtg ccattcgtgc tgcaaccgag 120

cacgacagga acgactccaa cgacgcagag aaacacaagt ataatattaa gtatgcatgg 180

acctaaggca acattgcaag acattgtatt gcatttagag ccccaaaatg aaattccggt 240

tgaccttcta tgtcacgagc aattaagcga ctcagaggaa gaaaacgatg a 291

<210> 45

<211> 422

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段3

<400> 45

acaaaggtat atgtgatttg ttaattaggt gtataacgtg tcaaagaccg ttgtgtccag 60

aagaaaaaca aagacatttg gataaaaaga aacgattcca caacatagga ggaaggtgga 120

caggacgttg catagcatgt tggagaagac ctcgtactga aacccaagtg taaacatgcg 180

tggagaaaca cctacgttgc aagactatgt gttagatttg caacctgagg caactgacct 240

ccactgttat gagcaattac ccgacagctc agatgaggag gatgtcatag acagtccagc 300

tggacaagca gaaccggaca catccaatta caatatcgtt accttttgtt gtcagtgtaa 360

gtctacactt cgtttgtgtg tacagagcac acaagtagat attcgcatat tgcaagagct 420

gt 422

<210> 46

<211> 380

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段4

<400> 46

acaaacgatt tcataatatt tcgggtcgtt gggcagggcg ctgtgcggcg tgttggaggt 60

cccgacgtag agaaactgca ctgtgacgtg taaaaacgcc atgagaggac acaagccaac 120

gttaaaggaa tatgttttag atttatatcc tgaaccaact gacctatact gctatgagca 180

attaagtgac agctcagatg aggatgaagg cttggaccgg ccagatggac aagcacaacc 240

agccacagct gattactaca ttgtaacctg ttgtcacact tgtaacacca cagttcgttt 300

atgtgtcaac agtacagcaa gtgacctacg aaccatacag caactactta tgggcacagt 360

gaatattgtg tgccctacct 380

<210> 47

<211> 433

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段5

<400> 47

tacagagttg tataatttgt taataaggtg cctgcggtgc cagaaaccat tgaacccagc 60

agaaaaacgt agacacctta aggacaaacg aagatttcac agcatagctg gacagtaccg 120

agggcagtgt aatacatgtt gtgaccaggc acggcaagaa agacttcgca gacgtaggga 180

aacacaagta tagcaataag tatgcatgga ccccgggaaa cactgcaaga aattgtattg 240

catttggaac ctcagaatga attagatcct gttgacctgt tgtgttacga gcaattaagc 300

gagtcagagg aggaaaacga tgaagcagat ggagttagtc atgcacaact accagcccga 360

cgagccgaac cacagcgtca caaaattttg tgtgtatgtt gtaagtgtga cggcagaatt 420

gagcttacag tag 433

<210> 48

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段6

<400> 48

ggacagggcg ctgtgcagtg tgttggagac cccgacgtag acaaacacaa gtgtaacctg 60

taacaacgcc atgagaggaa acaacccaac gctaagagaa tatattttag atttacatcc 120

tgaaccaact gacctattct gctatgagca attatgtgac agctcagacg aggatgaaat 180

aggcttggac gggccagatg gacaagcaca accggccaca gctaattact acattgtaac 240

ttgttgttac acttgtggca ccacggttcg tttgtgtatc aacagtacaa caaccgacgt 300

acgaacccta cagcagctgc ttatgggcac atgtac 336

<210> 49

<211> 370

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段7

<400> 49

ggagaaacgt tagaaaaaca atgcaacaaa cagttatgtc atttattaat taggtgtatt 60

acatgtcaaa aaccgctgtg tccagttgaa aagcaaagac atttagaaga aaaaaaacga 120

ttccataaca tcggtggacg gtggacaggt cggtgtatgt cctgttggaa accaacacgt 180

agagaaaccg aggtgtaatc atgcatggag aaataactac attgcaagac tatgttttag 240

atttggaacc cgaggcaact gacctatact gttatgagca attgtgtgac agctcagagg 300

aggaggaaga tactattgac ggtccagctg gacaagcaaa accagacacc tccaattata 360

atattgtaac 370

<210> 50

<211> 420

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段8

<400> 50

atacaaagtt atataattta tcaataaggt gcatgtgttg tctgaaaccg ctgtgtccag 60

cagaaaaatt aagacaccta aatagcaaac gaagatttca taaaatagca ggaagctata 120

caggacagtg tcgacggtgc tggaccacaa aacgggagga ccgcagactg acacgaagag 180

aaacccaagt ataacatcag atatgcgtgg accaaagccc accttgcagg aaattgtatt 240

agatctatgt ccttacaatg aaatacagcc ggttgacctt gtatgtcacg agcaattagg 300

agagtcagag gatgaaatag atgaacccga ccatgcagtt aatcaccaac atcaactact 360

agccagacgg gacgaaccac agcgtcacac aatacagtgt tcgtgttgta agtgtaacaa 420

<210> 51

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段9

<400> 51

atatgattta tcgataaggt gtcatagatg tcaaagacca cttgggcctg aagaaaagca 60

aaaattggtg gacgaaaaaa aaaggttcca tgaaatagcg ggacgttgga cggggcaatg 120

cgctaattgc tggcaacgta cacgacaacg taacgaaacc caagtgtaat aaagccatgc 180

gtggtaatgt accacaatta aaagatgtag tattgcattt aacaccacag actgaaattg 240

acttgcaatg ctacgagcaa tttgacagct cagaggagga ggatgaagta gataatatgc 300

gtgaccagct accagaaaga cgggctggac aggctacgtg ttacagaatt gaagctccgt 360

gttgcaggtg ttcaagtgta gtacaactgg cagtggaaag cagtggagac acccttcgcg 420

ttgta 425

<210> 52

<211> 380

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段10

<400> 52

aacaagcgat ttcataatat tatgggtcgt tggacagggc gctgttcaga gtgttggaga 60

ccccgacctg tgacccaagt gtaacgtcat gcgtggagac aaagcaacta taaaagatta 120

tatattagat ctgcaacctg aaacaactga cctacactgc tatgagcaat taggtgacag 180

ctcagatgag gaggatacag atggtgtgga ccggccagat ggacaagcag aacaagccac 240

aagcaattac tacattgtga catattgtca cagttgtgat agcacactac ggctatgcat 300

tcatagcact gcgacggacc ttcgtactct acagcaaatg ctgttgggca cattacaagt 360

tgtgtgcccc ggctgtgcac 380

<210> 53

<211> 431

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段11

<400> 53

gagctacact agaaagtata actaaaaaac agttatgtga tttattaata aggtgctaca 60

gatgtcaaag tccgttaact ccggaggaaa agcaattgca ttgtgacaga aaaagacgat 120

ttcatctaat agcacatggt tggaccgggt catgtttggg gtgctggaga caaacatcta 180

gagaacctag agaatctaca gtataatcat gcatggtaaa gtaccaacgc tgcaagacgt 240

tgtattagaa ctaacacctc aaacagaaat tgacctacag tgcaatgagc aattggacag 300

ctcagaggat gaggatgagg atgaagtaga ccatttgcag gagcggccac agcaagctag 360

acaagctaaa caacatacgt gttacctaat acacgtacct tgttgtgagt gtaagtttgt 420

ggtgcagttg g 431

<210> 54

<211> 380

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段12

<400> 54

cctaagacag caacgacaag cgcgtagtga aacactggtg taaaacaatg catggaccaa 60

aagcaacact ttgtgacatt gttttagatt tggaaccaca aaattatgag gaagttgacc 120

ttgtgtgcta cgagcaatta cctgactccg actccgagaa tgaaaaagat gaaccagatg 180

gagttaatca tcctttgcta ctagctagac gagctgaacc acagcgtcac aacattgtgt 240

gtgtgtgttg taagtgtaat aatcaacttc agctagtagt agaaacctcg caagacggat 300

tgcgagcctt acagcagctg tttatggaca cactatcctt tgtgtgtcct ttgtgtgcag 360

caaaccagta acctgcaatg 380

<210> 55

<211> 432

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段13

<400> 55

ggggcaacat tagaaagtat aactaaaaaa cagttatctg atttatcaat aaggtgctac 60

cgatgtcaat gtccgttaac accggaggaa aaacaattgc actgtgaaca taaaagacga 120

tttcattata tagcatatgc atggaccggg tcatgtttgc agtgttggag acatacgagt 180

agacaagcta cagaatctac agtataacca tgcatggtaa agtaccaacg ttgcaagagg 240

ttatattaga acttgcaccg caaacggaaa ttgacctaca atgcaatgag caattggaca 300

gctcagagga tgaggatgag gatgaaatag accatttgct ggagcggcca cagcaagcta 360

gacaagctga acaacataag tgttacctaa ttcacgtacc ttgttgtaag tgtgagttgg 420

tggtgcagtt gg 432

<210> 56

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段14

<400> 56

cgccactgct ggaccagtaa gcgagaggac cgcagacgca cacggcaaga gacacaagta 60

taaactaact atgcatggac caaagcccac cgtgcaggaa attgtgttag agttatgtcc 120

atgcaatgaa atagagccgg ttgaccttgt atgtcacgag caattaggag attcagacga 180

tgaaatagat gaacccgacc atgcagttaa tcaccaccaa catcaactac tagccagacg 240

ggacgaacaa cagcgtcaca gaattcagtg tatgtgttgt aagtgtaaca acccactgca 300

actagtagta gaagcgtcgc gggagaacct gcggaagcta caactgctgt ttatggactc 360

act 363