本發(fā)明屬于動物育種領(lǐng)域，涉及一種選育五指山小型豬近交系無PERV傳染性新品系的方法。

背景技術(shù)：

五指山小型豬近交系是中國擁有完全自主的知識產(chǎn)權(quán)的新型實驗動物?！敖幌?Inbred Strain Animals)”是指經(jīng)連續(xù)20代(或以上)的全同胞兄妹交配(或者親代與子代交配)培育、近交系數(shù)大于99％的品系，所有個體都可追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對共同祖先動物。五指山小型豬近交系體型小、性成熟早、產(chǎn)仔率較高、遺傳穩(wěn)定、無PERV-C型拷貝、PERV-A型及PERV-B型拷貝少、無應(yīng)激反應(yīng)基因、免疫代謝等基因與人類有較高同源性，異體皮膚移植鑒定試驗未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，全基因組序列測定60％基因純合，證明該近交系豬培育成功，為研究醫(yī)用疾病模型、新藥鑒定、醫(yī)用生物敷料產(chǎn)品研發(fā)與生產(chǎn)、以及異體器官移植等醫(yī)用產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展及應(yīng)用，創(chuàng)建、提供全新的科研平臺與產(chǎn)業(yè)平臺。

豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)是一種以前病毒DNA形式整合入豬基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒，是由PERV-gag、pol、env三基因組成，它可隨細(xì)胞基因組的復(fù)制而復(fù)制。部分豬源細(xì)胞可釋放PERV病毒顆粒，并能感染多種體外培養(yǎng)的人源細(xì)胞。由于豬器官大小和解剖生理與人體器官相似，被認(rèn)為是異種器官移植的最佳供體。但豬基因組內(nèi)的PERV存在跨物種間感染風(fēng)險，以豬源器官作為器官供體移植人體后可能導(dǎo)致PERV感染人體。PERV感染是異種器官移植的一大障礙，從生物安全性考慮，需要去除或抑制豬基因組內(nèi)PERV，以降低其物種間傳播風(fēng)險。根據(jù)PERV env基因編碼的不同，可以將PERV分為三個亞型：PERV-A、PERV-B、PERV-C，其差異主要在于SU表面糖基化的VRA、VRB和PRO區(qū)，這種差異可能導(dǎo)致不同類型的PERV有著不同的宿主感染范圍。PERV-A和PERV-B可感染多種人源細(xì)胞以及非人靈長類細(xì)胞，PERV-C僅感染特定豬來源的細(xì)胞。

因此，選育無PERV傳染性的五指山小型豬近交系具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種選育無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的方法。

本發(fā)明首先提供了一種應(yīng)用，具體為：HEK293細(xì)胞和記載有“鑒定待測豬是否為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的方法”的可讀性載體在制備用于選育無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的試劑盒中的應(yīng)用。所述待測豬為五指山小型豬近交系。

本發(fā)明還提供了一種試劑盒，具體為：用于選育無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的試劑盒。所述試劑盒中含有HEK293細(xì)胞和記載有“鑒定待測豬是否為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的方法”的可讀性載體。

以上所述“鑒定待測豬是否為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的方法”，具體可包括如下步驟：(A)將來源于待測豬的PBMC與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)4-7天(如4天)，去除所述PBMC，鑒定所述HEK293細(xì)胞中是否攜帶或表達(dá)PERV的結(jié)構(gòu)基因，根據(jù)鑒定結(jié)果確定所述待測豬是否為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系：若所述HEK293細(xì)胞中不攜帶且不表達(dá)PERV的結(jié)構(gòu)基因，則所述待測豬為候選無PERV傳染性的五指山小型豬近交系；若所述HEK293細(xì)胞中攜帶或表達(dá)PERV的結(jié)構(gòu)基因，則所述待測豬不為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系；所述待測豬為五指山小型豬近交系。

在步驟(A)之后，還可包括步驟(B)：

(B)將來源于經(jīng)過所述步驟(A)獲得的候選無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的PBMC與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)4-7天(如4天)，去除所述PBMC，繼續(xù)培養(yǎng)所述HEK293細(xì)胞30-60天，期間在細(xì)胞匯合時即行傳代，每次傳代時一方面收集所述HEK293細(xì)胞鑒定是否攜帶或表達(dá)PERV的結(jié)構(gòu)基因，另一方面收集細(xì)胞培養(yǎng)上清鑒定反轉(zhuǎn)錄酶活性，根據(jù)鑒定結(jié)果確定所述“經(jīng)過所述步驟(A)獲得的候選無PERV傳染性的五指山小型豬近交系”是否確實為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系：若每次的鑒定結(jié)果均顯示所述HEK293細(xì)胞中不攜帶且不表達(dá)PERV的結(jié)構(gòu)基因，并且所述細(xì)胞培養(yǎng)上清無反轉(zhuǎn)錄酶活性，則所述“經(jīng)過所述步驟(A)獲得的候選無PERV傳染性的五指山小型豬近交系”確實為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系；反之則所述“經(jīng)過所述步驟(A)獲得的候選無PERV傳染性的五指山小型豬近交系”不為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系。

本發(fā)明所提供的篩選無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的方法，具體可包括如上所述步驟(A)。根據(jù)需要，在所述步驟(A)之后，還可包括如上所述步驟(B)。

所述方法中，采用PCR和/或RT-PCR的方法鑒定所述HEK293細(xì)胞中是否攜帶有PERV的結(jié)構(gòu)基因。

所述PERV的結(jié)構(gòu)基因為gag基因、pol基因和env基因。只要這三個基因的檢測結(jié)果有陽性的就說明所述HEK293細(xì)胞攜帶或表達(dá)PERV的結(jié)構(gòu)基因。

用于擴增所述gag基因的引物對由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成，用于擴增所述pol基因的引物對由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成，用于擴增所述env基因的引物對由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA分子組成。

所述方法中，使用細(xì)胞培養(yǎng)液對PBMC與HEK293細(xì)胞的共培養(yǎng)體系沖洗至少4遍以去除所述PBMC。

所述方法中，可以運用PCR擴增豬種屬特異性基因驗證所述PBMC的去除情況。其中，PCR擴增時采用的引物對為特異于豬源細(xì)胞α-1,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因中種屬特異性內(nèi)含子序列的引物對，由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA分子組成。

所述方法中，PBMC與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)初始時，所述PBMC的量可為所述HEK293細(xì)胞的兩倍。

所述方法中，PBMC與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)初始時，需向培養(yǎng)體系中加入工作濃度為2.5μg/ml的PHA，兩天后以相同量補充一次PHA。

所述方法中，所述PBMC為離體PBMC，可分離自所述待測豬(或所述“經(jīng)過所述步驟(A)獲得的候選無PERV傳染性的五指山小型豬近交系”)的股動脈血。

所述方法中，應(yīng)用Cavidi公司的HS-Mn RT活性檢測試劑盒檢測所述細(xì)胞培養(yǎng)上清的反轉(zhuǎn)錄酶活性。

本發(fā)明還提供了一種選育五指山小型豬近交系無PERV傳染性新品系的方法。

本發(fā)明所提供的選育五指山小型豬近交系無PERV傳染性新品系的方法，具體可溶包括如下步驟：將經(jīng)權(quán)利要求5或6所述方法篩選獲得的無PERV傳染性的五指山小型豬近交系個體記為F0代，F(xiàn)0代公、母豬交配，妊娠、繁育生產(chǎn)得到仔豬后代，再經(jīng)權(quán)利要求5或6所述方法進行篩選，獲得的無PERV傳染性的五指山小型豬近交系個體記為F1代，以后依此類推，獲得的無PERV傳染性的五指山小型豬近交系分別記為F2、F3、F4、F5、……，采用這樣的繁育方式所獲得的近交系豬群體即為五指山小型豬近交系無PERV傳染性新品系。

本發(fā)明中的所述方法為非疾病診斷治療的方法。

實驗證明，采用本發(fā)明方法能夠準(zhǔn)確鑒定待測豬是否為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系，可用于選育五指山小型豬近交系無PERV傳染性新品系。

附圖說明

圖1為HEK293細(xì)胞和PBMC細(xì)胞共培養(yǎng)。

圖2為PCR擴增豬種屬特異性基因。M：DL1000DNA Marker；a～l：某次檢測1～12號樣品E3/4基因PCR產(chǎn)物；m：陰性對照PCR產(chǎn)物。

圖3為某次檢測樣品的PERV-gag、pol、env基因RT-PCR檢測結(jié)果。M：DL1000DNA Marker；a～l：1～12號樣品RT-PCR產(chǎn)物；m：陰性對照RT-PCR產(chǎn)物。

圖4為PCR擴增豬種屬特異性基因。M：DL1000DNA Marker；a～l：某次檢測1～12號樣品E3/4基因PCR產(chǎn)物；m：陰性對照PCR產(chǎn)物。

圖5為樣品的PERV-gag、pol、env基因PCR檢測結(jié)果。M：DL1000DNA Marker；a～l：1～12號樣品PCR產(chǎn)物，其中10號為陽性對照；m：陰性對照PCR產(chǎn)物。

圖6為樣品的PERV-gag、pol、env基因RT-PCR檢測結(jié)果。M：DL1000DNA Marker；a～l：1～12號樣品RT-PCR產(chǎn)物，其中10號為陽性對照；m：陰性對照RT-PCR產(chǎn)物。

圖7為繪制RT活性檢測試驗標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，x軸為反轉(zhuǎn)錄酶活性，單位μU/ml，y軸為OD405值。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

五指山小型豬近交系：北京蓋蘭德生物科技有限公司。

HEK293細(xì)胞：ATCC，CRL-1573^TM。

實施例1、無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的篩選及選育五指山小型豬近交系無PERV傳染性新品系

一、無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的初步篩選

從新鮮無菌采集的五指山小型豬近交系的股動脈血中分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)。共培養(yǎng)4天后，從共培養(yǎng)細(xì)胞中去除PBMC并使用PCR鑒定PBMC已完全去除，之后采用PCR、RT-PCR對共培養(yǎng)后的HEK293細(xì)胞進行PERV-gag、pol、env基因檢測，結(jié)果均為陰性者為初篩獲得的無PERV傳染性的五指山小型豬近交系。

1、細(xì)胞共培養(yǎng)及PCR驗證豬PBMC的去除情況

在細(xì)胞共培養(yǎng)前一天，用6孔板進行HEK293細(xì)胞鋪板，每孔細(xì)胞量為3×10⁵個，37℃、5％CO₂、飽和濕度中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長成50％單層時即可用于共培養(yǎng)。從新鮮無菌采集的五指山小型豬近交系的股動脈血中分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)(圖1)，每孔加入的PBMC細(xì)胞量約為HEK293細(xì)胞量的2倍，同時加入PHA(工作濃度為2.5μg/ml)，兩天后以相同量補充一次PHA。

共培養(yǎng)4天后，使用細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗至少4遍以去除PBMC，并運用PCR方法擴增豬種屬特異性基因驗證豬PBMC的去除情況。根據(jù)豬源細(xì)胞的α-1,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因中種屬特異性內(nèi)含子序列合成一對引物(表1)。

表1檢測豬種屬特異性基因的引物序列

使用Promega公司的基因組DNA純化試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA，以共培養(yǎng)后的HEK293細(xì)胞基因組為模板，用E3、E4引物進行PCR擴增，并以未經(jīng)共培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞基因組DNA為陰性對照。PCR反應(yīng)在50μL體系中進行，取1μL細(xì)胞基因組DNA作模板，依次加入10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTP混合物4μL，上、下游引物各50pmol，Taq DNA聚合酶3U，加無菌去離子水至50μL，于PCR儀上進行反應(yīng)。檢測豬α-1,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的擴增程序為：94℃預(yù)變性4min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、45s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。

預(yù)期片段位于500bp～750bp之間，結(jié)果表明共培養(yǎng)后細(xì)胞基因組DNA和陰性對照均沒有擴增出預(yù)期大小片段(圖2)。因此基本上可確認(rèn)豬PBMC已被完全去除。

2、PCR及RT-PCR檢測PERV結(jié)構(gòu)基因

共培養(yǎng)后的HEK293細(xì)胞經(jīng)PCR鑒定確認(rèn)無豬PBMC存在后，取上述制備的細(xì)胞基因組DNA和同期使用Trizol制備的細(xì)胞總RNA，分別通過PCR和RT-PCR檢測PERV結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env的存在和表達(dá)情況。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在20μL體系中進行，以9μL細(xì)胞總RNA為模板，1μL Oligo(dt)₁₅為引物，70℃水浴5min后迅速轉(zhuǎn)移到冰上，加入AMV 5×buffer 4μL，10mmol/L dNTP混合物4μL，Rnasin 20U，AMV反轉(zhuǎn)錄酶12U，室溫放置10min后，于42℃水浴1h，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

分別以細(xì)胞基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，檢測gag、pol、env基因保守區(qū)(表2)。

表2檢測PREV的引物序列

PCR反應(yīng)在25μL體系中進行，取1μL細(xì)胞基因組DNA或2μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，依次加入Premix Ex Taq 12.5μL，上、下游引物各50pmol，加無菌去離子水至25μL，于PCR儀上進行反應(yīng)。

檢測gag基因保守區(qū)的擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃，30s，55℃，50s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。檢測pol基因保守區(qū)的擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃，30s，57℃，50s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。檢測env基因保守區(qū)的擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃，30s，58℃，50s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。

PCR、RT-PCR檢測PERV-gag、pol、env基因的結(jié)果均為陰性者為初篩獲得的無PERV傳染性的五指山小型豬近交系。圖3為某次RT-PCR檢測結(jié)果，結(jié)果顯示4號為初篩無PERV傳染性的五指山小型豬。

二、確證實驗

初篩共獲得11頭候選的無PERV傳染性的五指山小型豬近交系以及1頭有PERV傳染性的五指山小型豬近交系，將這12頭豬進行編號，之后通過確證實驗來最終確定初篩所得的候選無PERV傳染性的五指山小型豬近交系是否確實為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系。

確證實驗時，重新采血并分離PBMC，將PBMC與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)。共培養(yǎng)4天后，完全從共培養(yǎng)細(xì)胞中去除PBMC并使用PCR鑒定PBMC已完全去除。繼續(xù)培養(yǎng)HEK293細(xì)胞30～60天，期間在細(xì)胞匯合時即行傳代，每次傳代時收集細(xì)胞進行PCR、RT-PCR檢測PERV-gag、pol、env基因，并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清用于反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測。若PCR、RT-PCR檢測均為陰性結(jié)果，再通過反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測對其進行進一步確證，檢測結(jié)果均為陰性時，可判定該樣品確實為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系。

1、細(xì)胞共培養(yǎng)及PCR驗證豬PBMC的去除情況

對初篩獲得的11頭無PERV傳染性的五指山小型豬近交系和1頭有PERV傳染性的五指山小型豬近交系(陽性對照)重新采血并分離PBMC，將PBMC與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)。共培養(yǎng)4天后，使用細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗4遍以除盡PBMC，如上所述，運用PCR方法擴增豬種屬特異性基因以驗證豬PBMC的去除情況。結(jié)果表明共培養(yǎng)后細(xì)胞基因組DNA和陰性對照均沒有擴增出預(yù)期大小片段(圖4)。因此基本上可確認(rèn)豬PBMC已被完全去除。

2、PCR及RT-PCR檢測PERV結(jié)構(gòu)基因

繼續(xù)培養(yǎng)HEK293細(xì)胞30～60天，期間在細(xì)胞匯合時即行傳代，每次傳代時收集細(xì)胞基因組DNA和總RNA，如上所述，分別進行PCR、RT-PCR檢測PERV-gag、pol、env基因。結(jié)果顯示，在確證實驗中除8號樣品在PCR、RT-PCR檢測中出現(xiàn)了pol陽性結(jié)果外，其余待確證樣品均為陰性結(jié)果。圖5、圖6分別顯示第一次細(xì)胞傳代后的PCR及RT-PCR檢測結(jié)果。

3、反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測

每次細(xì)胞傳代前收集細(xì)胞上清，將上清離心、過濾后除去細(xì)胞碎片等，然后應(yīng)用Cavidi公司的HS-Mn RT活性檢測試劑盒(產(chǎn)品目錄號為#52030)進行反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測。參照試劑盒說明書步驟，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得直線回歸方程y＝(2E-3)x+0.204，R²＝0.996(圖7)，其中x為反轉(zhuǎn)錄酶活性，單位μU/ml，y為OD405值。然后進行樣品檢測，結(jié)果顯示，陽性對照樣品自共培養(yǎng)后21天開始出現(xiàn)陽性結(jié)果，待測樣品中有5個樣品在各時間點的OD值均未超過空白對照孔平均值的2倍，為無效值，說明這5個樣品無反轉(zhuǎn)錄酶活性，即無PERV感染性。

根據(jù)以上確證實驗的檢測結(jié)果，可知：初篩獲得的11頭候選五指山小型豬中有5頭經(jīng)確證為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系。

三、選育五指山小型豬近交系無PERV傳染性新品系

利用步驟二獲得的5頭經(jīng)確證為無PERV傳染性的五指山小型豬近交系的3頭母豬(體號為351、457、505)和2頭公豬(體號為452、1)為系祖、記為F0。采用獲得《一種獲得近交系小型豬的方法》發(fā)明專利(ZL.02149030.9)方法，F(xiàn)0公、母豬交配，妊娠、繁育生產(chǎn)的仔豬后代，經(jīng)以上步驟一和二的方法篩選的無PERV傳染性的五指山小型豬近交系個體記為F1，以后依此類推獲得的無PERV傳染性的五指山小型豬近交系分別記為F2、F3、F4、F5、……。這樣繁育方式獲得的近交系豬群體為“五指山小型豬近交系無PERV傳染性新品系”。

<110> 北京蓋蘭德生物科技有限公司

<120> 選育五指山小型豬近交系無PERV傳染性新品系的方法

<130> GNCLN170447

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 1

cccgatcagg agccctatat ccttacgtg 29

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gccctgtcaa ggaggta 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

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agtgtgctat cttatagaaa gg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gctacctctt cttgttggct atgc 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 6

caccacctgt actaaccagg tacc 24

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<213> 人工序列

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tccgagctgg tttaacaatg g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 8

tcttcttcgt ggtaactgtg agtc 24