本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

巨細(xì)胞病毒（CMV）、單純皰疹病毒（HSV）1型和2型、細(xì)小病毒B19（B19）是導(dǎo)致先天性宮內(nèi)感染及圍產(chǎn)期感染而引起圍產(chǎn)兒畸形的四種常見(jiàn)的人類皰疹病毒。這些病原體感染母體后，引起母體的相關(guān)癥狀并不明顯，但可通過(guò)胎盤垂直傳播給胎兒，從而引起胎兒及新生兒的嚴(yán)重后遺癥。新生兒感染的臨床癥狀取決于病毒類型和感染時(shí)的胎齡，胎兒感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)通常與胎齡呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，感染后可引起新生兒肺炎、聽(tīng)力異常、高膽紅素血癥等多器官損傷，也可能累及神經(jīng)系統(tǒng)造成不同程度的智力障礙及各種癱瘓、失明、失聰?shù)葒?yán)重后遺癥。因此，通過(guò)這四種病毒的篩查和監(jiān)測(cè)減少母嬰傳播是防止胎兒宮內(nèi)感染的重要手段，可減少先天性感染及降低圍產(chǎn)期發(fā)病率和死亡率，減少出生缺陷，提高出生人口素質(zhì)。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型和2型和細(xì)小病毒B19的檢測(cè)技術(shù)主要包括電子顯微鏡技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)等。這些技術(shù)各具特點(diǎn)，但因在臨床上受靈敏度、特異性、檢測(cè)周期等問(wèn)題而未能在臨床推廣應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，為病毒檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的方法，因此在臨床檢測(cè)上得到廣泛應(yīng)用。因此，該方法廣泛應(yīng)用于臨床分子診斷，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度和特異性。在核酸單重?zé)晒舛繖z測(cè)領(lǐng)域，國(guó)外已經(jīng)有針對(duì)這四種病毒的檢測(cè)方法。多重檢測(cè)領(lǐng)域，有利用核酸雜交方法對(duì)巨細(xì)胞病毒（CMV）、單純皰疹病毒1型（HSV-1）、單純皰疹病毒2型（HSV-2）、水痘帶狀皰疹病毒（VZV）、EB病毒（EBV）和人皰疹病毒6型（HHV-6）進(jìn)行同步擴(kuò)增檢測(cè)的方法。Markoulatos等人采用多重PCR結(jié)合電泳分析的方法對(duì)MV、HSV-1、HSV-2、VZV和EBV進(jìn)行檢測(cè)。Leveque等人利用多重PCR擴(kuò)增結(jié)合DNA芯片對(duì)HSV-1、HSV-2、VZV、CMV、EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8和人腸道病毒（HEVs）進(jìn)行檢測(cè)。在國(guó)內(nèi)，有針對(duì)HSV、HPV的熒光定量PCR多重檢測(cè)的報(bào)道。由此可見(jiàn)，針對(duì)多種病毒的多重PCR反應(yīng)技術(shù)已經(jīng)是相當(dāng)成熟，但未見(jiàn)這四種病毒的多重?zé)晒舛縋CR方法的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，該引物能滿足多個(gè)待檢樣品在同一個(gè)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下擴(kuò)增，引物特異性好。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的探針，該探針特異性好，檢測(cè)靈敏精確。

本發(fā)明的還一個(gè)目的在于提供一種同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的試劑盒，該試劑盒能同步實(shí)時(shí)檢測(cè)血液、體液或者分泌物標(biāo)本中巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1 型和2 型和細(xì)小病毒B19核酸是否存在，準(zhǔn)確性好，靈敏度高。

本發(fā)明的還一個(gè)目的在于提供一種含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原體檢測(cè)序列的陽(yáng)性質(zhì)粒的制備方法，該制備方法步驟簡(jiǎn)單，操作控制方便，質(zhì)量穩(wěn)定。

本發(fā)明的還一個(gè)目的在于提供一種含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原體檢測(cè)序列的陽(yáng)性質(zhì)粒，該陽(yáng)性質(zhì)粒的檢測(cè)準(zhǔn)確性好，靈敏度高。

本發(fā)明的還一個(gè)目的在于提供一種同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的方法，該方法具有準(zhǔn)確、靈敏、窗口期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，可降低母嬰垂直傳播疾病的發(fā)病率。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，包括分別用于擴(kuò)增HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4對(duì)共8條引物，8條引物分別簡(jiǎn)寫(xiě)為F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4和R4；其中，F(xiàn)1和R1的擴(kuò)增區(qū)域位于HCMV病毒全基因序列的110779-110853nt，F(xiàn)2和R2的擴(kuò)增區(qū)域位于HSV1病毒全基因序列的25851-25976nt，F(xiàn)3和R3的擴(kuò)增區(qū)域位于HSV2病毒全基因序列的29401-29487nt，F(xiàn)4和R4的擴(kuò)增區(qū)域位于B19病毒全基因序列的2975-3082nt。

優(yōu)選的，所述8條引物的序列分別為：

F1：5’-TCGGTCAGATCTACCTGGTTCA-3’

R1：5’-TGTATTCCATATGCCTCGATGTCT-3’

F2：5’-GTCCCGAGGACAGACGAGAATA-3’

R2：5’-CGGCGCTTTATYTTCCACG-3’

F3：5’-CCCAACGCAACGCCTACTAC-3’

R3：5’-GCACGAAGTGAACCAACTGC-3’

F4：5’-CCTGGGCAAGTTAGCRTACAA-3’

R4：5’-ATGAATCCTTGCAGCACTGTCM-3’。

一種同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的探針，包括分別用于檢測(cè)HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4條探針。

優(yōu)選的，所述4條探針?lè)謩e簡(jiǎn)寫(xiě)為T1、T2、T3和T4，4條探針的序列分別為：

T1：5’-CTCCGCCAGAGGACCCGCAA-3’

T2：5’-CATGAGGACCCCACACGTATGCACG-3’

T3：5’-TTTCAGGCCCTGCACCGCTCC-3’

T4：5’-ACTAACTATRTTGGGCCTGG-3’。

各引物和探針的設(shè)計(jì)如下：

1、針對(duì)HCMV的UL75基因，設(shè)計(jì)的擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為75bp，位于病毒全基因序列的110779-11085nt之間（參考序列為KR534208.1），Taqman探針熒光基團(tuán)為5`HEX，淬滅基團(tuán)為3`BHQ1，擴(kuò)增序列如下：

TCGGTCAGATCTACCTGGTTCAGAAACTGCTCCGCCAGAGGACCCGCAAAAAGACATCGAGGCATATGGAATACA。

2、針對(duì)HSV1的UL12基因，設(shè)計(jì)的擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為 126bp，位于病毒全基因序列的25851-25976nt之間（參考序列為FJ593289.1），Taqman探針熒光基團(tuán)為5`ROX，淬滅基團(tuán)為3`BHQ2，擴(kuò)增序列如下：

GTCCCGAGGACAGACGAGAATATCCAGGGACGCCCCGACCATCCCCGTGTGACCGTCCATGAGGACCCCACACGTATGCACGTTCTCTTCGGCGAGGTCGCTGGGTTCGTGGAAGATAAAGCGCCG。

3、針對(duì)HSV2的UL15基因，設(shè)計(jì)的擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為 87bp，位于病毒全基因序列的29401-29487nt之間（參考序列為JN561323.2），Taqman探針熒光基團(tuán)為5`CY5，淬滅基團(tuán)為3`BHQ2，擴(kuò)增序列如下：

CCCAACGCAACGCCTACTACAGCGTCCTGAACACGTTTCAGGCCCTGCACCGCTCCGAAGCCTTTCGGCAGTTGGTTCACTTCGTGC。

4、針對(duì)B19的VP1基因，設(shè)計(jì)的擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為 108bp，位于病毒全基因序列的2975-3082nt之間（參考序列為NC_000883.2）， TaqMan-MGB探針熒光基團(tuán)為5`FAM，擴(kuò)增序列如下：

CCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCAT。

一種同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的試劑盒，該試劑盒包括上述所述的引物和上述所述的探針。本發(fā)明的試劑盒包括四種病原體核酸擴(kuò)增試劑，其中含有熒光定量反應(yīng)液、引物、探針、Taq酶、陽(yáng)性對(duì)照等。匹配儀器可使用美國(guó)ABI公司的ABI7500熒光定量PCR儀、Bio-Rad公司的Bio-rad chromo4四通道實(shí)時(shí)定量PCR儀、Roche的Light Cycler 480實(shí)時(shí)定量PCR儀或安捷倫公司的mx3000p實(shí)時(shí)定量PCR儀及以上級(jí)別定量PCR儀等，但不局限于這些。

本發(fā)明的試劑盒的工作原理：

本發(fā)明提供的同步擴(kuò)增檢測(cè)巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型和2型和細(xì)小病毒B19的熒光定量PCR試劑盒中，有標(biāo)記了熒光基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5’端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移（FRET）而被3’端非熒光淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒(méi)有熒光信號(hào)的變化且本底低。在PCR退火和延伸過(guò)程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5’端到3’端外切活性對(duì)探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了兩基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對(duì)巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型和2型和細(xì)小病毒B19的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值（Ct，Threshold Cycle）相比較得出。Ct值是PCR過(guò)程中，熒光量的積累超過(guò)基底熒光量的循環(huán)個(gè)數(shù)，Ct值與起始模板數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。

在本發(fā)明提供的同步擴(kuò)增檢測(cè)巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型和2型和細(xì)小病毒B19核酸的熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì)巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型和2型和細(xì)小病毒B19檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，并將熒光定量PCR技術(shù)和定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型和2型和細(xì)小病毒B19同步定量檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化方案，反復(fù)試驗(yàn)，研制出同步檢測(cè)巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型和2型和細(xì)小病毒B19熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10¹個(gè)拷貝，可以滿足快速同步診斷巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型和2型和細(xì)小病毒B19的要求。

一種含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原體檢測(cè)序列的陽(yáng)性質(zhì)粒的制備方法，包括如下步驟：

a、合成HCMV、HSV1、HSV2和B19的擴(kuò)增片段；

b、將合成后的擴(kuò)增片段連接到pUC57載體上構(gòu)建各自的重組質(zhì)粒；

c、將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后大量培養(yǎng)；

d、將培養(yǎng)好的質(zhì)粒提取后放-80℃冰箱備用。

一種含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原體檢測(cè)序列的陽(yáng)性質(zhì)粒，所述陽(yáng)性質(zhì)粒根據(jù)上述所述的制備方法制得。

一種采用上述所述的試劑盒同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的非診斷方法，包括如下步驟：

（1）用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品定量，對(duì)濃度為10⁷拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板進(jìn)行10倍的系列稀釋，制備濃度分別為10⁷拷貝/μL、10⁶拷貝/μL、10⁵拷貝/μL和10⁴拷貝/μL的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品；

（2）取來(lái)自臨床樣本的四種病原體核酸和同樣量的系列稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到含有Taq DNA聚合酶和熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；

（3）通過(guò)比較待測(cè)樣品和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。

優(yōu)選的，所述步驟（2）中，PCR反應(yīng)體系（以Mx3000p/LightCycler 480為例）以40μL計(jì)為：

10×PCR buffer 4.0μL

5U/μL Taq DNA聚合酶 0.5μL

25mM MgCl₂ 3.0μL

10mM dNTPs 1.0μL

10μM引物F 0.8μL×4

10μM引物R 0.8μL×4

探針 1.6μL×4

模板DNA 2.0μL

滅菌蒸餾水 16.7μL。

優(yōu)選的，所述步驟（2）中，PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為：50℃ 2min，94℃預(yù)變性30s，循環(huán)過(guò)程使用兩步法94℃ 5s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，該引物能滿足多個(gè)待檢樣品在同一個(gè)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下擴(kuò)增，引物特異性好。

本發(fā)明的同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的探針，該探針特異性好，檢測(cè)靈敏精確。

本發(fā)明的同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的試劑盒，該試劑盒能同步實(shí)時(shí)檢測(cè)血液、體液或者分泌物標(biāo)本中巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1 型和2 型和細(xì)小病毒B19核酸是否存在，準(zhǔn)確性好，靈敏度高。

本發(fā)明的含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原體檢測(cè)序列的陽(yáng)性質(zhì)粒的制備方法，該制備方法步驟簡(jiǎn)單，操作控制方便，質(zhì)量穩(wěn)定。

本發(fā)明的含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原體檢測(cè)序列的陽(yáng)性質(zhì)粒，該陽(yáng)性質(zhì)粒的檢測(cè)準(zhǔn)確性好，靈敏度高。

本發(fā)明的同步擴(kuò)增檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的方法，該方法具有準(zhǔn)確、靈敏、窗口期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，可降低母嬰垂直傳播疾病的發(fā)病率。

本發(fā)明創(chuàng)造性地研發(fā)了一種一步法單管單酶多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型和細(xì)小病毒B19四種病原體核酸的熒光定量PCR擴(kuò)增法。本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)同管擴(kuò)增、同時(shí)完成四種對(duì)優(yōu)生優(yōu)育危害較大、較常見(jiàn)病毒的檢測(cè)。本發(fā)明的方法結(jié)合熒光探針技術(shù)和實(shí)時(shí)基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，因此，開(kāi)展這四種病毒高通量的多重PCR核酸檢測(cè)方法（MNAT）對(duì)有效防止病毒母嬰傳播、進(jìn)行優(yōu)生優(yōu)育的篩查有著十分重要和實(shí)際的意義。

本發(fā)明研發(fā)了一種實(shí)時(shí)同步多項(xiàng)檢測(cè)的基于TaqMan/MGB探針核酸同步擴(kuò)增法，其特點(diǎn)是使用單管、單酶體系試劑。

本發(fā)明的引物、探針、陽(yáng)性質(zhì)粒中含四種病原體PCR檢測(cè)擴(kuò)增片段的序列以及其互補(bǔ)序列毫無(wú)疑問(wèn)應(yīng)當(dāng)受到所申請(qǐng)要求的權(quán)利保護(hù)之內(nèi)。

本發(fā)明的試劑盒可對(duì)巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1 型和2 型和細(xì)小病毒B19進(jìn)行同步定量檢測(cè)，并可在一定程度上替代傳統(tǒng)免疫檢測(cè)的方法或者作為免疫學(xué)方法的補(bǔ)充。

本發(fā)明通過(guò)進(jìn)行快速定量多重核酸檢測(cè)試劑研究，解決產(chǎn)業(yè)化相關(guān)的生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)問(wèn)題，組裝出4種嚴(yán)重傳染病的病原多重定量基因檢測(cè)試劑盒，以克服傳統(tǒng)蛋白檢測(cè)固有的缺陷和不足，同時(shí)彌補(bǔ)現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品的諸多不足，避免這四種重大傳染病的血液源傳播。本發(fā)明的同步多項(xiàng)檢測(cè)試劑最突出的優(yōu)點(diǎn)在于該檢測(cè)試劑的優(yōu)秀的靈敏度，使其能滿足臨床同步篩查的極其苛刻的要求。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

1、特異性好，靈敏度高，定量準(zhǔn)確；

2、檢測(cè)速度快，僅1小時(shí)，加上樣品核酸的提取制備，不到2.5小時(shí)；

3、使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品成本低廉；

4、可同時(shí)進(jìn)行高通量（四種）的樣品檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明四重FQ-PCR方法檢測(cè)HCMV的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2是本發(fā)明四重FQ-PCR方法檢測(cè)HSV1的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3是本發(fā)明四重FQ-PCR方法檢測(cè)HSV2的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖4是本發(fā)明四重FQ-PCR方法檢測(cè)B19的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖5是本發(fā)明四重FQ-PCR方法同步檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV2和B19的擴(kuò)增曲線圖；

圖6是本發(fā)明四重FQ-PCR方法檢測(cè)臨床標(biāo)本的擴(kuò)增曲線圖。

具體實(shí)施方式

為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合實(shí)施例及附圖1-4對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，實(shí)施方式提及的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如：J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第二版）：D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南：呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1：使用試劑盒制備巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1 型和2 型和細(xì)小病毒B19標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多重檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立（以安捷倫公司的mx3000p為例）

材料：

a、10×PCR緩沖液 4μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，25mM MgCl₂ 3.0μL，10mM dNTPs 1.0μL，10μmol/L的HCMV、HSV1、HSV2和B19的上下游引物各0.8μL，10μmol/L的HCMV、HSV1、HSV2和B19的探針各1.6μL，模板DNA 2μL,無(wú)菌雙蒸水16.7μL，反應(yīng)液總體系為40μL；

b、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板貯存液：濃度為10⁷拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，再進(jìn)行10倍系列稀釋；

c、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品：為無(wú)菌雙蒸水。

方法：

A、將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋到10⁷拷貝/μL，10⁶拷貝/μL，10⁵拷貝/μL，10⁴拷貝/μL。

B、分別取熒光定量PCR反應(yīng)液各38μL，取陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板2μL，并設(shè)陰性對(duì)照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量PCR儀上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為: 50℃2min，94℃預(yù)變性30s，循環(huán)過(guò)程使用兩步法94℃ 5s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。同步檢測(cè)FAM、HEX、ROX和CY5。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)，陰性對(duì)照為0；

圖1-4為四重FQ-PCR方法檢測(cè)HCMV，HSV1， HSV2和B19的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖所示，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度在1.0×10⁷-1.0×10⁴copies/ reaction時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系（其斜率均在-3.3±0.3之間、截距均＜45、R2＞0.99。）反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)三次，得到的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P>0.05，數(shù)據(jù)差異無(wú)顯著意義，說(shuō)明其不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。圖5為四重FQ-PCR方法同步檢測(cè)HCMV、HSV1、HSV12和B19陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，濃度分別為1.0×10⁷copies/ reaction、1.0×10⁶copies/ reaction、1.0×10⁵copies/ reaction和1.0×10⁴copies/ reaction，結(jié)果顯示擴(kuò)增效率良好，各種病毒無(wú)互相干擾。

實(shí)施例2：多重檢測(cè)試劑盒檢測(cè)臨床樣本實(shí)例（以安捷倫公司的mx3000p為例）

分別取熒光定量PCR反應(yīng)液各38μL，取陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板2μL，并設(shè)陰性對(duì)照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量PCR儀上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為: 50℃ 2min，94℃預(yù)變性30s，循環(huán)過(guò)程使用兩步法94℃ 5s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。同步檢測(cè)FAM、HEX、ROX和CY5。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，讀取結(jié)果。見(jiàn)圖6，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和臨床樣本的擴(kuò)增曲線，呈現(xiàn)平滑的S型，顯示擴(kuò)增效率較好。根據(jù)實(shí)施1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以進(jìn)行病毒定量結(jié)果計(jì)算。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實(shí)現(xiàn)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見(jiàn)的替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。