本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測甲胎蛋白的單克隆抗體及試劑盒和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人甲胎蛋白(humanalphafetoprotein，hafp)是一種由胎兒肝細胞和卵黃囊合成出的胚胎性糖蛋白，其功能與人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)相似，可視其為胎兒發(fā)育時期的hsa替代物。正常情況下，hafp僅存在于胎兒血清中，胎兒出生一年后hafp濃度可降回正常人水平(<5ng/ml)，正常人血清中的濃度一般不高于20ng/ml。當(dāng)身體發(fā)生原發(fā)性肝癌時，肝癌細胞可大量分泌hafp于外周血中，引發(fā)血液hafp濃度的異常升高。
hafp是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物之一，其長期以來被作為肝癌、胎兒缺陷以及胚胎相關(guān)癌的重要血清分子標(biāo)記物，是血液檢驗中的重要評價指標(biāo)分子。除應(yīng)用于產(chǎn)前診斷和肝細胞癌診斷外，hafp的血液檢測對肝損傷、肝硬化、肝炎、腸胃癌、神經(jīng)管損傷、內(nèi)胚竇瘤、生殖系統(tǒng)癌癥等疾病的診斷及病情監(jiān)控也具有重要意義。
中國是個人口大國，產(chǎn)前診斷與每個家庭都息息相關(guān)；同時，中國又是一個肝癌高發(fā)地區(qū)，每年死于肝癌的人數(shù)占全世界的40％以上，由于中晚期肝癌基本無有效治療方法，所以對原發(fā)性肝癌特異性腫瘤抗原h(huán)afp血液濃度的全民普查和早期診斷是解決肝癌高死亡率問題的最有效措施。因此，提供靈敏、特異、準確、簡便、低成本的血清hafp檢測方法迎合了社會的迫切需要。
人甲胎蛋白(hafp)作為原發(fā)性肝癌最特異的腫瘤標(biāo)志物和產(chǎn)前診斷監(jiān)測分子，其單克隆抗體具有極其重要的實際應(yīng)用意義。雖然國內(nèi)外均已成功制備了抗hafp單抗，但其大多數(shù)并不具備臨床應(yīng)用價值，無法用于試劑盒研發(fā)和生產(chǎn)。在國內(nèi)外現(xiàn)售的hafp檢測elisa試劑盒產(chǎn)品中，線性檢測范圍均在20-400ng/ml以內(nèi)，其中進口試劑盒的整體品質(zhì)明顯優(yōu)于國產(chǎn)產(chǎn)品，但其線性范圍和靈敏度仍有待進一步提高。此外，由于血清中成分復(fù)雜易出現(xiàn)假陽性，hafp濃度變化范圍極大(5ng/ml-10mg/ml)，故在實際檢測應(yīng)用中均采用雙抗體夾心elisa(das-elisa)兩步法以提高檢測準確度和穩(wěn)定性，該方法要求用于配對的捕獲抗體和檢測抗體都具有很高的親和力和好的特異性，且形成“抗體1-抗原-抗體2”復(fù)合物時空間位置距離越遠配對效果越好，故不斷開發(fā)具有更高靈敏度、更好線性檢測范圍的雙抗體夾心配對抗體是試劑盒研發(fā)的努力方向，也是臨床檢測的需要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供能特異性結(jié)合人甲胎蛋白不同表位的單克隆抗體，并建立雙抗體夾心elisa方法對人血清中的甲胎蛋白進行檢測。
本發(fā)明的目的是提供一組靶向人甲胎蛋白(humanalphafetoprotein，hafp)不同表位的鼠源性單克隆抗體，要求抗體能高親和力、高特異性的結(jié)合人甲胎蛋白，并形成雙抗體夾心模式，從而能夠?qū)θ思滋サ鞍走M行定量檢測。
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測甲胎蛋白的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測甲胎蛋白的試劑盒。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
一種高特異性高親和力結(jié)合人甲胎蛋白的單克隆抗體，該單克隆抗體為ab1、ab3或ab4，單克隆抗體ab1、ab3或ab4的可變區(qū)基因均包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；
所述單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.8所示；
所述單克隆抗體ab3的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.9所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.10所示；
所述單克隆抗體ab4重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.11所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.12所示。
進一步的，上述單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.1所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.2所示；
所述單克隆抗體ab3重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.3所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.4所示；
所述單克隆抗體ab4重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.5所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.6所示。
一種檢測人甲胎蛋白的試劑盒，該試劑盒中含有上述任一項所述的單克隆抗體。
一種檢測人甲胎蛋白的雙抗體夾心elisa試劑盒，該試劑盒中含有上述任一所述的單克隆抗體ab1和ab4，或者ab3和ab4，或者ab1、ab3和ab4。
進一步的，上述的單克隆抗體ab1或/和ab3為捕獲抗體，所述的單克隆抗體ab4為檢測抗體。
一種檢測人甲胎蛋白的雙抗體夾心elisa方法，該方法以上述任一所述的單克隆抗體ab1或/和ab3作為捕獲抗體，以上述任一所述的單克隆抗體ab4作為檢測抗體；該方法用于非疾病的診斷或治療。
進一步的，上述方法具體包括以下步驟：
s1.包被：用含單克隆抗體ab1或/和ab3的溶液對包被板進行過夜包被；
s2.封閉：將包被有ab1或/和ab3的包被板用pbst洗滌干凈，再用脫脂奶粉或bsa進行封閉；
s3.加抗原：將封閉好的包被板用pbst洗滌干凈，加入待檢測血漿樣本，孵育50～70min；
s4.加二抗：將孵育樣本后的包被板用pbst洗滌干凈，加入二抗hrp-ab4，孵育30～50min；
s5.用pbst洗滌干凈，拍干后加入tmb顯色液，室溫避光孵育后終止顯色，酶標(biāo)儀讀取od450值。
上述任一項所述的單克隆抗體在制備肝癌早期診斷試劑盒或試劑中的應(yīng)用。
上述任一項所述的單克隆抗體在制備檢測人甲胎蛋白的試劑盒或試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是：
1)本發(fā)明公開了能特異性結(jié)合人甲胎蛋白的鼠源性單克隆抗體，該抗體能結(jié)合人甲胎蛋白的不同表位，形成雙抗體夾心模式，實現(xiàn)人血清中的甲胎蛋白的定量檢測，對產(chǎn)前診斷及肝癌早期診斷具有一定作用。
2)本發(fā)明ab1、ab3、ab4這3株單抗均能在人肝癌細胞和肝癌組織中特異性識別人源的天然hafp，且ab1、ab3、ab4與高濃度的交叉蛋白hsa無反應(yīng)，具有很好的特異性。
3)本發(fā)明ab1/hrp-ab4、ab3/hrp-ab4這2對配對抗體組合的檢測靈敏度均為5ng/ml，線性檢測范圍10～200ng/ml，檢測上線400ng/ml。ab1+ab3/hrp-ab4配對組合的線性檢測范圍約為5-250ng/ml，檢測下限可達2ng/ml，檢測上限400ng/ml。
4)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的抗體ab1、ab3和ab4對hafp具有很好的檢測效果，尤其是利用抗體配對組合ab1+ab3/hrp-ab4對樣品進行雙抗體夾心elisa檢測時，其線性檢測范圍為5～250ng/ml，最低檢測限2ng/ml，檢測上限400ng/ml，優(yōu)于進口試劑盒(abcamelisakit)的線性范圍5～200ng/ml和最低檢測限5ng/ml；臨床樣品檢測結(jié)果顯示本發(fā)明檢測方法的陽性血清檢測準確率100％，陰性血清準確率100％。說明本發(fā)明建立的雙抗體夾心elisa方法具有更大的線性范圍，具有更好的推廣應(yīng)用價值。
附圖說明
圖1為單克隆抗體ab1～ab4的相對親和力測定
圖2為單抗ab1-ab4對hepg2人肝癌細胞進行免疫熒光染色檢測；
圖3為單抗ab1-ab4對人原發(fā)性肝癌組織的進行免疫組化檢測；
圖4為ab1抗體重鏈可變區(qū)3個cdr(互補決定簇)區(qū)；
圖5為ab1抗體輕鏈可變區(qū)3個cdr(互補決定簇)區(qū)；
圖6為ab3抗體重鏈可變區(qū)3個cdr(互補決定簇)區(qū)；
圖7為ab3抗體輕鏈可變區(qū)3個cdr(互補決定簇)區(qū)；
圖8為ab4抗體重鏈可變區(qū)3個cdr(互補決定簇)區(qū)；
圖9為ab4抗體輕鏈可變區(qū)3個cdr(互補決定簇)區(qū)；
圖10為不同配對抗體的雙抗體夾心elisa的檢測曲線；
圖11為配對抗體ab1/hrp-ab4雙抗體夾心elisa檢測的線性標(biāo)準曲線；
圖12為配對抗體ab3/hrp-ab4雙抗體夾心elisa檢測的線性標(biāo)準曲線；
圖13為配對抗體ab1+ab3/hrp-ab4雙抗體夾心elisa檢測的線性標(biāo)準曲線。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
實施例1單克隆抗體的制備
抗原人甲胎蛋白(humanmyoglobin)購自桂林英美特生物技術(shù)有限公司，分離純化自人臍帶血，其濃度為7,6mg/ml，為天然的人甲胎蛋白分子，分子量為69kda，由609個氨基酸殘基組成。hafp是一種在胎兒時期高表達、出生后表達沉默的多功能轉(zhuǎn)運蛋白。血清hafp濃度是多種疾病的直接或間接的評價指標(biāo)，尤其常見于產(chǎn)前診斷和肝癌的診斷及病情監(jiān)控。
抗人甲胎蛋白鼠源性單克隆抗體的制備方法如下：
(1)動物免疫
1)初次免疫：30μg抗原加等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后對小鼠進行皮下多點注射；
2)二次免疫：2周后，與初次免疫同樣的抗原量加等量弗氏不完全佐劑充分乳化后皮下多點注射；
3)三次免疫：2周后，與初次免疫同樣的抗原量加等量弗氏不完全佐劑充分乳化后皮下多點注射(10天后尾靜脈采血測其效價)；
4)加強免疫：三次免疫效價達到細胞融合要求后，用初次免疫同樣的抗原量不加佐劑進行腹腔注射；
5)72h后取脾臟融合。
(2)細胞融合
1)飼養(yǎng)細胞的制備：取一只健康的balb/c小鼠，摘眼球采血，待血放干凈以后，頸脫臼處死，體表消毒和固定后，從大腿上剪開皮膚，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用5ml注射器注射10mlrpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(rpmimedium1640basic，gibco購買，貨號8114056，使用前加入青霉素與鏈霉素，加入量為每100ml培養(yǎng)基加入1ml含100u的青霉素與鏈霉素雙抗)到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部，抽回腹腔內(nèi)液體，注入已準備好的無菌10ml離心管中，1000rmp離心7分鐘，用10％胎牛血清rpmi1640(含hat)完全培養(yǎng)基重懸，稀釋約為2×105個/ml,隨后加入到96孔板中，每孔100μl,置于細胞培養(yǎng)箱(37℃，5％co2)中備用。
2)取對數(shù)生長的小鼠骨髓瘤細胞sp2/0，用rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌，吹懸稀釋后計數(shù)；
3)取小鼠脾臟，rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌、碾磨制備單個脾細胞懸液，計數(shù)；
4)將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10的比例混合在一起，1000rpm離心7min；
5)棄上清，用滴管吸盡殘余液體，在37℃水浴條件下1min內(nèi)逐滴加入1ml的聚乙二醇(peg)，靜置90秒，2～4min內(nèi)逐滴加入15mlrpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止反應(yīng)；
6)1000rpm離心7min，棄上清，用100ml10％胎牛血清rpmi1640(含hat)輕輕混懸；滴加于預(yù)先鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，100μl/孔；37℃，5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
(3)融合細胞的篩選與克隆化
1)于細胞融合后第7天左右取細胞培養(yǎng)上清，用包被有30ng/孔人甲胎蛋白的elisa板進行間接elisa檢測，篩選陽性孔；用免疫小鼠融合前取的血清作為陽性對照，用sp2/0上清作為陰性對照。最終篩選出14株陽性細胞株。
2)將該14株細胞株經(jīng)3～4次連續(xù)克隆化實驗后，發(fā)現(xiàn)其中3株細胞株上清的效價不穩(wěn)定，不符合要求。最終，通過克隆化共篩選得到12株能夠穩(wěn)定分泌抗hafp單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞株(命名為ab1～ab12)，基本可滿足進一步的抗體配對實驗要求。
(4)腹水型單克隆抗體的制備
1)取10周齡雌性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐劑；
2)1周后于小鼠腹腔接種約5*105個雜交瘤細胞，細胞接種7～12天后可誘生腹水；
3)待腹水盡可能多時抽取腹水；
4)間隔1～2天，待腹水再生積聚后，同法再抽，抽取后腹水3000rpm離心10min，取上清置于-20℃保存。
(5)單克隆抗體的純化及效價檢測
1)取腹水4℃12000rpm離心30min，取上清；
2)持續(xù)攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨溶液，4℃靜置過夜；
3)過夜后的液體于7500rpm，4℃離心30min，棄上清，沉淀用0.1mpbs復(fù)溶；
4)將復(fù)溶液用脫鹽柱進行脫鹽處理，具體操作步驟如下：
①平衡柱子：用0.1mpbs(5～10倍柱體積)，平衡柱子，沖出柱內(nèi)20％乙醇，將核酸蛋白儀調(diào)零；
②上樣：上樣前，先將恒流泵關(guān)閉，再緩慢上樣，上樣完畢后持續(xù)通入0.1mpbs，當(dāng)a值開始上升時，收集液體(目的蛋白)，當(dāng)a值下降到10以下時停止收集。收集的樣本繼續(xù)進行下一步的純化。
③平衡柱子：當(dāng)a值為“0”時，用0.1mpbs(5倍以上柱體積)過柱；
④保存：用20％乙醇(5倍柱體積)過柱子，保存柱子。
5)proteing親和層析柱純化脫鹽后的蛋白。
純化步驟如下：
①裝柱平衡柱子：用0.1mpbs(5～10倍柱體積)，平衡柱子，沖出柱內(nèi)20％乙醇，將核酸蛋白儀調(diào)零；
②上樣：上樣前，先將恒流泵關(guān)閉，再緩慢上樣，當(dāng)a值開始上升時，收集液體(雜蛋白)防止蛋白質(zhì)未結(jié)合上柱子，當(dāng)樣品即將上樣完畢時加入0.1mpbs稀釋，使蛋白質(zhì)幾乎完全上柱；
③洗脫：當(dāng)a值降至“0”時，用洗脫液洗脫目的蛋白，當(dāng)a值開始上升時收集液體(由于蛋白質(zhì)帶負電，呈弱堿性，收集管中預(yù)先加入一定量中和液，使收集液ph保持在7.0以上)；
④平衡柱子：當(dāng)a值為“0”時，用0.1mpbs(5倍以上柱體積)過柱；
⑤保存：用20％乙醇(5倍柱體積)過柱子，保存柱子。
⑥蛋白質(zhì)超濾濃縮后取少量進行sds-page凝膠電泳鑒定純度，并采用elisa方法檢測抗體效價。
成功篩選得到12株能夠穩(wěn)定分泌抗hafp單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其中有5株分泌的單克隆抗體抗(ab1～ab5)具有極高的腹水效價，可達高達3000萬。
(6)單克隆抗體的相對親和力檢測
根據(jù)腹水中igg抗體濃度，分別將上述篩選出的12株單抗的腹水或上清稀釋至igg抗體濃度105ng/ml，10倍比梯度稀釋并繪圖(如圖1)。
當(dāng)抗體稀釋曲線到達od450最大值的一半時，所對應(yīng)igg抗體濃度(p50值，50％ofmaximalbinding)越低，代表其對應(yīng)親和力越高。如圖1所示，在制備得到的12株單抗中，有4株抗體(ab1～ab4)的親和力高于或接近于進口標(biāo)準抗體afp-01(標(biāo)01，圖中以箭頭標(biāo)出)和afp-11(標(biāo)11，圖中以箭頭標(biāo)出)，表明這5株抗體具有極高的親和力，是潛在最優(yōu)配對抗體的選擇。
經(jīng)上述相對親和力測定，成功篩選得到12株能夠穩(wěn)定分泌抗hafp單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其中有4株分泌的單克隆抗體(ab1～ab4)的親和力高于或近似于abcam配對抗體afp-01和afp-11的親和力，故表明這4株單抗均已達到商用配對抗體的親和力要求。
實施例2單克隆抗體的特異性分析
上述篩選出的4株重要單抗ab1-ab4對免疫原h(huán)afp均有非常高的親和力，為進一步鑒定其特異性，驗證其是否能夠與天然存在的hafp特異性結(jié)合，于是分別在細胞層面和組織層面設(shè)計了以下兩個實驗。
1)hepg2人肝癌細胞免疫熒光染色
已知人肝癌細胞hepg2在胞內(nèi)能大量合成hafp，使用ab1-ab4這4株單抗進行細胞熒光染色實驗。
實驗方法：①實驗前一天，取狀態(tài)良好的hepg2細胞制成細胞懸液，經(jīng)細胞計數(shù)，以細胞濃度5×105個/孔的量鋪入已放置有蓋玻片的六孔板孔中；②培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一天，待細胞匯合度達到70％左右時開始染色步驟；③pbs沖洗蓋玻片一遍，棄盡液體后，用4％多聚甲醛固定細胞細胞10min，后pbs洗3次，5min/次；④用pbs配制3％的triton-x100溶液，對細胞進行膜透化，處理10min，pbs洗3次，5min/次；⑤5％脫脂奶粉封閉30min，pbs洗3次；⑥加入適當(dāng)稀釋的制備單抗于蓋玻片上，以無關(guān)抗體做陰性對照組，37℃孵育1h，pbs洗3次；⑦加入1:100倍稀釋的fitc標(biāo)記驢抗小鼠igg二抗，37℃孵育40min，pbs洗2次；⑧加入0.5ug/ml的dapi染色液染色10min，pbs洗3次；⑨加入20ul封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察(400×)并儲存結(jié)果。
實驗結(jié)果：觀察結(jié)果顯示(圖2，放大倍數(shù)：400×)，在4株單抗對應(yīng)的實驗組中，hepg2細胞內(nèi)均呈現(xiàn)明顯綠色熒光，而無關(guān)抗體對照組細胞未觀察到綠色熒光，說明ab1-ab4單抗特異性得識別了人肝癌細胞胞漿內(nèi)的hafp分子，證明該4株單抗均能夠特異識別天然產(chǎn)生的人源afp分子。
2)人肝癌組織免疫組化：
當(dāng)人體發(fā)生原發(fā)性肝癌時,肝癌細胞可分泌大量afp于外周血中。對原發(fā)性肝癌患者的肝組織做免疫組化分析。
實驗方法：①固定和包埋：4％多聚甲醛固定組織塊，經(jīng)70％乙醇30min、80％乙醇30min、90％乙醇30min2次、95％乙醇30min2次、100％乙醇30min2次、二甲苯透明30min2次、55℃石蠟中30min2次，模具中蠟包埋組織塊；②切片：將厚度3-5um的組織切片置于多聚賴氨酸活化的載玻片上，60℃過夜；③脫蠟、入水：將切片浸于二甲苯5min2次、100％乙醇5min2次、95％乙醇5min2次、90％乙醇5min2次、85％乙醇5min2次、75％乙醇5min2次，pbs洗2次；④1％甲醇雙氧水室溫10min，蒸餾水洗1次，pbs洗3次；⑤將切片置入0.01m檸檬酸鹽緩沖液(ph6.0)中修復(fù)，微波爐內(nèi)10min，pbs洗3次；⑥封閉：5％脫脂奶粉封閉，室溫20min，不洗；⑦切片上分別滴加適度稀釋的酶標(biāo)抗體(ab1-hrp、ab2-hrp、ab3-hrp、ab4-hrp)，4℃過夜，pbs洗5次；⑧切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(s-a/hrp)，37℃20min，pbs洗3次；⑨dab顯色：使用dab顯色試劑盒1ml蒸餾水加顯色劑a、b、c各一滴，混勻，加至標(biāo)本上，顯色6min，水洗終止；⑩蘇木素復(fù)染細胞核1min，水洗、1％鹽酸酒精分化、1％胺水反藍、水洗、經(jīng)70％乙醇5min、80％乙醇5min、90％乙醇5min2次、95％乙醇5min2次、100％乙醇5min2次脫水、二甲苯透明5min2次，中性樹脂封片。
實驗結(jié)果：檢測結(jié)果顯示(圖3，放大倍數(shù)：400×)，在4株單抗ab1～ab4對應(yīng)的肝癌組織切片中，大部分細胞的胞漿部分被染成褐色，表明這些細胞有大量分泌hafp的能力，即為癌變的肝細胞，為被染成棕色的細胞可能為未發(fā)生癌變的肝細胞。同時，組化結(jié)果還表明了ab1～ab4這4株單抗均能夠特異性識別并結(jié)合肝癌組織中肝癌細胞胞漿內(nèi)的hafp分子。
3)交叉反應(yīng)分析
已知hafp的主要交叉反應(yīng)蛋白為人血清白蛋白hsa，仿照人血液中hsa濃度，以40mg/ml濃度的hsa作為交叉反應(yīng)原，通過間接elisa法檢測單抗ab1～ab4是否對人血清白蛋白has存在交叉反應(yīng)。實驗設(shè)立hsa交叉反應(yīng)組和pbs陰性對照組。實驗重復(fù)3次。(afp400ng/ml，hsa40mg/ml)
間接elisa測定法的具體操作方法為：用0.05mph9.6的碳酸鹽緩沖液(包被液)稀釋hafp抗原至500ng/ml，100μl/孔37℃包被3h或4℃過夜，pbs-t洗板3次，3min/次；5％脫脂奶粉200μl/孔37℃封閉1h，pbs-t洗3次；將待測小鼠多抗血清和陰性對照血清，均以2倍比梯度倍比稀釋，加入孔中100ul/孔，37℃孵育1h，pbs-t洗3次；加hrp標(biāo)記羊抗小鼠igg抗體(1:8000稀釋)100ul，37℃孵育40min，pbs-t洗滌5次；tmb底物顯色，37℃避光顯色10min；2mh2so450μl/孔終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀波長450nm測a值。
檢測結(jié)果顯示，單抗ab1～ab4與hsa完全無交叉反應(yīng)。
上述單抗特異性鑒定結(jié)果顯示，ab1～ab4這4株單抗均能在人肝癌細胞和肝癌組織中特異性識別人源的天然hafp，且ab1～ab4與高濃度的交叉蛋白hsa無反應(yīng)。
實施例3單克隆抗體ab1～ab4的序列和結(jié)構(gòu)分析
對所得到的單克隆抗體ab1、ab3、ab4作進一步的序列和結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)ab1、ab3、ab4的可變區(qū)均包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。
(1)從基因序列層面來看：
單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.1所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.2所示；
單克隆抗體ab3重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.3所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.4所示；
單克隆抗體ab4重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.5所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.6所示。
(2)從多肽序列層面來看：
單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.8所示；
單克隆抗體ab3的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.9所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.10所示；
單克隆抗體ab4重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.11所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.12所示。
(3)可變區(qū)的結(jié)構(gòu)特征
所述ab1重鏈可變區(qū)由360個堿基組成，編碼119個氨基酸，可變區(qū)含有3個cdr(互補決定簇)區(qū)。cdr1編碼5個氨基酸，cdr2編碼17個氨基酸，cdr3編碼11個氨基酸(如圖4所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性高于91％，而3個cdr區(qū)則是特異性序列，與其他鼠源性抗體重鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。
單克隆抗體ab1輕鏈可變區(qū)由314個堿基組成，編碼104個氨基酸，可變區(qū)含有3個cdr(互補決定簇)區(qū)。cdr1編碼11個氨基酸，cdr2編碼7個氨基酸，cdr3編碼9個氨基酸(如圖5所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性高于97.1％，而3個cdr區(qū)則為特異性序列，與其他鼠源性抗體輕鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。
單克隆抗體ab3重鏈可變區(qū)由357個堿基組成，編碼119個氨基酸，可變區(qū)含有3個cdr(互補決定簇)區(qū)。cdr1編碼5個氨基酸，cdr2編碼17個氨基酸，cdr3編碼11個氨基酸(如圖6所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性高于94.8％，而3個cdr區(qū)則是特異性序列，與其他鼠源性抗體重鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。
單克隆抗體ab3輕鏈可變區(qū)由314個堿基組成，編碼104個氨基酸，可變區(qū)含有3個cdr(互補決定簇)區(qū)。cdr1編碼11個氨基酸，cdr2編碼7個氨基酸，cdr3編碼9個氨基酸(如圖7所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性高于97.1％，而3個cdr區(qū)則為特異性序列，與其他鼠源性抗體輕鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。
單克隆抗體ab4重鏈可變區(qū)由357個堿基組成，編碼119個氨基酸，可變區(qū)含有3個cdr(互補決定簇)區(qū)。cdr1編碼5個氨基酸，cdr2編碼17個氨基酸，cdr3編碼11個氨基酸(如附圖8所示)。可變區(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性高于95.2％，而3個cdr區(qū)則是特異性序列，與其他鼠源性抗體重鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。
單克隆抗體ab4輕鏈可變區(qū)由324個堿基組成，編碼108個氨基酸，可變區(qū)含有3個cdr(互補決定簇)區(qū)。cdr1編碼15個氨基酸，cdr2編碼7個氨基酸，cdr3編碼8個氨基酸(如圖9所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性大于95.6％，而3個cdr區(qū)則為特異性序列，與其他鼠源性抗體輕鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。
本發(fā)明獲得的3株抗人甲胎蛋白抗體(ab1、ab3、ab4)的功能由抗體輕、重鏈可變區(qū)抗原互補決定族(complementaritydetermingregionscdrs)cdr1、cdr2、cdr3(功能活性區(qū))中特異性核苷酸序列決定的，其相應(yīng)的氨基酸序列構(gòu)成了抗體特異性結(jié)合人甲胎蛋白上的不同表位。
實施例4雙抗體夾心elisa檢測的抗體配對
選擇純化、hrp標(biāo)記的7株單抗(ab1、ab2、ab3、ab4、ab5、ab6、ab10)用于抗體配對實驗。實驗設(shè)立hsa交叉反應(yīng)組和pbs陰性對照組。實驗重復(fù)3次。(afp400ng/ml，hsa40mg/ml)。
雙抗體夾心elisa檢測方法的具體步驟如下：
s1.包被：將捕獲單克隆抗體用ph9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度3～8μg/ml，100μl每孔加入包被板，4℃包被過夜；
s2.封閉：pbst(含0.05％吐溫)洗滌3次，3min/次，用5％脫脂奶粉或2％bsa進行封閉，每孔200μl，37℃孵育1h；
s3.加抗原：pbst洗滌3次，3min/次，拍干后依次加入人n端腦鈉肽前體抗原(10～10000g/ml)，每孔50μl，37℃孵育1h；
s4.加二抗：pbst洗滌3～5次，用5％脫脂奶粉8000倍稀釋二抗(hrp標(biāo)記的檢測抗體)，每孔50μl，37℃孵育45min；
s5.用pbst洗滌3～5次，每次3min，拍干后加入tmb顯色液，室溫避光孵育10～15min后終止，酶標(biāo)儀讀取od450值。
表1雙抗體夾心elisa法篩選配對抗體
注：“+”數(shù)量代表od450值的高低：“+”>1.0，“++”>2.0，“+++”>3.0；“-”代表od450值<0.5；“*”代表有交叉反應(yīng)。
配對結(jié)果如表1所示，在49(7×7)種抗體配對組合中，有13種組合可形成雙抗體夾心配對，其中配對效果較好的有8對抗體，與hsa完全無交叉反應(yīng)且具有較好配對效果的共有4種組合：ab1/hrp-ab2、ab1/hrp-ab4、ab3/hrp-ab2、ab3/hrp-ab4。
實施例5雙抗體夾心elisa檢測的靈敏度及線性檢測范圍
實驗方法：分別以ab1、ab3、ab1+ab3(捕獲抗體ab1和ab3以1:1混合)作為捕獲抗體，以hrp-ab4為檢測抗體，利用雙抗體夾心elisa檢測法(實施例4中所述)進行檢測，并給制相應(yīng)的檢測曲線和標(biāo)準曲線，檢測不同捕獲抗體條件下各雙抗體夾心elisa檢測的靈敏度及線性檢測范圍。
實驗結(jié)果：
圖10為不同配對抗體的雙抗體夾心elisa的檢測曲線；圖11～13分別為配對抗體ab1/hrp-ab4、ab3/hrp-ab4、ab1+ab3/hrp-ab4雙抗體夾心elisa檢測的線性標(biāo)準曲線。
從圖10～13中可以看出，ab1/hrp-ab4、ab3/hrp-ab4這2對配對抗體組合的檢測曲線十分相近，其檢測靈敏度均為5ng/ml，線性檢測范圍10～200ng/ml，檢測上線400ng/ml。
當(dāng)使用相同濃度的hrp-ab4為檢測抗體時，將捕獲抗體ab1和ab3以1:1混合包被時，ab1+ab3/hrp-ab4相比于ab1/hrp-ab4和ab3/hrp-ab4，其靈敏度及線性檢測范圍均有輕微提高；在檢測曲線的底部和頂部，ab1+ab3/hrp-ab4的od值明顯高于ab1/hrp-ab4和ab3/hrp-ab4(圖10)，且ab1+ab3/hrp-ab4配對組合的線性檢測范圍約為5～250ng/ml，檢測下限2ng/ml，檢測上限400ng/ml(圖10和13)。這表明混合包被組ab1+ab3/hrp-ab4捕獲抗原的能力及形成雙抗體夾心復(fù)合物的能力均比單獨包被組有輕微提高。
實施例6本發(fā)明雙抗體夾心elisa檢測在臨床樣本檢測中的應(yīng)用
共收集了hafp陽性患者血清120例(孕婦118例，原發(fā)性肝癌2例)，陰性正常人血清40例，分別用本發(fā)明配對抗體ab1+ab3/hrp-ab4雙抗體夾心elisa和進口的abcamelisakit進行檢測，統(tǒng)計二者的樣檢準確率(表2)。
本發(fā)明配對抗體ab1+ab3/hrp-ab4雙抗體夾心elisa檢測方法的步驟：
s1.包被：捕獲抗體ab1和ab3以1:1混合，用ph9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度7.5μg/ml，100μl每孔加入包被板，4℃包被過夜；
s2.封閉：pbst(含0.05％吐溫)洗滌3次，3min/次，用5％脫脂奶粉或2％bsa進行封閉，每孔200μl，37℃孵育1h；
s3.加抗原：pbst洗滌3次，3min/次，拍干后加入不同濃度的用樣本稀釋液兩倍稀釋的人甲胎蛋白標(biāo)準抗原和人血清樣本，加入量80μl；37℃孵育1h；
s4.加二抗：pbst洗滌3～5次，用5％脫脂奶粉8000倍稀釋二抗(hrp標(biāo)記的檢測抗體hrp-ab4)，每孔50μl，37℃孵育1h；
s5.用pbst洗滌5次，3min/次，拍干后加入顯色液，室溫避光孵育10min后終止，酶標(biāo)儀讀取od450值。
同時，用進口試劑盒(購自abcam公司，貨號ab108631)對hafp陽性患者血清120例(孕婦118例，原發(fā)性肝癌2例)和陰性正常人血清40例進行檢測，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。記錄二者的檢測結(jié)果，驗證樣本檢測的準確度。
表2不同方法檢測樣品的檢測結(jié)果
統(tǒng)計結(jié)果顯示(表2)，使用本發(fā)明配對抗體組合ab1+ab3/hrp-ab4建立的hafp檢測方法與abcamelisakit均能夠有效檢測人血清中的afp分子。其中，進口試劑盒對陰、陽性血清樣品的檢測準確率均為100％，檢測穩(wěn)定、準確；證明本發(fā)明檢測方法能夠很好地檢測出血清中的hafp抗原。
綜上所述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的抗體ab1、ab3和ab4對hafp具有很好的檢測效果，尤其是利用抗體配對組合ab1+ab3/hrp-ab4對樣品進行雙抗體夾心elisa檢測時，其線性檢測范圍為5～250ng/ml，最低檢測限2ng/ml，檢測上限400ng/ml，優(yōu)于進口試劑盒(abcamelisakit)的線性范圍5～200ng/ml和最低檢測限5ng/ml；臨床樣品檢測結(jié)果顯示本發(fā)明檢測方法的陽性血清檢測準確率100％，陰性血清準確率100％。說明本發(fā)明建立的雙抗體夾心elisa方法具有更大的線性范圍，具有更好的推廣應(yīng)用價值。用本發(fā)明抗體建立的雙抗體夾心elisa方法能用于人甲胎蛋白的檢測，進行產(chǎn)前診斷及肝癌的早期診斷，具有很好的商業(yè)應(yīng)用價值。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
sequencelisting
<110>廣東谷盈生物科技產(chǎn)業(yè)研究院有限公司
<120>檢測甲胎蛋白的單克隆抗體及試劑盒和應(yīng)用
<130>
<160>12
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>360
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
taggtgaaactgcagcagtctggggcagaacttgtgaagccaggggcctcggtcaagttg60
tcctgttcagcttctggcttcaacattcaagactccttcatgcactgggtgaaacagagg120
cctgaacagggcctggagtggattggagggattgatcctgcaaatggaaatattagatat180
gacccgaaattccaggacaaggccactatgacatccgacacatcctccaatacagcctac240
ctgaccctcaacagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtgttagaggacaa300
ctcggaggtcgaggctggtttgtttactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca360
<210>2
<211>314
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gacattcagctgacccagtctccatcctccttatctgcctctctgggagaaagagtcagt60
ctcacttgtcgggcaagtcaggaaattagtgattacttaatctggcttcagcagaaacca120
gatggaacttttaaacgcctgatctacgccgcgtccactttagattctggtgtcccaaaa180
aggttcagtggcagtaagtctgggtcagatttttctctcaccatcagcagccttgagtct240
gaagattttgcagactattactgtctacaatatgctagttttccgtacacgttcggaggg300
gggaccaagctgga314
<210>3
<211>357
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
gtcaagctgcaggagtctggggcagaacttgtgaagccaggggcctcagtcaagttgtcc60
tgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcct120
gaacagggcctggagtggattggagggattgatcctgcgaatggtaagactaaatttgac180
ccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctg240
cacctcagccgcctgacatctgacgacacggccgtctattactgtgttagagggcaagtc300
ggaggtcgaggctggtttgcttactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca357
<210>4
<211>314
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gacattcagctgacccagtctccatcctccttatctgcctctctgggagaaagagtcagt60
ctcacttgtcgggcaagtcaggaaattagtggttacttaagctggcttcagcggaaacca120
gatggaactattaaacgcctgatctacgccgcatccactttagattctggtgtcccaaaa180
aggttcagtggcagtaggtctgggtcagattattctctcaccatcagcagccttgagtct240
gaagattttgcagactattactgtctacagtatgctagttatccgtacacgttcggaggg300
gggaccaagctgga314
<210>5
<211>288
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
tctggctacaccttcacaagctactatatacactgggtgaagcagaggcctggacaggaa60
cttgaatggattggatggatttatcctggaaatgttaatactaagtacaatgagaagttc120
aagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagc180
agcctgacctctgaggactctgcggtctatttctgtgctagatgctcgggccgtctttac240
tatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca288
<210>6
<211>324
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
gacattgtgatgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccacc60
atctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaac120
caacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatct180
ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccat240
cctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgt300
tcggaggggggaccaagctggaaa324
<210>7
<211>119
<212>prt
<213>人工序列
<400>7
vallysleuglnglnserglyalagluleuvallysproglyalaser
151015
vallysleusercysseralaserglypheasnileglnaspserphe
202530
methistrpvallysglnargprogluglnglyleuglutrpilegly
354045
glyileaspproalaasnglyasnileargtyraspprolysphegln
505560
asplysalathrmetthrseraspthrserserasnthralatyrleu
65707580
thrleuasnserleuthrsergluaspthralavaltyrtyrcysval
859095
argglyglnleuglyglyargglytrpphevaltyrtrpglyglngly
100105110
thrthrvalthrvalserser
115
<210>8
<211>104
<212>prt
<213>人工序列
<400>8
aspileglnleuthrglnserproserserleuseralaserleugly
151015
gluargvalserleuthrcysargalaserglngluileserasptyr
202530
leuiletrpleuglnglnlysproaspglythrphelysargleuile
354045
tyralaalaserthrleuaspserglyvalprolysargphesergly
505560
serlysserglyserasppheserleuthrileserserleugluser
65707580
gluaspphealaasptyrtyrcysleuglntyralaserpheprotyr
859095
thrpheglyglyglythrlysleu
100
<210>9
<211>119
<212>prt
<213>人工序列
<400>9
vallysleuglngluserglyalagluleuvallysproglyalaser
151015
vallysleusercysthralaserglypheasnilelysaspthrtyr
202530
methistrpvallysglnargprogluglnglyleuglutrpilegly
354045
glyileaspproalaasnglylysthrlyspheaspprolysphegln
505560
glylysalathrilethralaaspthrserserasnthralatyrleu
65707580
hisleuserargleuthrseraspaspthralavaltyrtyrcysval
859095
argglyglnvalglyglyargglytrpphealatyrtrpglyglngly
100105110
thrthrvalthrvalserser
115
<210>10
<211>104
<212>prt
<213>人工序列
<400>10
aspileglnleuthrglnserproserserleuseralaserleugly
151015
gluargvalserleuthrcysargalaserglngluileserglytyr
202530
leusertrpleuglnarglysproaspglythrilelysargleuile
354045
tyralaalaserthrleuaspserglyvalprolysargphesergly
505560
serargserglyserasptyrserleuthrileserserleugluser
65707580
gluaspphealaasptyrtyrcysleuglntyralasertyrprotyr
859095
thrpheglyglyglythrlysleu
100
<210>11
<211>119
<212>prt
<213>人工序列
<400>11
vallysleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyalaser
151015
valthrleusercyslysalaserglytyrthrphethrsertyrtyr
202530
ilehistrpvallysglnargproglyglngluleuglutrpilegly
354045
trpiletyrproglyasnvalasnthrlystyrasnglulysphelys
505560
glylysalathrleuthralaasplysserserserthralatyrmet
65707580
glnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecysala
859095
argcysserglyargleutyrtyralametasptyrtrpglyglngly
100105110
thrthrvalthrvalserser
115
<210>12
<211>108
<212>prt
<213>人工序列
<400>12
aspilevalmetthrglnserproalaserleualavalserleugly
151015
glnargalathrilesertyrargalaserlysservalserthrser
202530
glytyrsertyrmethistrpasnglnglnlysproglyglnpropro
354045
argleuleuiletyrleuvalserasnleugluserglyvalproala
505560
argpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehis
65707580
provalgluglugluaspalaalathrtyrtyrcysglnhisilearg
859095
gluleuthrargsergluglyglyprosertrplys
100105