本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，具體涉及一種純化α1-抗胰蛋白酶的方法。
技術(shù)背景
血液制品(bloodproducts)，是指由健康人血漿或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離、提純或由重組dna技術(shù)制成的血漿蛋白組分，以及血液細(xì)胞有形成份。目前，按照血液制品不同作用，可將其分為人血白蛋白、免疫球蛋白類、凝血因子類、特殊蛋白及微量蛋白和纖維蛋白粘合劑五大類。在過去幾十年里，因治療和預(yù)防用血液制品的大量研制與應(yīng)用，使原本無法治愈和控制的疾病獲得了有效遏制，因此，世界各國(guó)對(duì)其品種和工藝進(jìn)行了深入的研發(fā)，主要采用的是低溫乙醇技術(shù)提純血液制品，如cohn和n-k法。
低溫乙醇法是以混合血漿為原料，逐級(jí)降低酸度(ph7.0降到ph4.0),提高乙醇濃度(從0升到40％)，同時(shí)降低溫度(從2℃降到-2℃)，各種蛋白在不同條件下以組分(粗制品)的形式分步從溶液中析出，并通過離心或過濾分離出來。根據(jù)粗制品沉淀的先后次序分別稱為“冷沉淀”、“組分1”、“組分2”、“組分3”、“組分4”和“組分5”。蛋白分子量越大(如凝血因子)越先析出，分子量越小(如白蛋白)越后析出(見表4-10)。除酸度、乙醇濃度和溫度外，低溫乙醇法的控制參數(shù)還有蛋白濃度、溶液離子強(qiáng)度和反應(yīng)時(shí)間。從1940年發(fā)明低溫乙醇法到1950年的10多年間，cohn及其同事一共研究了10種變法，各種方法的差異在于參數(shù)的變化和不同組合，比較常用的是cohn6法。在此基礎(chǔ)上，以后很多學(xué)者為了簡(jiǎn)化分離步驟、提高蛋白得率、降低生產(chǎn)成本，提出了許多改良方法。其中得到應(yīng)用的有nitschman和kistler提出的n-k法和壓濾法。n-k法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了操作，縮短了生產(chǎn)周期，提高了白蛋白和免疫球蛋白的回收率，生產(chǎn)中乙醇的消耗量降低了約40％，最大溶液體積減少了約20％～25％。壓濾法是在低溫乙醇分離蛋白組分的過程中，用加壓過濾技術(shù)代替低溫離心技術(shù)來進(jìn)行固液分離的一種方法，與傳統(tǒng)的離心法相比，該法操作更為方便、蛋白回收率高、生產(chǎn)周期短。
表1低溫乙醇法各組分所含主要的血漿蛋白成分
α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-at)又稱α1-蛋白酶抑制劑，是人血漿中含量最為豐富的一種蛋白酶抑制劑，它可有效抑制彈性蛋白酶、組織蛋白酶以及蛋白酶iii等，從而保護(hù)正常細(xì)胞不受蛋白酶溶解而損傷。而自首例α1-at缺乏癥患者起，國(guó)外相繼報(bào)道出α1-at與肺氣腫、腦中風(fēng)以及機(jī)體免疫抑制的相關(guān)研究。但是，目前我國(guó)對(duì)于α1-at研究報(bào)道相對(duì)較少，其中原因之一是進(jìn)口產(chǎn)品價(jià)格昂貴，而我國(guó)內(nèi)企業(yè)又無上市的α1-at生物制品，使得大規(guī)模臨床研究較難順利開展。
α1-at缺乏癥屬于遺傳性疾病，α1-at缺乏?？蓪?dǎo)致患者肺部組織對(duì)嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抵抗減弱，從而引發(fā)肺氣腫；若給予一定劑量α1-at，患者癥狀又可顯著緩解。但是α1-at屬于血液中微量蛋白，如何獲得大量α1-at則成了治療α1-at缺乏癥的關(guān)鍵因素。
reh等(rehg,nerlib,picóg.isolationofalpha-1-antitrypsinfromhumanplasmabypartitioninginaqueousbiphasicsystemsofpolyethyleneglycol–phosphate[j].journalofchromatographyb,2002,780(2):389-396.)則發(fā)現(xiàn)，采用雙水相系統(tǒng)可從人血漿中直接分離α1-at，且該法可使α1-at比活提高10倍，活性回收43％。此外，kumpalume(kumpalumep,podmorea,lepagec,etal.newprocessforthemanufactureofα-1antitrypsin[j].journalofchromatographya,2007,1148(1):31-37)采用captoq柱及chelatingsepharose層析柱從kistler和nitschmann法組分a1上清中分離出純度＞90％α1-at。但是，前者并非提高了血清利用率，而后者以kistler和nitschmann法組分a1為原料與我國(guó)低溫乙醇法并不相符合。可見，完全照搬國(guó)外的分離技術(shù)在我國(guó)并非可行。此外，我國(guó)學(xué)者張學(xué)俊(張學(xué)俊,葉生亮,曹海軍,等.親和凝膠分離純化人α1-抗胰蛋白酶的研究[j].中國(guó)輸血雜志,2012,25(06):560-564.)等人以低溫乙醇組分fiv為原料，采用氣相二氧化硅去除脂蛋白、免疫親和層析吸附α1-at成功回收40％產(chǎn)品活性。但是，親和層析需制備相應(yīng)抗體并將與介質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，雖然蛋白純度及活性均能獲得較好保障，但前期制備流程復(fù)雜且成本相對(duì)較高，在實(shí)際大規(guī)模應(yīng)用將受到一定限制。yavelow發(fā)現(xiàn)，將α1-at加入到乳腺癌細(xì)胞中可抑制細(xì)胞增殖作用，并能降低il-6表達(dá)水平及活性，阻礙tgfα的釋放及抑制生長(zhǎng)因子活性，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，mercapide[曾將含α1-at序列載體轉(zhuǎn)染入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，并在成功表達(dá)α1-at后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度及侵襲能力均明顯減弱，并有凋亡現(xiàn)象發(fā)生。
中國(guó)專利200710044380.9(抗胰蛋白酶的純化方法)中公開了使用離子交換柱層析純化α1-at的方法，應(yīng)用deae-sepharose或deae-separoseff離子交換介質(zhì)，采用tris-hcl分步洗脫，解析吸附到柱上的目的蛋白；中國(guó)專利101778860a(α-1-抗胰蛋白酶和載脂蛋白a-i的純化方法)0063中描述的也是通過將α1-at吸附在iec介質(zhì)中，通過洗脫解析得到目的蛋白。由此可見，目前的離子層析技術(shù)總是有洗脫分離目的蛋白的步驟，后續(xù)也不可避免地需要進(jìn)行脫鹽處理。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種純化α1-抗胰蛋白酶的方法，利用工業(yè)廢物血漿iv組分作原料，該方法在層析分離過程中不需要對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫分離，避免目的蛋白因洗脫分離和后續(xù)脫鹽而變性。
出于不對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫分離的指導(dǎo)思想，本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)比較在不同層析緩沖液的ph值和離子濃度條件下，目的蛋白與deae-sepharose-ff的吸附能力后。發(fā)現(xiàn)在特定的ph值和離子濃度下，目的蛋白與deae-sepharose-ff不吸附，且此時(shí)雜蛋白表面帶的負(fù)電荷較多，加上空間位阻效應(yīng)，雜蛋白能有效吸附到介質(zhì)上，從而使目的蛋白作為流穿峰(流傳液)收集，不需要離子液洗脫。
提高了收獲率，降低了目的蛋白解吸時(shí)對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)等的再次影響。
本發(fā)明方法包括：首先是血漿組分iv的預(yù)處理；然后對(duì)血漿組分iv進(jìn)行第一次離子交換凝膠層析，獲得流穿液i；對(duì)流穿液i進(jìn)行第二次離子交換凝膠層析，獲得流穿液ii；對(duì)流穿液ii進(jìn)行超濾濃縮，得到濃縮液；對(duì)濃縮液進(jìn)行分子篩層析，即得到最終的α1-抗胰蛋白酶。
其中優(yōu)選的血漿組分iv預(yù)處理方法是，取血漿組分ⅳ，加入緩沖液溶解、離心、棄沉淀、取上清液i；向上清液i加入鹽析常用的鹽，靜置過夜，離心，棄沉淀，取上清液ii；對(duì)上清液ii進(jìn)行透析除鹽，收集透析液。
其中優(yōu)選的離子交換凝膠層析方法是，使用deae-sepharose-ff進(jìn)行一次層析，先以ph6.50.05mol/ltris-hcl緩沖液平衡層析柱，再將血漿組分iv的ph調(diào)至6.5，將其以60cm/h線速度流經(jīng)層析柱，收取流穿液i；使用deae-sepharose-ff進(jìn)行第二次層析，以ph7.10.05mol/ltris-hcl緩沖液平衡層析柱，調(diào)整流穿液i的ph為7.1，將其以60cm/h線速度流經(jīng)層析柱，收取流穿液ii。
其中優(yōu)選的超濾濃縮方法是，使用30kd分子截留管離心，使用ph8.20.05mol/l的tris-hcl緩沖液，將流穿液ii濃縮15倍。
其中優(yōu)選的分子篩層析方法是，用sephacryls-200進(jìn)行柱層析，用超濾濃縮得到的濃縮液進(jìn)行上樣，上樣體積為柱體積10％，以10cm/h線速度流經(jīng)層析柱，得到純化的α1-抗胰蛋白酶。
此外，本發(fā)明通過底物顯色反應(yīng)確認(rèn)α1-抗胰蛋白酶生物學(xué)活性，隨后將該純化的α1-抗胰蛋白酶作用于肺癌a549細(xì)胞，并用傳統(tǒng)工藝純化的蛋白做對(duì)照，觀察α1-抗胰蛋白酶對(duì)該細(xì)胞的抗增殖及成瘤性影響。通過抗細(xì)胞增殖及軟克隆形成實(shí)驗(yàn)可知，α1-抗胰蛋白酶濃度＞1mg/ml時(shí)，a549細(xì)胞增殖速度則明顯變緩，且細(xì)胞更不容易形成克隆體，即可明顯抑制細(xì)胞增殖(f＝5.464，p＜0.05)以及細(xì)胞克隆群的形成。
本發(fā)明以血液制品傳統(tǒng)工藝中的組分iv為原料，通過硫酸銨沉淀、兩步deae層析及s200分子篩步驟，最終獲得純度大于90％(93％)濃度大于3mg/ml(3.2mg/ml)的α1-at蛋白，產(chǎn)品活性回收率為37.8％，雖然產(chǎn)品在活性回收上略低于以往發(fā)表的研究，但基本達(dá)已到了對(duì)廢棄物fiv組分回收再利用目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明最大區(qū)別在于進(jìn)行deae吸附時(shí)，目的蛋白并不與deae介質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，而主要是存在于流穿液中，層析分離過程中不需要洗脫，簡(jiǎn)化工藝步驟，提高收獲率和更重要的是避免離子洗脫液帶來再次脫鹽對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)或者表面的影響。
有益效果：簡(jiǎn)化離子交換層析工藝步驟，不對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫分離，也避免后續(xù)脫鹽操作，最終獲得純度95％，濃度為3.2mg/ml的α1-at蛋白，產(chǎn)品活性回收率為37.8％，所得α1-at可對(duì)細(xì)胞增殖及成瘤進(jìn)行干擾，基本已達(dá)到了對(duì)廢棄物fiv(血漿組分iv)回收再利用目的。
附圖說明
圖1：實(shí)驗(yàn)組3各步驟所獲溶液的蛋白電泳圖譜；
1.分子量標(biāo)準(zhǔn)、2.透析液、3.流穿液i、4.第一次洗脫液、5.第二次流穿液、6.第二次洗脫液、7.最終蛋白液
圖2：實(shí)驗(yàn)組14各步驟所獲溶液的蛋白電泳圖譜；
1.分子量標(biāo)準(zhǔn)、2.透析液、3.流穿液i、4.第一次洗脫液、5.第二次流穿液、6.第二次洗脫液、7.最終蛋白液
圖3：實(shí)驗(yàn)組7各步驟所獲溶液的蛋白電泳圖譜；
1.分子量標(biāo)準(zhǔn)、2.透析液、3.流穿液i、4.第一次洗脫液、5.第二次流穿液、6.第二次洗脫液、7.最終蛋白液
圖4：中試工藝中各步驟所獲溶液的sds-page圖；
圖5.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)；
a：0mg/ml、b：0.125mg/ml、c：0.25mg/ml、d：0.5mg/ml、e：1mg/ml、f2mg/ml
具體實(shí)施方式
材料：
血漿組分iv(fiv)由深圳衛(wèi)光生物制品股份有限公司提供；
deae-sepharose-ff、sephadexg25、sephacryls-200購(gòu)自ge公司；na-苯甲酰-dl-精氨酸-對(duì)硝基酰胺鹽酸鹽購(gòu)自上海碩拓生物科技有限公司；胰蛋白酶、人血清白蛋白、α1-at標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司；rpmi-1640、胎牛血清購(gòu)自gibco公司，a549細(xì)胞來自深圳市大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與細(xì)胞資源庫(kù)公共技術(shù)服務(wù)平臺(tái)；
低熔點(diǎn)瓊脂糖及其余試劑均購(gòu)自廣州鼎國(guó)。
實(shí)施例1【fiv的預(yù)處理】
1.1樣品前處理：取一定量-80℃保存的fiv，按重量比1∶10(血漿：緩沖液)加入ph8.20.05mol/ltris-hcl緩沖液溶解，冰浴攪拌至無明顯固體，離心(4℃，6000g×30min)，棄去沉淀；上清液ⅰ可放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2硫酸銨沉淀：取1.1的上清液ⅰ緩慢加入硫酸銨固體粉末，并不斷攪拌，直至使硫酸銨終濃度達(dá)20％后，4℃靜置過夜，離心(4℃，6000rpm30min)，棄沉淀，上清液ⅱ置于4℃?zhèn)溆谩?/p>
1.3透析：取1.2的上清液ⅱ放置于透析袋中，每隔6小時(shí)依次放入10％硫酸銨溶液、5％硫酸銨溶液、ph8.20.05mol/l的tris-hcl緩沖液中，透析液置于4℃?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2【離子交換層析的條件確定】
設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組1-19，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組都順序進(jìn)行離子交換層析，超濾濃縮和分子篩層析步驟，所述離子交換層析使用deae-sepharose-ff填料和tris-hcl緩沖液，所述超濾濃縮使用30kd分子截留管，所述分子篩層析使用sephacryls-200填料。其中實(shí)驗(yàn)組12-19用于篩選用于離子交換層析的tris-hcl緩沖液濃度，實(shí)驗(yàn)組1-11用于篩選用于離子交換層析的tris-hcl緩沖液的ph。
2.1tris-hcl緩沖液濃度篩選
用不同濃度的tris-hcl緩沖液進(jìn)行離子交換層析，并測(cè)定各工藝步驟中目的蛋白的純度和活力等，以確定目的蛋白分布位置和最佳平衡液的濃度，層析圖譜結(jié)果見表2，其中所述第一流穿峰為第一次層析的流穿液i，所述洗脫峰為對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行洗脫得到的洗脫液，所述“部分”意味著目的蛋白在此不完全地分布。
表2.緩沖液濃度篩選
由此可知當(dāng)tris-hcl緩沖液濃度為0.05mol/l(第14組)時(shí)，目的蛋白主要分布于層析的流穿液i(第一流穿峰)，根據(jù)對(duì)最終得到的蛋白液檢測(cè)，其純度和活性也是最高的。
2.2tris-hcl緩沖液的ph篩選
在采用0.05mol/ltris-hcl緩沖液的基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)其ph進(jìn)行離子交換層析，以確定目的蛋白分布位置和最佳平衡液的ph，結(jié)果見表3，其中所述第一流穿峰為第一次層析的流穿液i，所述洗脫峰為對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行洗脫得到的洗脫液，所述“部分”意味著目的蛋白在此不完全地分布。
表3.緩沖液ph篩選
結(jié)果發(fā)現(xiàn)ph為6.5時(shí)，目的蛋白主要分布于層析的流穿液i(第一流穿峰)。
以tris-hcl緩沖液的ph為6.5濃度為0.05mol/l的實(shí)驗(yàn)組(第3組)的蛋白收率和蛋白純度以及蛋白活性最好，所以選擇這個(gè)條件進(jìn)行下面的純化。
實(shí)施例3【離子交換柱層析中試工藝】
第一次層析：先以ph6.50.05mol/ltris-hcl緩沖液平衡deae-sepharose-ff柱，將實(shí)施例1.3的透析液ph調(diào)至6.5，以60cm/h線速度過柱，收取流穿液i；流穿液i的成分分析見圖4；
第二次層析：調(diào)節(jié)流穿液i的ph至7.1，再次以相同線速度，流經(jīng)以ph7.10.05mol/ltris-hcl緩沖液平衡過的deae-sepharose-ff柱，收取流穿液ii。
流穿液ii的成分分析見圖4。
實(shí)施例4【超濾濃縮和層析中試工藝】
3.1超濾濃縮：使用ph8.20.05mol/l的tris-hcl緩沖液，將流穿液ii經(jīng)30kd分子截留管離心(30min，4000rpm，4℃)濃縮15倍，得到濃縮液。
3.2分子篩層析：上樣體積為柱體積10％，將3.1的濃縮液按10cm/h流經(jīng)sephacryls-200柱(柱高*內(nèi)徑40cm*1.2cm)，依據(jù)出峰情況收集最終蛋白液，對(duì)其進(jìn)行蛋白純度(sds-page)檢測(cè)。
實(shí)施例5【本發(fā)明方法各步驟中a1-抗胰蛋白酶活性測(cè)定】
檢測(cè)方法：參照文獻(xiàn)(rennertom.measurementofaipha1-antitrypsininserum,byimmunodiffusionandbyenzymaticassay[j].clinicalchemistry,1974,20(3):396-399.)，其步驟如下，每個(gè)樣品準(zhǔn)備3根試管，兩根平行管，一根空白管，每管均添加5mlbnpna(1mg/ml)，37℃孵育10min，隨后往平行管中加入待測(cè)樣品2ml+胰蛋白酶2ml的混合液，空白管不添加，37℃孵育10min，每管均加入1ml醋酸終止反應(yīng)，同時(shí)向空白管中添加樣品2ml+胰蛋白酶2ml混合液。在400nm處檢測(cè)樣品吸光度值，以初始溶解血漿組分iv吸光度值作為100％活性。
分別檢測(cè)實(shí)施例1中的上清液ⅰ、上清液ⅱ、透析液，實(shí)施例2中的流穿液ⅰ、流穿液ⅱ，實(shí)施例3的濃縮液、最終蛋白液，檢測(cè)結(jié)果見表4。
結(jié)果表明，最終蛋白液的α1-at蛋白純度90.22％，濃度為0.95mg/ml。
表4：中試工藝純化各步α1-at蛋白純度、活性及收率等結(jié)果
實(shí)施例6【本發(fā)明α1-抗胰蛋白的效果驗(yàn)證】
6.1不同純化工藝制備的α1-at比活比較：在所含α1-at濃度相同的情況下，本發(fā)明工藝純化制備的α1-at的活力是原料(fiv)中α1-at的1.4倍
6.2抗增殖試驗(yàn)：a549細(xì)胞傳代2-3次后，經(jīng)胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至1*106/ml，以100μl/孔接種于2塊96孔板中，且96孔板外圍添加100μlpbs。將96孔板放置在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h至細(xì)胞完全貼壁后，取α1-at用完全培養(yǎng)基稀釋、過濾除菌，按100μl/孔添加到96孔板細(xì)胞中，并使樣品終濃度為2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml，每孔設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(僅添加200μl完全培養(yǎng)基)及空白孔(100μl細(xì)胞懸液+100μl細(xì)胞培養(yǎng)基)，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)分別于24h或48h后，取出1塊96孔板，每孔添加10μlmtt(5mg/ml)后，繼續(xù)放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，每孔添加100μldmso，避光振蕩10min后，在490nm處檢測(cè)吸光度值。細(xì)胞增殖速度隨著α1-at添加濃度的增加明顯減慢，且經(jīng)s-n-k檢驗(yàn)可知，不同α1-at濃度下，細(xì)胞的吸光度值不全相同(f＝5.464，p＜0.05)，如表5所示，本發(fā)明工藝所獲α1-at抗增殖效果與同類產(chǎn)品相當(dāng)。
表5不同工藝純化的α1-at抗細(xì)胞增殖結(jié)果
6.3軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)：配置2xrpmi-1640完全培養(yǎng)基(含2xfbs)，用其稀釋?duì)?-at樣品，并與等體積1.2％低熔點(diǎn)瓊脂混合，使得樣品終濃度為2mg/ml(f)、1mg/ml(e)、0.5mg/ml(d)、0.25mg/ml(c)、0.125mg/ml(b)、0mg/ml(a)，加入6孔板中，每孔2ml，常溫過夜放置促其凝固。隔日，將經(jīng)傳代2-3次的a549細(xì)胞胰酶消化、離心，添加2x完全培養(yǎng)基使細(xì)胞濃度為1*104cell/ml；另用2xrpmi-1640完全培養(yǎng)基稀釋?duì)?-at樣品，并與等體積0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖混合，使α1-at樣品濃度與前一天點(diǎn)孔樣品濃度保持一致，再分別加入100μl細(xì)胞懸液混勻，分別添加至α1-at濃度相對(duì)應(yīng)的凝固的瓊脂完全培養(yǎng)基中，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱10-14天后，每孔加入1ml(0.1％)結(jié)晶紫，室溫染色10min，拍照計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，α1-抗胰蛋白酶(0mg/ml)組細(xì)胞增殖快，且未見單獨(dú)細(xì)胞；而隨著α1-抗胰蛋白酶濃度增加，視野下可見單獨(dú)細(xì)胞數(shù)逐漸增多，其中以α1-抗胰蛋白酶(2mg/ml)組視野最為明顯，見圖5。