本發(fā)明屬于山羊分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及三種山羊mc1r缺陷突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明的分子標(biāo)記從編碼山羊mc1r缺陷突變體的基因中得到。
背景技術(shù)：
毛色是認(rèn)定畜禽品種的主要條件之一。被毛顏色取決于真黑色素和褐黑色素的比率。真黑色素增加，被毛呈現(xiàn)黑色；褐黑色素增加，被毛呈現(xiàn)黃或紅色。兩個(gè)基因座——extension與agouti基因座——調(diào)節(jié)著毛發(fā)或皮膚中的真黑色素和褐黑色素的量1。其中，extension基因座編碼黑皮質(zhì)素受體1(melanocortin1receptor，mc1r)，它是僅存在于黑色素細(xì)胞中的黑皮質(zhì)素受體(melanocortinreceptors，mcrs)，是g蛋白偶聯(lián)受體的家族成員，具有7個(gè)跨膜區(qū)。對(duì)調(diào)控色素沉積具有關(guān)鍵作用2。mc1r受體的激活產(chǎn)生真黑色素，mc1r受體功能缺陷則產(chǎn)生褐黑色素。因此它是褐黑色素到真黑色素的開(kāi)關(guān)。一般情況下，mc1r被促黑激素(melanocyte-stimulatinghormone，msh)激活，產(chǎn)生第二信使camp并磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，erk)3,camp介導(dǎo)黑色素細(xì)胞分化和黑色素生成4，磷酸化激活的erk則促進(jìn)黑色素細(xì)胞的增殖5。agouti基因座編碼agouti信號(hào)蛋白(agoutisignallingprotein，asip)，這個(gè)旁分泌的信號(hào)小分子是mc1r的拮抗劑和抑制劑，能使mc1r受體功能失活。extension基因座(mc1r)與agouti基因座(asip)存在上位效應(yīng)間的互作。mc1r對(duì)asip的上位效應(yīng)表現(xiàn)為：出現(xiàn)mc1r的隱性純合缺陷突變受體，產(chǎn)生紅/黃/淺色被毛(只有褐黑色素的合成)；或出現(xiàn)高組成型活性突變受體，產(chǎn)生黑/深色被毛(真黑色素合成)。而asip對(duì)mc1r上位的前提是有野生型mc1r受體的存在。asip的上位效應(yīng)表現(xiàn)為：過(guò)量拮抗劑/抑制劑的表達(dá)，產(chǎn)生紅/黃/淺色被毛(褐黑色素合成比率提高)；或拮抗劑/抑制劑的表達(dá)缺失，產(chǎn)生黑/深色被毛(真黑色素合成)。
mc1r基因富含多態(tài)，具有物種特異性。在多種哺乳動(dòng)物中通過(guò)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)的mc1r高組成型活性突變位點(diǎn)就高達(dá)11個(gè)，包含小鼠中的s71l、e94k和l100p6、豬中的l99p、d121n和a240t7、綿羊中的m73k、d121n8,9、牛中的l99p10、馬中的s83p、狐貍中的c125r、熊中的y298c、狗中的r306x位點(diǎn)。其共同特點(diǎn)是能產(chǎn)生高組成型(基礎(chǔ)水平)的camp信號(hào)。針對(duì)山羊mc1r基因，wu等11在波爾山羊中發(fā)現(xiàn)了錯(cuò)譯突變k226e。fontanesi等利用6種不同毛色品種山羊發(fā)現(xiàn)了mc1r受體的5個(gè)自然突變體，包括a61a,a81v,f250v,q255x和c267w12。badaoui等13發(fā)現(xiàn)了在紅色palmera山羊排它性存在的g255d突變體。然而這些自然突變體對(duì)毛色性狀的作用都是基于性狀關(guān)聯(lián)分析，其結(jié)果容易受到asip上位效應(yīng)的影響。因此，本領(lǐng)域迫切需要對(duì)這些發(fā)現(xiàn)的自然突變體進(jìn)行功能性鑒定，為毛色的標(biāo)記輔助選擇提供理論基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是提供三種功能確定的山羊mc1r突變體。本發(fā)明的另一目的是基于上述突變體，提供其作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。
申請(qǐng)人前期通過(guò)對(duì)麻城黑山羊和波爾山羊mc1r受體的變異分析，發(fā)現(xiàn)mc1r出現(xiàn)a61a、k226e、f250v、g255d、v265i和c267w共六個(gè)自然突變體；在群體中的連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)其中a61a與f250v呈連鎖遺傳，g255d與v265i呈連鎖遺傳?；趍c1r突變體對(duì)毛色性狀的重要影響，構(gòu)建了包含2個(gè)連鎖遺傳的8種突變載體，進(jìn)行受體的功能鑒定。
在本發(fā)明的第一方面，提供了三種功能確定的山羊mc1r突變體，它們都具有致mc1r受體缺陷的功能，并且所述的缺陷突變體選自下列序列：
(a)seqidno：1中第250位苯丙氨酸(f)被纈氨酸(v)替換的mc1r自然突變體；
(b)seqidno：1中第255位甘氨酸(g)被天冬氨酸(d)替換的mc1r自然突變體；
(c)seqidno：1中第267位半胱氨酸(c)被色氨酸(w)替換的mc1r自然突變體；
其中突變體(a)和(b)都位于第六跨膜區(qū)上，突變體(c)位于第三膜外環(huán)上。
以上所述的突變體氨基酸序列選自：seqidno：2、3或4。
以上所述的突變體完全喪失了對(duì)α-msh配體的親和力(見(jiàn)圖3)。
以上所述的突變體顯著降低了誘導(dǎo)型(見(jiàn)圖4)和組成型camp水平(見(jiàn)圖4、5)。
以上所述的突變體顯著降低了誘導(dǎo)型(見(jiàn)圖6、8)和組成型p-erk水平(見(jiàn)圖6、7)。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了三個(gè)致mc1r受體缺陷的遺傳標(biāo)記在山羊毛色分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了三個(gè)致mc1r受體缺陷的遺傳標(biāo)記，它們都位于序列表seqidno：5的954堿基位的序列內(nèi)，其包括：
(a)seqidno：5中第748bp處t堿基突變?yōu)間；
(b)seqidno：5中第764bp處g堿基突變?yōu)閍；
(c)seqidno：5中第801bp處c堿基突變?yōu)間。
在本發(fā)明的另一方面，申請(qǐng)人制備了檢測(cè)上述缺陷突變位點(diǎn)的引物對(duì)，該引物對(duì)的序列如下所示：
正向引物：atgcctgcactcggctccc，(見(jiàn)序列表seqidno：6)
反向引物：tcaccaggagcactgcagcacc。(見(jiàn)序列表seqidno：7)
最后，申請(qǐng)人提供了一種上述遺傳標(biāo)記的篩選方法，該方法包括以下步驟：
提取樣本山羊血液總dna，根據(jù)山羊mc1r基因組dna序列信息設(shè)計(jì)引物對(duì)，該引物對(duì)的序列如序列表seqidno：6和seqidno：7所示，用序列表seqidno：6和seqidno：7所示的引物對(duì)在山羊基因組dna樣本中進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物直接測(cè)序，獲得如序列表seqidno：5和圖1所示的測(cè)序峰圖，以此判斷是否存在上述的分子標(biāo)記。
歸納起來(lái)，本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：
一種山羊mc1r缺陷突變體f250v，該突變體的氨基酸序列如下所示：
mpalgsprrllgslnctppatlpltlapnrtgpqclevsipdglflslglvslvenvlvvaaiaknrnlhspmyyficclamsdllvsvsnvletavmllleagvlatraavvqqldnvidvlicssmvsslcflgaiavdryisifyalryhsvvtlprawriiaaiwvasiltsvlsityynhtvvllclvgffiamlalmavlyvhmlaracqhargiarlqkrqrpihqgfglkgaatltillgvx(f/v)flcwgpfflhlslivlcpqhptcgcifknfnlflaliicnaivdpliyafrsqelrktlqevlqcsw
上述序列的第250位的x是突變氨基酸，其中的苯丙氨酸(f)被纈氨酸(v)替換。
一種山羊mc1r缺陷突變體g255d，該突變體的氨基酸序列如下所示：
mpalgsprrllgslnctppatlpltlapnrtgpqclevsipdglflslglvslvenvlvvaaiaknrnlhspmyyficclamsdllvsvsnvletavmllleagvlatraavvqqldnvidvlicssmvsslcflgaiavdryisifyalryhsvvtlprawriiaaiwvasiltsvlsityynhtvvllclvgffiamlalmavlyvhmlaracqhargiarlqkrqrpihqgfglkgaatltillgvfflcwx(g/d)pfflhlslivlcpqhptcgcifknfnlflaliicnaivdpliyafrsqelrktlqevlqcsw
上述序列的第255位的x是突變氨基酸，其中的甘氨酸(g)被天冬氨酸(d)替換。
一種山羊mc1r缺陷突變體c267w，該突變體的氨基酸序列如下所示：
mpalgsprrllgslnctppatlpltlapnrtgpqclevsipdglflslglvslvenvlvvaaiaknrnlhspmyyficclamsdllvsvsnvletavmllleagvlatraavvqqldnvidvlicssmvsslcflgaiavdryisifyalryhsvvtlprawriiaaiwvasiltsvlsityynhtvvllclvgffiamlalmavlyvhmlaracqhargiarlqkrqrpihqgfglkgaatltillgvfflcwgpfflhlslivlx(c/w)pqhptcgcifknfnlflaliicnaivdpliyafrsqelrktlqevlqcsw
上述序列的第267位的x是突變氨基酸，其中的半胱氨酸(c)被色氨酸(w)替換。
本發(fā)明所述突變體的功能缺陷在于：?jiǎn)适Я藢?duì)α-msh配體的親和力，顯著降低了誘導(dǎo)型和組成型camp(環(huán)腺苷酸)水平，以及顯著降低了誘導(dǎo)型和組成型p-erk(磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶)水平。
一種山羊mc1r缺陷突變體f250v的分子標(biāo)記在山羊毛色標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用，其特征在于：該分子標(biāo)記的核苷酸序列如下所示：
atgcctgcactcggctccccgaggcggctgctgggttcccttaactgcacacccccagccaccctccccctcacactggcccccaatcggacagggccccagtgcctggaggtgtccatccctgacgggctctttctcagcctggggctggtgagtcttgtggagaacgtgctggtggtggccgccatcgccaagaaccgcaacctgcactcccccatgtactacttcatctgctgcctggccatgtccgacctgctggtgagcgtcagcaacgtgctggagacggcagtcatgctgctgctggaggctggtgtcctggccacccgggcggccgtggtacagcagctggacaatgtcattgacgtgctcatctgcagctccatggtgtccagcctctgcttcctgggtgccatcgctgtggaccgctacatctccatcttctacgccctgcggtaccacagtgtcgtgacactgccccgcgcgtggaggatcattgcagccatctgggtggccagcatcctcaccagcgtgctctccatcacctactacaaccacacggtcgtcctgctgtgcctcgttggcttcttcatagccatgctggccctgatggccgtcctctatgtccacatgctggcccgggcctgccagcatgcccggggcatcgcccggctccagaagaggcagcgccccattcatcagggctttggcctcaagggcgctgccaccctcaccatcctgctgggcgtcr(t/g)tcttcctctgctggggccccttctttctgcacctctcgctcatcgtcctctgcccccagcaccccacctgtggctgcatcttcaagaacttcaacctcttcctggccctcatcatttgcaacgccattgtggaccccctcatctatgccttccgcagccaggagctccggaagacgctccaagaggtgctgcagtgctcctggtga
上述序列的748位的r是突變位點(diǎn)，其中的堿基t突變?yōu)間。
一種山羊mc1r缺陷突變體g255d的分子標(biāo)記在山羊毛色標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如下所示：
atgcctgcactcggctccccgaggcggctgctgggttcccttaactgcacacccccagccaccctccccctcacactggcccccaatcggacagggccccagtgcctggaggtgtccatccctgacgggctctttctcagcctggggctggtgagtcttgtggagaacgtgctggtggtggccgccatcgccaagaaccgcaacctgcactcccccatgtactacttcatctgctgcctggccatgtccgacctgctggtgagcgtcagcaacgtgctggagacggcagtcatgctgctgctggaggctggtgtcctggccacccgggcggccgtggtacagcagctggacaatgtcattgacgtgctcatctgcagctccatggtgtccagcctctgcttcctgggtgccatcgctgtggaccgctacatctccatcttctacgccctgcggtaccacagtgtcgtgacactgccccgcgcgtggaggatcattgcagccatctgggtggccagcatcctcaccagcgtgctctccatcacctactacaaccacacggtcgtcctgctgtgcctcgttggcttcttcatagccatgctggccctgatggccgtcctctatgtccacatgctggcccgggcctgccagcatgcccggggcatcgcccggctccagaagaggcagcgccccattcatcagggctttggcctcaagggcgctgccaccctcaccatcctgctgggcgtcttcttcctctgctgggr(g/a)ccccttctttctgcacctctcgctcatcgtcctctgcccccagcaccccacctgtggctgcatcttcaagaacttcaacctcttcctggccctcatcatttgcaacgccattgtggaccccctcatctatgccttccgcagccaggagctccggaagacgctccaagaggtgctgcagtgctcctggtga
上述序列的764位的r是突變位點(diǎn)，其中的堿基g突變?yōu)閍。
一種山羊mc1r缺陷突變體c267w的分子標(biāo)記在山羊毛色標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如下所示：
atgcctgcactcggctccccgaggcggctgctgggttcccttaactgcacacccccagccaccctccccctcacactggcccccaatcggacagggccccagtgcctggaggtgtccatccctgacgggctctttctcagcctggggctggtgagtcttgtggagaacgtgctggtggtggccgccatcgccaagaaccgcaacctgcactcccccatgtactacttcatctgctgcctggccatgtccgacctgctggtgagcgtcagcaacgtgctggagacggcagtcatgctgctgctggaggctggtgtcctggccacccgggcggccgtggtacagcagctggacaatgtcattgacgtgctcatctgcagctccatggtgtccagcctctgcttcctgggtgccatcgctgtggaccgctacatctccatcttctacgccctgcggtaccacagtgtcgtgacactgccccgcgcgtggaggatcattgcagccatctgggtggccagcatcctcaccagcgtgctctccatcacctactacaaccacacggtcgtcctgctgtgcctcgttggcttcttcatagccatgctggccctgatggccgtcctctatgtccacatgctggcccgggcctgccagcatgcccggggcatcgcccggctccagaagaggcagcgccccattcatcagggctttggcctcaagggcgctgccaccctcaccatcctgctgggcgtcttcttcctctgctggggccccttctttctgcacctctcgctcatcgtcctctgr(c/g)ccccagcaccccacctgtggctgcatcttcaagaacttcaacctcttcctggccctcatcatttgcaacgccattgtggaccccctcatctatgccttccgcagccaggagctccggaagacgctccaagaggtgctgcagtgctcctggtga
上述序列的801位的r是突變位點(diǎn)，其中的堿基c突變?yōu)間。
本發(fā)明的分子標(biāo)記可以應(yīng)用于檢測(cè)山羊mc1r受體是否存在缺陷。其中所設(shè)計(jì)的引物對(duì)也可應(yīng)用于山羊mc1r受體遺傳多態(tài)性的檢測(cè)。
更詳細(xì)的技術(shù)方案如《具體實(shí)施方式》所述。
附圖說(shuō)明
序列表seqidno：1是野生型山羊mc1r受體的氨基酸序列。
序列表seqidno：2是山羊mc1r缺陷受體f250v的氨基酸序列。編碼317個(gè)氨基酸序列。在該序列的第250位氨基酸發(fā)生突變(第250位為突變后的氨基酸)。
序列表seqidno：3是山羊mc1r缺陷受體g255d的氨基酸序列。編碼317個(gè)氨基酸序列。在該序列的第255位氨基酸發(fā)生突變(第255位為突變后的氨基酸)。
序列表seqidno：4是山羊mc1r缺陷受體c267w的氨基酸序列。編碼317個(gè)氨基酸序列。在該序列的第267位氨基酸發(fā)生突變(第267位為突變后的氨基酸)。
序列表seqidno：5是山羊毛色相關(guān)基因mc1r的全長(zhǎng)序列(全長(zhǎng)為954bp)，在該序列的第748位堿基處存在一個(gè)t/g替換；在第764位堿基處存在一個(gè)g/a替換；在第801位堿基處存在一個(gè)c/g替換(即等位基因突變，突變位點(diǎn)在附圖中和本說(shuō)明書(shū)中以“r”表示)。
序列表seqidno：6和7是本發(fā)明設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物的序列，該引物對(duì)的位置位于seqidno：4所示序列的第1-19位和第933-954位。
圖1：本發(fā)明中pcr擴(kuò)增的山羊mc1r基因序列直接測(cè)序檢測(cè)到的缺陷突變位點(diǎn)測(cè)序色譜圖。
圖2：是本發(fā)明pcr擴(kuò)增獲得的山羊mc1r基因序列的瓊脂糖凝膠電泳圖，附圖標(biāo)記說(shuō)明：泳道：1是mc1r基因條帶，m是dl2000marker。
圖3：是山羊mc1r野生受體與8個(gè)突變體與α-msh配體親和力結(jié)果。其中左圖是：野生型mc1r受體以及a61a、k226e、v265i突變體與α-msh的配體親和力結(jié)果；右圖是野生型mc1r受體以及f250v、g255d、c267w、g255d-v265i、a61a-f250v突變體與α-msh的配體親和力結(jié)果。
圖4：在α-msh誘導(dǎo)下山羊mc1r野生受體與8個(gè)突變體產(chǎn)生信號(hào)分子camp的水平。其中左圖是：野生型mc1r受體以及a61a、k226e、g255d、v265i突變體在不同濃度α-msh誘導(dǎo)下產(chǎn)生的camp；右圖是：野生型mc1r受體以及f250、c267w、g255d-v265i、a61a-f250v突變體在不同濃度α-msh誘導(dǎo)下產(chǎn)生的camp。
圖5：是山羊mc1r野生受體與8個(gè)突變體產(chǎn)生組成型(基礎(chǔ)型)camp水平的柱狀比較圖。
圖6：在ndp-msh誘導(dǎo)和非ndp-msh誘導(dǎo)條件下山羊mc1r野生受體與8個(gè)突變體產(chǎn)生p-erk水平的wb結(jié)果圖。用藥濃度為10-5m。其中左圖：野生型mc1r受體以及a61a、k226e、f250、g255d突變體分別在有和無(wú)ndp-msh誘導(dǎo)下產(chǎn)生的perk1/2；右圖:野生型mc1r受體以及v265i、c267w、g255d-v265i、a61a-f250v突變體分別在有和無(wú)ndp-msh誘導(dǎo)下產(chǎn)生的perk1/2。
圖7：是山羊mc1r野生受體與8個(gè)突變體產(chǎn)生基礎(chǔ)型p-erk水平的柱狀比較圖。
圖8：是山羊mc1r野生受體和8個(gè)突變體產(chǎn)生誘導(dǎo)型p-erk水平的柱狀圖。
圖9：是山羊mc1r野生受體與8個(gè)突變體在細(xì)胞表面(圖左)及細(xì)胞內(nèi)(圖右)總表達(dá)。其中左圖：野生型mc1r受體以及8個(gè)突變體在細(xì)胞膜的表達(dá)量；右圖：野生型mc1r受體以及8個(gè)突變體在細(xì)胞內(nèi)的總表達(dá)量。
圖10：是山羊mc1r缺陷突變體f250v的氨基酸序列。
圖11：是山羊mc1r缺陷突變體g255d的氨基酸序列。
圖12：是山羊mc1r缺陷突變體c267w的氨基酸序列。
圖13：是山羊mc1r缺陷突變體f250v的分子標(biāo)記序列。
圖14：是山羊mc1r缺陷突變體g255d的分子標(biāo)記序列。
圖15：是山羊mc1r缺陷突變體c267w的分子標(biāo)記序列。
具體實(shí)施方式
為理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明；下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保范圍。
本發(fā)明選取商用質(zhì)粒pcdna3.1(+)(購(gòu)自clontech公司)作為表達(dá)載體，構(gòu)建了野生型(wt)山羊黑皮質(zhì)素受體-1(gmc1r)的表達(dá)載體pcdna3.1-myc-gmc1r。即在pcdna3.1(+)的多克隆位點(diǎn)插入了一個(gè)n端myc標(biāo)記的gmc1r基因編碼區(qū)的表達(dá)序列。
本發(fā)明以構(gòu)建好的野生型pcdna3.1-myc-gmc1r為模板，利用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了8個(gè)(例如：a61a，k226e，f250v，g255d，v265i，c267w，g255d-v265i，a61a-f250v)突變載體，其中g(shù)255d-v265i和a61a-f250v均為連鎖突變載體(其構(gòu)建依據(jù)為：g255d和v265i在麻城黑山羊及波爾山羊中呈連鎖遺傳，a61a和f250v在麻城黑山羊及波爾山羊中呈連鎖遺傳)。
本發(fā)明將不表達(dá)mc1r受體人腎胚胎細(xì)胞(hek293t)作為gmc1r及其突變體的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)體系為含10％小牛血清的dmem培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以0.14×106個(gè)/ml的密度接種細(xì)胞到6孔板中，30h后(待細(xì)胞貼壁伸展開(kāi))采用磷酸鈣法14轉(zhuǎn)染mc1r突變體和野生型陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒，48h后收樣；
本發(fā)明對(duì)gmc1r缺陷突變體的鑒定涉及配體親和力、產(chǎn)生組成型和誘導(dǎo)型信號(hào)分子camp的能力、產(chǎn)生基礎(chǔ)型和誘導(dǎo)型p-erk水平的能力，以及在細(xì)胞內(nèi)的定位表達(dá)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施實(shí)例1:
野生型山羊黑皮質(zhì)素受體-1(gmc1r)及自然突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建
對(duì)gmc1r的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，gmc1r無(wú)內(nèi)含子，該gmc1r基因的(genbank收錄號(hào)：xm_013970999.1)開(kāi)放閱讀框?yàn)?54bp，編碼316個(gè)氨基酸(見(jiàn)序列表seqidno：1)；該受體蛋白有7個(gè)跨膜區(qū)，3個(gè)膜外環(huán)，3個(gè)膜內(nèi)環(huán)。
在本實(shí)施例中，用真核表達(dá)載體pcdna3.1(購(gòu)自clontech公司)構(gòu)建gmc1r野生型質(zhì)粒和8個(gè)突變體質(zhì)粒，具體操作為：利用含有hindiii酶切位點(diǎn)和kozak序列的上游引物(cccaagcttgccaccatgcctgcactcggctccc)和含有bamhi酶切位點(diǎn)的下游引物(cgcggatcctcaccaggagcactgcagcacc)，用pcr的方法擴(kuò)增野生型gmc1r基因的編碼區(qū)，以hindiii/bamhi酶切位點(diǎn)裝入pcdna3.1載體后，交北京奧科鼎盛生物科技有限公司改造成能夠表達(dá)n端帶有myc檢測(cè)標(biāo)簽的野生型表達(dá)載體pcdna3.1-myc-gmc1r。其它8個(gè)gmc1r突變體的表達(dá)載體(例如命名為：a61a，k226e，f250v，g255d，v265i，c267w，g255d-v265i，a61a-f250v)，也由北京奧科鼎盛生物科技有限公司采用定點(diǎn)突變方法(所述的定點(diǎn)突變方法為常規(guī)方法)構(gòu)建完成。經(jīng)過(guò)酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤。
實(shí)施實(shí)例2:
野生型gmc1r及突變體的配體親和力試驗(yàn)
細(xì)胞收樣前，用無(wú)血清培養(yǎng)基(購(gòu)自gibco公司)洗細(xì)胞2次，將不同終濃度(10-10—10-5m)配體α-msh(購(gòu)自bachem公司)與100,000cpm的放射性標(biāo)記配體125i-ndp-msh(購(gòu)自密西西比大學(xué)肽放射性碘標(biāo)記服務(wù)中心)(50μl)在37℃共同溫育轉(zhuǎn)染gmc1r野生受體及突變體的hek293t細(xì)胞(購(gòu)自atcc公司)1h，終止反應(yīng)后，用預(yù)冷的pbs(137mmnacl，2.7mmkcl，1.4mmkh2po4，4.3mmna2hpo4，ph7.4)洗去未被結(jié)合的標(biāo)記物，加入100μl的0.5nnaoh收集細(xì)胞后，利用伽馬閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞中的受體結(jié)合的125i-ndp-msh的總量，即得出mc1r突變體與配體α-msh的結(jié)合能力。利用graphpadprism5軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作出非線性回歸s型曲線，計(jì)算得到受體與配體結(jié)合的有效中濃度值(ic50)和最大濃度值(bmax)。
通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)5個(gè)突變體(f250、g255d、c267w、a61a-f250v和g255d-v265i)均喪失了與α-msh配體的親和力，而其它突變體與野生型受體具有相似的配體親和力(見(jiàn)圖3和表1)。
同時(shí)，申請(qǐng)人也明確a61a-f250v和g255d-v265i的受體缺陷分別源于f250和g255d。
表1gmc1r野生受體及突變體與α-msh配體的結(jié)合能力和camp信號(hào)特征
a表示與野生型gmc1r受體相比p<0.05；b表示與野生型gmc1r受體相比p<0.01；c表示與野生型gmc1r受體相比p<0.001；n/d表示沒(méi)有檢測(cè)到。野生型gmc1r受體在α-msh誘導(dǎo)下的rmax值是3117.01±472.62pmol/106細(xì)胞。
實(shí)施實(shí)例3:
野生型gmc1r及突變體產(chǎn)生組成型信號(hào)分子和誘導(dǎo)型信號(hào)分子camp活性比較
細(xì)胞收樣前，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次，并將含0.5mm的異丁基甲基黃嘌呤的無(wú)血清培養(yǎng)基(購(gòu)自gibco公司)在37℃溫育已轉(zhuǎn)染gmc1r野生受體及突變體的hek293t細(xì)胞15min，然后將不同終濃度(10-10—10-5m)的α-msh刺激處理細(xì)胞，37℃溫育1h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板放冰上，吸棄培養(yǎng)基，加入含180μg/ml茶堿的0.5n高氯酸提取細(xì)胞內(nèi)camp，利用放射免疫分析(ria)方法15.進(jìn)行信號(hào)分子camp產(chǎn)生的劑量依賴性曲線測(cè)定，并利用graphpadprism5軟件計(jì)算其零濃度值(basal)，有效中濃度(ec50)和最大濃度值(emax)。
結(jié)果表明突變體g255d,c267w和g225d-v265i幾乎完全喪失了產(chǎn)生信號(hào)分子camp的能力，f250v和a61a-f250v突變體產(chǎn)生信號(hào)分子camp信號(hào)分子的能力顯著降低(ec50變大，emax變小)。a61a，k226e和v265i則與野生型gmc1r受體產(chǎn)生camp信號(hào)分子的能力相似。結(jié)果見(jiàn)圖4和表1。
同時(shí)，除a61a外所有突變體產(chǎn)生組成型(基礎(chǔ)水平)camp信號(hào)分子的能力也有不同程度的下降，其中k226e和v265i只有野生型gmc1r受體的50％和73％,f250和a61a-f250只有野生型gmc1r受體的24％,g267w只有野生型gmc1r受體的15％,g255d和g255d-v265i幾乎沒(méi)有組成型camp信號(hào)。結(jié)果見(jiàn)圖5和表2。
表2gmc1r野生受體及突變體的組成型camp水平
a表示與野生型gmc1r受體相比p<0.05；b表示與野生型gmc1r受體相比p<0.01；c表示與野生型gmc1r受體相比p<0.001。
實(shí)施實(shí)例4:
野生型gmc1r及突變體表達(dá)基礎(chǔ)型和誘導(dǎo)型p-erk的水平比較
利用westernblot方法來(lái)檢測(cè)p-erk(磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶)的水平。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，再用無(wú)血清培養(yǎng)基使hek293t細(xì)胞饑餓24h。在收樣日，用10-5mndp-msh(促黑激素)誘導(dǎo)5min。收樣前先用hepes緩沖液(150mmnacl和20mmhepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸),ph7.4)洗細(xì)胞2次，再加裂解液(hepes緩沖液中含0.5％np-40(乙基苯基聚乙二醇),2mmedta(乙二胺四乙酸),1mmna3vo4(釩酸鈉)和1mmnaf(氟化鈉)收集細(xì)胞。總蛋白用bradford法16測(cè)定濃度。蛋白每孔上樣35mg，用10％sds–page膠分離后轉(zhuǎn)到pvdf膜上。pvdf膜用10％脫脂奶粉(含0.2％tween-20)室溫封閉4h后，加兩種一抗4℃孵育過(guò)夜，其中兔抗perk1/2(1:2000)和鼠抗β-tubulin(1:5000)用含5％bsa的tbst來(lái)稀釋。第二天，加辣根過(guò)氧化物酶-標(biāo)記的抗兔(1:1500)和抗鼠(1:5000)的二抗igg室溫孵育2h，二抗用10％脫脂奶粉稀釋。最后用ecl顯色法17顯色。然后用圖像處理軟件imagej對(duì)蛋白條帶進(jìn)行光密度掃描。erk1/2的磷酸化水平通過(guò)perk1/2與β-tubulin的比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
非ndp-msh處理結(jié)果表明，f250v,g255d和c267w相較于野生型gmc1r受體表現(xiàn)出較低水平的基礎(chǔ)型p-erk1/2，而其它突變體與野生型gmc1r受體的基礎(chǔ)型p-erk1/2沒(méi)有顯著差異。見(jiàn)圖6和圖7。
ndp-msh處理結(jié)果表明，野生型gmc1r受體能被誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的p-erk1/2，a61a和v265i也能被誘導(dǎo)，而k226e,f250v,g255d,c267w,a61a-f250v和g255d-v265則不能被誘導(dǎo)(見(jiàn)圖6和圖8)。
實(shí)施實(shí)例5:
野生型gmc1r及突變體在細(xì)胞表面表達(dá)的定量分析
在已轉(zhuǎn)染了gmc1r突變體和野生型質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞收樣前，用1ml的pbs-ih緩沖液(137mmnacl,2.7mmkcl,1.4mmkh2po4,4.3mmna2hpo4,ph7.4)洗細(xì)胞，吸棄后，再加1ml的pbs-ih將細(xì)胞從培養(yǎng)板中吹打收集到離心管中。針對(duì)滲透化細(xì)胞(檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總表達(dá))，以500×g離心5min，吸棄液體，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞15min；離心、吸棄液體，加1％tritonx-100(購(gòu)自sigma-aldrich公司)作用15min使細(xì)胞膜通透，離心、吸棄液體，再加5％牛血清白蛋白(bsa)封閉1h。然后將滲透化和非滲透化(檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá))細(xì)胞一起離心，選用fitc(異硫氰酸熒光素)偶聯(lián)的抗myc標(biāo)簽抗體(購(gòu)自abcam公司)以體積比為1︰40的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)⒚庖邩?biāo)記1h，其熒光強(qiáng)度采用facs(流式細(xì)胞術(shù))法17進(jìn)行量化測(cè)定。將pcdna3.1空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光值作為背景值。
非滲透化處理結(jié)果表明，除突變體a61a和f250在細(xì)胞表面的表達(dá)相較于野生型gmc1r受體有輕微的增加外，其它突變體在細(xì)胞表面的表達(dá)與野生型受體無(wú)顯著差異；滲透化處理結(jié)果表明，所有突變體在細(xì)胞內(nèi)的總表達(dá)差異不顯著(見(jiàn)圖9)。
此結(jié)果表明突變體f250、g255d、c267w并不存在轉(zhuǎn)錄水平的差異或細(xì)胞定位的缺陷，缺陷的原因可能是受體構(gòu)象改變?cè)斐伞?/p>
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