本發(fā)明涉及hiv-1廣譜中和抗體，所述抗體特異性結(jié)合hiv-1gp120。本發(fā)明還涉及所述抗體的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
hiv-1中和抗體能夠有效阻止hiv-1進(jìn)入人的cd4+t細(xì)胞。因此，作為對(duì)hiv-1感染者的一種治療手段，艾滋病研究領(lǐng)域一直在致力于開發(fā)強(qiáng)效的hiv-1廣譜中和抗體。
最早通過噬菌體展示文庫技術(shù)得到了單克隆抗體b12，但是僅能中約40％的已知hiv-1病毒[1]。從2010年開始，得益于單個(gè)b細(xì)胞分選和深度測(cè)序等技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，已經(jīng)從hiv-1感染者中分離出多種具有抗hiv-1廣譜中和活性的人源單克隆抗體，如針對(duì)cd4結(jié)合位點(diǎn)的vrc01[2]，針對(duì)可變區(qū)v1/v2和v3的pg9/pg16和pgt121[3,4]，針對(duì)近膜區(qū)(mper，membraneproximalexternalregion)的10e8抗體[5]和針對(duì)gp120-gp41交界處的35o22[6]等。
鑒于hiv-1存在多種進(jìn)化枝且在世界范圍內(nèi)不同地區(qū)存在不同的主要流行株，組合應(yīng)用兩種或更多種廣譜中和抗體顯然是一種更具潛力的治療策略。因此，艾滋病研究領(lǐng)域仍需要開發(fā)出新的強(qiáng)效廣譜反應(yīng)性hiv-1中和抗體。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供特異性結(jié)合hiv-1gp120的人單克隆抗體及其功能性片段，所述抗體能夠阻斷hiv-1進(jìn)入靶細(xì)胞。本發(fā)明還提供編碼上述抗體或抗體片段的核酸分子以及包含至少一種上述核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供經(jīng)至少一種上述核酸分子或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供使用至少一種上述核酸分子或表達(dá)載體或宿主細(xì)胞來生產(chǎn)抗體的方法。本發(fā)明還提供包含至少一種上述抗體或抗體片段的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)包含分別相應(yīng)于seqidno:2的氨基酸31-35、50-66和99-109的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)包含分別相應(yīng)于seqidno:4的氨基酸24-34、50-56和89-93的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)包含分別相應(yīng)于seqidno:6的氨基酸22-32、48-54和87-91的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在其他一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)包含分別相應(yīng)于seqidno:8的氨基酸24-34、50-56和89-93的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。本發(fā)明的抗體是特異性結(jié)合hiv-1gp120的廣譜中和抗體。
本發(fā)明還提供檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的方法，包括使來自所述對(duì)象的生物學(xué)樣品與本發(fā)明的抗體或抗體片段相接觸，并確定所述樣品中是否存在由所述抗體或所述抗體片段形成的免疫復(fù)合物，其中存在所述免疫復(fù)合物表明所述對(duì)象有hiv-1感染。在一些實(shí)施方式中，在進(jìn)行所述接觸之前將所述樣品固定化于固相基材。在另一些實(shí)施方式中，在進(jìn)行所述接觸之前將所述抗體或抗體片段固定化于固相基材。在一些實(shí)施方式中，所述抗體或抗體片段標(biāo)記了熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記或放射性標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，使用特異性結(jié)合所述抗體或抗體片段的第二抗體檢測(cè)免疫復(fù)合物。在另一些實(shí)施方式中，使用特異性結(jié)合hiv-1的抗原的第二抗體檢測(cè)免疫復(fù)合物。本發(fā)明還提供用于檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的試劑盒，其包含本發(fā)明的抗體或抗體片段。
本發(fā)明進(jìn)一步提供預(yù)防或治療人類對(duì)象的hiv-1感染的方法，包括給所述對(duì)象施用有效量的至少一種本發(fā)明的抗體或抗體片段或本發(fā)明的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，所述對(duì)象患有獲得性免疫缺陷綜合征(aids)。在一些實(shí)施方式中，還包括給所述對(duì)象施用至少一種抗hiv-1的抗病毒藥物。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的抗體或抗體片段在制備用于檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的試劑盒或用于預(yù)防或治療人類對(duì)象的hiv-1感染的藥物組合物中的用途。
附圖說明
圖1所示為本發(fā)明的單克隆抗體的結(jié)合能力，(a)為抗體drvia7結(jié)合gp140的能力，(b)為抗體drvia7結(jié)合gp120的能力，(c)為抗體drvia7h+gdrvi01-l57結(jié)合gp140的能力，和(d)為抗體drvia7h+gdrvi01-l40結(jié)合gp140的能力。
圖2是抗體drvia7與gp120結(jié)合的示意圖。
圖3所示為drvia7+gp120復(fù)合物氨基酸殘基依賴性能量評(píng)估。
圖4是抗體drvia7輕鏈n端和cdrl1區(qū)與gp120的結(jié)合示意圖。
圖5所示為drvia7和vrc01的重鏈和輕鏈與相應(yīng)的家系基因序列比對(duì)分析結(jié)果。
圖6顯示了抗體drvia7與vrc01-like抗體的晶體結(jié)構(gòu)比較。
圖7顯示了對(duì)感染者體內(nèi)抗體輕鏈基因庫的相似性/差異度二維分析結(jié)果。
序列說明
seqidno:1是抗體drvia7重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
seqidno:2是抗體drvia7重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
seqidno:3是抗體drvia7輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
seqidno:4是抗體drvia7輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
seqidno:5是輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l57的核苷酸序列。
seqidno:6是輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l57的氨基酸序列。
seqidno:7是輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l40的核苷酸序列。
seqidno:8是輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l40的氨基酸序列。
保藏信息
攜帶包含抗體drvia7的重鏈基因的表達(dá)載體的大腸桿菌(e.coli)于2015年12月14日保藏于cgmcc，保藏號(hào)為cgmccno.11879。
攜帶包含抗體drvia7的輕鏈基因的表達(dá)載體的大腸桿菌(e.coli)于2015年12月14日保藏于cgmcc，保藏號(hào)為cgmccno.11880。
攜帶包含編碼輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l57的抗體輕鏈基因的表達(dá)載體的大腸桿菌(e.coli)于2015年12月14日保藏于cgmcc，保藏號(hào)為cgmccno.11881。
攜帶包含編碼輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l40的抗體輕鏈基因的表達(dá)載體的大腸桿菌(e.coli)于2015年12月14日保藏于cgmcc，保藏號(hào)為cgmccno.11882。
發(fā)明詳述
本發(fā)明人從一名hiv-1中國流行株感染者體內(nèi)分離得到了一種單克隆抗體，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種hiv-1具有廣譜中和活性，該抗體命名為drvia7。進(jìn)一步地，本發(fā)明人基于抗體drvia7的重鏈，通過抗體輕鏈基因改造和抗體輕鏈基因庫篩選技術(shù)，獲得了更加強(qiáng)效的hiv-1廣譜中和抗體。本發(fā)明的抗體能夠阻斷多種hiv-1進(jìn)入靶細(xì)胞。
在一方面，本發(fā)明提供分離的人單克隆抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含分別相應(yīng)于seqidno:2所示氨基酸序列中所含的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，其中所述抗體是特異性結(jié)合hiv-1gp120的中和抗體。
在一些實(shí)施方式中，所述重鏈可變區(qū)包含分別相應(yīng)于seqidno:2的氨基酸31-35、50-66和99-109的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3。
在本文中，當(dāng)涉及本發(fā)明的抗體時(shí)，“重鏈可變區(qū)包含相應(yīng)于所述seqidno:2所示氨基酸序列中所含的vhcdr1的vhcdr1”這一表述是指該抗體重鏈可變區(qū)中的vhcdr1與所述seqidno:2所示氨基酸序列中所含的vhcdr1具有相同的氨基酸序列。例如，依據(jù)kabat命名法，抗體drvia7的vhcdr1由如seqidno:2所示重鏈可變區(qū)的第31-35位氨基酸(ssfih)組成，則上述表述指的是本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)的vhcdr1由ssfih組成。
在本文中，vhcdr、hcdr和cdrh具有同樣的含義，指的是抗體重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定簇，可互換使用。
在一些實(shí)施方式中，所述重鏈可變區(qū)包含seqidno:2所示氨基酸序列或與seqidno:2具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)由seqidno:2所示氨基酸序列或與seqidno:2具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列組成。在一些實(shí)施方式中，所述重鏈可變區(qū)包含與seqidno:2具有約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、或約99％序列相同性的氨基酸序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重鏈可變區(qū)包含表1中所示的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3。
在一些實(shí)施方式中，所述輕鏈可變區(qū)包含：
(i)分別相應(yīng)于seqidno:4所示氨基酸序列中所含的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3；
(ii)分別相應(yīng)于seqidno:6所示氨基酸序列中所含的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3；或
(iii)分別相應(yīng)于seqidno:8所示氨基酸序列中所含的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。
在一些實(shí)施方式中，所述輕鏈可變區(qū)包含：
(i)分別相應(yīng)于seqidno:4的氨基酸24-34、50-56和89-93的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3；
(ii)分別相應(yīng)于seqidno:6的氨基酸22-32、48-54和87-91的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3；或
(iii)分別相應(yīng)于seqidno:8的氨基酸24-34、50-56和89-93的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。
在本文中，當(dāng)涉及本發(fā)明的抗體時(shí)，“輕鏈可變區(qū)包含相應(yīng)于所述seqidno:4所示氨基酸序列中所含的vlcdr1的vlcdr1”這一表述是指該抗體輕鏈可變區(qū)中的vlcdr1與所述seqidno:4所示氨基酸序列中所含的vlcdr1具有相同的氨基酸序列。例如，依據(jù)kabat命名法，抗體drvia7的vlcdr1由如seqidno:4所示輕鏈可變區(qū)的第22-32位氨基酸(rasqridnwva)組成，則上述表述指的是本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)的vlcdr1由rasqridnwva組成。
在本文中，vlcdr、lcdr和cdrl具有同樣的含義，指的是抗體輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定簇，可互換使用。
在另一些實(shí)施方式中，所述輕鏈可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成：(i)seqidno:4所示氨基酸序列或與seqidno:4具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列；(ii)seqidno:6所示氨基酸序列或與seqidno:6具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列；和(iii)seqidno:8所示氨基酸序列或與seqidno:8具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述輕鏈可變區(qū)包含與seqidno:4、seqidno:6或seqidno:8具有約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、或約99％序列相同性的氨基酸序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述輕鏈可變區(qū)包含表1中所示的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。
本發(fā)明還提供分離的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合hiv-1gp120上由前述本發(fā)明的抗體所識(shí)別的表位。
本發(fā)明還提供分離的抗體，其中所述抗體與前述本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hiv-1gp120上的表位。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是igg。在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是igm。在其他一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是iga。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離的抗體片段，其是前述本發(fā)明的抗體的功能性片段，其能夠特異性結(jié)合hiv-1gp120。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體片段選自fab片段、fab’片段、f(ab)’2片段、單鏈fv蛋白(scfv)和二硫鍵穩(wěn)定的fv蛋白(dsfv)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體片段對(duì)多種hiv-1具有廣譜中和活性。
本發(fā)明還提供分離的多肽，所述多肽是免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，其可用于構(gòu)建特異性結(jié)合hiv-1gp120并對(duì)hiv-1具有廣譜中和活性的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含分別相應(yīng)于seqidno:2的氨基酸31-35、50-66和99-109的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3。在另一些實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含與seqidno:2具有約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、或約99％序列相同性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含分別相應(yīng)于seqidno:4的氨基酸24-34、50-56和89-93的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在另一些實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含與seqidno:4具有約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、或約99％序列相同性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含分別相應(yīng)于seqidno:6的氨基酸22-32、48-54和87-91的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在另一些實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含與seqidno:6具有約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、或約99％序列相同性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含分別相應(yīng)于seqidno:8的氨基酸24-34、50-56和89-93的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在另一些實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含與seqidno:8具有約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、或約99％序列相同性的氨基酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其編碼前述本發(fā)明的抗體或抗體片段或多肽。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子包含seqidno:1所示的編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。在其他一些具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子包含seqidno:3、5或7所示的編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子可操作地連接至啟動(dòng)子。
本發(fā)明還提供表達(dá)載體，其包含至少一種前述本發(fā)明的核酸分子。
本發(fā)明還提供分離的宿主細(xì)胞，其由至少一種前述本發(fā)明的核酸分子或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
在另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)抗體的方法，包括：
(i)用前述至少一種本發(fā)明的核酸分子或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，
(ii)在適合所述核酸分子或表達(dá)載體表達(dá)的情況下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和
(iii)分離并純化由所述核酸分子或表達(dá)載體所表達(dá)的抗體或抗體片段。
本發(fā)明還涉及通過上述本發(fā)明的方法而獲得的分離的抗體或抗體片段，其能夠特異性結(jié)合hiv-1gp120。優(yōu)選地，通過上述本發(fā)明的方法而獲得的分離的抗體或抗體片段對(duì)多種hiv-1具有廣譜中和活性。
在另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含至少一種前述本發(fā)明的抗體或抗體片段，以及可藥用載體。
在另一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的方法，包括：
(i)使來自所述對(duì)象的生物學(xué)樣品與前述本發(fā)明的抗體或抗體片段相接觸，并且
(ii)確定所述樣品中是否存在由所述抗體或所述抗體片段形成的免疫復(fù)合物，
其中存在所述免疫復(fù)合物表明所述對(duì)象有hiv-1感染。
在本發(fā)明的檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的方法的一些實(shí)施方式中，在步驟(i)中，所述樣品固定化于固相基材，且所述接觸包括將所述抗體或抗體片段加至固定化有所述樣品的固相基材。在一些實(shí)施方式中，所述抗體或抗體片段標(biāo)記了熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記或放射性標(biāo)記。在另一些實(shí)施方式中，在步驟(ii)中，使所述固相基材與特異性結(jié)合所述抗體或抗體片段的第一結(jié)合配偶體相接觸。在一些實(shí)施方式中，所述第一結(jié)合配偶體是特異性結(jié)合所述抗體或抗體片段的第二抗體。
在本發(fā)明的檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的方法的另一些實(shí)施方式中，在步驟(i)中，所述抗體或抗體片段固定化于固相基材，且所述接觸包括將所述樣品加至固定化有所述抗體或抗體片段的固相基材。在一些實(shí)施方式中，在步驟(ii)中，使所述固相基材與特異性結(jié)合hiv-1的抗原的第二結(jié)合配偶體相接觸。在一些實(shí)施方式中，所述第二結(jié)合配偶體是特異性結(jié)合hiv-1的抗原的第二抗體。在一些實(shí)施方式中，所述第二抗體特異性結(jié)合hiv-1gp120。在一些實(shí)施方式中，所述抗體或抗體片段與所述特異性結(jié)合hiv-1抗原的第二抗體結(jié)合hiv-1抗原上的不同表位。
在本發(fā)明的檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的方法的一些實(shí)施方式中，來自所述對(duì)象的生物學(xué)樣品是全血、血漿、血清、血細(xì)胞或血細(xì)胞裂解物。
在本發(fā)明的檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的方法的一些實(shí)施方式中，來自所述對(duì)象的生物學(xué)樣品含有血細(xì)胞，且其中所述方法進(jìn)一步包括在步驟(i)之前、過程中或之后，將所述生物學(xué)樣品與特異性結(jié)合所述血細(xì)胞的第三結(jié)合配偶體相接觸。在一些實(shí)施方式中，所述第三結(jié)合配偶體是特異性結(jié)合所述血細(xì)胞的抗體。在一些具體的實(shí)施方式中，所述血細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，例如t細(xì)胞，例如cd4+t細(xì)胞。在另一些具體的實(shí)施方式中，所述血細(xì)胞是單核細(xì)胞。在一些具體的實(shí)施方式中，所述第三結(jié)合配偶體是特異性結(jié)合所述血細(xì)胞上的特征性標(biāo)記物的抗體。
在另一方面，本發(fā)明涉及前述本發(fā)明的抗體或抗體片段在制備用于檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的試劑盒中的用途。
在另一方面，本發(fā)明還提供用于檢測(cè)人類對(duì)象的hiv-1感染的試劑盒，其包含前述本發(fā)明的抗體或抗體片段。
在另一方面，本發(fā)明還提供預(yù)防或治療人類對(duì)象的hiv-1感染的方法，包括給所述對(duì)象施用有效量的至少一種前述本發(fā)明的抗體或抗體片段或本發(fā)明的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，所述對(duì)象患有獲得性免疫缺陷綜合征(aids)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括給所述對(duì)象施用至少一種抗hiv-1的抗病毒藥物。
在另一方面，本發(fā)明還涉及前述本發(fā)明的抗體或抗體片段在制備用于預(yù)防或治療人類對(duì)象的hiv-1感染的藥物組合物中的用途。在一些實(shí)施方式中，所述對(duì)象患有aids。
以下實(shí)施例用于闡述本發(fā)明，其無意于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
實(shí)施例1：廣譜中和抗體drvia7的鑒定
從中國hiv-1感染者體內(nèi)分離得到抗體drvia7
發(fā)明人從一個(gè)中國hiv-1感染者的樣品中分離得到了一株單克隆抗體。經(jīng)鑒定，該抗體對(duì)多種hiv-1具有廣譜中和性，命名為drvia7。攜帶包含抗體drvia7的重鏈基因的表達(dá)載體(drvia7h)和輕鏈基因的表達(dá)載體(drvia7l)的大腸桿菌分別以保藏號(hào)cgmccno.11879和cgmccno.11880保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))。drvia7h中所含重鏈可變區(qū)的編碼序列為seqidno:1，其編碼的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno:2。drvia7l中所含輕鏈可變區(qū)的編碼序列為seqidno:3，其編碼的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno:4。
drvia7抗體的表達(dá)和純化
將攜帶重鏈表達(dá)載體drvia7h的大腸桿菌和輕鏈表達(dá)載體drvia7l的大腸桿菌，分別接種于100ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基(amersham公司產(chǎn)品)中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。利用omega公司的plasmidmidikit試劑盒提取表達(dá)載體質(zhì)粒。利用pei轉(zhuǎn)染試劑(polysciences公司產(chǎn)品)以等量的重鏈和輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞，8％co2，37℃培養(yǎng)6天。利用proteina親和柱(gehealth公司產(chǎn)品)純化得到抗體drvia7。利用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(thermo公司產(chǎn)品)測(cè)定抗體濃度，4℃放置待檢測(cè)。
drvia7抗體的結(jié)合能力
通過elisa方法測(cè)定了抗體的結(jié)合能力。將抗原蛋白cn54gp140(cn54亞型gp140蛋白)、wtyu2gp120(野生型yu2亞型gp120蛋白)和t278gyu2gp120(t278g點(diǎn)突變yu2亞型gp120蛋白)用pbs稀釋至2μg/ml，每孔100μl包被于96孔elisa板中(corningcostar公司產(chǎn)品)，4℃過夜。用pbs-t溶液(0.05％吐溫-20)洗板5次；每孔加入250μl封閉液(pbs，2％bsa+5％脫脂奶粉)室溫封閉1小時(shí)。pbs-t洗板3次。將抗體drvia7以10μg/ml為起始濃度，用封閉液進(jìn)行5倍系列稀釋，分別取100μl樣本加入到elisa板中，37℃孵育1小時(shí)。pbs-t洗板5次。每孔加入100μl用封閉液1:5000稀釋后的辣根酶標(biāo)記的山羊抗人igg(h+l)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，37℃孵育1小時(shí)。pbs-t洗板5次。加入tmb顯色底物(北京金豪制藥股份有限公司產(chǎn)品)100μl，室溫避光顯色20分鐘。每孔直接加入50μl終止液(北京金豪制藥股份有限公司產(chǎn)品)終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取450nm和630nm波長的吸光度值(od)。結(jié)果如圖1顯示，單克隆抗體drvia7特異性結(jié)合gp140抗原蛋白(圖1a)以及野生型和突變的gp120抗原蛋白(圖1b)。
drvia7抗體的中和能力
通過tzm-bl/假病毒中和實(shí)驗(yàn)[7]測(cè)定了抗體的中和能力。用dmem生長培養(yǎng)基(hyclone公司產(chǎn)品)將抗體drvia7梯度系列稀釋，100μl稀釋好的抗體和50μl含有200tcid50的假病毒加入96孔平底培養(yǎng)板中，5％co2，37℃孵育1小時(shí)。將含有1×104個(gè)tzm-bl細(xì)胞和11μg/mldeae-dextran(sigma公司產(chǎn)品)的細(xì)胞液加入96孔板中，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照(只含tzm-bl細(xì)胞)和病毒對(duì)照(只含tzm-bl細(xì)胞和假病毒)，5％co237℃培養(yǎng)48小時(shí)。利用bright-gloluciferasereagent試劑盒(promega公司產(chǎn)品)檢測(cè)熒光素酶反應(yīng)，計(jì)算50％抑制劑量。如表2a和表2b所示，drvia7抗體可以中和不同亞型的hiv-1病毒，為廣譜中和抗體。
drvia7抗體的晶體結(jié)構(gòu)
通過x射線晶體衍射，解析了未結(jié)合型drvia7抗體和drvia7+gp120復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，具體結(jié)構(gòu)參數(shù)如表3所示。圖2顯示了drvia7抗體與hiv-1gp120結(jié)合的結(jié)構(gòu)示意圖。
表3.x射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)收集和細(xì)化統(tǒng)計(jì)分析
a插入的數(shù)字指的是最高分辨率。
b計(jì)算方法為平均值(i)/平均值(σi)。
crsym＝σhklσi|ihkl,i-<ihkl>|/σhklσiihkl,i,其中ihkl,i是反射h,k,l的ith測(cè)定的成比例強(qiáng)度,<ihkl>是反射的平均強(qiáng)度,n是冗余度.rpim是一種冗余度非依賴的強(qiáng)度測(cè)量方法.rpim＝σhkl(1/(n-1))1/2σi|ihkl,i-<ihkl>|/σhklσiihkl,i,其中ihkl,i是反射h,k,l的ith測(cè)定的成比例強(qiáng)度,<ihkl>是反射的平均強(qiáng)度,n是冗余度。
drcryst＝σhkl|fo-fc|/σhkl|fo|x100
erfree被計(jì)算成rcryst,但是在一個(gè)測(cè)試組上包含了5％的細(xì)化統(tǒng)計(jì)排除的數(shù)據(jù)。
f這些數(shù)值使用molprobity數(shù)據(jù)庫計(jì)算得出(http://molprobity.biochem.duke.edu/)。
實(shí)施例2：改造的抗體drvia7h+gdrvi01-l57
基于氨基酸殘基的能量評(píng)估
發(fā)明人對(duì)drvia7+gp120形成的復(fù)合物進(jìn)行了基于氨基酸殘基的能量評(píng)估(residue-basedenergyevaluation)[8]。如圖3所示，發(fā)現(xiàn)在drvia7輕鏈可變區(qū)的n端、cdrl1區(qū)和cdrl3區(qū)可能存在干擾drvia7與gp120結(jié)合的結(jié)構(gòu)沖突。
改造的輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l57
基于這一發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人對(duì)drvia7的輕鏈進(jìn)行了系列的改造。對(duì)cdrl1區(qū)進(jìn)行了多種改造，但是抗體的中和能力并未有顯著提高。然而，當(dāng)刪除drvia7輕鏈可變區(qū)n端兩個(gè)氨基酸后，發(fā)現(xiàn)改造抗體的結(jié)合能力和中和寬度均有大幅度提高，將改造后的抗體輕鏈可變區(qū)命名為gdrvi01-l57。攜帶包含編碼輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l57的抗體輕鏈基因的表達(dá)載體(gdrvi01-l57)的大腸桿菌以保藏號(hào)cgmccno.11881保藏于cgmcc。輕鏈表達(dá)載體gdrvi01-l57中所含輕鏈可變區(qū)編碼序列為seqidno:5，其編碼的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno:6。
抗體drvia7h+gdrvi01-l57結(jié)合能力
使用攜帶重鏈表達(dá)載體drvia7h的大腸桿菌和輕鏈表達(dá)載體gdrvi01-l57的大腸桿菌，按照與實(shí)施例1類似的方法進(jìn)行抗體表達(dá)和純化，獲得了抗體drvia7h+gdrvi01-l57。按照與實(shí)施例1類似的方法，通過elisa方法測(cè)定抗體drvia7h+gdrvi01-l57的結(jié)合能力。結(jié)果如圖1c所示，抗體drvia7h+gdrvi01-l57與cn54gp140的結(jié)合能力較抗體drvia7明顯提高。
抗體drvia7h+gdrvi01-l57中和能力
按照與實(shí)施例1類似的方法，通過tzm-bl/假病毒中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗體的中和能力。結(jié)果如表2a和表2b所示，抗體drvia7h+gdrvi01-l57對(duì)所測(cè)試的全球假病毒組和病毒免疫室假病毒組的中和寬度較抗體drvia7顯著提高。
為了進(jìn)一步探討抗體drvia7h+gdrvi01-l57中和能力提高的機(jī)制，發(fā)明人分析了drvia7抗體輕鏈n端(lc-nt)和cdrl1區(qū)與gp120的結(jié)合。如圖4所示，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)野生型drvia7抗體輕鏈的n端與gp120上的n461糖基化位點(diǎn)非常接近。鑒于n聯(lián)糖基化位點(diǎn)有利于病毒逃逸中和，因此刪除n端兩個(gè)氨基酸后，可能有助于避免n461糖基化位點(diǎn)對(duì)抗體與gp120結(jié)合的影響，而這可能有利于抗體中和病毒。
實(shí)施例3：通過篩選抗體輕鏈基因庫獲得抗體drvia7h+gdrvi01-l40
drvia7抗體序列分析
如圖5所示，利用抗體基因分析數(shù)據(jù)庫imgtv-qestserver(http://www.imgt.org/imgt_vquest/vquest？livret＝0&option＝humanig)分析了drvia7抗體基因。drvia7抗體重鏈屬于ighv1-02*02家系，cdrh3為11個(gè)氨基酸(kabat命名法)。輕鏈屬于igkv1-5*03家系，cdrl3為5個(gè)氨基酸。與vrc01抗體[1]比較發(fā)現(xiàn)，drvia7抗體與vrc01抗體使用了相同的重鏈家系基因，同時(shí)輕鏈cdrl3的長度與vrc01相同，揭示了drvia7抗體可能屬于vrc01-like抗體。
drvia7與vrc01-like抗體的結(jié)構(gòu)比較分析
實(shí)施例1中解析了drvia7抗體的晶體結(jié)構(gòu)。通過與已發(fā)表的四種vrc01-like抗體vrc01(pdbid:3ngb)、vrc03(pdbid:3se8)、pg04(pdbid:3se9)和12a21(pdbid:4jpw)的結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，drvia7抗體結(jié)構(gòu)與之非常相似(圖6)，可能屬于vrc01-like抗體。
建立感染者的抗體輕鏈基因庫
利用自其分離到抗體drvia7的hiv-1感染者的血液樣品，通過深度測(cè)序技術(shù)建立了該感染者體內(nèi)的抗體輕鏈基因庫，發(fā)現(xiàn)該感染者體內(nèi)存在大量的drvia7-like輕鏈基因。根據(jù)序列比較發(fā)現(xiàn)vrc01-like抗體輕鏈具有共同特征。根據(jù)vrc01-like抗體的cdrl3的特征(包括長度為5個(gè)氨基酸、第三個(gè)殘基是疏水性的和第4為是氨基酸q或者e)自抗體輕鏈基因庫中篩選輕鏈。如圖7所示，得到了703條具備vrc01-like抗體cdrl3特征的輕鏈(藍(lán)色表示)，最終驗(yàn)證了22條候選輕鏈(紅色表示)。
抗體drvia7h+gdrvi01-l40
通過將上述22條候選輕鏈與drvia7抗體重鏈分別配對(duì)，并按照與實(shí)施例1類似的方法進(jìn)行抗體表達(dá)和純化，制備了一系列抗體，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)合與中和能力的測(cè)定，最終鑒定得到了輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l40。由包含gdrvi01-l40的輕鏈與drvia7抗體的重鏈配對(duì)產(chǎn)生的抗體drvia7h+gdrvi01-l40較drvia7顯示出更強(qiáng)的cn54gp140結(jié)合能力(圖1d)和中和能力(表2a和表2b)。攜帶包含編碼輕鏈可變區(qū)gdrvi01-l40的抗體輕鏈基因的表達(dá)載體(gdrvi01-l40)的大腸桿菌以保藏號(hào)cgmccno.11882保藏于cgmcc。輕鏈表達(dá)載體gdrvi01-l40中所含輕鏈可變區(qū)編碼序列為seqidno:7，其編碼的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno:8。
盡管參照具體實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施方式僅僅是用于舉例闡述本發(fā)明的應(yīng)用原則。在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以對(duì)其做出各種改變。
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