本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用兩個(gè)誘導(dǎo)條件控制基因在植物中表達(dá)的質(zhì)粒，即一種高效的植物雙元誘導(dǎo)基因表達(dá)質(zhì)粒，是一種遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究有力工具。

背景技術(shù)：

受生長(zhǎng)素特異性誘導(dǎo)的啟動(dòng)子響應(yīng)元件有D1、P3、ER7和DR5等，其中，由基本序列TGTCTC以一定間隔多次重復(fù)而成的DR5是生物活性最強(qiáng)的響應(yīng)元件之一，近年來(lái)，通過(guò)與報(bào)告基因融合，DR5等高活性生長(zhǎng)素特異性誘導(dǎo)啟動(dòng)子被廣泛應(yīng)用于研究IAA相關(guān)突變體的遺傳篩選、植物組織和細(xì)胞對(duì)IAA的響應(yīng)以及IAA誘導(dǎo)基因的表達(dá)與定位。植物中還普遍存在感受溫度條件的保守反應(yīng)元件，如擬南芥RD29A基因啟動(dòng)子中的DRE元件(核心序列為CRT)可以控制基因在低溫下的激活表達(dá)。其他一些冷誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子中也存在多個(gè)CRT重復(fù)，如擬南芥COR15A、油菜BN115和小麥WCS120等。Gal4為酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因，其編碼蛋白能識(shí)別目標(biāo)基因啟動(dòng)子上游激活序列(UAS)中17bp的片段(5'-CGGN11CCG-3')。Gal4具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)，其編碼序列可以分別用兩個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，然后在胞內(nèi)自主裝成完整的Gal4，通過(guò)結(jié)合UAS以激活下游基因的表達(dá)。因而，Gal4/UAS系統(tǒng)是一個(gè)模式生物中被廣泛應(yīng)用的基因表達(dá)及功能研究工具。

盡管誘導(dǎo)啟動(dòng)子及基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)廣泛用于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中，但這些系統(tǒng)都是單因素誘導(dǎo)型(即由單一條件誘導(dǎo)基因表達(dá))，在某些特殊領(lǐng)域，由于生物體自身的背景物質(zhì)的干擾而造成誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)程度并不同步。另外，現(xiàn)有的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)大多是單級(jí)的，在誘導(dǎo)信號(hào)放大方面有一定的應(yīng)用局限性，因此設(shè)計(jì)一種雙元的具有兩級(jí)放大作用的基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的不足，提供一種高效的植物雙元誘導(dǎo)基因表達(dá)重組質(zhì)粒，其需要兩個(gè)誘導(dǎo)條件同時(shí)存在時(shí)才能誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)，可以保證取樣植物材料免受背景(如IAA)干擾與實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)程度的同步化；同時(shí)，本發(fā)明利用Gal4/UAS系統(tǒng)基本原理，實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)信號(hào)的兩級(jí)放大，可以提高誘導(dǎo)信號(hào)的檢測(cè)靈敏度。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種高效的植物雙元誘導(dǎo)基因表達(dá)重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒是將DR5Pro::BD_Gal4表達(dá)段、LTPro::AD_Gal4表達(dá)段及UAS Pro::GFP表達(dá)段同時(shí)導(dǎo)入同一植物表達(dá)載體pBI121中得到；

其中，上述DR5Pro::BD_Gal4表達(dá)段是通過(guò)構(gòu)建受生長(zhǎng)素IAA誘導(dǎo)的啟動(dòng)子DR5Pro，以此啟動(dòng)子啟動(dòng)酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的BD結(jié)構(gòu)域表達(dá)得到；上述LTPro::AD_Gal4表達(dá)段是構(gòu)建受低溫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，以此啟動(dòng)子啟動(dòng)酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的AD結(jié)構(gòu)域表達(dá)得到；上述UAS Pro::GFP表達(dá)段是通過(guò)構(gòu)建受Gal4激活的啟動(dòng)子上游激活序列UAS，以此啟動(dòng)報(bào)告基因GFP的表達(dá)得到。

較具體地，上述DR5Pro::BD_Gal4表達(dá)段是通過(guò)人工合成含7個(gè)重復(fù)的受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的DR5響應(yīng)元件，在其后接上CaMV35S啟動(dòng)子的最小啟動(dòng)元件組成生長(zhǎng)素誘導(dǎo)啟動(dòng)子DR5Pro，然后在DR5Pro后添加酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的BD結(jié)構(gòu)域基因及Nos終止子融合得到。

上述LTPro::AD_Gal4表達(dá)段是在LT Pro低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子后融合酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的AD結(jié)構(gòu)域編碼序列和Nos終止子得到；其中，該LT Pro低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子(為英文low temperature promoter的縮寫)包括：一是通過(guò)人工合成7個(gè)重復(fù)的受低溫誘導(dǎo)的DRE元件，在其后接上CaMV35S啟動(dòng)子的最小啟動(dòng)元件組成DRE啟動(dòng)子；二是直接克隆擬南芥中的COR15A、油菜中BN115和小麥中的WCS120低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子。

上述UASPro::GFP表達(dá)段是通過(guò)克隆受Gal4激活的啟動(dòng)子上游激活序列UAS，在其后接上CaMV35S啟動(dòng)子的最小啟動(dòng)元件組成UASPro，然后在UASPro后添加報(bào)告基因GFP及Nos終止子融合得到。

檢測(cè)原理：Gal4為酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白，包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)，完整的Gal4能識(shí)別目標(biāo)基因啟動(dòng)子上游激活序列(UAS)激活下游基因的表達(dá)。前人的研究已經(jīng)證明，當(dāng)分別表達(dá)Gal4的AD和BD結(jié)構(gòu)域時(shí)，如果AD和BD能夠互相靠近并組裝成復(fù)合體，那么這種復(fù)合體同樣可以行使Gal4的功能，從而與UAS結(jié)合并激活下游基因表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建兩種誘導(dǎo)啟動(dòng)子(受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的DR5Pro和受低溫誘導(dǎo)的LTPro)分別啟動(dòng)Gal4的BD和AD結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，當(dāng)生長(zhǎng)素和低溫同時(shí)存在時(shí)，BD和AD被誘導(dǎo)表達(dá)后可組裝成復(fù)合體，從而結(jié)合UAS并激活報(bào)告基因GFP的高效表達(dá)。為了保證BD和AD能高效組裝，本發(fā)明在BD的碳端和AD的氮端融合了互相咬合的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明效果是：本發(fā)明需要兩個(gè)誘導(dǎo)條件同時(shí)存在時(shí)才能誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)，可以排除干擾因素，確保目的基因按預(yù)期準(zhǔn)確表達(dá)；同時(shí)，本發(fā)明利用Gal4/UAS系統(tǒng)基本原理，實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)信號(hào)的兩級(jí)放大，可以提高誘導(dǎo)信號(hào)的檢測(cè)靈敏度；另外，本發(fā)明還具有很大的靈活性和延伸性，多種響應(yīng)化學(xué)信號(hào)、物理信號(hào)的DNA元件均可以用于構(gòu)建雙元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，可以廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究。

附圖說(shuō)明

圖1是是本發(fā)明的雙元誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)原理圖。

圖2是pBI121質(zhì)粒圖譜。

圖3是轉(zhuǎn)基因擬南芥根中GFP在不同處理時(shí)間下的誘導(dǎo)表達(dá)圖。其中，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)包含二個(gè)圖，左圖為熒光圖，右圖為明場(chǎng)圖。

圖4是轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞中GFP在不同處理時(shí)間下的誘導(dǎo)表達(dá)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。

一、材料、試劑與儀器

植物材料：哥倫比亞野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存和擴(kuò)繁。

菌株和質(zhì)粒：克隆用大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101、相關(guān)質(zhì)粒均在本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁和保存。其中植物表達(dá)載體pBI121作為重組載體基礎(chǔ)骨架；pEGAD載體作為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因供體；pGAT7 AD作為GAL4 AD和核定位信號(hào)序列(nuclear localization sequence，NLS)的供體；pGBKT7作為GAL4 BD供體；pCambia 1301作為Nos終止子(Nos terminator)的供體；pYES2作為UAS元件的供體。

主要試劑與耗材：RNA抽提試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、T載體和Real-Time PCR試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA內(nèi)切酶購(gòu)于Takara和Thermo Fisher公司；纖維素酶、崩潰酶及純度要求較高的試劑購(gòu)于Sigma公司；其它常規(guī)試劑購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；小立碗蘚用培養(yǎng)瓶/皿、細(xì)胞分選用離心管和激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿等關(guān)鍵耗材購(gòu)于Corning公司。

主要儀器設(shè)備：Nuaire超低溫冰箱、Barnstead D3750超純水系統(tǒng)、Beckman超速冷凍離心機(jī)、Eppendorf 5415R離心機(jī)、Olympus IX71-22RC顯微操作系統(tǒng)、Olympus FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡、TC-412PCR儀、HTY細(xì)菌培養(yǎng)箱、ZHWY-200B恒溫?fù)u床、GeneGenius全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)。

二、雙元誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.受低溫誘導(dǎo)的LTPro::AD_Gal4表達(dá)段的構(gòu)建

利用7個(gè)重復(fù)的低溫響應(yīng)型元件DRE(序列為TACCGACAT)融合CaMV35S最小啟動(dòng)子元件構(gòu)成DRE啟動(dòng)子；此外，分別從擬南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)和小麥(Triticumaestivum)植物中直接克隆獲得COR15A(SEQ ID No.1)、BN115(SEQ ID No.2)、WCS120(SEQ ID No.3)低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子，統(tǒng)一簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)TPro。

然后在LTPro后依次融合亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的R鏈Zip R、GAL4 AD(酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的AD結(jié)構(gòu)域，簡(jiǎn)稱AD_Gal4)、核定位信號(hào)NLS和終止子Nos terminator，DNA片段融合操作由華大基因公司完成。最后利用引物P1(CAAGCTTTACCGACATTACCGACAT/CAAGCTTAGATCTTGTCCGTTGAAT/CAAGCTTTTAGAAAGTTTAAAATT/CAAGCTTAAACCACGGGTTTTTGG，SEQ ID No.4)和P2(CTCTAGAGGAGGCCCGATCTAGTAAC，SEQ ID No.5)PCR擴(kuò)展前述融合片段獲得LTPro::AD_Gal4表達(dá)段，PCR體系(30μL)：模板1μL、PCR Mix 15μL、P1引物1μL、P2引物1μL、聚合酶0.4μL、ddH₂O 11.6μL。PCR條件為：94℃2min預(yù)變性；94℃30s，56℃30s，72℃2min 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃6min，4℃保存。

2.受生長(zhǎng)素IAA誘導(dǎo)的DR5Pro::BD_Gal4表達(dá)段的構(gòu)建

7個(gè)重復(fù)的生長(zhǎng)素特異響應(yīng)元件DR5(核心序列CCTTTTGTCTC)融合CaMV35S最小啟動(dòng)子元件構(gòu)成生長(zhǎng)素誘導(dǎo)啟動(dòng)子DR5Pro，然后在DR5Pro后依次融合亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的E鏈Zip E、GAL4 BD(酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的BD結(jié)構(gòu)域，簡(jiǎn)稱BD_Gal4)和終止子Nos terminator，DNA片段融合操作由華大基因公司完成。最后利用引物P3(CTCTAGACTATACTAAGTTCATGATAATAG，SEQ ID No.6)和P4(CGGATCCACTAGTCTCGAGTCGACGGAGGCCCGATCTAGTAAC，SEQ ID No.7)通過(guò)PCR擴(kuò)展前述融合片段獲得受生長(zhǎng)素IAA誘導(dǎo)的DR5Pro::BD_Gal4表達(dá)段，PCR體系為：30μL反應(yīng)體系，其中模板1μL、PCR Mix 15μL、P3引物1μL、P4引物1μL、聚合酶0.4μL、ddH₂O 11.6μL。PCR條件為：94℃2min預(yù)變性；94℃30s，56℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃6min，4℃保存。

3.受Gal4激活的UASPro::GFP表達(dá)段的構(gòu)建

從pYES2載體獲得受Gal4激活的啟動(dòng)子上游激活序列UAS(Upstream active sequence)序列，在其后融合CaMV35S最小啟動(dòng)子元件形成UAS Pro啟動(dòng)子。然后在UASPro后融合綠色熒光蛋白報(bào)告基因GFP和終止子Nos terminator，DNA片段融合操作由華大基因公司完成。最后利用引物P5(CACTAGTCGGATTAGAAGCC，SEQ ID No.8)和P6(CGTCGACGGAGGCCCGATCTAGTAAC，SEQ ID No.9)通過(guò)PCR獲得受Gal4激活的UASPro::GFP表達(dá)段，PCR體系為：30μL反應(yīng)體系，其中模板1μL、PCR Mix 15μL、P1引物1μL、P2引物1μL、聚合酶0.4μL、ddH₂O 11.6μL。PCR條件為：94℃2min預(yù)變性；94℃30s，56℃30s，72℃2min 10s，30個(gè)循環(huán)；72℃6min，4℃保存。

4.三個(gè)表達(dá)段的導(dǎo)入

融合LTPro::AD_Gal4表達(dá)段的各DNA片段后，利用HindIII(啟動(dòng)子方向)和XbaI(終止子方向)導(dǎo)入pBI121，pBI121質(zhì)粒圖譜如圖2所示。融合DR5Pro::BD_Gal4表達(dá)段的各DNA片段后，利用XbaI和BamHI導(dǎo)入第一步構(gòu)建好的載體。由于pBI121上酶切位點(diǎn)不夠，所以在DR5-Nos Ter的NosTer 3’端和BamHI的5’端之間導(dǎo)入SpeI和SalI為第三表達(dá)段的導(dǎo)入做好準(zhǔn)備。融合UASPro::GFP表達(dá)段的各DNA片段后，利用SpeI和SalI導(dǎo)入第二步構(gòu)建好的載體，得雙元誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒。

5.重組質(zhì)粒酶切鑒定

利用DNA限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI酶切重組質(zhì)粒，鑒定LTPro::AD_Gal4表達(dá)段是否成功導(dǎo)入pBI121質(zhì)粒；利用DNA限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI酶切重組質(zhì)粒，鑒定DR5Pro::BD_Gal4表達(dá)段是否成功導(dǎo)入pBI121質(zhì)粒；利用DNA限制性內(nèi)切酶SpeI和SalI酶切重組質(zhì)粒，鑒定UASPro::GFP表達(dá)段是否成功導(dǎo)入pBI121質(zhì)粒。反應(yīng)體系為：重組質(zhì)粒2μL、內(nèi)切酶各1μL、酶切緩沖液2μL、ddH₂O補(bǔ)齊20μL，反應(yīng)條件為：37℃反應(yīng)2h。最后獲得同時(shí)具有三個(gè)表達(dá)段的重組質(zhì)粒。

三、雙元誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒GFP誘導(dǎo)表達(dá)熒光驗(yàn)證

以成功轉(zhuǎn)化該重組質(zhì)粒的擬南芥為材料進(jìn)行GFP誘導(dǎo)表達(dá)熒光驗(yàn)證：轉(zhuǎn)基因擬南芥種子滅菌后點(diǎn)播于包含MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，春化24h后置于22℃、16h光照、8h黑暗的培養(yǎng)室中培養(yǎng)兩周。從培養(yǎng)基中取出擬南芥幼苗用1-20μg/L預(yù)冷(4℃)的IAA溶液處理30-210min。制作根的臨時(shí)裝片用后置激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示，隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)，擬南芥根中的熒光逐步增強(qiáng)。

分離轉(zhuǎn)基因擬南芥根原生質(zhì)體(取50株苗齡為4-6周擬南芥根→切成0.5-1mm長(zhǎng)的小段→浸沒(méi)于3mL酶溶液(1.5％Cellulase RS，1％cellulysin，0.1％pectolyase Y-23，10mmol/L KCl，10mmol/L CaCl2，2mmol/L MgCl2，2mmol/L MES，pH5.6)中→60rpm，28℃振蕩30-50min→200目細(xì)胞篩過(guò)濾→洗液清洗后200g離心5min→洗液稀釋沉淀→冰上靜置保存)，用1-20μg/L預(yù)冷(4℃)的IAA溶液處理30min，制作根的臨時(shí)裝片用后置激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖4所示，隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)，擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞中的熒光逐步增強(qiáng)。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種高效的植物雙元誘導(dǎo)基因表達(dá)重組質(zhì)粒

<130> 001

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 985

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

agatcttgtc cgttgaattt attttagact ttttttttaa tggacttcat tttaaatttt 60

tacaaaatta aattattgca ttttctattt catattgaat taggagatgt tactgtccgt 120

cagattctct agactttttt ttttaaagac tgatctatga tcagaattcc aatttttttt 180

ttctttaagg aaatacatca gagagaaaaa ttattacgaa acgattctat tacaagtaat 240

gattttaacc tttttttttt tacaattgac aatcttttca caacaaaaat ccacaagaaa 300

cgttagacaa tggcataaat ttatttaaat taatccgtat atattcgcct tctatgagaa 360

ttgaattcta taccactgta aaattcttaa acgagataag attattttca gcatgtaaaa 420

aatggtttgt ggtttcaact catttgggct attagtttta catttaggct tgcaaccttg 480

tcggtttatt ttgtgtaggc ttttggtaga tttgggcttg caaacccaaa ttaacttgtt 540

ggccgacata catttgtttc tattacaaat ttaacaacaa acgtcaataa atacacgtga 600

aggaaatgag aacgaccctc ttaagtagta ctggaaattg aaaaaaagaa atctagaaat 660

gctaacatgt aagtttttgt taccaaaaat gcaatttgta tgtagccaca atttcatggc 720

cgacctgctt tttttttctt cttctttctg aaaaccacaa atatgattac acgtggcctg 780

aaaagaacga acagaaactc ggtaatgtgc aaaaaatatc ttactcttaa tacgtgtaat 840

tttggagtgt aataggtcta tcgatctata aaacgatact attggagatt agattcttct 900

catctcactt tgttcatcta aaaactcctc ctttcatttc caaacaaaaa cttcttttta 960

ttctcacatc ttaaagatct ctctc 985

<210> 2

<211> 1337

<212> DNA

<213> Brassica napus

<400> 2

ttagaaagtt taaaatttaa tacttgaaca tgtgaaagat ttttctttta aaatatgatt 60

ttagaaaaaa aatatattat ctaattttta tttattttat tattaaaaac tgacatgtca 120

ctacatataa catgtaaatg aatagtcatc ttgcggtcga cattgaaaga ttcatgttct 180

aagatttagt tacaatttga tgaacaaata agttaagttt aaagtttttt gcgatacaaa 240

tgttaggttg aaagtttaaa atgctaatga aaaactttaa aagtttaaag tgttaatgaa 300

taccactttg agggttttta tgcaatttta tgcaattttc tcaattttta agttacccat 360

ctaggtacaa aaatatttta aaccattttg tccaagattc gtgatttctt tgagccggtc 420

ctgatggctt ggctctgatg taccagaaaa tcgatgcacc acgctaatat tttgtacaaa 480

aaaaaatcaa tgttatatag cattcaatga aacgatttaa cccattttgt aaatcctaat 540

tgaaaaaact aatcttgcac ccggtgaccg ttatatatgc aactttgtga aaatatggtt 600

tgtagttttt atttaagcta ttacaccatg tctgtttaga agttcctagt ggataggata 660

tctctgaaag tgacgttaat taattgttat ttatgtaatg gtatgccttt taaaattaca 720

aaaattggtt ttagtagata aatatgttgt ttaaaggaaa ataaatataa tggtatgcct 780

tttgaaatta caaatatgac gttaattaat tgttatttat gtaatggaac cccatgaaat 840

accataaacc atatatcact ctataagtgt gataggcttg ccatcatata cgttatattt 900

ttatatctat attttgaaaa ctttttaggc ttgccatcat atacgttttt tttttttggg 960

gtagatttac taacatgttg gccgacgtat acttttgttt ttatcacaac aaaggtggta 1020

cacgtgaagt aacgataacg acccacaact ccgatttctt tgtgtttaat tttgcaaaaa 1080

ataaaagcag aaatgctaac atgtatatca ccacaagttt tgatggccga cctgtttttt 1140

caatagttaa agaaaataac atcaatgcat tataaaaaaa ttctacgatg ccacgtgatt 1200

tggattgcag ttggtctagt atctataaaa ctatgatact attggagaat agattattac 1260

tcatctcact cttgttccta ttaaaactcc tcctttgatt tcttttgctc gcttttgact 1320

ctttaaagag aactttc 1337

<210> 3

<211> 941

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 3

aaaccacggg tttttggccg gatccgtggc gggggacgac aacgcggtca gtcgcggcag 60

aggcggcgtc ggacatcggg ccgttcacgt ccgcggtgtc ggacggggac ggtgagatgc 120

ggtgtcgaac gtcgggccgt tcacgtccgc gtcgtcggac gggcacggtg agatgcggcg 180

tcgggcgggg ttgggacggc ggcgatcggc cagttggaaa aatggaacgg gaggagcatg 240

atcgccgggc gggcgagaag atcatgcaac tgcctctttt ttcccgtaca cgggcgatgc 300

cttttttttt gcatccgcgc gggtatacgt acgtcggcct gtatgtacaa tagaaggtgg 360

gtatatcgtt tccttcatat ggccattctg cccttctaca ttttgttggg ggtctaccga 420

agcacttctc agaatcctac tgtataaaat tatttcgaat caaagcccta agcctctcgt 480

atgcttcttc tagttactct catagtctca ttgtcgttac atgccgacac tttggatctt 540

ccatcctctt aagcaaacaa tactaccatt tttgcaagag aaaagaatca tcttcttccc 600

ggacaaggac gaatgagctg ggacgtggcg acccggacgc gccactggct tcagaggccc 660

ggccccccta gtcggcagcc acctgccgac cactgatgcg accacacgta gctcccagcc 720

gcggcgattc gtccatctga ccagccctct ttatgggcta gtcggcactc acctgcccat 780

ccactcacga gcgcgcacgt cgtggttcgt ataccctcca acggcctata aatactgcgt 840

cgcgctgcat atgctttaca caaccacctg cttcacacta ccaaggcaag tacacagcag 900

caatacgtag tagatttccc gagtgaggag ctcagcgcaa g 941

<210> 4

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

caagctttac cgacattacc gacatcaagc ttagatcttg tccgttgaat caagctttta 60

gaaagtttaa aattcaagct taaaccacgg gtttttgg 98

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctctagagga ggcccgatct agtaac 26

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctctagacta tactaagttc atgataatag 30

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cggatccact agtctcgagt cgacggaggc ccgatctagt aac 43

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cactagtcgg attagaagcc 20

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cgtcgacgga ggcccgatct agtaac 26