本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種產(chǎn)生苜蓿CRISPR/Cas9基因組編輯純合植株的方法。

背景技術(shù)：

苜蓿作為一種優(yōu)質(zhì)豆科牧草，在畜禽生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。其適應(yīng)性強(qiáng)、栽培歷史長(zhǎng)、分布范圍廣，具有生產(chǎn)力穩(wěn)定、利用年限長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好、飼喂畜禽效果佳、蓄水保土、防風(fēng)固沙、改土肥田、后作增產(chǎn)和恢復(fù)植被、保護(hù)生態(tài)等應(yīng)用價(jià)值，被譽(yù)為“牧草之王”，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著不可替代的作用。

苜蓿中的生物活性成分，如苜蓿多糖、苜蓿皂苷和苜蓿黃酮在改善動(dòng)物的健康狀況、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和免疫功能方面有較好的效果。此外，苜蓿中的葉蛋白、天然色素和綠原酸等有益成分對(duì)畜禽的健康狀況及生產(chǎn)性能同樣有作用，相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及對(duì)苜蓿研究的不斷深入，其生物活性成分作為飼料添加劑將有廣闊的前景，苜蓿將為畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是成簇、有規(guī)律間隔、短回文重復(fù)序列。CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)源自對(duì)細(xì)菌防御系統(tǒng)的研究。作為一門新興的基因工程技術(shù)，CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段對(duì)作物基因組進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，獲得與天然突變體類似的種質(zhì)新資源，從而有效規(guī)避轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的市場(chǎng)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，CRISPR/Cas9技術(shù)因設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作方便，短短幾年已成為研究者爭(zhēng)相研究的熱點(diǎn)。

目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)在擬南芥、水稻、楊樹(shù)、大豆等基因組編輯過(guò)程中獲得了穩(wěn)定的突變植株，并在煙草、大豆、甜橙、小麥、高粱、玉米等多種植物的葉片或原生質(zhì)體等瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了基因組編輯，驗(yàn)證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中進(jìn)行基因組編輯的可行性。目前，第一例基因組編輯蘑菇已經(jīng)問(wèn)世，它無(wú)需通過(guò)美國(guó)法規(guī)機(jī)構(gòu)的監(jiān)管程序，可以直接用于種植和銷售。然而，CRISPR/Cas9基因組編輯過(guò)程中產(chǎn)生的材料多為雜合編輯，如何用一套簡(jiǎn)潔快速的方法獲得純合編輯，用于解決植物因生長(zhǎng)周期長(zhǎng)而延長(zhǎng)試驗(yàn)周期、基因組編輯后需要大規(guī)模篩選鑒定的難題，成為基因組編輯研究工作中非常重要的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)生苜蓿CRISPR/Cas9基因組編輯純合植株的方法，提供一種快速高效產(chǎn)生苜蓿CRISPR/Cas9基因組編輯純合植株的體系，用于苜蓿重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良和分子設(shè)計(jì)。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種產(chǎn)生苜蓿CRISPR/Cas9基因組編輯純合植株的方法，它的內(nèi)容包括：

苜蓿毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立；

苜?；蚪M編輯純合毛狀根根系的篩選鑒定；

苜蓿基因組編輯純合植株的獲得。

進(jìn)一步，所述的苜蓿毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立：針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)gRNA，并構(gòu)建至CRISPR/Cas9基因組編輯表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌作為基因工程菌株用于侵染苜蓿外植體，并在誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基(SHS)培養(yǎng)10-14d誘導(dǎo)產(chǎn)生苜蓿毛狀根，培養(yǎng)箱溫度為25±2℃，暗培養(yǎng)。

進(jìn)一步，所述的苜?；蚪M編輯純合毛狀根根系的篩選鑒定：將誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，S1和S2代則隨機(jī)挑選5-10個(gè)單一毛狀根進(jìn)行連續(xù)繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為25±2℃，暗培養(yǎng)；同時(shí)收集繼代后剩余的根段進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增包含gRNA在內(nèi)的目的基因，并進(jìn)行單酶切鑒定，選擇已發(fā)生編輯的毛狀根的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，快速篩選獲得純合根系。

進(jìn)一步，所述的苜蓿基因組編輯純合植株的獲得：把篩選鑒定的基因組編輯純合根系繼代到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SHC)上，經(jīng)3-5周誘導(dǎo)愈傷細(xì)胞產(chǎn)生，然后繼代到分化培養(yǎng)基(MSR)上，經(jīng)3-5周獲得再生芽，然后繼代到生根培養(yǎng)基(MS0)，經(jīng)3-4周獲得再生苗，培養(yǎng)箱溫度為25±2℃，光照時(shí)間每天16h光/8h暗。

進(jìn)一步，所述的農(nóng)桿菌菌株類型為發(fā)根農(nóng)桿菌；其中除了攜帶Ri質(zhì)粒外，還攜帶外源CRISPR/Cas9基因組編輯表達(dá)載體質(zhì)粒；所述的CRISPR/Cas9載體為pYLCRISPR/Cas9系列載體。

進(jìn)一步，抗性篩選試劑為草胺膦(PPT)、潮霉素(Hyg)或卡那霉素(Kan)。

進(jìn)一步，所述的用于毛狀根誘導(dǎo)的苜蓿外植體為苜蓿無(wú)菌幼苗全株或營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的室外植株葉片。

進(jìn)一步，所述的苜蓿無(wú)菌幼苗為種子苗或無(wú)菌擴(kuò)繁苗。

進(jìn)一步，所述種子苗的獲得方法為：成熟種子用以下方法進(jìn)行消毒：70％酒精不超過(guò)1min，0.1％升汞5-10min，無(wú)菌水洗5遍，將消毒后的種子接種于1/2MS培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)催芽，然后移至光周期16h光/8h暗繼續(xù)培養(yǎng)，10d后隨時(shí)取用；

進(jìn)一步，所述無(wú)菌擴(kuò)繁苗的獲得方法為：無(wú)菌苗自頂端生長(zhǎng)點(diǎn)下數(shù)2-3節(jié)處剪下，接種于MS0培養(yǎng)基培養(yǎng)生根，繼續(xù)培養(yǎng)至生長(zhǎng)正常的幼苗，剪莖和包括葉柄在內(nèi)的葉片為外植體備用。

進(jìn)一步，所述室外植株葉片的消毒方法為：含0.1％吐溫的水洗葉片2min，30％NaClO 5-10min，無(wú)菌水洗至無(wú)味。

本發(fā)明中所述的SHS為SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加400mg/L特美汀，15g/L蔗糖，4g/L植物凝膠；另外根據(jù)另外根據(jù)所使用植物表達(dá)載體的抗生素類型分別添加PPT 1.5mg/L或Hyg 15mg/L或Kan50mg/L作為篩選試劑，pH5.8，121℃高壓滅菌15min；

本發(fā)明中所述的SHC為SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2-4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，0.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)，400mg/L特美汀，30g/L蔗糖，4g/L植物凝膠；另外根據(jù)所使用植物表達(dá)載體的抗生素類型分別添加PPT 1.0mg/L或Hyg 10mg/L或Kan 50mg/L作為篩選試劑，pH5.8，121℃高壓滅菌15min，以上各成份濃度均為各成份在培養(yǎng)基中的終濃度；

本發(fā)明中所述的MSR為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5-1.0mg/L 6-BA，1.0mg/L激動(dòng)素(KT)，400mg/L特美汀，30g/L蔗糖，7.5g/L瓊脂，pH5.8，121℃高壓滅菌15min，以上各成份濃度均為各成份在培養(yǎng)基中的終濃度；

本發(fā)明中所述的MS0為1/2MS培養(yǎng)基添加1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)，400mg/L特美汀，10g/L蔗糖，7.5g/L瓊脂，pH5.8，121℃高壓滅菌15min，以上各成份濃度均為各成份在培養(yǎng)基中的終濃度。

以上所述各成份的濃度均為培養(yǎng)基中的終濃度。

所述的CRISPR/Cas9載體可以串聯(lián)多個(gè)gRNA靶序列，目前技術(shù)水平可以串聯(lián)至少8個(gè)gRNA，能夠顯著提高基因組編輯的效率。

本發(fā)明中所述的毛狀根生長(zhǎng)迅速，能夠顯著縮短基因組編輯純合系的篩選周期。

本發(fā)明中所述的毛狀根誘導(dǎo)、篩選及擴(kuò)繁培養(yǎng)基中無(wú)需激素添加。

本發(fā)明中所述的gRNA的PAM區(qū)附近含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

本發(fā)明中所述的用于毛狀根誘導(dǎo)的外植體來(lái)源豐富，包括苜蓿無(wú)菌幼苗的根、莖、葉等部位，以及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的室外植株葉片。

本發(fā)明中所述的基因克隆、gRNA設(shè)計(jì)、載體構(gòu)建和農(nóng)桿菌侵染均可使用基因工程技術(shù)及CRISPR/Cas9設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明可用于在苜蓿中成功進(jìn)行CRISPR/Cas9基因組編輯。

本發(fā)明的核心特點(diǎn)和發(fā)明理念包括：

1)作物基因組編輯如果能夠在當(dāng)代獲得純合的株系，那么將極大降低下一代篩選鑒定的周期和工作量，然而像其他作物一樣，苜蓿經(jīng)典的葉圓盤轉(zhuǎn)化方法的整個(gè)周期需要6-8個(gè)月，一旦基因組編輯位點(diǎn)失敗或不能獲得基因組編輯純合的株系，勢(shì)必會(huì)增加基因組編輯苜蓿的工作量和延長(zhǎng)其產(chǎn)生的周期，因此需要發(fā)展快速可靠的苜蓿基因組編輯體系，迅速篩選出編輯效率高的gRNA，并產(chǎn)生基因組編輯純合的植株?；谏鲜霭l(fā)明理念，本發(fā)明的核心特點(diǎn)在于：當(dāng)前建立的毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)具有誘導(dǎo)效率高、生長(zhǎng)迅速且每條根系大多來(lái)自單個(gè)細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，能夠用于苜蓿CRISPR/Cas9基因組編輯gRNA編輯效率的快速鑒定和基因純合系的穩(wěn)定產(chǎn)生。

2)基因組被定點(diǎn)編輯后無(wú)論產(chǎn)生何種編輯方式，gRNA序列均會(huì)發(fā)生變化，因此基因組編輯靶位點(diǎn)的鄰近PAM區(qū)如果含有限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，那么純合編輯的毛狀根DNA就不會(huì)被限制性內(nèi)切酶切開(kāi)，而無(wú)編輯或雜合編輯的毛狀根則會(huì)完全或部分被切開(kāi)，從而能夠快速篩選鑒定出基因組編輯的純合根系。基于上述發(fā)明理念，本發(fā)明的核心特點(diǎn)在于：在基因組編輯的gRNA序列設(shè)計(jì)時(shí)優(yōu)先選擇鄰近PAM區(qū)具有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的序列，極大簡(jiǎn)化了后期篩選基因組編輯純合毛狀根根系的工作量。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

1)篩選鑒定周期縮短：本發(fā)明中所述發(fā)根農(nóng)桿菌侵染外植體后10-14天即開(kāi)始產(chǎn)生毛狀根。毛狀根生長(zhǎng)10-14d作為S0代，以后10-14d即可繁殖一代，最多需要2個(gè)月的時(shí)間即可繁殖出S2代。所以經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染外植體后1-2個(gè)月即可鑒定獲得純合毛狀根根系。顯著縮短獲得基因組編輯純合系的周期。

2)純合編輯根系獲得效率高：本發(fā)明在經(jīng)過(guò)S0、S1和S2代毛狀根的酶切鑒定后，獲得純合編輯毛狀根根系的幾率高達(dá)80％以上。

3)純合編輯植株的獲得量大：通過(guò)純合編輯毛狀根根系誘導(dǎo)愈傷，進(jìn)行再生，獲得的再生植株幾乎100％全為純合編輯，較之于大量篩選轉(zhuǎn)化材料而言，后續(xù)篩選的工作量減少，毛狀根再生獲得純合編輯植株的數(shù)量增多。

附圖說(shuō)明

圖1實(shí)施例1中苜蓿pYLCRISPR/Cas9P35S-B-tRNA融合片段的過(guò)表達(dá)載體簡(jiǎn)圖。

圖2實(shí)施例1中蒺藜苜蓿R108毛狀根形態(tài)圖。

圖3實(shí)施例2中純合毛狀根根系快速篩選方法簡(jiǎn)圖。

圖4實(shí)施例2中酶切鑒定電泳圖。WT為野生型，1為少部分編輯，2為大部分編輯，3為純合編輯。

圖5實(shí)施例2中測(cè)序結(jié)果分析圖。左圖為多種編輯方式的純合編輯，右圖為單一編輯方式的純合編輯。

圖6實(shí)施例3中苜蓿毛狀根的再生簡(jiǎn)圖。

圖7實(shí)施例3中純合毛狀根根系誘導(dǎo)的再生白化苗。

具體實(shí)施方式

下面以產(chǎn)生蒺藜苜蓿(R108)CRISPR/Cas9基因組編輯純合植株的方法為實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理及特征進(jìn)行描述，所述實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、發(fā)根農(nóng)桿菌和載體等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從公司通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買，而本實(shí)施例中所述的CRISPR/Cas9表達(dá)載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光老師饋贈(zèng)載體改造而來(lái)。

實(shí)施例1：CRISPR/Cas9-PDS表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化獲得蒺藜苜蓿(R108)毛狀根根系，其包括以下步驟：

1)蒺藜苜蓿(R108)PDS基因的克隆與gRNA設(shè)計(jì)：

PDS基因的克?。和ㄟ^(guò)NCBI及Phytozome搜索，蒺藜苜?；蚪M中只有一個(gè)完整的PDS基因序列(基因號(hào)為Medtr3g084830)。以此基因的序列為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)引物，以蒺藜苜蓿(R108)DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序。

gRNA設(shè)計(jì)：使用CRICPR-P網(wǎng)站，以Medicago truncatula(Mt4.0v2)為Target Genome，以Medtr3g084830基因?yàn)長(zhǎng)ocus Tag，Submit。注意選擇在鄰近PAM區(qū)具有合適酶切位點(diǎn)的gRNA作為定點(diǎn)編輯的靶位點(diǎn)。

2)基因組編輯表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9P35S-B-tRNA-PDS的構(gòu)建：

pUC57載體質(zhì)粒提?。涸撦d體含有合成的gRNA+tRNA序列(菌株名稱為Top10)，提質(zhì)粒，備用。

目的片段(tRNA-PDS-gRNA片段)的獲得：分別以F1和R1、F2和R2為引物，以pUC57質(zhì)粒為模板，選用平末端的KOD高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，備用。其中R1和F2上含有g(shù)RNA的序列；F1和R1擴(kuò)增的目的片段為111bp，F(xiàn)2和R2的為117bp，片段太小，切膠回收時(shí)需謹(jǐn)慎。

pYLCRISPR/Cas9P35S-B載體質(zhì)粒提取：該載體在農(nóng)桿菌中的抗性為Kan，植物中為PPT。

目的片段與表達(dá)載體連接：回收片段與pYLCRISPR/Cas9P35S-B載體混合，構(gòu)建pYLCRISPR/Cas9P35S-B-tRNA-PDS。pYLCRISPR/Cas9P35S-B載體酶切使用的是BsaI內(nèi)切酶，二者連接用T4DNA連接酶，兩步反應(yīng)在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定陽(yáng)性克隆，測(cè)序。

重組質(zhì)粒pYLCRISPR/Cas9P35S-B-tRNA-PDS轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，鑒定陽(yáng)性，存-80℃，備用。

3)基因工程菌株制備：將步驟(2)中獲得的-80℃下保存的發(fā)根農(nóng)桿菌劃線接種于YEP培養(yǎng)基添加50mg/L利福平(Rif)的固體培養(yǎng)基上，28℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種于YEP添加Rif的液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，次日以1％接種量擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)18℃3500rpm離心15min，棄上清，用轉(zhuǎn)化液稀釋至OD₆₀₀為0.2-0.4備用。

4)外植體的準(zhǔn)備：蒺藜苜蓿(R108)無(wú)菌幼苗的整個(gè)植株均可作為外植體，其根系部位可以直接用于侵染轉(zhuǎn)化，莖或葉柄切成1.5cm左右的小段，葉片則稍切邊緣使之產(chǎn)生傷口即可。

5)發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染：將步驟(4)中獲得的外植體放入盛有步驟(3)制備的菌液中，于脫色搖床上輕搖20min。

6)共培養(yǎng)：吸凈步驟(5)中的侵染液后，將外植體放置在無(wú)菌濾紙上，于超凈工作臺(tái)中晾干，然后擺放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)24-48h。

7)毛狀根的誘導(dǎo)：將步驟(6)中共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移至毛狀根誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基(SHS)上，黑暗培養(yǎng)，約10-14d即可長(zhǎng)出毛狀根。培養(yǎng)箱溫度為25±2℃，暗培養(yǎng)。

所述的苜蓿PDS基因長(zhǎng)度為1347bp，基因序列、引物序列及靶位點(diǎn)序列見(jiàn)SEQ NO.1-3。

所述的蒺藜苜蓿(R108)PDS基因的gRNA靶位點(diǎn)序列含有MwoI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)為SEQ NO.4、5。

所述的gRNA、tRNA及F1、R1、F2、R2引物序列見(jiàn)SEQNO.6-11。

所述的苜蓿基因組編輯載體pYLCRISPR/Cas9P35S-B-tRNA融合片段的簡(jiǎn)圖見(jiàn)附圖1。

所述的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA9402。

所述的蒺藜苜蓿外植體可以來(lái)自種子苗營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的室外植株葉片，也可以來(lái)自無(wú)菌幼苗的整個(gè)植株，包括根、莖和葉片等不同組織器官。

所述的苜蓿共培養(yǎng)培養(yǎng)基為SH基本培養(yǎng)基添加乙酰丁香酮(As)100mg/L。SHS為SH基本培養(yǎng)基添加400mg/L特美汀，15g/L蔗糖，4g/L植物凝膠。另添加PPT 1.5mg/L。pH5.8，121℃高壓滅菌15min，以上各成份濃度均為各成份在培養(yǎng)基中的終濃度。

所述的誘導(dǎo)出的蒺藜苜蓿R108毛狀根形態(tài)見(jiàn)附圖2。

實(shí)施例2：蒺藜苜蓿(R108)PDS基因被定點(diǎn)編輯的純合毛狀根根系的快速篩選，其主要操作步驟如下：

1)毛狀根的擴(kuò)繁：將實(shí)施例1中誘導(dǎo)出的抗性毛狀根隨機(jī)編號(hào)，并按照順序?qū)⒏惦S機(jī)編號(hào)1S0、2S0、3S0……，便于追蹤和純化?？剐愿瞪L(zhǎng)迅速，10-14d繼代一次。S1和S2代則隨機(jī)挑選5-10個(gè)單一毛狀根進(jìn)行連續(xù)繼代培養(yǎng)，同時(shí)收集繼代后剩余的根段進(jìn)行DNA提取，留做鑒定用。培養(yǎng)箱溫度為25±2℃，暗培養(yǎng)。

2)毛狀根的酶切鑒定：將步驟(1)中獲取的抗性毛狀根樣品提取DNA，PCR擴(kuò)增包含gRNA在內(nèi)的目的基因，并用已選好的MwoI酶進(jìn)行單酶切，電泳分析。

3)純合毛狀根根系的測(cè)序及分析：將步驟(2)經(jīng)PCR/RE法鑒定為陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，快速篩選獲得純合根系。同時(shí)將此PCR產(chǎn)物連T載體，挑取單菌落PCR鑒定為陽(yáng)性，每個(gè)根系至少送樣10個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序，確定編輯效率和編輯方式。

所述毛狀根擴(kuò)繁培養(yǎng)基與毛狀根誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基(SHS)相同。

所述的PDS基因片段被MwoI酶切后，野生型未發(fā)生編輯，酶切后理論上應(yīng)該出現(xiàn)兩條帶，分別為978bp和369bp。

所述的純合毛狀根體系快速篩選方法簡(jiǎn)圖見(jiàn)附圖3.

所述的PDS基因片段的編輯情況，存在野生型、雜合和純合三種可能的版本，如果該片段未被成功編輯，則會(huì)跟對(duì)照的野生型版本一樣被MwoI限制性內(nèi)切酶切開(kāi)，而編輯過(guò)的版本，不論是雜合還是純化片段，MwoI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)已經(jīng)部分或全部出現(xiàn)突變，因此被編輯成功的片段不會(huì)被MwoI限制性內(nèi)切酶切開(kāi)，即仍舊會(huì)存留1347bp的單一片段(見(jiàn)圖4)。

所述的測(cè)序分析，是在酶切鑒定的基礎(chǔ)上對(duì)鑒定基因組編輯成功的片段進(jìn)一步精確分析出編輯效率和編輯方式(見(jiàn)圖5)。

實(shí)施例3：毛狀根再生體系建立及PDS基因純合編輯蒺藜苜蓿(R108)白化苗植株的獲得，其主要特點(diǎn)包括如下操作步驟：

1)毛狀根誘導(dǎo)愈傷：把篩選鑒定的基因組編輯純合根系轉(zhuǎn)移到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SHC)上，3-5周誘導(dǎo)，產(chǎn)生的愈傷組織即可進(jìn)行下一步的分化再生。培養(yǎng)箱溫度為25±2℃，暗培養(yǎng)。

2)毛狀根分化再生：將步驟(1)中獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(MSR)上，一周以內(nèi)即可分化出芽點(diǎn)，經(jīng)3-5周分化獲得再生芽。培養(yǎng)箱溫度為25±2℃，光照時(shí)間每天16h光/8h暗(見(jiàn)圖6)。

3)毛狀根再生芽生根：將步驟(2)中獲得的再生芽繼代到生根培養(yǎng)基(MS0)，經(jīng)3-4周獲得白化的蒺藜苜蓿(R108)再生苗。培養(yǎng)箱溫度為25±2℃，光照時(shí)間每天16h光/8h暗。

所述的SHC為SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2-4mg/L 2,4-D，0.5mg/L6-BA，400mg/L特美汀30g/L蔗糖，4g/L植物凝膠；另添加PPT 1.0mg/L，pH5.8，121℃高壓滅菌15min，以上。pH5.8，121℃高壓滅菌15min各成份濃度均為各成份在培養(yǎng)基中的終濃度。。

所述的MSR為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5-1.0mg/L 6-BA，1.0mg/LKT，400mg/L特美汀，30g/L蔗糖，7.5g/L瓊脂，pH5.8，121℃高壓滅菌15min，以上各成份濃度均為各成份在培養(yǎng)基中的終濃度。

所述的MS0為1/2MS培養(yǎng)基添加1.0mg/L IBA，400mg/L特美汀，10g/L蔗糖，7.5g/L瓊脂，pH5.8，121℃高壓滅菌15min，以上各成份濃度均為各成份在培養(yǎng)基中的終濃度。

所述的純合編輯毛狀根產(chǎn)生出的再生苗全為白化苗(見(jiàn)圖7)。

使用實(shí)施例1中蒺藜苜蓿(R108)毛狀根誘導(dǎo)頻率大于30％。

使用實(shí)施例2中蒺藜苜蓿(R108)獲得純合編輯根系的周期縮短，酶切鑒定至S2代，純合毛狀根根系的獲得率高于80％。

使用實(shí)施例3中蒺藜苜蓿(R108)毛狀根的再生頻率高于50％，白化苗獲得率幾乎為100％。

本發(fā)明技術(shù)方案不僅適用于一年生自交親和的蒺藜苜蓿，還適用于紫花苜蓿等多年生自交不親和豆科牧草的基因組編輯純合植株的獲得。

最后應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，因此任何對(duì)本發(fā)明方案的修改或等同替換，均不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所

<120> 一種產(chǎn)生苜蓿CRISPR/Cas9基因組編輯純合植株的方法

<130> 無(wú)

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1347

<212> DNA

<213> Medicago lupulina

<400> 1

gattatccac gtcctgagct tgatgatact gttaatttca ttgaagcttc ttacttgtct 60

tctacctttc gtgcttctcc tcgtcctact aaacctttga aggttgttat tgctggtgca 120

ggtaacatat acccatcttt tttttttttt tttttttttt ttgtatcaaa attgtaactt 180

tgctgcgaaa tttgttgttt ttgttctatt gggtgctttt taaatagtac ttgtagttga 240

ctaattgact tgacttgagc tttgttttct aatggtggtg gaaattatga agcacatata 300

ccggatatga cactgacagg ttgacaacgg tagtaatttg aaaaaataac ataattgagt 360

ataatcatac atgtggtgtt cgtgtcggtg ttggacacaa acacaaggta tgcgtttgat 420

cagaagtgtc tgtgctacag gtggaaagtg agaatgggat aggattgtta tttatataat 480

gagcttcttg cttgctgttt ttggcagatg tgttctttat gcatgaaagg agtttggagt 540

tcttttctta tgtataagct gttttcataa gcagagtgtt tatggaaata agctgaaaat 600

agcttatgaa catgttataa gttgttttca ttagctatgc ccaacaatca cacaattgcg 660

tatgctagta gataaatttg ataaactcaa ataatccaac aatgagtgaa ggctttatca 720

cattgtgtga gatcctgtgc caataaagaa aaaaaaaatt atggaataga ctgtagcatt 780

ttcagttttt tataaagttt caaatgaaag gtaccatatt attgtgttgg atatttaagc 840

aaaaattgat tataatattt gtgtacgagt tttggcctct ttctttttct tttggattga 900

tttgttcttc aaattatccc aggactggct ggtttgtcaa ctgcaaaata tttggcagat 960

gctggtcaca agcctatatt gctggaggca agagacgttc taggtggaaa ggttttctga 1020

ctaatttaat ctcatttgtc attaagcttc tattttgtgc ttcgtgtttt attcatttca 1080

gcttgctgtt tagttaaata agaaacctat tcttatttga ttgttcctaa ataatttaat 1140

aattcaagtt cttgtttcaa gaattaattt tctggctcat tggagtggta atgttgaact 1200

tctacatcga tttttttttt aagattcaac agtacttgca agttatttgt tatagctcaa 1260

ttttaaatgt tttcatgcta ttttcttatt ttctaaggtt gcggcatgga aagatgaaga 1320

tggagattgg tatgagaccg gcctaca 1347

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 克隆MtPDS基因引物序列F

<400> 2

gattatccac gtcctgagct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 克隆MtPDS基因引物序列R

<400> 3

tgtaggccgg tctcatacca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Medicago lupulina

<400> 4

tggtcacaag cctatattgc 20

<210> 5

<211> 11

<212> DNA

<213> Medicago lupulina

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

gcnnnnnnng c 11

<210> 6

<211> 11

<212> DNA

<213> Medicago lupulina

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

cgnnnnnnnc g 11

<210> 7

<211> 76

<212> DNA

<213> Medicago lupulina

<400> 7

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 8

<211> 77

<212> DNA

<213> Medicago lupulina

<400> 8

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60

gattcccggc tggtgca 77

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物序列F1

<400> 9

cgggtctcag tcaaacaaag caccagtgg 29

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物序列R1

<400> 10

taggtctcag gcttgtgacc atgcaccagc cgggaa 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物序列F2

<400> 11

taggtctcca gcctatattg cgttttagag ctagaa 36

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物序列R2

<400> 12

taggtctcca aacaaaaaaa gcaccgactc g 31