本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻OsWOX11蛋白及其編碼基因的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物組織培養(yǎng)是指在無(wú)菌和人工控制的環(huán)境條件下，利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基對(duì)離體的植物器官組織細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生細(xì)胞或是完整植株的技術(shù)。其研究的類(lèi)型主要包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體培養(yǎng)。組織培養(yǎng)已廣泛的應(yīng)用于作物育種，次生代謝物的生產(chǎn)，植物的快速繁殖等領(lǐng)域。

利用組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的遺傳轉(zhuǎn)化、品種培育和快速繁殖等技術(shù)依賴于愈傷組織的形成。傳統(tǒng)上，認(rèn)為愈傷組織是一團(tuán)脫分化的，無(wú)序分裂的細(xì)胞團(tuán)。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)愈傷組織類(lèi)似于一團(tuán)有序的根原基，其形成更像是一個(gè)轉(zhuǎn)分化的過(guò)程〔Sugimoto,K.、Jiao,Y.和Meyerowitz,E.M.，2010，Arabidopsis regeneration from multiple tissues occurs via a root development pathway，Dev Cell 18，463-471；Liu,J.、Sheng,L.、Xu,Y.、Li,J.、Yang,Z.、Huang,H.和Xu,L.，2014，WOX11and 12are involved in the first-step cell fate transition during de novo root organogenesis in Arabidopsis，Plant Cell 26，1081-1093〕。植物被認(rèn)為具有很強(qiáng)的再生能力，其成體干細(xì)胞分布在各個(gè)組織中，而愈傷組織的細(xì)胞來(lái)源就是這些潛在的成體干細(xì)胞〔Sugimoto,K.等，同上；Liu,J.等，同上〕。通過(guò)利用植物體內(nèi)成體干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制來(lái)提高植物組織培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織發(fā)生能力是從源頭上來(lái)增強(qiáng)愈傷組織形成能力的新方法，更加具有普適性的意義。

WOX(WUSCHEL related homeobox)是一類(lèi)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，含有同源異型結(jié)構(gòu)域，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用〔van der Graaff, E.、Laux,T.和Rensing,S.A.，2009，The WUS homeobox-containing(WOX)protein family，Genome Biology 10，248〕。目前的研究表明WOX基因通常表達(dá)在干細(xì)胞龕中，并且具有維持細(xì)胞干性的功能，例如WUS，WOX5以及WOX4分別在莖頂端分生組織的OC(organize center)，根頂端分生組織的QC(quiescent center)以及形成層處表達(dá)，具有維持其周?chē)杉?xì)胞的屬性的功能。綜上所述，愈傷組織起源于植物體內(nèi)的干細(xì)胞，而WOX基因通常都具有維持細(xì)胞干性的功能，并且該功能在各個(gè)物種都非常的保守，這為我們的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供新的植物愈傷組織的培養(yǎng)方式以及WOX蛋白及其編碼基因在組織培養(yǎng)中調(diào)控愈傷組織形成中的應(yīng)用。

更具體而言，本發(fā)明的目的是提供新的水稻愈傷組織的培養(yǎng)方式以及水稻W(wǎng)OX蛋白或其編碼序列在組織培養(yǎng)中調(diào)控愈傷組織形成中的應(yīng)用。

更具體而言，作為一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明所提供的同源異型結(jié)構(gòu)域的WOX蛋白，名稱為OsWOX11，來(lái)源于水稻(Oryza sativa ssp.japonica)，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

因此，本發(fā)明第一方面提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體能在植物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)WOX蛋白。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體能在植物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)水稻W(wǎng)OX蛋白。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體能在植物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)水稻、玉米、楊樹(shù)、番茄或擬南芥的WOX11蛋白。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述水稻的WOX11(即OsWOX11)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體含有SEQ ID NO:4所示的編碼序列。

本發(fā)明第二方面提供一種農(nóng)桿菌，所述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入了本發(fā)明的重組表達(dá)載體。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述農(nóng)桿菌是根癌農(nóng)桿菌。

本發(fā)明第三方面提供植物WOX蛋白或其編碼序列、能過(guò)表達(dá)植物WOX蛋白的重組表達(dá)載體以及含所述重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在組織培養(yǎng)中調(diào)控(尤其是提高或增強(qiáng))愈傷組織形成中的應(yīng)用。

本發(fā)明第四方面提供植物WOX蛋白或其編碼序列、能過(guò)表達(dá)植物WOX蛋白的重組表達(dá)載體以及含所述重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在形成愈傷組織中的應(yīng)用。

本發(fā)明第五方面提供一種形成愈傷組織的方法，所述方法包括：

(1)將過(guò)表達(dá)植物WOX蛋白的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中；

(2)獲取過(guò)表達(dá)該WOX蛋白的植物的組織或器官；和

(3)在適于形成愈傷組織的條件下培養(yǎng)所述組織或器官；

從而形成愈傷組織。

本發(fā)明第六方面提供一種產(chǎn)生愈傷組織能力增強(qiáng)的植株的方法，所述方法包括：

(1)用過(guò)表達(dá)植物WOX的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株；

(2)收獲該植株的繁殖材料；和

(3)使該繁殖材料再生成植株；

從而產(chǎn)生愈傷組織能力增強(qiáng)的植株。

本發(fā)明第七方面提供一種提高植物再生能力的方法，所述方法包括用過(guò)表達(dá)植物WOX的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株的步驟。

在組織培養(yǎng)中，將上述水稻OsWOX11基因的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化被子植物的模式物種擬南芥(Arabidopsis thaliana Col-0)，可以得到產(chǎn)生愈傷組織能力增強(qiáng)的植株，提高了植物的再生能力。因此為植物遺傳育種提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)基因，同時(shí)也對(duì)深入理解愈傷組織形成過(guò)程的分子機(jī)理，進(jìn)一步利用和理解植物再生過(guò)程具有非常重要的意義。本發(fā)明的愈傷組織誘導(dǎo)方式，蛋白以及其編碼基因具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說(shuō)明

圖1顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥中檢測(cè)OsWOX11基因的過(guò)表達(dá)量的結(jié)果。OX1， OX2和OX3分別為三個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系。WT為非轉(zhuǎn)基因野生型對(duì)照。

圖2顯示OsWOX11過(guò)量表達(dá)擬南芥葉片外植體生長(zhǎng)愈傷組織的表型。材料培養(yǎng)于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上8天。A，非轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥。B，轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)OsWOX11(pCAMBIA1300-35S:OsWOX11)擬南芥。

圖3顯示不同物種的WOX11家族蛋白同源結(jié)構(gòu)域的序列對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供新的植物愈傷組織的培養(yǎng)方式以及WOX蛋白及其編碼基因在組織培養(yǎng)中調(diào)控愈傷組織形成中的應(yīng)用。

WOX(WUSCHEL related homeobox)是一類(lèi)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，含有同源異型結(jié)構(gòu)域，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用。WOX包括WUS、WOX5、WOX4、WOX11等。

本發(fā)明尤其涉及來(lái)自水稻(Oryza sativa ssp.japonica)的WOX11，即OsWOX11。具體而言，本發(fā)明OsWOX11的氨基酸序列如氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明也包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的突變體。這些突變體包括：與SEQ ID NO:1具有至少80％，優(yōu)選至少85％，優(yōu)選至少90％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少97％的序列相同性并保留SEQ ID NO:1的生物學(xué)活性的氨基酸序列?？刹捎美鏝CBI的BLASTp計(jì)算兩條比對(duì)的序列之間的序列相同性。這類(lèi)突變體包括來(lái)自不同物種的WOX11蛋白，例如來(lái)自玉米、楊樹(shù)、番茄、擬南芥等的WOX11蛋白。優(yōu)選的是，來(lái)自其它植物的WOX11家族蛋白與OsWOX11(SEQ ID NO:1)第18－85位所示的同源結(jié)構(gòu)域具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、甚至98％以上的序列相同性。更優(yōu)選的是，本發(fā)明包括與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％、優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少97％以上的序列相同性，同時(shí)同源結(jié)構(gòu)域(即WOX11蛋白的第18－85位氨基酸序列)之間的序列相同性在90％以上、優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選97％以上的序列相同性的突變體。

突變體還包括：在SEQ ID NO:1所示的序列中具有一個(gè)或數(shù)個(gè)突變(插入、缺失或取代)、同時(shí)仍保留SEQ ID NO:1的生物學(xué)活性的氨基酸序列。所述數(shù) 個(gè)突變通常指1－10個(gè)以內(nèi)，例如1－8個(gè)、1－5個(gè)或1－3個(gè)。取代優(yōu)選是保守性取代。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行保守性取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能?！靶阅芟嘟蛳嗨频陌被帷卑ɡ?，具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族，這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在本發(fā)明多肽中用來(lái)自同一側(cè)鏈類(lèi)的另一氨基酸殘基替換一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)，將不會(huì)在實(shí)質(zhì)上影響其活性。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在基因克隆操作中，常常需要設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，這勢(shì)必在所表達(dá)的蛋白末端引入一個(gè)或多個(gè)不相干的殘基，而這并不影響目的蛋白的活性。又如為了構(gòu)建融合蛋白、促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)、獲得自動(dòng)分泌到宿主細(xì)胞外的重組蛋白、或利于重組蛋白的純化，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或該蛋白內(nèi)的其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，適合的接頭肽、信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的標(biāo)簽，或Xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點(diǎn)。應(yīng)理解，這些氨基酸序列的存在不會(huì)影響到所得多肽的活性。因此，本發(fā)明也包括在本發(fā)明多肽的C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸(例如前述接頭肽、信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、GST、麥芽糖E結(jié)合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的標(biāo)簽，或Xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點(diǎn)等)所得的多肽，這些多肽仍具有本文所述的生物學(xué)活性。

本發(fā)明包括編碼WOX蛋白，尤其是OsWOX11蛋白及其突變體的多核苷酸序列。OsWOX11的編碼序列例子之一如SEQ ID NO:4所示。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編 碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:4所示的編碼序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體?！昂?jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但與SEQ ID NO:4所示的編碼序列有差別的核酸序列。

編碼SEQ ID NO:1的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。

本文中，編碼多肽的多核苷酸可以是包括編碼所述多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及與上述的多核苷酸序列雜交且兩條序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳至少90％，最佳至少95％的相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指：(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO:1所示的多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。

應(yīng)理解，雖然本發(fā)明以O(shè)sWOX11為例，但來(lái)自其它植物的與OsWOX11的基因高度同源(如具有50％以上，如60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、甚至98％以上的序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，例如BLAST。作為例子，所示其它植物包括玉米，楊樹(shù)，番茄和擬南芥。其中，玉米的WOX11(ZmWOX11)的登陸號(hào)為EU954172；楊樹(shù)的WOX11包括PtrWOX11/12a，基因號(hào)：Potri.013G066900；和PtrWOX11/12b，基因號(hào)：Potri.019G040800；番茄(SlWOX11)的登陸號(hào)為XP_004242129.1；擬南芥(AtWOX11)的基因號(hào)：AT3G03660；而水稻(OsWOX11)的基因號(hào)：Os07g48560。

本發(fā)明的WOX蛋白的核苷酸全長(zhǎng)序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體優(yōu)選是過(guò)表達(dá)載體。

本發(fā)明中，可將編碼WOX蛋白的多核苷酸序列插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼WOX蛋白的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。

此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。

本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。

本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法也是本領(lǐng)域周知的。

本發(fā)明提供一種農(nóng)桿菌，所述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入了本發(fā)明的重組表達(dá)載體。通常，農(nóng)桿菌是根癌農(nóng)桿菌。轉(zhuǎn)入的方法也是周知的，例如可采用電擊法。

本發(fā)明提供植物WOX蛋白或其編碼序列、能過(guò)表達(dá)植物WOX蛋白的重組表達(dá)載體以及含所述重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在組織培養(yǎng)中調(diào)控(尤其是提高或增強(qiáng))愈傷組織形成中的應(yīng)用，以及植物WOX蛋白或其編碼序列、能過(guò)表達(dá)植物WOX蛋白的重組表達(dá)載體以及含所述重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在形成愈傷組織中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種形成愈傷組織的方法，所述方法包括：

(1)將過(guò)表達(dá)植物WOX蛋白的重組表達(dá)載體或含該重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入植物中；

(2)獲取過(guò)表達(dá)該WOX蛋白的植物的組織或器官；和

(3)在適于形成愈傷組織的條件下培養(yǎng)所述組織或器官；

從而形成愈傷組織。

還提供的是一種產(chǎn)生愈傷組織能力增強(qiáng)的植株的方法，所述方法包括：

(1)用過(guò)表達(dá)植物WOX的重組表達(dá)載體或含該重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株；

(2)收獲該植株的繁殖材料；和

(3)使該繁殖材料再生成植株；

從而產(chǎn)生愈傷組織能力增強(qiáng)的植株。

還提供的是一種提高植物再生能力的方法，所述方法包括用過(guò)表達(dá)植物WOX的重組表達(dá)載體或含該重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的步驟。

如本文所用，所述的“植物”包括農(nóng)作物以及園藝植物，包括但不限于：十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科蕓薹屬的擬南芥(Arabidopsis thaliana)，禾本科的水稻和玉米，薔薇科的櫻桃，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司提供，測(cè)序工作由上海鉑尚生物科技有限公司完成。

實(shí)施例1、獲取過(guò)表達(dá)OsWOX11的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株

一、OsWOX11基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu)獲得OsWOX11(Os07g48560)基因的CDS序列(SEQ ID NO:4)，根據(jù)5’和3’末端序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列分別為F端：5’-cgcggatccATGGACGGCGGCCACAGCCCGGAC-3’(SEQ ID NO:5)，和R端5’-acgcgtcgacTCGCTCAACTCGATCAAGACG-3’(SEQ ID NO:6)。

提取水稻幼葉于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天的總RNA(使用TRIzol，Invitrogen)抽提)，以水稻的總RNA為模板，用RevertAid Reverse反轉(zhuǎn)錄酶(Thermo Scientific)合成cDNA(依據(jù)User Guide:RevertAid Reverse Transcriptase，Thermo Scientific的用戶手冊(cè)進(jìn)行)。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增水稻的OsWOX11基因的全長(zhǎng)CDS序列。PCR反應(yīng)體系包含(50μl)：模板0.5μl，高保真酶KOD plus(TOYOBO)1μl，10×緩沖液5μl，2.5μM dNTP 5μl，25mM MgSO₄5μl，10μl的5’和3’引物各2.5μl，水28.5μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化約800bp的擴(kuò)增片段，使用BamHI酶和SalI酶切回收后將其連接到載體pCAMBIA1300-35S載體上(由pCAMBIA1300改造而來(lái))，形成OsWOX11基因過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S:OsWOX11。

二、過(guò)表達(dá)OsWOX11在擬南芥中的表達(dá)檢測(cè)

將構(gòu)建好的OsWOX11基因過(guò)表達(dá)載體(即pCAMBIA1300-35S:OsWOX11)，使用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，再使用常規(guī)的浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。待擬南芥種子成熟后，收取種子，干燥，使用75％的 乙醇滅菌20分鐘，均勻播撒種子于含潮霉素(25mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基上，其中1/2MS培養(yǎng)基配制方法為：MS(購(gòu)自phytoTechology Laboratories)2.2g/L；蔗糖10g/l；MES(購(gòu)自上海雙向西巴斯公司)0.5g/L；Agar 1％(pH 5.8)。大約3周后得到轉(zhuǎn)化苗，將轉(zhuǎn)化苗移栽至土壤中，并剪取葉片，使用前述方法提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以所得到的cDNA為模版進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，PCR體系(20μl)為：模板0.5μl，無(wú)菌水7.9μl，OsWOX11的F端定量引物：5’-ATCTCCTCCGACTGCTTCGTC-3’(SEQ ID NO:7)0.8μl，和R端定量引物5’-CTCGAGATGGCGAACAGGTC-3’(SEQ ID NO:8)0.8μl，Sybrgreen PCR Mix 10μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果如如圖1所示，結(jié)果顯示在擬南芥葉片中出現(xiàn)了OsWOX11的高表達(dá)。

實(shí)施例2、過(guò)表達(dá)OsWOX11在擬南芥中的表型鑒定

待轉(zhuǎn)基因擬南芥結(jié)子后，收取種子，干燥，于1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)12天后，以葉片為外植體在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基及CIM培養(yǎng)基配制方法為：B5(購(gòu)自phytoTechology Laboratories)3.21g/L；MES 0.5g/L；蔗糖20-40g/L；2,4-D(購(gòu)自SIGMA)2.2μM；Kinetin(購(gòu)自SIGMA)0.2μM；Agar 0.8％(pH 5.8)上誘導(dǎo)7天，結(jié)果如圖2所示。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥形成愈傷組織的能力明顯增強(qiáng)。