本發(fā)明涉及基因工程及疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種表達(dá)羊種布氏菌P39基因的rBCG及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

布魯氏菌病(Brucellosis)簡稱布病，是由布氏菌感染引起的一種人畜共患傳染病。布氏菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，對(duì)人和哺乳動(dòng)物具有高度感染性和致病性。該菌屬主要包括羊種、牛種、豬種和犬種等6個(gè)生物種，中國流行的主要是前3種，其中以羊種布氏菌感染最常見。布病的傳播方式為動(dòng)物—?jiǎng)游锖蛣?dòng)物—人群。羊、牛、豬等家畜最易感染，動(dòng)物感染后可導(dǎo)致生殖器官和胎膜發(fā)炎、流產(chǎn)、不育和各種組織病變，極大地增加了向人群傳播的幾率。人群對(duì)布氏菌普遍易感，一般羊種布氏菌對(duì)人危害最大。人與病畜及受污染的畜產(chǎn)品接觸后，布氏菌可通過消化道、呼吸道、泌尿生殖道、皮膚及眼結(jié)膜等途徑感染。

近20年來，我國布病疫情日趨嚴(yán)重并由迅速蔓延的趨勢。國內(nèi)外現(xiàn)行的布病疫苗均為減毒活疫苗，這些疫苗普遍存在毒性較大、保護(hù)周期較短、無法區(qū)分自然感染和疫苗接種等諸多不足，無法滿足布病防控的現(xiàn)實(shí)需求。因此，新型布病疫苗的研究與開發(fā)對(duì)于控制布病疫情的蔓延具有重要意義，也是國內(nèi)外布病研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已證實(shí)的布氏菌T細(xì)胞抗原包括PBP39、L7/L12和Cu-Zn SOD等，這些蛋白及其編碼基因已用于布病亞單位疫苗和DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)研究。

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是目前唯一用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，在世界衛(wèi)生組織全球性擴(kuò)展免疫計(jì)劃中廣泛使用。BCG具有數(shù)十年大量安全使用記錄、熱穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低、顯著的佐劑效應(yīng)以及經(jīng)口服可誘導(dǎo)有效粘膜免疫等特點(diǎn)，同時(shí)BCG也是一種極具吸引力的活疫苗載體，利用BCG作為新型疫苗的表達(dá)宿主前景誘人。近年來，以BCG為載體的重組BCG疫苗研發(fā)日益受到國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注和重視，針對(duì)的病原體涉及細(xì)菌、病毒、寄生蟲及腫瘤等，具有廣闊的發(fā)展前景。

目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)構(gòu)建攜帶羊種布氏菌M5株39kDa胞質(zhì)結(jié)合蛋白PBP39編碼基因(P39基因)重組BCG的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)羊種布氏菌P39基因的rBCG及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一目的是提供所述rBCG在制備布魯氏菌病疫苗中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體攜帶有經(jīng)過密碼子優(yōu)化的羊種布氏菌P39基因的表達(dá)盒，且出發(fā)載體為大腸桿菌-分支桿菌穿梭表達(dá)載體pMV361。

本發(fā)明中，羊種布氏菌P39基因來自于羊種布氏菌(Brucella melitensis)M5菌株(CMCC55009)且經(jīng)過密碼子優(yōu)化，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

優(yōu)選地，所述表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發(fā)明還提供一種表達(dá)羊種布氏菌P39基因的rBCG，其是將攜帶有羊種布氏菌P39基因表達(dá)盒的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BCG中，篩選獲得可分泌表達(dá)羊種布氏菌P39基因的rBCG。

本發(fā)明表達(dá)羊種布氏菌P39基因的rBCG，由以下方法構(gòu)建獲得：

1)根據(jù)已公開的羊種布氏菌M5株P(guān)39基因序列，采用Jcat軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，人工合成全序列優(yōu)化后的P39基因作為目的基因；

2)攜帶有優(yōu)化后的羊種布氏菌P39基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建：將上述目的基因通過PvuⅡ和EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)插入穿梭表達(dá)載體pMV361中；

3)宿主菌轉(zhuǎn)化：將步驟2)構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BCG中，篩選陽性克隆，即得可分泌表達(dá)羊種布氏菌P39基因的rBCG。

本發(fā)明還提供所述rBCG在制備布魯氏菌病疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供由所述rBCG制備的布魯氏菌病疫苗。

可將本發(fā)明所述的rBCG直接作為布魯氏菌病疫苗使用，或者輔以免疫佐劑，制成布魯氏菌病疫苗。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)由布氏菌產(chǎn)生約39kDa大小的胞質(zhì)結(jié)合蛋白PBP39(編碼基因?yàn)镻39)是一種T細(xì)胞抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。

(二)BCG(卡介苗)是迄今唯一商品化的預(yù)防結(jié)核的疫苗，作為外源基因的表達(dá)宿主，所制備的疫苗具有安全性高、熱穩(wěn)定性好、制備簡單、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

(三)BCG本身具有顯著的免疫佐劑效應(yīng)，因此rBCG疫苗無需添加疫苗佐劑，進(jìn)一步節(jié)約了成本。

(四)BCG也是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，rBCG可以模擬布氏菌感染和胞內(nèi)寄生的特征，更有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

(五)P39基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，能夠提高外源基因在BCG的表達(dá)量(表達(dá)量可提高30％以上，尤其是60℃誘導(dǎo)4小時(shí)后的表達(dá)量可提高一倍以上)，解決了因外源基因表達(dá)量不高所致的重組BCG免疫效果不佳的難題。

(六)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的rBCG能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答。

(七)利用羊種布氏菌P39基因制備重組BCG疫苗具有重要的研究意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中經(jīng)優(yōu)化和未經(jīng)優(yōu)化的P39基因構(gòu)建的重組BCG中目的蛋白PBP39的SDS-PAGE電泳結(jié)果；其中，1：攜帶未經(jīng)優(yōu)化的P39基因重組BCG；2：攜帶經(jīng)優(yōu)化后的P39基因重組BCG；3：未轉(zhuǎn)染的BCG；4：攜帶經(jīng)優(yōu)化后的P39基因重組BCG(溫度誘導(dǎo))；M：蛋白Marker。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中構(gòu)建的不同重組BCG對(duì)Balb/c小鼠的免疫效果比較。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例1攜帶有羊種布氏菌P39基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建

包括以下步驟：

1、根據(jù)已公開的羊種布氏菌M5株P(guān)39基因的序列(GenBank:EF189139.1)，采用Jcat軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，人工合成全序列優(yōu)化后的P39基因作為目的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)。

2、攜帶有優(yōu)化后的M5菌株P(guān)39基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建：

將上述目的基因通過PvuⅡ和EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)插入穿梭表達(dá)載體pMV361中。

3、插入正確的重組表達(dá)載體的驗(yàn)證：

通過核酸序列測定，證實(shí)攜帶有優(yōu)化后的羊種布氏菌P39基因的重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

實(shí)施例2表達(dá)羊種布氏菌P39基因的rBCG的構(gòu)建

1、以BCG作為宿主菌，將實(shí)施例1中構(gòu)建的重組表達(dá)載體(全序列如SEQ ID NO:2所示)轉(zhuǎn)化至BCG中。

采用電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)條件為：2500V、25μF、1000Ω，電轉(zhuǎn)時(shí)間5ms，0.1cm電擊杯。電轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系為：質(zhì)粒3μl(濃度為0.65μg/μl)，感受態(tài)BCG菌液100μl(濃度約為1×10¹⁰CFU/ml)。

2、陽性克隆的篩選

電轉(zhuǎn)后，吸取菌液接種到含有50μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基(斜面)上進(jìn)行陽性克隆篩選。

3、目的基因表達(dá)量的檢測

將篩選得到的陽性克隆(即重組BCG)接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，SDS-PAGE電泳檢測目的基因的表達(dá)量。經(jīng)優(yōu)化后的P39基因表達(dá)升高，尤其是溫度誘導(dǎo)(60℃誘導(dǎo)4小時(shí))后，表達(dá)量顯著提高。結(jié)果見圖1。

實(shí)施例3布魯氏菌病疫苗的效果實(shí)驗(yàn)

用重組BCG免疫6-8周齡雌性Balb/c小鼠，皮下注射，注射劑量為4×10⁸CFU/只，免疫4周后，檢測各組小鼠血清中Th1/Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與攜帶未經(jīng)優(yōu)化P39基因的重組BCG(rBCG-P39(wild))和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的BCG相比，攜帶經(jīng)過密碼子優(yōu)化P39基因的重組BCG(rBCG-P39)能夠有效地誘導(dǎo)IL-2、IL-12和IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。(圖2)

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)

<120> 表達(dá)羊種布氏菌P39基因的rBCG及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

<130> KHP161118991.5

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggccccgg tggccaacgc ccaggagaag cagaacgtgg aggtgctgca ctggtggacc 60

tcgggcggcg aggcctcggc cctggaggtg ctgaagaagg acctggagtc gaagggcatc 120

tcgtggaccg acatgccggt ggccggcggc ggcggcaccg aggccatgac cgtgctgcgc 180

gcccgcgtga ccgccggcaa cgccccgacc gccgtgcaga tgctgggctt cgacatccgc 240

gactgggccg agcagggcgc cctgggcaac ctggacaccg tggcctcgaa ggagggctgg 300

gagaaggtga tcccggcccc gctgcaggag ttcgccaagt acgacggcca ctggatcgcc 360

gccccggtga acatccactc gaccaactgg atgtggatca acaaggccgc cctggacaag 420

gccggcggca aggagccgac caactgggac gagctgatcg ccctgctgga caacttcaag 480

gcccagggca tcaccccgat cgcccacggc ggccagccgt ggcaggacgc caccatcttc 540

gacgccgtgg tgctgtcgtt cggcccggac ttctacaaga aggccttcat cgacctggac 600

ccggaggccc tgggctcgga caccatgaag caggccttcg accgcatgtc gaagctgcgc 660

acctacgtgg acgacaactt ctcgggccgc gactggaacc tggcctcggc catggtgatc 720

gagggcaagg ccggcgtgca gttcatgggc gactgggcca agggcgagtt cctgaaggcc 780

ggcaagaagc cgggcgagga cttcgtgtgc atgcgctacc cgggcaccca gggcgccgtg 840

accttcaact cgggcatgtt cgccatgttc aaggtgtcgg aggacaaggt gccggcccag 900

ctggagatgg cctcggccat cgagtcgccg gccttccagt cggccttcaa cgtggagaag 960

ggctcggccc cggcccgcac cgacgtgccg gacaccgcct tcgacgcctg cggcaagaag 1020

accatcgccg acgtgaagga ggccaactcg aagggcaccc tgctgggctc gatggcccac 1080

ggctacgcca acccggccgc cgtgaagaac gccatctacg acgtggtgac ccgccagttc 1140

aacggccagc tgtcgtcgga ggacgccgtg aaggagctgg tggtggccgt ggaggccgcc 1200

aagtaa 1206

<210> 2

<211> 5654

<212> DNA

<213> 重組表達(dá)載體

<400> 2

gctagcaaca aagcgacgtt gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca caagataaaa 60

atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca aggggtgtta 120

tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg 180

ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct 240

atcgcttgta tgggaagccc catgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg 300

ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc 360

ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga 420

tccccgggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg 480

ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt 540

ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg 600

ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag 660

aaatgcataa tcttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac 720

ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg 780

gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc 840

cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat 900

tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaatcaga attggttaat tggttgtaac 960

actggcagag cattacgctg acttgacggg acggcggctt tgttgaataa atcgaacttt 1020

tgctgagttg aaggatcaga tcacgcatct tcccgacaac gcagaccgtt ccgtggcaaa 1080

gcaaaagttc aaaatcacca actggtccac ctacaacaaa gctctcatca accgtggctc 1140

cctcactttc tggctggatg atggggcgat tcaggcctgg tatgagtcag caacaccttc 1200

ttcacgaggc agacctcact agttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 1260

atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 1320

gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 1380

tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 1440

ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 1500

ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 1560

ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 1620

aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc 1680

cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 1740

gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 1800

ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 1860

cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 1920

tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 1980

cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcaa cgcgtgcggc cgcggtaccc ggggatcctc 2040

tagagtcgac caccaagggc accatctctg cttgggccac cccgttggcc gcagccagct 2100

cgctgagagc cgtgaacgac agggcgaacg ccagcccgcc gacggcgagg gttccgaccg 2160

ctgcaactcc cggtgcaacc ttgtcccggt ctattctctt cactgcacca gctccaatct 2220

ggtgtgaatg cccctcgtct gttcgcgcag gcggggggct ctattcgttt gtcagcatcg 2280

aaagtagcca gatcagggat gcgttgcaac cgcgtatgcc caggtcagaa gagtcgcaca 2340

agagttgcag acccctggaa agaaaaatgg ccagagggcg aaaacaccct ctgaccagcg 2400

gagcgggcga cgggaatcga acccgcgtag ctagtttgga agaatgggtg tctgccgacc 2460

acatatgggc cggtcaagat aggtttttac cccctctcgg ctgcatcctc taagtggaaa 2520

gaaattgcag gtcgtagaag cgcgttgaag cctgagagtt gcacaggagt tgcaacccgg 2580

tagccttgtt cacgacgaga ggagacctag ttggcacgtc gcggatgggg atcgctgaag 2640

actcagcgca gcgggaggat ccaagcctca tacgtcaacc cgcaggacgg tgtgaggtac 2700

tacgcgctgc agacctacga caacaagatg gacgccgaag cctggctcgc gggcgagaag 2760

cggctcatcg agatggagac ctggacccct ccacaggacc gggcgaagaa ggcagccgcc 2820

agcgccatca cgctggagga gtacacccgg aagtggctcg tggagcgcga cctcgcagac 2880

ggcaccaggg atctgtacag cgggcacgcg gagcgccgca tctacccggt gctaggtgaa 2940

gtggcggtca cagagatgac gccagctctg gtgcgtgcgt ggtgggccgg gatgggtagg 3000

aagcacccga ctgcccgccg gcatgcctac aacgtcctcc gggcggtgat gaacacagcg 3060

gtcgaggaca agctgatcgc agagaacccg tgccggatcg agcagaaggc agccgatgag 3120

cgcgacgtag aggcgctgac gcctgaggag ctggacatcg tcgccgctga gatcttcgag 3180

cactaccgga tcgcggcata catcctggcg tggacgagcc tccggttcgg agagctgatc 3240

gagcttcgcc gcaaggacat cgtggacgac ggcatgacga tgaagctccg ggtgcgccgt 3300

ggcgcttccc gcgtggggaa caagatcgtc gttggcaacg ccaagaccgt ccggtcgaag 3360

cgtcctgtga cggttccgcc tcacgtcgcg gagatgatcc gagcgcacat gaaggaccgt 3420

acgaagatga acaagggccc cgaggcattc ctggtgacca cgacgcaggg caaccggctg 3480

tcgaagtccg cgttcaccaa gtcgctgaag cgtggctacg ccaagatcgg tcggccggaa 3540

ctccgcatcc acgacctccg cgctgtcggc gctacgttcg ccgctcaggc aggtgcgacg 3600

accaaggagc tgatggcccg tctcggtcac acgactccta ggatggcgat gaagtaccag 3660

atggcgtctg aggcccgcga cgaggctatc gctgaggcga tgtccaagct ggccaagacc 3720

tcctgaaacg caaaaagccc ccctcccaag gacactgagt cctaaagagg ggggtttctt 3780

gtcagtacgc gaagaaccac gcctggccgc gagcgccagc accgccgctc tgtgcggaga 3840

cctgggcacc agccccgccg ccgccaggag cattgccgtt cccgccagaa atctagacgg 3900

tgaccacaac gacgcgcccg ctttgatcgg ggacgtctgc ggccgaccat ttacgggtct 3960

tgttgtcgtt ggcggtcatg ggccgaacat actcacccgg atcggagggc cgaggacaag 4020

gtcgaacgag gggcatgacc cggtgcgggg cttcttgcac tcggcatagg cgagtgctaa 4080

gaataacgtt ggcactcgcg accggtgagt cgtaggtcgg gacggtgagg ccaggcccgt 4140

cgtcgcagcg agtggcagcg aggacaactt gagccgtccg tcgcgggcac tgcgcccggc 4200

cagcgtaagt agcggggttg ccgtcacccg gtgacccccg gtttcatccc cgatccggag 4260

gaatcacttc gcaatggcca agacaattgc ggatccagct ggccacatgg ccccggtggc 4320

caacgcccag gagaagcaga acgtggaggt gctgcactgg tggacctcgg gcggcgaggc 4380

ctcggccctg gaggtgctga agaaggacct ggagtcgaag ggcatctcgt ggaccgacat 4440

gccggtggcc ggcggcggcg gcaccgaggc catgaccgtg ctgcgcgccc gcgtgaccgc 4500

cggcaacgcc ccgaccgccg tgcagatgct gggcttcgac atccgcgact gggccgagca 4560

gggcgccctg ggcaacctgg acaccgtggc ctcgaaggag ggctgggaga aggtgatccc 4620

ggccccgctg caggagttcg ccaagtacga cggccactgg atcgccgccc cggtgaacat 4680

ccactcgacc aactggatgt ggatcaacaa ggccgccctg gacaaggccg gcggcaagga 4740

gccgaccaac tgggacgagc tgatcgccct gctggacaac ttcaaggccc agggcatcac 4800

cccgatcgcc cacggcggcc agccgtggca ggacgccacc atcttcgacg ccgtggtgct 4860

gtcgttcggc ccggacttct acaagaaggc cttcatcgac ctggacccgg aggccctggg 4920

ctcggacacc atgaagcagg ccttcgaccg catgtcgaag ctgcgcacct acgtggacga 4980

caacttctcg ggccgcgact ggaacctggc ctcggccatg gtgatcgagg gcaaggccgg 5040

cgtgcagttc atgggcgact gggccaaggg cgagttcctg aaggccggca agaagccggg 5100

cgaggacttc gtgtgcatgc gctacccggg cacccagggc gccgtgacct tcaactcggg 5160

catgttcgcc atgttcaagg tgtcggagga caaggtgccg gcccagctgg agatggcctc 5220

ggccatcgag tcgccggcct tccagtcggc cttcaacgtg gagaagggct cggccccggc 5280

ccgcaccgac gtgccggaca ccgccttcga cgcctgcggc aagaagacca tcgccgacgt 5340

gaaggaggcc aactcgaagg gcaccctgct gggctcgatg gcccacggct acgccaaccc 5400

ggccgccgtg aagaacgcca tctacgacgt ggtgacccgc cagttcaacg gccagctgtc 5460

gtcggaggac gccgtgaagg agctggtggt ggccgtggag gccgccaagt aagaattcga 5520

agcttatcga tgtcgacgta gttaactagc gtacgatcga ctgccaggca tcaaataaaa 5580

cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc cggccatcat 5640

ggccgcggtg atca 5654