描述

本發(fā)明涉及對植物病原體具有增強的抗性的植物以及通過影響肌醇焦磷酸鹽，特別是insp8，的細胞內濃度來在植物中產生增強的病原體抗性的方法。

植物經常暴露于植物病原體。具體為食草性昆蟲及其幼蟲，以及真菌和真菌樣病原體(例如卵菌綱)。保守估計提出，由葡萄孢屬(botrytis)物種單獨造成的農藝損害估計約為十億/年¹。產生的損害不僅由直接的產量損失引起，而且還由產品質量的損失(例如由真菌毒素的富集)引起。

用于防治昆蟲和真菌病原體的常規(guī)方法是使用化學的植物保護產品。然而，這些措施往往導致部分產量的損失。在作物中使用化學的植物保護產品可能對人類和環(huán)境具有負面影響。此外，這些措施是非常成本密集型和勞動密集型的。此外，用化學的植物保護產品消滅的病原體經常發(fā)展適應機制，使得這些措施往往達不到期望的保護效果。

使用化學試劑的替代方法是使用昆蟲和真菌抗性品種。因為植物基因組的復雜性，使用常規(guī)植物育種的新品種的育種是非?？菰锖屠щy的；常規(guī)植物培養(yǎng)通常使用自發(fā)突變或誘導突變，其表現(xiàn)不受外部因素(例如冷休克或放射性照射)的影響。

常規(guī)育種的替代方法是生產轉基因植物。將具有期望性質的基因特異地引入植物的基因組中。目前，特別是抗除草劑和抗蟲植物作為轉基因植物銷售。新一代品種的目標是在不利條件(如干旱脅迫或昆蟲侵襲)下的產量增加。

目前正在種植的主要是具有抗蟲性的轉基因玉米和棉花植物。在大多數(shù)情況下，該屬性來自bt毒素，bt毒素由引入植物的基因編碼。該基因來源于土壤細菌蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)，其天然產生這種活性成分。然而，這一策略的一個問題是第一抗性已經在植物病原體中發(fā)展。

此外，許多科學論文已經表明bt玉米會傷害蝴蝶并危及許多其他非目標生物體。bt毒素僅緩慢降解，積累在土壤中，并在食物鏈中傳播。類似于bt毒素在生物植物保護中的使用以及對蚊子的控制，bt玉米的種植因此對生物多樣性帶來了廣泛的風險。

因此，本發(fā)明的目標是提供對植物病原體具有提高的抗性的植物及其制備方法，其不具有現(xiàn)有技術已知的活性物質的長期毒性的缺點，例如，通過積累在土壤中。此外，通過分別提供此類植物和方法，應擴大針對病原體的可能措施的范圍，從而最小化抗性發(fā)展的可能性。

該目標通過提供與野生型植物相比，其中肌醇焦磷酸鹽insp7和/或inspe8的細胞內濃度增加的植物來實現(xiàn)。

在動物系統(tǒng)中，肌醇焦磷酸鹽已被描述為重要的細胞內信號轉導分子。在本發(fā)明中，首次顯示蛋白質vih2和vih1抑制肌醇焦磷酸鹽insp6和insp7的磷酸化，并且在擬南芥(arabidopsis)幼苗中的vih2主要負責合成肌醇焦磷酸鹽insp8。vih2轉錄物主要在不同的營養(yǎng)組織中表達，并通過機械損傷以及毛蟲侵染誘導，而vih1轉錄物主要在花粉中積累。

在本發(fā)明中，顯示vih2(genbank登錄號：at3g01310)參與植物中病原體防御(參見實施例)。

具體地，通過提供具有至少一種參與合成肌醇焦磷酸鹽，特別是insp8，的蛋白質的可誘導的表達或提高的表達的植物來實現(xiàn)本發(fā)明的目標。

本發(fā)明的一實施方案是這樣的植物，其中由核苷酸序列2(genbank登錄號：at3g01310)編碼的蛋白質vih2或能夠合成肌醇焦磷酸鹽，特別是insp8，的同源蛋白質的表達和/或活性，與野生型植物相比，在整個植物或特定組織中是可誘導的或增加的。

在本發(fā)明的另一實施方案中，植物是其中由核苷酸序列1(genbank登錄號：at5g15070)編碼的蛋白質vih1或能夠合成肌醇焦磷酸鹽，特別是insp8，的同源蛋白質的表達和/或活性，與野生型植物相比，在整個植物或特定組織中是可誘導的或增加的植物。

核苷酸序列1或核苷酸序列2可以來源于一種植物物種，即是同源表達的，或來源于自另一種生物體，即是異源表達的。異源表達可能是有利的，因為宿主生物體中的轉錄后或翻譯后調節(jié)機制(例如由于過度產生導致酶的失活)可以被頻繁地規(guī)避。

vih2、vih1或其同源蛋白的可誘導性可以通過本領域技術人員已知的方法來實現(xiàn)。例如，相應的核苷酸序列的表達可以在目標植物中的誘導型啟動子的控制下實現(xiàn)。已經在擬南芥、煙草、水稻或玉米中成功使用的已知的誘導型表達系統(tǒng)通常由兩個組分組成：組成型或組織特異性表達的(通常是嵌合的)轉錄因子和控制期望的核苷酸序列表達的實際啟動子。這種啟動子可以通過外部刺激被嵌合轉錄因子活化。已知的實例是乙醇誘導型(“alcr/alca”系統(tǒng))、地塞米松誘導型(gr-融合體、gvg系統(tǒng)和pop/lhgr系統(tǒng))、β-雌二醇誘導型(xve/olexa系統(tǒng))和熱休克誘導型表達系統(tǒng)。

對于誘導表達，也可以使用天然存在于目標植物中的啟動子，例如由病原體誘導的啟動子。已知的實例是例如調節(jié)在茉莉酮酸酯代謝中重要的并存在于所有高等植物中的jaz(“茉莉酮酸酯zim結構域”)蛋白的轉錄物的表達的啟動子。

vih2、vih1或其同源蛋白的增加的表達(過表達)可以通過本領域技術人員已知的方法實現(xiàn)。因此，相應的核苷酸序列的表達可以在組成型啟動子(例如花椰菜花葉病毒啟動子camv35s或泛素(ubq)啟動子)的轉錄控制下進行。也可以使用組織特異性啟動子，其是例如僅在可能被病原體感染的組織中表達，如葉特異性啟動子、果實特異性啟動子或種子特異性啟動子。

本發(fā)明還涉及用于增強針對植物病原體的植物抗性的方法，其中與野生型植物相比，肌醇焦磷酸鹽insp7和/或insp8的細胞內濃度是被調節(jié)的或增加的。

具體地，肌醇焦磷酸鹽insp7和/或insp8的細胞內濃度可以通過vih2、vih1或它們的同源蛋白的誘導型表達或組成型表達和/或活性來實現(xiàn)。

在替代的實施方案中，通過用insp7的底物(insp8的前體)、用insp8和/或用insp7或insp8的衍生物處理(例如以噴霧、噴灑等形式)植物來增加肌醇焦磷酸鹽insp7和/或insp8的細胞內濃度。在這種情況下，可透過膜的酯是特別有意義的，例如為信使insp3的外源性應用的開發(fā)的那些可透過膜的酯²。在這種情況下，利用在細胞中天然存在的酯酶活性，其在衍生物攝取后導致活性肌醇磷酸鹽或肌醇焦磷酸鹽的釋放。

根據(jù)本發(fā)明的植物所抵抗的植物病原體具體為食草性昆蟲，例如農業(yè)相關害蟲的幼蟲，農業(yè)相關害蟲如小白菜白蛾或夜蛾；以及病原性真菌，諸如死體營養(yǎng)性真菌(necrotrophicfungi)，例如鏈格孢屬(alternaria)或葡萄孢屬(botrytis)的代表。

與現(xiàn)有技術已知的方法(例如，植物中來自細菌蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)的bt毒素的表達)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是在本發(fā)明的植物中，可有利地利用內源性機制用于增強對植物病原體和環(huán)境脅迫的抗性。由于這需要使用原始植物基因而不是外來物種基因和物質，可以假定此類植物在公眾中的接受度比常規(guī)轉基因植物的情況更好。此外，預料根據(jù)本發(fā)明的植物的農業(yè)使用將不會對非目標生物體和環(huán)境具有嚴重影響，諸如使用常規(guī)殺蟲劑或培育bt植物的影響。也可以假定與用于生產抗性植物的常規(guī)方法相反，害蟲的抗性形成發(fā)生得更慢，因為針對病原體的整個植物防御機制是由肌醇焦磷酸鹽而不僅僅是個別毒素引起的。

根據(jù)參閱附圖的下面描述的示例性實施方案，在下文中描述了本發(fā)明的進一步的優(yōu)勢、特征和可能的應用。

圖1.擬南芥vih2功能缺失突變體對小白菜白蛾(菜粉蝶(pierisrapae))的幼蟲顯示出降低的抗性。在所謂的“無選擇”分析中研究幼蟲發(fā)育。在該分析中，將幼蟲階段l1中的一只單一毛蟲置于指定基因型的單株5周齡的植物上，并使用紗布防止其逸出。col-0表示使用的野生型擬南芥(arabidopsisthaliana)(擬南芥(thalecress))生態(tài)型，vih2-3和vih2-4是在col-0背景中vih2功能缺失突變體。7天后確定毛蟲的鮮重。值表示平均值(±標準誤差)(n＝20)。統(tǒng)計學顯著性差異由星號(t檢驗；*p<0.02)表示。

圖2.擬南芥vih2功能喪失突變體對夜蛾甘藍夜蛾(mamestrabrassicae)(圓白菜蛾)幼蟲顯示出降低的抗性。在所謂的“無選擇”分析中研究幼蟲發(fā)育。在該分析中，將幼蟲階段l1中的一只單一毛蟲置于指定基因型的單株5周齡的植物上，并使用紗布防止其逸出。col-0表示使用的野生型擬南芥(擬南芥)生態(tài)型，vih2-4是在col-0背景中vih2功能缺失突變體。8天后確定毛蟲的鮮重。值表示平均值(±標準誤差)(n＝20)。統(tǒng)計學顯著性差異由星號(t檢驗；*p<0.02)表示。

圖3.擬南芥vih2過表達系對夜蛾甘藍夜蛾(圓白菜蛾)幼蟲顯示出增強的抗性。在所謂的“無選擇”分析中研究幼蟲發(fā)育。在該分析中，將幼蟲階段l1中的一只單一毛蟲置于指定基因型的單株5周齡的植物上，并使用紗布防止其逸出。col-0表示使用的野生型擬南芥(擬南芥)生態(tài)型，“camv35s：vih2”是轉基因植物，其中野生型vih2基因的激酶結構域在強病毒camv35s啟動子的控制下是過表達的。8天后確定毛蟲的鮮重。值表示平均值(±標準誤差)(n＝20)。統(tǒng)計學顯著性差異由星號(t檢驗；*p<0.05)表示。這些實驗顯示vih2的表達增加(與肌醇焦磷酸鹽insp8的增加有關)導致植物對食草性昆蟲害蟲的增強的抗性。害蟲在轉基因植物上的生長(和近似害蟲誘發(fā)的損害)減少約30％。肌醇焦磷酸鹽的增加沒有“不良”的副作用：植物健康，正常發(fā)育和繁殖。

圖4.在擬南芥中，vih2的過表達導致對死體營養(yǎng)性子囊菌甘藍鏈格孢菌(alternariabrassicicola)增強的抗性，然而vih2功能缺失突變體顯示出降低的抗性。如前所述進行用甘藍鏈格孢菌(分離株mucl20297)的感染實驗³。為此，將孢子調節(jié)至5×10⁵個孢子/ml的密度，將四至六滴5μl孢子懸浮液滴加到葉表面，并將植物在100％的濕度，22℃和8小時/16小時光/黑暗節(jié)律中培育7-10天(植株數(shù)≥15)。隨后，將疾病癥狀記錄在案，并將其分為不同等級的每種葉損害表型。等級如下。i級(橫條紋)：感染部位的淺棕色斑點；ii級(斜條紋)：感染部位的深棕色斑點和壞死的第一跡象；iii級(全黑)：進行性壞死和葉片浸解。通過卡方檢驗評估數(shù)據(jù)的分布，并顯示col-0和vih2-3之間、col-0和vih2-4之間以及col-0和camv35s：vih2之間的差異是顯著的(p<0.05)。vih2-3和vih2-4是vih2功能缺失突變體，camv35s：vih2是其中野生型vih2基因的激酶結構域在強的病毒camv35s啟動子的控制下被過表達的轉基因植物。這些實驗表明，vih2表達的增加(與肌醇焦磷酸鹽insp8的增加相關)導致植物針對死體營養(yǎng)性真菌的增強的抗性，因為對此類植物的真菌誘導型損傷是顯著降低的。

圖5.擬南芥vih2功能缺失突變體顯示出對死體營養(yǎng)性真菌和灰霉病成因劑灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)的降低的抗性。將5μl大滴的灰葡萄孢菌的分生孢子(孢子)懸浮液吸移到5周齡植物的葉表面上。這是針對指定基因型的每株植物5個生長的葉子和總共20個植物進行的。只使用比各個植物的第4葉更年輕的葉子。此后，將接種的植物在21℃的氣候室中，在10小時/14小時光/黑暗節(jié)律中，在100％濕度下培育3天。隨后，根據(jù)病變的大小和發(fā)生時間，記錄疾病癥狀并分為不同的等級。等級如下：i級(橫條紋)：直徑2mm的病變；ii級(全黑)：伴有褪綠病的直徑2mm的病變；iii級(斜條紋)：伴有褪綠病的直徑2-4mm的病變；iv級(豎條紋)：有直徑≥4毫米和褪綠病的病變。采用卡方檢驗進行數(shù)據(jù)的分布，并顯示col-0和vih2-3之間以及col-0和vih2-4之間的差異是顯著的(p<0.001)。如前所述制備用于這些實驗的分生孢子懸浮液⁴。為此，將灰葡萄孢菌的分生孢子從甘油儲備液接種到半濃縮馬鈴薯葡萄糖肉湯固體培養(yǎng)基(pdb，difco^tm)上，并在22℃，在10小時/14小時光/黑暗節(jié)律下培育2周。隨后，用半濃縮pdb液體培養(yǎng)基從固體培養(yǎng)基表面洗滌分生孢子，通過玻璃棉過濾，并用計數(shù)室測定分生孢子密度。將懸浮液在半濃縮的pdb-液體培養(yǎng)基中調節(jié)至5×10⁵個分生孢子/ml的密度，在室溫下培育2小時，并用于葉接種。實驗重復3次，結果相似。

示例性實施方案

用相同生態(tài)型(擬南芥，col-0)的同基因系進行實驗，其以完整vih2基因(和因此vih2蛋白)的存在(col-0)和不存在(vih2-3和vih2-4)為特征，或以vih2激酶結構域的增加的表達(camv35s：vih2)為特征。在后一植物(camv35s：vih2)中，野生型vih2基因的激酶結構域處于強病毒camv35s啟動子的控制下。為此，通過擬南芥cdna擴增vih2激酶序列，并插入到載體pentr^tm/(invitrogenlifetechnologies)中。從那里，vih2激酶結構域序列由lrconase^tmii(invitrogenlifetechnologies)轉移到二元植物轉化載體pgwb441(nakagawa等人，2007，biosci.biotechnol.biochem，71,2095-2100)中。由此產生的載體“pgwb441-vih2kd”用于擬南芥植物的轉化。在卡那霉素上選擇幾個獨立的轉化體，建立不再分離的camv35s：vih2t3植物，并在這些植物中證實了增加的insp8生物合成。圖3和圖4顯示了這些系的一個的實驗的實例，證明vih2激酶結構域的增加的表達(并伴隨著增加的insp8的產生)導致對食草性昆蟲甘藍夜蛾(圓白菜蛾，圖3)的幼蟲以及針對死體營養(yǎng)性真菌甘藍鏈格孢菌(圖4)的增強的抗性。使用的vih2功能缺失植物(vih2-3和vih2-4)來源于如下公開可取得的種子庫：來自“索爾克研究所基因組分析實驗室(salkinstitutegenomicanalysislaboratory)”(usa)的擬南芥col-0(基因組完全測序的columbia-0，cs60000)；來自先正達擬南芥插入物庫(syngentaarabidopsisinsertionlibrary(sail))收集的vih2-3(sail_165_f12)。這一品系通過“俄亥俄州立大學(ohiostateuniversity)”的“擬南芥生物研究中心(arabidopsisbiologicalresearchcenter”(abrc)(usa)提供給我們；vih2-4(gk-080a07)來源于比勒費爾德大學(universitybielefeld)的“生物體系中植物基因組分析(genomanalyseimbiologischensystempflanze)(gabi-kat)”收集。在兩種情況下(sail和gabi-kat)，通過借助農桿菌轉化含有特異性t-dna的載體來轉化擬南芥col-0植物。t-dna大部分非定向地整合到基因組中，并且根據(jù)基因組位點可導致受影響基因的破壞(并因此導致由該基因編碼的蛋白質的缺失)。借助于t-dna特異性寡核苷酸，在相應的庫中對多個此類植物進行測序以確定特定植物中的插入位點和因此受影響基因的身份。相應的數(shù)據(jù)可在線獲得，以便能夠鑒定所期望蛋白質的潛在的功能缺失突變體。這種迂回路線(非定向插入和隨后的基因分型)是必需的，因為在較高等的植物中，通過同源重組原理(與例如面包酵母或小鼠相反)的靶向生產的“敲除”植物是非常無效的。

示例性實施方案指出vih2功能缺失突變體對食草性昆蟲和死體營養(yǎng)性真菌具有降低的抗性(圖1、圖2、圖4和圖5)，而vih2激酶結構域的增加的表達(和因此增加insp8的產生)導致對食草性昆蟲和死體營養(yǎng)性真菌增強的抗性(圖3和圖4)。

參考文獻

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