本發(fā)明涉及通過(guò)優(yōu)化的新型多核苷酸序列和用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主來(lái)高水平表達(dá)細(xì)菌類毒素。本發(fā)明還提供了用于多肽crm197的大量生產(chǎn)的方法，其中將本發(fā)明的多核苷酸用于轉(zhuǎn)化合適的宿主，得到相應(yīng)蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)，以及用于分離表達(dá)的多肽的方法。
背景技術(shù)：
：白喉毒素(dt)是由白喉棒狀桿菌(corynebacteriumdiphtheriae)合成和分泌的蛋白質(zhì)外毒素。白喉棒狀桿菌的產(chǎn)毒菌株包含攜帶毒素基因的噬菌體溶源菌。dt的成熟形式合成為含535個(gè)氨基酸的單一多肽，其源自初始的536個(gè)前肽，其在190、192和193位經(jīng)受蛋白水解以形成成熟的毒素。這種剪接或蛋白水解導(dǎo)致兩個(gè)亞單位a和b，其通過(guò)二硫化物橋連接在一起(moskangetal，biol.chem.264:15709-15713，1989)。亞單位a是催化活性的nad依賴性adp-核糖基轉(zhuǎn)移酶部分。其負(fù)責(zé)使延伸因子-2(ef-2)無(wú)活性，因此下調(diào)靶細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成。白喉毒素是高度細(xì)胞毒性的；單個(gè)分子可以對(duì)細(xì)胞致死，且10ng/kg的劑量可殺死動(dòng)物和人類。在通過(guò)注射該毒素提供人工免疫的過(guò)程中，應(yīng)包括解毒過(guò)程，以使其對(duì)于接受者的攝入是安全的。通常，通過(guò)天然形式的dt的化學(xué)修飾來(lái)將其解毒，以這種方式其仍保留疫苗制劑中所需的需要的抗原性。隨后，引入稱為交叉反應(yīng)物質(zhì)197或crm197的白喉毒素的遺傳解毒形式；其基本上保留了dt的免疫交叉反應(yīng)性質(zhì)。crm197已用于制備包括白喉棒狀桿菌(corynebacteriumdiphtheria)、乙型肝炎(hepatitisb)、百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)、破傷風(fēng)梭菌(clostridiumtetani)、腦膜炎奈瑟菌(neisseriameningitides)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumonia)、流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenza)的結(jié)合疫苗。其通過(guò)產(chǎn)毒棒狀桿菌噬菌體β的亞硝基胍誘變產(chǎn)生，然后將棒狀桿菌噬菌體β用于感染白喉棒狀桿菌。(uchidaetal，naturenewbiology(1971)233；8-11，nucleicacidsres.1984may25；12(10).4063-9)。已研究了crm197作為dt增效劑或疫苗抗原的潛在用途。crm197蛋白質(zhì)具有與dt相同的分子量；但在a亞單位中的單堿基變化，即野生型dt的多核苷酸序列的堿基變化上不同，其中鳥(niǎo)嘌呤替換為腺嘌呤導(dǎo)致在52位的氨基酸替換，產(chǎn)生crm197中的谷氨酸替代甘氨酸(gianninig.etal，1984)。該點(diǎn)突變導(dǎo)致毒性的顯著損失，并使crm197對(duì)于人類使用是安全的。由于在野生型細(xì)菌中表達(dá)水平低，因此用于疫苗的大量的白喉毒素(如用于疫苗的crm197)的生產(chǎn)受到阻礙。先前由bishai等人(j.beeteriol.189：5140-5151)通過(guò)在大腸桿菌(escherichiacoli)中表達(dá)crm197解決了該問(wèn)題，其描述了含有白喉毒素(包含毒性信號(hào)序列)的重組融合蛋白的表達(dá)；但這導(dǎo)致產(chǎn)生降解的蛋白質(zhì)。取決于毒素的具體特征，例如大小和二級(jí)結(jié)構(gòu)，活性形式的低產(chǎn)率也與降解、不當(dāng)?shù)恼郫B或兩者有關(guān)。因此，與大多數(shù)生物制藥一樣，存在在crm197的純化步驟期間發(fā)生的表達(dá)的蛋白質(zhì)的額外損失，由此維持crm197的生物活性形式形成挑戰(zhàn)。因此，存在以活性形式實(shí)現(xiàn)細(xì)菌類毒素crm197的高水平表達(dá)的需要。wo2011/042516公開(kāi)了通過(guò)周質(zhì)表達(dá)制備細(xì)菌毒素的改進(jìn)方法，包括以下步驟：a)培育包含其中特定的信號(hào)序列與細(xì)菌毒素的序列連接的表達(dá)載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，和b)誘導(dǎo)包含與細(xì)菌毒素連接的特定信號(hào)序列的多肽的表達(dá)，使得周質(zhì)表達(dá)細(xì)菌毒素。wo2013/178974a1公開(kāi)了在大腸桿菌宿主中細(xì)胞內(nèi)表達(dá)crm197的方法，其包括表達(dá)包含可操作地連接至啟動(dòng)子和至少一個(gè)完全回文操縱子序列的編碼crm197的基因的載體。wo2015/134402a1公開(kāi)了用于在大腸桿菌宿主的簡(jiǎn)化基因組中產(chǎn)生重組crm197的方法，其包括在適合于表達(dá)重組crm197蛋白質(zhì)的條件下，溫育簡(jiǎn)化基因組大腸桿菌，其包含含有編碼融合到引導(dǎo)crm197蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移到可操作地連接到表達(dá)控制序列的周質(zhì)的信號(hào)序列的crm197蛋白質(zhì)的核苷酸序列的表達(dá)載體，由此獲得至少1克/升的可溶性crm197的產(chǎn)量，并且其中天然親本大腸桿菌菌株是12菌株，優(yōu)選為k12mg1655。us2012/0128727a1公開(kāi)了編碼多肽crm197的分離的核酸分子、包含該分離的核酸分子的表達(dá)載體，和用于重組生產(chǎn)crm197標(biāo)簽融合蛋白的方法，包括在有利于生產(chǎn)所述crm197標(biāo)簽融合蛋白的條件下培養(yǎng)重組細(xì)胞以及分離所述融合蛋白。us2012/0289688a1公開(kāi)了用于通過(guò)以下來(lái)周質(zhì)表達(dá)重組多肽的方法(a)培育革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物；和(b)誘導(dǎo)多肽的表達(dá)使得周質(zhì)表達(dá)蛋白質(zhì)；其中在表達(dá)過(guò)程中執(zhí)行以下步驟中的一個(gè)或多個(gè)：(i)步驟a)的ph低于步驟b)的ph；(ii)步驟a)的溫度高于步驟b)的溫度；或(iii)步驟a)的底物進(jìn)料速率高于步驟b)的底物進(jìn)料速率。us2014/0050758a1公開(kāi)了用于細(xì)菌類毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，包括以下步驟：a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培育革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中用多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且其中該多核苷酸編碼細(xì)菌類毒素和周質(zhì)信號(hào)序列；誘導(dǎo)細(xì)菌類毒素的表達(dá)；b)使所述宿主細(xì)胞成熟，其中成熟步驟包括：i)使宿主細(xì)胞經(jīng)受ph沖擊：ii)不加入飼料溫育宿主細(xì)胞；或iii)使宿主細(xì)胞經(jīng)受低于-20℃的溫度；以及c)從宿主細(xì)胞中提取細(xì)菌類毒素，其中提取過(guò)程包括滲透壓休克(osmoticshock)，其中革蘭氏陰性宿主細(xì)胞選自由大腸桿菌、假單胞菌(pseudomonas)和莫拉氏菌(moraxella)組成的組，其中宿主細(xì)胞在步驟b)期間是活的，并且其中在含有10-5000升的培養(yǎng)物的發(fā)酵器中進(jìn)行該過(guò)程。us8,530,171公開(kāi)了在假單胞菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組毒素蛋白的方法，所述方法包括：將編碼毒素蛋白的核苷酸序列連接到表達(dá)載體中；用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化假單胞菌宿主細(xì)胞；并在適于表達(dá)重組毒素蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的假單胞菌宿主細(xì)胞；其中重組載體蛋白是crm197，并且其中以約0.2克/升至約12克/升的可溶性或活性crm197蛋白質(zhì)的產(chǎn)率產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。使用crm197作為載體蛋白的復(fù)合多糖疫苗已被批準(zhǔn)用于人類使用。這些包括：(novartisvaccinesanddiagnostics)，指定用于預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏菌亞組a、c、y和w-135引起的侵入性腦膜炎球菌病的疫苗；(novartisvaccines)，c群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗；和(wyethpharmaceuticals,inc.)，靶向13種血清型的肺炎鏈球菌的兒童肺炎疫苗，以及(wyeth)，流感嗜血桿菌b型疫苗。此外，crm197具有作為白喉棒狀桿菌疫苗接種的增強(qiáng)抗原的潛在用途，并且正在研究作為用于其它疫苗的載體蛋白質(zhì)。近來(lái)，因?yàn)榕c其結(jié)合hb-egf的可溶形式的能力相關(guān)的其潛在的抗腫瘤作用(mekadaetal，美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)2006/0270600a1)，對(duì)crm197的興趣正在增加。這種抗腫瘤功能不僅可歸因于crm197，而且可歸因于dt毒素的其它無(wú)毒性衍生物(例如，雙突變體dt52e148k或融合蛋白gst-dt)。已從編碼crm197的基因開(kāi)始通過(guò)pcr構(gòu)建這些突變體。然而，在所述研究中，使用白喉棒狀桿菌的培養(yǎng)物在35℃下生長(zhǎng)16-17小時(shí)生產(chǎn)完整的crm197。通過(guò)用硫酸銨初步沉淀，然后在離子交換和疏水層析中的三個(gè)連續(xù)步驟，從上清液中純化crm197(mekadaetal.,)。因此，顯然需要用于以高產(chǎn)率和成本有效的方式生產(chǎn)crm197的可替代方法。因此，用于經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)crm197的方法將極大地促進(jìn)疫苗研究、開(kāi)發(fā)和制造。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供用于crm197的高水平表達(dá)的優(yōu)化的多核苷酸。又一個(gè)目的是提供用于控制多肽表達(dá)以獲得crm197的可調(diào)節(jié)方法。又一個(gè)目的是提供用于以高產(chǎn)率以純凈形式商業(yè)生產(chǎn)crm197的高水平表達(dá)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了包含seqidno.2的優(yōu)化多核苷酸序列及其變體，該變體與優(yōu)化多核苷酸序列seqidno.2至少70％同源。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于高水平表達(dá)多肽crm197的優(yōu)化多核苷酸序列(seqidno:2)及其結(jié)構(gòu)變體，其選自但不限于seqidno.3、4、5、6、7、8、9和10。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了優(yōu)化多核苷酸序列(seqidno.2)及其結(jié)構(gòu)變體，如seqidno.3、4、5、6、7、8、9和10，其與所述優(yōu)化多核苷酸序列seqidno.2至少70至88％同源。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)多肽的方法，包括以下步驟：a)選擇基本上由seqidno.2或其與seqidno.2至少70％同源的變體組成的優(yōu)化多核苷酸序列b)可選地將步驟(a)的多核苷酸序列連接到合適的載體中，c)將多核苷酸序列插入或轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細(xì)胞中，d)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞用于多肽的高水平表達(dá)，e)保持10至40℃的誘導(dǎo)溫度以產(chǎn)生多肽，f)從宿主細(xì)胞中提取細(xì)菌多肽，然后純化以獲得具有高產(chǎn)率的純多肽。以上獲得的多肽適合用作用于制備復(fù)合免疫原性制劑的載體蛋白質(zhì)。附圖說(shuō)明圖1：示出了對(duì)應(yīng)于由多核苷酸seqidno.2編碼的表達(dá)的crm197運(yùn)行的sds-page電泳凝膠法；其中泳道1：標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量標(biāo)記；泳道2和3：由大腸桿菌培養(yǎng)物提取物的總細(xì)胞蛋白分離和純化的crm197，并且分別在非還原性和還原性sds-page上進(jìn)行。圖2：示出了使用兔多克隆抗體的純化的crm197的蛋白質(zhì)印跡分析；泳道1：分子量階梯。泳道2和3分別包括在還原性和非還原性條件下電泳的crm197樣品。圖3：sdspage顯示純化的可溶性部分泳道1：參照蛋白質(zhì)；泳道2：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；泳道3-10：合并的多肽crm197。圖4：顯示在crm197的溶解時(shí)進(jìn)行的測(cè)試的電泳凝膠運(yùn)行(sdspage12％)，泳道1：crm197的尿素溶解的部分；泳道2：上清液；泳道3：來(lái)自第一團(tuán)塊洗滌的樣品；泳道4：合并自第二團(tuán)塊洗滌的樣品。圖5：尺寸排阻色譜法(sec-hplc)，其中主洗脫峰顯示樣品中crm197的存在。圖6：多肽crm197的肽質(zhì)量指紋(質(zhì)譜)以定義一級(jí)氨基酸序列的一致性。本發(fā)明的重組crm(bioercrm)具有與參照crm197序列100％的序列相似性。圖7：通過(guò)埃德曼降解(edmandegradation)的rcrm197的n末端序列確認(rèn)。10個(gè)氨基酸序列g(shù)addwdssk(n-末端乙?；?顯示純化的多肽的起始部分。第一個(gè)氨基酸確定為g。圖8：本發(fā)明的重組crm(bioercrm)的cd光譜與參照crm197重疊。還分析了二級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)，并顯示與參照相似。結(jié)果表明本發(fā)明的重組crm(bioercrm)在結(jié)構(gòu)上與參照相似。圖9：使用熒光試驗(yàn)用參照確認(rèn)本發(fā)明的重組crm(bioercrm)的結(jié)構(gòu)等同性。用參照crm197(c7crm)覆蓋本發(fā)明的重組crm(bioercrm)的dsf曲線。該數(shù)據(jù)確認(rèn)本發(fā)明的重組crm(bioercrm)與參照c7-crm197的相似性。圖10：二硫鍵的確認(rèn)。分析本發(fā)明的重組crm(biorcrm)在蛋白質(zhì)中存在正確的二硫鍵?？梢源_認(rèn)存在于蛋白質(zhì)中的二硫鍵，第一個(gè)連接氨基酸186至201，并且第二鍵連接氨基酸461至471。質(zhì)譜法用于分析crm197中的二硫鍵連。圖11：通過(guò)crm197特異性elisa用參照crm197確認(rèn)的本發(fā)明的重組crm(bioercrm)的抗原相似性。來(lái)自不同的來(lái)源的所有crm都顯示出與單克隆抗體相似的識(shí)別特征。具體實(shí)施方式用作藥物產(chǎn)品或疫苗的多肽表達(dá)需要實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞系的高生物量和/或生產(chǎn)力。在不存在多因素的情況下，可以顯著降低多肽產(chǎn)生的效率，其包括使用編碼該多肽的最佳多核苷酸序列。已知遺傳密碼表現(xiàn)出簡(jiǎn)并性，其總計(jì)為編碼相同的氨基酸序列的多核苷酸序列的變異。氨基酸鏈的合成速率是影響表達(dá)構(gòu)建體設(shè)計(jì)的來(lái)自單個(gè)基因的整體表達(dá)水平的決定因素，具有重要意義。因此，最佳多核苷酸序列的構(gòu)建對(duì)于確定多肽的整體表達(dá)水平是重要的，并且必須被良好地調(diào)控。其包括但不限于密碼子在生物體中偏好的頻率或在人工載體或媒介的情況下是期望的最接近頻率。這轉(zhuǎn)而反映了trna豐度或同源細(xì)胞trna頻率，必須由其小心選擇同義密碼子選擇模式。其它因素還包括形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的潛力、mrna水平和rna穩(wěn)定性，待進(jìn)行的隨后預(yù)期的操作、合成路徑等。必須小心調(diào)控這些結(jié)構(gòu)的發(fā)生，因?yàn)檫@些模式的選擇與感興趣的個(gè)體蛋白質(zhì)和表達(dá)宿主的優(yōu)化不同。因此，本發(fā)明的主要實(shí)施方式提供了優(yōu)化多核苷酸序列(seqidno.2)及其結(jié)構(gòu)變體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于crm197的多肽的高水平表達(dá)的優(yōu)化多核苷酸序列(seqidno.2)及其結(jié)構(gòu)變體，該結(jié)構(gòu)變體選自但不限于seqidno.3、4、5、6、7、8、9和10，具有等于或大于70％的相似性。周質(zhì)表達(dá)是指來(lái)自宿主細(xì)胞內(nèi)的周質(zhì)空間中的感興趣的預(yù)期基因(如細(xì)菌類毒素或白喉類毒素)的表達(dá)產(chǎn)物的分泌。細(xì)胞質(zhì)表達(dá)是指包封在細(xì)胞膜內(nèi)的細(xì)胞的胞質(zhì)隔室中的蛋白質(zhì)的表達(dá)。表達(dá)的誘導(dǎo)是指從多核苷酸誘導(dǎo)表達(dá)而進(jìn)行的步驟，使得以加速的速率獲得產(chǎn)物，這可能包括添加合適的誘導(dǎo)劑如iptg、阿拉伯糖、麥芽糖等。本發(fā)明的優(yōu)化序列可應(yīng)用于選自但不限于seqidno.3、4、5、6、7、8、9、10的seqidno.2的其他變體并且還包括在seqidno.1(保留相同的炎性和免疫刺激性能并且能夠結(jié)合細(xì)胞受體hb-egf的野生型白喉毒素)的衍生物的產(chǎn)生中的序列，但與crm197在單個(gè)氨基酸替換上不同，并且缺乏對(duì)靶宿主的細(xì)胞毒性。crm197的多核苷酸序列可以源自白喉毒素的序列(greenfield,l.etal.，1983，proc.natl.acad.sci.usa80:6853-6857)，或通過(guò)使用由gianninig.etal.,(1984)給出的crm197的氨基酸序列作為參照得出。優(yōu)化由此獲得的野生型多核苷酸序列用于宿主細(xì)胞，更優(yōu)選地革蘭氏陰性細(xì)胞，更優(yōu)選地作為宿主細(xì)胞的大腸桿菌中的高表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)合成或通過(guò)組裝程序制備本發(fā)明的這種多核苷酸序列。在又一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于宿主細(xì)胞中的crm197的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法，其中具有調(diào)控序列的表達(dá)構(gòu)建體提供本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)?？梢詫⒃摱嗪塑账嵝蛄信c用于編碼的多肽的導(dǎo)向轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)序列關(guān)聯(lián)。其可以可操作地連接到提供靶向在宿主的周質(zhì)空間中分泌的表達(dá)的周質(zhì)信號(hào)序列。本發(fā)明還提供了crm197的高水平生產(chǎn)，其中通過(guò)為多核苷酸的表達(dá)提供合適的誘導(dǎo)溫度來(lái)引起周質(zhì)表達(dá)，而沒(méi)有用于導(dǎo)向轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間中的任何異源序列。可選地，還可以將本發(fā)明的多核苷酸與標(biāo)簽多肽的多核苷酸關(guān)聯(lián)。還已知標(biāo)簽的存在增強(qiáng)蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性和溶解度，并用于其隨后的純化。可以單獨(dú)地或結(jié)合多標(biāo)記相關(guān)，在5’端或3’端將這些標(biāo)簽與編碼標(biāo)簽多肽的寡核苷酸序列關(guān)聯(lián)，以促進(jìn)其細(xì)胞質(zhì)穩(wěn)定性和/或使用具有對(duì)各種標(biāo)簽肽的高親和性的基體和樹(shù)脂的隨后的純化?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的各種標(biāo)簽包括ha標(biāo)簽(血細(xì)胞凝集素)、myc標(biāo)簽、strepii、flag、hpc(蛋白質(zhì)c的重鏈)、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)、纖維素結(jié)合蛋白(cbd)和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(cbp)。還可用本領(lǐng)域公知的分子技術(shù)將本發(fā)明的多核苷酸并入包含調(diào)控序列的載體構(gòu)建體中(參見(jiàn)sambrooketal.，molecularcloning，2nded.，(1989))。這包括但不限于合適的啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列、可選擇性標(biāo)記和多克隆位點(diǎn)。特別地，具有有效和特異性的構(gòu)建體的質(zhì)粒是優(yōu)選的；如包含對(duì)噬菌體t7的rna聚合酶特異的t7啟動(dòng)子的一種?？梢詤⒖歼@些方法，但不限于在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?012/0128727；美國(guó)專利號(hào)5,055,294；美國(guó)專利號(hào)5,128,130；美國(guó)專利號(hào)5,281,532；美國(guó)專利號(hào)4,695,455；美國(guó)專利號(hào)4,861,595；美國(guó)專利號(hào)4,755,465和美國(guó)專利號(hào)5,169,760中公開(kāi)的一種。用于在白喉棒狀桿菌中生產(chǎn)crm197蛋白質(zhì)的質(zhì)粒系統(tǒng)也描述于美國(guó)專利號(hào)5,614,382中。在一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌、芽孢桿菌屬(bacillussp.)、假單胞菌屬(pseudomonassp.)已經(jīng)在蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中廣泛討論。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選用于大腸桿菌中的crm197的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其中宿主菌株選自bl21(de3)、bl21a1、hms174(de3)、dh5α、w3110、b834、origami、rosetta、novablue(de3)、lemo21(de3)、t7、er2566和c43(de3)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了編碼細(xì)菌類毒素的多核苷酸序列(seqidno.2)，可選地將其連接到載體中，隨后將載體插入到宿主細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行到宿主細(xì)胞中的插入?？梢酝ㄟ^(guò)物理或化學(xué)的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行這種插入或轉(zhuǎn)化。隨后，在具有添加的抗生素的培養(yǎng)皿上選擇轉(zhuǎn)化的菌落。用于本發(fā)明的合適的載體包括但不限于pet9a、pet3a、pet3b、pet3c、pet5a、pet5b、pet5c、pet9b、pet9c、pet12a、ptwtn1、ptwtn2、pet12b、pet12c、pet17b，以及通常具有強(qiáng)噬菌體t7啟動(dòng)子(例如，prseta、b和c[invitrogen])和ptyb1、ptyb2、ptyb3和ptyb4的所有載體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，大腸桿菌細(xì)胞用于表達(dá)編碼crm197的多核苷酸。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證插入的多核苷酸的適當(dāng)取向和位置。得到的構(gòu)建體用于通過(guò)任何已知的化學(xué)或物理方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。例如使用6.5kv.cm-1至25kv.cm-1范圍內(nèi)的電場(chǎng)電穿孔宿主細(xì)胞，此處用于轉(zhuǎn)化宿主的優(yōu)選的化學(xué)方法。使得這些細(xì)胞在25至40℃下，在合適的培養(yǎng)基如lb或soc培養(yǎng)基中生長(zhǎng)30分鐘至120分鐘，然后在25至40℃下轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基陪替氏平皿(petriplate)10至36小時(shí)，其中選擇包含本發(fā)明的多核苷酸的陽(yáng)性菌落?？梢允褂没虿皇褂脴?biāo)記完成陽(yáng)性克隆的選擇?？墒褂玫暮线m的標(biāo)記選自但不限于抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素等。將編碼全長(zhǎng)crm197蛋白質(zhì)的多核苷酸克隆在t7laci啟動(dòng)子附近，其驅(qū)動(dòng)大腸桿菌的t7聚合酶陽(yáng)性菌株中的蛋白質(zhì)的表達(dá)。多核苷酸的表達(dá)由t7啟動(dòng)子嚴(yán)格控制，其在iptg或自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的存在下誘導(dǎo)。優(yōu)化用于培養(yǎng)宿主的參數(shù)用于crm197蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)化培養(yǎng)基組分、包括生長(zhǎng)溫度、誘導(dǎo)物濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的培養(yǎng)條件。使用的培養(yǎng)基可選自但不限于化學(xué)限定培養(yǎng)基、lb(luria-bertani)、tb(極品肉湯(terrificbroth))、sob(超級(jí)優(yōu)化肉湯(superoptimalbroth))、soc(具有分解代謝阻遏物的超級(jí)優(yōu)化肉湯)、yt肉湯(酵母提取物和胰蛋白胨)、超級(jí)肉湯、豐富培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基、礦物質(zhì)培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基的成分包括但不限于，碳源，如例如葡萄糖、蔗糖或甘油，有機(jī)氮源如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物，使用無(wú)機(jī)氮源并且其可選自例如銨鹽、氨水和氣態(tài)氨，補(bǔ)充有例如低水平的氨基酸、維生素、蛋白胨或其它成分的補(bǔ)充劑?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法制備培養(yǎng)基?？梢栽谛◇w積上如在lb、極品肉湯或化學(xué)限定培養(yǎng)基中5-50ml上測(cè)試轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表達(dá)。該表達(dá)可以經(jīng)受約0.01mm、約0.05mm、約0.2mm、約0.3mm、約0.4mm、約0.5mm、約0.6mm、約0.7mm、約0.8mm、約0.9mm和約1mm范圍內(nèi)的不同濃度的誘導(dǎo)物。在電泳裝置中，優(yōu)選在sdspage電泳中測(cè)定多肽表達(dá)，并觀察為用考馬斯亮藍(lán)(-)染色的過(guò)表達(dá)的條帶。隨后，將宿主細(xì)胞接種在500ml的燒瓶培養(yǎng)物中；并使其在最佳條件下生長(zhǎng)，在此期間crm197表達(dá)從16小時(shí)持續(xù)到32小時(shí)。在恒定攪拌且優(yōu)選在需氧條件下培養(yǎng)之后，收獲細(xì)胞并裂解?？梢詰?yīng)用任何已知的方法裂解細(xì)胞，優(yōu)選的方法包括以適當(dāng)濃度含有洗滌劑的裂解緩沖液。在裂解后，在一個(gè)或多個(gè)離心步驟中將蛋白質(zhì)組分合并。在含有20-50mmph7.5-8.5的tris-hcl、100-150mm的nacl、0.5-1.5％的洗滌劑和0.5-1.5％的蛋白酶抑制劑的緩沖液中伴隨攪拌進(jìn)行裂解。在一個(gè)實(shí)施方式中，在10至40℃下進(jìn)行用于表達(dá)的誘導(dǎo)溫度。在一個(gè)實(shí)施方式中，以可調(diào)節(jié)的方式在誘導(dǎo)溫度下得到crm197，其中當(dāng)誘導(dǎo)溫度保持在10至20℃時(shí)，可溶部分中存在大于80％的表達(dá)的crm197。在另一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)誘導(dǎo)溫度保持在25至40℃時(shí)，獲得的大于80％的表達(dá)的crm197在不溶性部分中作為胞質(zhì)包涵體，在從合并的胞質(zhì)部分的溶解步驟后將其從其中純化。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用各種濃度的尿素本身，1m尿素、或2m尿素、或3m尿素、或4m尿素、或5m尿素、或6m尿素、或7m尿素、或8m尿素、或9m尿素來(lái)溶解胞質(zhì)包涵體。在具體的實(shí)施方式中，可溶性crm197的產(chǎn)率為約0.1g/l、0.25g/l、0.5g/l、約1g/l、約1.5g/l、約2g/l、約2.5g/l、約3g/l、約3.5g/l、約4g/l、約4.5g/l、約4.5g/l、約5g/l。在具體的實(shí)施方式中，不溶性crm197的產(chǎn)率為約0.25g/l、0.5g/l、約1g/l、約1.5g/l、約2g/l、約2.5g/l、約3g/l、約3.5g/l、約4g/l、約4.5g/l、約4.5g/l、約5g/l。使用離子交換色譜柱純化表達(dá)的蛋白質(zhì)，隨后親和層析。因此，本發(fā)明涉及多于一個(gè)隨后的純化步驟，并且還在離子交換色譜步驟中利用crm197的pi值，由此將其與其它污染蛋白質(zhì)分離。最后，通過(guò)bca/bradford/lowry試驗(yàn)量化crm197的量，并在10-12％的丙烯酰胺凝膠中可視化(sds-page)。通過(guò)蛋白印跡法和類似的免疫測(cè)定進(jìn)行多肽的確定。通過(guò)sds-page和hplc方法測(cè)量純化的多肽的純度和完整性。由此表達(dá)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量為500-1000mg/l的培養(yǎng)基，并且隨后可以通過(guò)調(diào)控培養(yǎng)添加劑和條件以及純化步驟來(lái)改變。本發(fā)明的方法還提供了工業(yè)上適用的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)時(shí)間，并且隨后調(diào)控層析步驟的ph和溫度的方法，提供簡(jiǎn)單、便宜并且不費(fèi)力。其排除了包括制備緩沖液或試劑盒或其工作溶液的大量步驟的需要。在去除標(biāo)簽期間，不需要提供額外的緩沖液或鹽或酶或設(shè)備。在具體的實(shí)施方式中，純化的crm197多肽容易缺乏第一蛋氨酸氨基酸，其存在在最終的crm197蛋白質(zhì)中是不期望的，并且其去除引起額外的純化步驟的需要。由此獲得的多肽為活性和天然形式；其容易缺乏不期望的蛋氨酸作為第一氨基酸，而不需要額外的步驟。通過(guò)insilico/生物信息學(xué)工具分析crm197氨基酸序列；顯示在蛋白質(zhì)中約38.4％的疏水性。發(fā)現(xiàn)crm197的等電點(diǎn)為約5.81。crm197蛋白質(zhì)含有4個(gè)半胱氨酸氨基酸殘基和21個(gè)脯氨酸殘基。通過(guò)測(cè)量dna上的核酸內(nèi)切酶活性的功能試驗(yàn)來(lái)證實(shí)多肽的再折疊。通過(guò)多肽的圓二色性(cd)分析(圖8)和差示掃描熒光分析法(dsf)(圖9)進(jìn)行生物物理學(xué)/二級(jí)結(jié)構(gòu)確認(rèn)，并與可商購(gòu)的多肽(sigmaaldrich)比較。在另一個(gè)實(shí)施方式中，證實(shí)了正確的二硫鍵連的存在，并與可商購(gòu)的crm197多肽(sigmaaldrich)比較(圖10)。通過(guò)用多種蛋白酶酶切crm197多肽和氨基酸序列的繪圖也證實(shí)產(chǎn)生的多肽的氨基酸序列的正確性(圖6)。通過(guò)edman降解測(cè)序證實(shí)產(chǎn)生的多肽的n-端氨基酸序列(圖7)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于crm197多肽的高水平表達(dá)的優(yōu)化多核苷酸序列(seqidno.2)，及其具有等于或大于70％的相似性，優(yōu)選85-99％的相似性的結(jié)構(gòu)變體。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于大腸桿菌細(xì)胞中的crm197的多肽的高水平表達(dá)的優(yōu)化多核苷酸序列(seqidno.2)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明使用核酸seqidno.2及其變體在革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌中提供白喉毒素或crm197或其變體的高水平表達(dá)，包括以下步驟：a)選擇編碼多肽crm197的基因seqidno.2或其變體，b)將基因seqidno.2亞克隆至表達(dá)載體中，c)用步驟b的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌細(xì)胞；d)在適于表達(dá)毒素蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；e)通過(guò)在30至40℃范圍內(nèi)的溫度下加入iptg作為誘導(dǎo)劑來(lái)誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，f)從宿主細(xì)胞中提取不溶形式的細(xì)菌類毒素，以及g)以大于0.5mg/l的產(chǎn)率純化純凈形式的crm197。使用層析法進(jìn)行純化。層析技術(shù)可以是親和層析、凝膠過(guò)濾、高壓液相色譜(hplc)或離子交換色譜法或兩種或更多種的組合。優(yōu)選地，當(dāng)將crm197與標(biāo)簽融合蛋白關(guān)聯(lián)時(shí)，親和層析可用于將crm197與其它蛋白質(zhì)分離。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，涉及柱條件的溫度和ph的變化的簡(jiǎn)單步驟也有助于從關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽中洗脫crm197。更具體地，在6.5-8.5范圍內(nèi)的ph和在4℃-30℃范圍內(nèi)的溫度可用于從標(biāo)簽中分離crm197。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明制備的crm197用于結(jié)合從傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellatyphi)、副傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellaparatyphi)、肺炎球菌(pneumococcus)、流感嗜血桿菌、腦膜炎球菌(meningococcus)、肺炎鏈球菌和其它致病細(xì)菌分離的多糖分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明制備的crm197用作用于疫苗的復(fù)合載體，如對(duì)抗傷寒沙門(mén)氏菌、副傷寒沙門(mén)氏菌、肺炎球菌(pneumococcus)、流感嗜血桿菌、腦膜炎球菌(meningococcus)、肺炎鏈球菌和其它致病細(xì)菌的那些疫苗。參照以下實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不以任何方式受這些實(shí)施例限制，而是包括其在本文描述的的參數(shù)內(nèi)的變化，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。實(shí)施例1步驟(i)：新型crm197基因的合成：根據(jù)大腸桿菌密碼子使用優(yōu)化全長(zhǎng)crm197基因。以下參數(shù)用于crm197基因優(yōu)化：密碼子使用偏好性、gc含量、mrna二級(jí)結(jié)構(gòu)、自定義期望模式(customdesiredpattern)、自定義不期望模式、重復(fù)序列(直接重復(fù)、反向重復(fù)和二分體重復(fù))、限制酶識(shí)別位點(diǎn)(缺失或插入)。使用bamh1和sap1限制性位點(diǎn)在puc57質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)處克隆優(yōu)化的crm197基因(seqidno.2)，生成puc57_crm197。在大腸桿菌dh5α宿主中轉(zhuǎn)化含有crm197基因的載體，并在lb+卡那霉素r板上選擇克隆體。通過(guò)由agei(位于crm197基因中)和ndei(位于puc57質(zhì)粒中)的puc57_crm197質(zhì)粒的限制性酶切，證實(shí)puc57中的crm197基因的存在和正確性。此外，通過(guò)pcr和dna測(cè)序證實(shí)crm197的序列。步驟(ii)：將crm197插入表達(dá)載體ptwin1中在lb+卡那霉素中在50ml體積中將攜帶puc57_crm197的大腸桿菌dh5α生長(zhǎng)過(guò)夜。將細(xì)菌離心，并將團(tuán)塊用于質(zhì)粒分離。使用制造商的說(shuō)明，通過(guò)使用qiagen質(zhì)粒小量制備試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的分離。通過(guò)nono-drop量化分離的質(zhì)粒。將crm197(seqidno.2)從puc57中切除，用限制性內(nèi)切核酸酶bamhi和sapi酶切5μg質(zhì)粒。在1％瓊脂糖凝膠上運(yùn)行酶切的質(zhì)粒，并且通過(guò)使用制造商的說(shuō)明，使用qiagen凝膠萃取試劑盒純化對(duì)應(yīng)于crm197基因(seqidno.2，～1.6kb)的條帶。隨后，還使用bamhi和sapi酶切5μg的表達(dá)質(zhì)粒ptwin1，以產(chǎn)生與crm197基因相容的限制性位點(diǎn)。還用具有制造商的說(shuō)明，使用qiagen凝膠萃取試劑盒從凝膠中純化酶切的ptwin1。使用制造商的說(shuō)明，使用基于t4連接酶的dna連接試劑盒(promega)，將酶切的crm197基因連接在ptwin1中。在t4dna連接酶和緩沖液的存在下在20μl的反應(yīng)體積中，將載體(ptwin1)和插入片段(crm197)以1:3、1:4、1:5的比例混合。在16℃下將連接混合物溫育過(guò)夜。第二天早晨，在bl21-de3大腸桿菌表達(dá)宿主中加入/轉(zhuǎn)化5μl的連接混合物。通過(guò)使用化學(xué)轉(zhuǎn)化方案來(lái)轉(zhuǎn)化bl21。在冰中將連接+bl21細(xì)胞溫育30分鐘。在溫育后，在42℃下提供45秒的熱休克。將樣品在室溫下冷卻，并向其中加入500μl的soc培養(yǎng)基。在37℃下以200rpm將具有轉(zhuǎn)化體的管溫育2小時(shí)。將來(lái)自其的100μl的混合物涂板在lb+氨芐青霉素板上用于轉(zhuǎn)化體的篩選。第二天早晨，從luria肉湯+氨芐青霉素板選擇crm197表達(dá)bl21-de3轉(zhuǎn)化體。在這些之中，選擇生長(zhǎng)在luria肉湯+氨芐青霉素上的5個(gè)克隆體，在37度，200rpm下，在10ml的luria肉湯+氨芐青霉素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物離心并使用qiagen質(zhì)粒萃取試劑盒從細(xì)胞團(tuán)塊中提取質(zhì)粒。為了驗(yàn)證克隆的正確性，分別用agei和apai限制性內(nèi)切核酸酶來(lái)酶切2μg的質(zhì)粒。agei位點(diǎn)存在于crm197中，且apai位于ptwin1中。因此，使用兩種酶的雙重酶切用于確認(rèn)正確的克隆。將克隆體命名為ptwin1_crm197(bl21-de3)。此外，通過(guò)使用crm197基因特異性引物的pcr和dna測(cè)序確認(rèn)克隆。通過(guò)在10ml的luria肉湯+氨芐青霉素中生長(zhǎng)細(xì)菌過(guò)夜，制備表達(dá)crm197的bl21的甘油儲(chǔ)液。第二天早晨，將40％滅菌的甘油加入到培養(yǎng)物中，并將1ml的等份分配到冷凍小瓶中。在-80度下保存小瓶以進(jìn)一步用于表達(dá)分析。步驟(iii)：crm197的表達(dá)的確認(rèn)將保存在-80度下的bl21克隆體在luria肉湯+氨芐青霉素板上劃線。將板在37度下溫育過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落，并在150ml的燒瓶中接種于50ml的luria肉湯+氨芐青霉素培養(yǎng)基中。在37度，200rpm下溫育燒瓶直到od600＝1。一旦od達(dá)到期望點(diǎn)，抽取5ml培養(yǎng)物用作未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物。將未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物保存在冰上直到使用。為了誘導(dǎo)crm197基因的表達(dá)，將0.5mm的iptg加入至剩余的45ml培養(yǎng)物，并將燒瓶在30度和200rpm旋轉(zhuǎn)下進(jìn)一步溫育另外的4小時(shí)。4小時(shí)后收獲誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，并通過(guò)sds-page(圖1)和蛋白質(zhì)印跡法(圖2)檢測(cè)crm197的表達(dá)。對(duì)于sds-page分析，將1ml誘導(dǎo)的培養(yǎng)物和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物(二者都?xì)w一化為od600＝1)置于1.5ml的微量離心管(eppendorftube)中。將管離心并將團(tuán)塊重新懸浮于50μl的pbs中。在該懸浮液中，加入50μl的具有還原劑(2x)的sds-page加樣緩沖液。將混合物在100度下煮沸5分鐘。將樣品在室溫下冷卻，并將20μl的未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的培養(yǎng)物加載到4-12％的tris甘氨酸凝膠中。在150伏下將凝膠運(yùn)行1.5小時(shí)。取出凝膠并在考馬斯亮藍(lán)染料中溫育1小時(shí)。染色后，將凝膠留在含40％的甲醇＝10％的乙酸的脫色溶液中3小時(shí)。將crm197表達(dá)可視化為～58kd的蛋白質(zhì)，其僅在誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中可見(jiàn)。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡法，以與sds-page相同的方式運(yùn)行單獨(dú)的凝膠組，并將凝膠印跡在pvdf(聚偏二氟乙烯膜)上。通過(guò)抗crm197抗體將膜免疫印跡。在蛋白質(zhì)印跡法中，crm197顯示為～58kd處的單一的免疫反應(yīng)性條帶。在未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中沒(méi)有觀察到crm197特異性條帶。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本研究中產(chǎn)生的克隆體可以表達(dá)rcrm197蛋白質(zhì)。將這些克隆體進(jìn)一步用于crm197的大規(guī)模生產(chǎn)和純化。步驟(iv)：來(lái)自bl21大腸桿菌的crm197的發(fā)酵和純化。將1ml小瓶的bl21大腸桿菌細(xì)胞接種到50ml的lb+amp培養(yǎng)基中，并在37度，200rpm下生長(zhǎng)過(guò)夜。在20l規(guī)模下進(jìn)行發(fā)酵。將大腸桿菌細(xì)胞接種到發(fā)酵器中并在30攝氏度下培養(yǎng)。在od600＝20下用0.5mm的iptg誘導(dǎo)培養(yǎng)物。在誘導(dǎo)后12小時(shí)收獲發(fā)酵培養(yǎng)物，并通過(guò)離心制備細(xì)胞團(tuán)塊。將細(xì)胞團(tuán)塊在勻漿器中機(jī)械裂解。通過(guò)離心細(xì)胞裂解物分離包涵體(其包含期望的蛋白質(zhì)crm197)。丟棄上清液，并保留含有包涵體(ib)的團(tuán)塊。通過(guò)將團(tuán)塊再懸浮于8m的尿素中將ib均質(zhì)化，并通過(guò)離子交換色譜法純化蛋白質(zhì)。測(cè)量發(fā)酵水平下crm197的定量。在sds-page上將全細(xì)胞裂解物與作為標(biāo)準(zhǔn)的已知量的bsa一起運(yùn)行。通過(guò)密度測(cè)定分析定量在sds-page(圖3)中顯示為～58kd條帶的crm197的定量。bsa用作定量的參照。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的總量為1.4克crm197/升bl21大腸桿菌細(xì)胞。在電泳凝膠運(yùn)行(sdspage12％)中進(jìn)行以上制備的crm197的溶解測(cè)試，顯示對(duì)crm197的溶解進(jìn)行的測(cè)試，泳道1：crm197的尿素溶解的餾分；泳道2：上清液；泳道3：來(lái)自第一團(tuán)塊洗滌的樣品；泳道4：合并自第二團(tuán)塊洗滌的樣品(圖4)。通過(guò)尺寸排阻色譜法(sec-hplc)測(cè)定樣品中crm197的存在，其中主洗脫峰顯示樣品中crm197的存在(圖5)。通過(guò)肽質(zhì)量指紋(質(zhì)譜法)測(cè)定以上制備的crm197的一級(jí)氨基酸序列，并具有與參照crm197序列100％的序列相似性(圖6)。a.通過(guò)lc-ms分析的bercrm的胃蛋白酶酶切。b.胰蛋白酶、glu-c和asp-n酶切crm197中的序列覆蓋率(與seqidno.1相同，即顯示100％的同源性)通過(guò)埃德曼降解證實(shí)以上制備的rcrm197的n-末端序列。10個(gè)氨基酸序列g(shù)addvvdssk(n-末端乙?；?顯示純化的多肽的起始部分。第一個(gè)氨基酸確定為g(圖7)。以上制備的crm197的cd光譜與參照crm197重疊。結(jié)果表明以上制備的重組crm197在結(jié)構(gòu)上類似于參照crm197(圖9)。分析了通過(guò)上述方法制備的crm197的二硫鍵的確認(rèn)(圖10)，并通過(guò)質(zhì)譜法確認(rèn)蛋白質(zhì)中存在的兩個(gè)二硫鍵，第一個(gè)連接氨基酸186至201，且第二個(gè)鍵連接氨基酸461至471。表i胱氨酸編號(hào)多肽序列186gqdamyeymaqacagnr(seqidno.11)201svgsslscinldwdvir(seqidno.12)461cr(seqidno.13)471aidgdvtfcrpk(seqidno.14)表ii胰蛋白酶多肽鏈組合理論monom/z觀察的monom/zcys186-201935.6706935.6694cys461-471913.9558913.9539通過(guò)crm197特異性elisa證實(shí)通過(guò)上述方法制備的crm197與參照crm197的抗原相似性。來(lái)自不同的來(lái)源的所有crm都顯示出與單克隆抗體相似的識(shí)別特征(圖11)。序列表<110>生物e有限公司密碼子優(yōu)化,crm197<120>用于crm197的高水平表達(dá)的密碼子優(yōu)化多核苷酸<130>crm197_密碼子優(yōu)化<150>4045/che/2014<151>2014-11-20<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>535<212>prt<213>人造<220><223>重組體<400>1glyalaaspaspvalvalaspserserlysserphevalmetgluasn151015phesersertyrhisglythrlysproglytyrvalaspserilegln202530lysglyileglnlysprolysserglythrglnglyasntyraspasp354045asptrplysgluphetyrserthraspasnlystyraspalaalagly505560tyrservalaspasngluasnproleuserglylysalaglyglyval65707580vallysvalthrtyrproglyleuthrlysvalleualaleulysval859095aspasnalagluthrilelyslysgluleuglyleuserleuthrglu100105110proleumetgluglnvalglythrgluglupheilelysargphegly115120125aspglyalaserargvalvalleuserleuprophealagluglyser130135140serservalglutyrileasnasntrpgluglnalalysalaleuser145150155160valgluleugluileasnphegluthrargglylysargglyglnasp165170175alamettyrglutyrmetalaglnalacysalaglyasnargvalarg180185190argservalglyserserleusercysileasnleuasptrpaspval195200205ileargasplysthrlysthrlysilegluserleulysgluhisgly210215220proilelysasnlysmetsergluserproasnlysthrvalserglu225230235240glulysalalysglntyrleuglugluphehisglnthralaleuglu245250255hisprogluleusergluleulysthrvalthrglythrasnproval260265270phealaglyalaasntyralaalatrpalavalasnvalalaglnval275280285ileaspsergluthralaaspasnleuglulysthrthralaalaleu290295300serileleuproglyileglyservalmetglyilealaaspglyala305310315320valhishisasnthrglugluilevalalaglnserilealaleuser325330335serleumetvalalaglnalaileproleuvalglygluleuvalasp340345350ileglyphealaalatyrasnphevalgluserileileasnleuphe355360365glnvalvalhisasnsertyrasnargproalatyrserproglyhis370375380lysthrglnpropheleuhisaspglytyralavalsertrpasnthr385390395400valgluaspserileileargthrglypheglnglygluserglyhis405410415aspilelysilethralagluasnthrproleuproilealaglyval420425430leuleuprothrileproglylysleuaspvalasnlysserlysthr435440445hisileservalasnglyarglysileargmetargcysargalaile450455460aspglyaspvalthrphecysargprolysserprovaltyrvalgly465470475480asnglyvalhisalaasnleuhisvalalaphehisargserserser485490495glulysilehisserasngluileserseraspserileglyvalleu500505510glytyrglnlysthrvalasphisthrlysvalasnserlysleuser515520525leuphephegluilelysser530535<210>2<211>1611<212>dna<213>人造<220><223>密碼子優(yōu)化<400>2ggcgccgacgatgtggtggatagcagcaagagcttcgtgatggagaattttagcagctac60cacggcaccaaaccgggctacgtggacagcatccagaagggtattcagaaaccgaaaagc120ggcacccagggcaactatgacgatgactggaaagaattttacagcaccgacaacaaatac180gatgccgccggttatagcgtggataatgagaatccgctgagcggcaaagccggtggtgtt240gtgaaagtgacataccctggcctgaccaaggtgctggccctgaaggttgataacgcagag300accattaagaaagaactgggcctgagcctgacagaaccgctgatggaacaggtgggcaca360gaggagttcatcaagcgctttggtgacggtgccagccgcgttgtgctgagtctgccgttt420gccgaaggcagcagtagcgtggagtacattaacaactgggagcaggccaaagccctgagc480gttgagctggagatcaactttgagacacgcggtaagcgtggtcaggacgccatgtacgaa540tatatggcccaggcctgcgccggtaatcgtgtgcgtcgtagcgttggcagcagtctgagc600tgtatcaacctggactgggacgtgatccgcgacaagacaaagaccaagatcgagagcctg660aaggagcatggtcctattaaaaataagatgagcgaaagcccgaataaaaccgttagtgaa720gaaaaagccaaacagtatctggaagagtttcatcagaccgccctggaacacccggagctg780agtgaactgaagaccgtgaccggtacaaacccggtgtttgcaggtgccaactatgccgca840tgggcagttaacgttgcccaggttatcgacagcgaaacagccgataacctggaaaagacc900accgcagccctgagcatcctgcctggcatcggtagcgttatgggtattgccgacggtgca960gtgcaccataataccgaggagattgtggcccagagcatcgccctgagcagtctgatggtg1020gcccaagccattccgctggttggtgaactggtggacatcggttttgccgcctacaacttc1080gtggagagcattatcaacctgttccaggtggtgcataacagctacaaccgtccggcctat1140agtccgggccacaaaacccagccttttctgcacgatggctatgccgtgagttggaataca1200gtggaggacagtattattcgcaccggctttcagggcgagagcggtcatgacattaaaatc1260accgccgagaacacaccgctgcctatcgcaggtgtgttactgccgaccattccgggcaag1320ctggatgtgaacaaaagcaagacacatatcagcgtgaatggccgcaaaatccgcatgcgc1380tgccgcgcaatcgatggcgacgttacattttgccgtccgaaaagcccggtgtatgtgggc1440aacggtgtgcatgccaacctgcacgttgcattccatcgcagcagtagtgagaaaattcat1500agcaatgagatcagcagcgatagcattggcgtgctgggctaccagaagaccgttgatcac1560acaaaggttaacagcaaactgagcctgttctttgaaattaaaagttaataa1611<210>3<211>1611<212>dna<213>人造<220><223>密碼子優(yōu)化<400>3ggagccgatgatgtcgtcgatagtagtaagagttttgtcatggagaattttagtagttat60catggaacaaagcccggatatgtcgatagtatacaaaagggaatacaaaagcccaagagt120ggaacacaaggaaattatgatgatgattggaaggagttttatagtacagataataagtat180gatgccgccggatatagtgtcgataatgagaatcccctaagtggaaaggccggaggagtc240gtcaaggtcacatatcccggactaacaaaggtcctagccctaaaggtcgataatgccgag300acaataaagaaggagctaggactaagtctaacagagcccctaatggagcaagtcggaaca360gaggagtttataaagaggtttggagatggagccagtagggtcgtcctaagtctacccttt420gccgagggaagtagtagtgtcgagtatataaataattgggagcaagccaaggccctaagt480gtcgagctagagataaattttgagacaaggggaaagaggggacaagatgccatgtatgag540tatatggcccaagcctgtgccggaaatagggtcaggaggagtgtcggaagtagtctaagt600tgtataaatctagattgggatgtcataagggataagacaaagacaaagatagagagtcta660aaggagcatggacccataaagaataagatgagtgagagtcccaataagacagtcagtgag720gagaaggccaagcaatatctagaggagtttcatcaaacagccctagagcatcccgagcta780agtgagctaaagacagtcacaggaacaaatcccgtctttgccggagccaattatgccgcc840tgggccgtcaatgtcgcccaagtcatagatagtgagacagccgataatctagagaagaca900acagccgccctaagtatactacccggaataggaagtgtcatgggaatagccgatggagcc960gtccatca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