交叉引用

本申請要求2014年10月3日提交的第62/059,847號美國臨時申請的權(quán)益，該申請通過引用并入本文。

背景技術(shù)：

一些遺傳病由單倍性不足而引起，其中僅存在基因的一個功能性拷貝，并且該單個拷貝無法產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物。例如，這可由半合子缺失而引起，其中該基因的一個拷貝丟失。其他遺傳病則由改變基因產(chǎn)物使其僅具有部分功能的突變而引起。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

如本文所述，可使用反義寡聚體(aso)，通過促進在含內(nèi)含子的基因的內(nèi)含子剪接位點處的組成性剪接(采用野生型序列)以增加基因產(chǎn)物的表達，來增加蛋白質(zhì)或功能rna(在非蛋白質(zhì)編碼基因的情況下)的產(chǎn)生量。針對用于這些方法而描述的aso促進組成性剪接且不校正由突變導致的異常剪接，或促進組成性剪接且不調(diào)節(jié)其它剪接。因此，本文所述的方法可用來治療由基因產(chǎn)物的表達減少或活性不足所導致的病況。

本文描述了增加在細胞中表達由前mrna編碼的靶蛋白的方法，該前mrna包含至少一個保留內(nèi)含子(ric前mrna)；保留內(nèi)含子是當一個或多個其他內(nèi)含子被剪接掉(去除)時仍然存在的內(nèi)含子。靶蛋白的表達依賴于細胞核的前mrna中全部內(nèi)含子的完全剪接(去除)以生成成熟mrna，成熟mrna隨后輸出到細胞質(zhì)并翻譯為靶蛋白。內(nèi)含子的未充分剪接(去除)導致含保留內(nèi)含子(ric)的前mrna主要蓄積在細胞核中，并且如果被輸出到細胞質(zhì)則其降解，使得ric前mrna未翻譯為靶蛋白。用本文方法所述的反義寡聚體(aso)處理可以促進將保留內(nèi)含子從前mrna轉(zhuǎn)錄物(包含一個或多個內(nèi)含子的前mrna種類)上剪接，以及導致mrna的增加，該增加的mrna得到翻譯以提供更高水平的靶蛋白。

在實施方案中，所述方法是增加具有含保留內(nèi)含子的前mrna(ric前mrna)的細胞表達靶蛋白或功能rna的方法，該ric前mrna包含保留內(nèi)含子、位于保留內(nèi)含子的5’剪接位點側(cè)翼的外顯子、位于保留內(nèi)含子的3’剪接位點側(cè)翼的外顯子，并且其中該ric前mrna編碼該靶蛋白或功能rna。在實施方案中，該方法包括使所述細胞與同編碼靶蛋白或功能rna的ric前mrna的靶向部分互補的aso相接觸，借此將保留內(nèi)含子從編碼靶蛋白或功能rna的ric前mrna中組成性剪接，從而增加編碼靶蛋白或功能rna的mrna的水平，以及增加該細胞中靶蛋白或功能rna的表達。在實施方案中，所述細胞在受試者中或來自受試者，并且所述方法是治療該受試者以增加該受試者的細胞表達靶蛋白或功能rna的方法。在實施方案中，所述細胞在具有由靶蛋白的量或活性缺陷或功能rna的量或活性缺陷引起的病況的受試者中，或來自該受試者。在實施方案中，該靶蛋白或該功能rna是補償?shù)鞍谆蜓a償功能rna，其功能性地增加或代替在受試者中的量或活性缺陷的靶蛋白或功能rna。

在實施方案中，由靶蛋白的量或活性缺陷或功能rna的量或活性缺陷引起的病況并非由aso所靶向的保留內(nèi)含子的其它剪接或異常剪接而引起的病況。在實施方案中，由靶蛋白的量或活性缺陷或功能rna的量或活性缺陷引起的病況并非由在編碼該靶蛋白或功能rna的ric前mrna中的任何保留內(nèi)含子的其它剪接或異常剪接而引起的病況。

在實施方案中，靶蛋白的量的缺陷由該靶蛋白的單倍性不足所導致，其中該受試者具有編碼功能性靶蛋白的第一等位基因，以及不產(chǎn)生該靶蛋白的第二等位基因，或編碼非功能性靶蛋白的第二等位基因，并且其中所述反義寡聚體與由第一等位基因所轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的靶向部分結(jié)合。

在其他實施方案中，受試者具有由常染色體隱性病癥引起的病況，該常染色體隱性病癥由靶蛋白的量或功能缺陷導致，其中該受試者具有a)第一突變體等位基因，由其i)產(chǎn)生靶蛋白的水平與由野生型等位基因產(chǎn)生相比降低，ii)產(chǎn)生與對應的野生型蛋白相比功能降低的形式的靶蛋白，或iii)不產(chǎn)生靶蛋白，以及b)第二突變體等位基因，由其i)產(chǎn)生靶蛋白的水平與由野生型等位基因產(chǎn)生相比降低，ii)產(chǎn)生與對應的野生型蛋白相比功能降低的形式的靶蛋白，或iii)不產(chǎn)生靶蛋白，并且其中ric前mrna由該第一等位基因和/或該第二等位基因轉(zhuǎn)錄。在實施方案中，與對應的野生型蛋白相比，以降低的水平產(chǎn)生功能降低的形式的靶蛋白。

在實施方案中，與對應的野生型蛋白相比，產(chǎn)生功能降低的形式的靶蛋白。在其他實施方案中，與對應的野生型蛋白相比，產(chǎn)生完全功能性形式的靶蛋白。

在實施方案中，功能rna的量的缺陷由該功能rna的單倍性不足所導致，其中受試者具有編碼功能性的功能rna的第一等位基因，以及不產(chǎn)生該功能rna的第二等位基因，或編碼非功能性的功能rna的第二等位基因，并且其中所述反義寡聚體與由該第一等位基因所轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的靶向部分結(jié)合。

在其他實施方案中，受試者具有由常染色體隱性病癥引起的病況，該常染色體隱性病癥由功能rna的量或功能缺陷導致，其中該受試者具有a)第一突變體等位基因，由其i)產(chǎn)生功能rna的水平與由野生型等位基因產(chǎn)生相比降低，ii)產(chǎn)生與對應的野生型蛋白相比功能降低的形式的功能rna，或iii)不產(chǎn)生功能rna，以及b)第二突變體等位基因，由其i)產(chǎn)生功能rna的水平與由野生型等位基因產(chǎn)生相比降低，ii)產(chǎn)生與對應的野生型蛋白相比功能降低的形式的功能rna，或iii)不產(chǎn)生功能rna，并且其中ric前mrna由該第一等位基因和/或該第二等位基因轉(zhuǎn)錄。在實施方案中，與對應的野生型功能rna相比，以降低的水平產(chǎn)生功能降低的形式的功能rna。

在實施方案中，產(chǎn)生與對應的野生型蛋白相比功能降低的形式的功能rna。在其他實施方案中，產(chǎn)生與對應的野生型蛋白相比為完全功能性形式的功能rna。

在實施方案中，ric前mrna的靶向部分在保留內(nèi)含子中相對于該保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6區(qū)域至相對于該保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-16區(qū)域之內(nèi)。在實施方案中，ric前mrna的靶向部分在保留內(nèi)含子中相對于該保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6至+100區(qū)域內(nèi)；或在相對于該保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-16至-100區(qū)域內(nèi)。在實施方案中，ric前mrna的靶向部分在位于該保留內(nèi)含子的5’剪接位點側(cè)翼的外顯子中的+2e至-4e區(qū)域內(nèi)；或在位于該保留內(nèi)含子的3’剪接位點側(cè)翼的外顯子中的+2e至-4e區(qū)域內(nèi)。

在實施方案中，所述反義寡聚體并不是通過調(diào)節(jié)由編碼功能rna或靶蛋白的基因轉(zhuǎn)錄的前mrna的其它剪接來增加該靶蛋白或該功能rna的量。在實施方案中，該反義寡聚體并不是通過調(diào)節(jié)由編碼靶蛋白或功能rna的基因的突變所導致的異常剪接來增加該靶蛋白或該功能rna的量。

在實施方案中，所述ric前mrna由全長前mrna的部分剪接或野生型前mrna的部分剪接所產(chǎn)生。在實施方案中，編碼靶蛋白或功能rna的mrna是全長成熟mrna或野生型成熟mrna。在實施方案中，所產(chǎn)生的靶蛋白是全長蛋白或野生型蛋白。在實施方案中，所產(chǎn)生的功能rna是全長功能rna或野生型功能rna。

在實施方案中，與編碼在對照細胞中所產(chǎn)生的靶蛋白或功能rna的mrna的總量或成熟mrna的總量相比，編碼在與所述反義寡聚體相接觸的細胞中所產(chǎn)生的靶蛋白或功能rna的mrna的總量或成熟mrna的總量增加至約1.1至約10倍、約1.5至約10倍、約2至約10倍、約3至約10倍、約4至約10倍、約1.1至約5倍、約1.1至約6倍、約1.1至約7倍、約1.1至約8倍、約1.1至約9倍、約2至約5倍、約2至約6倍、約2至約7倍、約2至約8倍、約2至約9倍、約3至約6倍、約3至約7倍、約3至約8倍、約3至約9倍、約4至約7倍、約4至約8倍、約4至約9倍，至少約1.1倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍或至少約10倍。

在實施方案中，與編碼在對照細胞中所產(chǎn)生的靶蛋白或功能rna的mrna的總量相比，編碼在與所述反義寡聚體相接觸的細胞中所產(chǎn)生的靶蛋白或功能rna的mrna的總量增加至約1.1至約10倍、約1.5至約10倍、約2至約10倍、約3至約10倍、約4至約10倍、約1.1至約5倍、約1.1至約6倍、約1.1至約7倍、約1.1至約8倍、約1.1至約9倍、約2至約5倍、約2至約6倍、約2至約7倍、約2至約8倍、約2至約9倍、約3至約6倍、約3至約7倍、約3至約8倍、約3至約9倍、約4至約7倍、約4至約8倍、約4至約9倍，至少約1.1倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍或至少約10倍。

在實施方案中，與編碼在對照細胞中所產(chǎn)生的靶蛋白或功能rna的成熟mrna的總量相比，編碼在與所述反義寡聚體相接觸的細胞中所產(chǎn)生的靶蛋白或功能rna的成熟mrna的總量增加至約1.1至約10倍、約1.5至約10倍、約2至約10倍、約3至約10倍、約4至約10倍、約1.1至約5倍、約1.1至約6倍、約1.1至約7倍、約1.1至約8倍、約1.1至約9倍、約2至約5倍、約2至約6倍、約2至約7倍、約2至約8倍、約2至約9倍、約3至約6倍、約3至約7倍、約3至約8倍、約3至約9倍、約4至約7倍、約4至約8倍、約4至約9倍，至少約1.1倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍或至少約10倍。

在實施方案中，與對照細胞所產(chǎn)生的靶蛋白或功能rna的量相比，與所述反義寡聚體相接觸的細胞所產(chǎn)生的靶蛋白或功能rna的總量增加至約1.1至約10倍、約1.5至約10倍、約2至約10倍、約3至約10倍、約4至約10倍、約1.1至約5倍、約1.1至約6倍、約1.1至約7倍、約1.1至約8倍、約1.1至約9倍、約2至約5倍、約2至約6倍、約2至約7倍、約2至約8倍、約2至約9倍、約3至約6倍、約3至約7倍、約3至約8倍、約3至約9倍、約4至約7倍、約4至約8倍、約4至約9倍，至少約1.1倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍或至少約10倍。

在實施方案中，所述方法包括使具有ric前mrna的細胞與包含主鏈修飾的反義寡聚體接觸，該主鏈修飾包含硫代磷酸酯鍵或磷二酰胺鍵。在實施方案中，該反義寡聚體包含磷二酰胺嗎啉基(pmo)、鎖定核酸(lna)、肽核酸(pna)、2’-o-甲基、2’-氟或2’-o-甲氧乙基部分。在實施方案中，該反義寡聚體包含至少一個經(jīng)修飾的糖部分。在相關(guān)的實施方案中，每一個糖部分均為經(jīng)修飾的糖部分。

在實施方案中，所述反義寡聚體由8至50個核堿基組成。在實施方案中，該反義寡聚體由8至40個核堿基、8至35個核堿基、8至30個核堿基、8至25個核堿基、8至20個核堿基、8至15個核堿基、9至50個核堿基、9至40個核堿基、9至35個核堿基、9至30個核堿基、9至25個核堿基、9至20個核堿基、9至15個核堿基、10至50個核堿基、10至40個核堿基、10至35個核堿基、10至30個核堿基、10至25個核堿基、10至20個核堿基、10至15個核堿基、11至50個核堿基、11至40個核堿基、11至35個核堿基、11至30個核堿基、11至25個核堿基、11至20個核堿基、11至15個核堿基、12至50個核堿基、12至40個核堿基、12至35個核堿基、12至30個核堿基、12至25個核堿基、12至20個核堿基或12至15個核堿基組成。在實施方案中，該反義寡聚體與編碼所述蛋白質(zhì)的ric前mrna的靶向部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％互補。

在任何前述方法中，所述細胞可包含由編碼靶蛋白或功能rna的基因所轉(zhuǎn)錄的一群ric前mrna，其中該群ric前mrna包含兩個或更多個保留內(nèi)含子，并且其中所述反義寡聚體與該群ric前mrna中最豐富的保留內(nèi)含子結(jié)合。在這些實施方案中，該反義寡聚體與最豐富的保留內(nèi)含子的結(jié)合可誘導所述兩個或更多個保留內(nèi)含子從該群ric前mrna中剪接掉，以產(chǎn)生編碼該靶蛋白或功能rna的mrna。

在其他實施方案中，所述細胞包含由編碼靶蛋白或功能rna的基因所轉(zhuǎn)錄的一群ric前mrna，其中該群ric前mrna包含兩個或更多個保留內(nèi)含子，并且其中所述反義寡聚體與該群ric前mrna中第二豐富的保留內(nèi)含子結(jié)合。在這些實施方案中，該反義寡聚體與第二豐富的保留內(nèi)含子的結(jié)合可誘導所述兩個或更多個保留內(nèi)含子從該群ric前mrna中剪接掉，以產(chǎn)生編碼該靶蛋白或功能rna的mrna。

在前述方法中，所述病況可以是疾病或病癥。在這些實施方案中，該疾病或病癥可選自：血栓性血小板減少性紫癜、復合型結(jié)節(jié)性硬化癥、多囊腎病、家族性自主神經(jīng)功能異常、10型視網(wǎng)膜色素變性、11型視網(wǎng)膜色素變性、囊性纖維化、視網(wǎng)膜母細胞瘤、家族性腺瘤性息肉病、蛋白s缺陷癥、β地中海貧血和鐮狀細胞病。在相關(guān)的實施方案中，所述靶蛋白和ric前mrna由選自adamts13、tsc1、pkd1、ikbkap、impdh1、prpf31、cftr、rb1、apc、pros1、nedd4l、hbg1、hbg2和hbb的基因編碼。在實施方案中，所述反義寡聚體可與選自seqidno:1-102的ric前mrna的一部分結(jié)合。

在實施方案中，任何前述方法進一步包括評估蛋白質(zhì)表達。

在一些實施方案中，所述受試者是人。在其他實施方案中，該受試者是非人類動物。在實施方案中，所述反義寡聚體通過受試者的玻璃體內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射或靜脈內(nèi)注射來施用。在實施方案中，所述細胞是離體的。

在實施方案中，在位于5’剪接位點側(cè)翼的外顯子的-3e至-1e和保留內(nèi)含子的+1至+6處的9個核苷酸與相應的野生型序列相同。在實施方案中，在保留內(nèi)含子的-15至-1和位于3’剪接位點側(cè)翼的外顯子的+1e處的16個核苷酸與相應的野生型序列相同。

本文描述了包含用于本文所述方法的反義寡聚體的組合物。還描述了包含該反義寡聚體和賦形劑的藥物組合物。在實施方案中，包含該反義寡聚體的組合物意在用于增加細胞表達靶蛋白或功能rna的方法中，以治療受試者中與缺陷蛋白質(zhì)或缺陷功能rna相關(guān)的病況，其中該缺陷蛋白質(zhì)或缺陷功能rna是該受試者中量或活性的缺陷，其中該反義寡聚體增強編碼靶蛋白或功能rna的含保留內(nèi)含子的前mrna(ric前mrna)的組成性剪接，其中該靶蛋白為：(a)所述缺陷蛋白質(zhì)；或(b)在功能上增加或代替該受試者中的缺陷蛋白質(zhì)的補償?shù)鞍?；并且其中該功能rna為：(a)所述缺陷rna；或(b)在功能上增加或代替該受試者中的缺陷功能rna的補償功能rna；其中該ric前mrna包含保留內(nèi)含子，位于5’剪接位點側(cè)翼的外顯子，以及位于3’剪接位點側(cè)翼的外顯子，并且其中將該保留內(nèi)含子從編碼該靶蛋白或該功能rna的ric前mrna中剪接，從而增加該受試者中靶蛋白或功能rna的產(chǎn)生量或活性。

在實施方案中，包含所述反義寡聚體的組合物意在用于治療受試者中與靶蛋白或功能rna相關(guān)的疾病或病癥的方法，該方法包括增加該受試者的細胞表達該靶蛋白或功能rna的步驟，其中該細胞具有含保留內(nèi)含子的前mrna(ric前mrna)，該ric前mrna包含保留內(nèi)含子，位于該保留內(nèi)含子的5’剪接位點側(cè)翼的外顯子，位于該保留內(nèi)含子的3’剪接位點側(cè)翼的外顯子，并且其中該ric前mrna編碼該靶蛋白或功能rna，該方法包括使所述細胞與反義寡聚體相接觸，借此將該保留內(nèi)含子從編碼該靶蛋白或功能rna的ric前mrna轉(zhuǎn)錄物中組成性剪接，從而增加該受試者的細胞中編碼該靶蛋白或功能rna的mrna的水平，并且增加該受試者的細胞中該靶蛋白或功能rna的表達。

在實施方案中，所述包含反義寡聚體的組合物意在用于治療受試者中由靶蛋白或功能rna的量或活性缺陷所導致的病況的方法。在實施方案中，該病況是疾病或病癥。在實施方案中，該疾病或病癥選自：血栓性血小板減少性紫癜、復合型結(jié)節(jié)性硬化癥、多囊腎病、家族性自主神經(jīng)功能異常、10型視網(wǎng)膜色素變性、11型視網(wǎng)膜色素變性、囊性纖維化、視網(wǎng)膜母細胞瘤、家族性腺瘤性息肉病、蛋白s缺陷癥、β地中海貧血和鐮狀細胞病。在實施方案中，該組合物意在用于一種方法，其中靶蛋白和ric前mrna由選自adamts13、tsc1、pkd1、ikbkap、impdh1、prpf31、cftr、rb1、apc、pros1、nedd4l、hbg1、hbg2和hbb的基因編碼。

在實施方案中，所述組合物的反義寡聚體靶向ric前mrna的一部分，該部分在保留內(nèi)含子中相對于該保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6區(qū)域至相對于該保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-16區(qū)域內(nèi)。在實施方案中，該組合物的反義寡聚體靶向ric前mrna的一部分，該部分在保留內(nèi)含子中相對于該保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6至+100區(qū)域內(nèi)；或在相對于該保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-16至-100區(qū)域內(nèi)。在實施方案中，所述反義寡聚體靶向ric前mrna的一部分，該部分在所述至少一個保留內(nèi)含子的5’剪接位點下游約100個核苷酸至所述至少一個保留內(nèi)含子的3’剪接位點上游約100個核苷酸的區(qū)域內(nèi)。在實施方案中，所述ric前mrna的靶向部分在位于該保留內(nèi)含子的5’剪接位點側(cè)翼的外顯子中的+2e至-4e區(qū)域內(nèi)；或在位于該保留內(nèi)含子的3’剪接位點側(cè)翼的外顯子中的+2e至-4e區(qū)域內(nèi)。

在實施方案中，所述組合物的或如本文所述方法中所用的反義寡聚體并不是通過調(diào)節(jié)由編碼靶蛋白或功能rna的基因所轉(zhuǎn)錄的前mrna的其它剪接來增加該靶蛋白或功能rna的量。在實施方案中，所述組合物的或如本文所述方法中所用的反義寡聚體并不是通過調(diào)節(jié)由編碼靶蛋白或功能rna的基因的突變導致的異常剪接來增加該靶蛋白或功能rna的量。

在實施方案中，所述ric前mrna由全長前mrna或野生型前mrna的部分剪接而產(chǎn)生。在實施方案中，編碼靶蛋白或功能rna的mrna是全長成熟mrna或野生型成熟mrna。在實施方案中，所產(chǎn)生的靶蛋白是全長蛋白或野生型蛋白。在實施方案中，所產(chǎn)生的功能rna是全長功能rna或野生型功能rna。

在實施方案中，所述保留內(nèi)含子為限速內(nèi)含子。在實施方案中，該保留內(nèi)含子為所述ric前mrna中最豐富的內(nèi)含子。在實施方案中，該保留內(nèi)含子為所述ric前mrna中第二豐富的內(nèi)含子。

在實施方案中，所述組合物的或如本文所述方法中所用的反義寡聚體包含主鏈修飾，該主鏈修飾包含硫代磷酸酯鍵或磷二酰胺鍵。在實施方案中，該反義寡聚體為反義寡核苷酸。

在實施方案中，該反義寡聚體包含磷二酰胺嗎啉基、鎖定核酸、肽核酸、2’-o-甲基、2’-氟或2’-o-甲氧乙基部分。在實施方案中，該反義寡聚體包含至少一個經(jīng)修飾的糖部分。在相關(guān)的實施方案中，每一個糖部分均為經(jīng)修飾的糖部分。

該反義寡聚體可由8至50個核堿基組成。在實施方案中，反義寡聚體由8至40個核堿基、8至35個核堿基、8至30個核堿基、8至25個核堿基、8至20個核堿基、8至15個核堿基、9至50個核堿基、9至40個核堿基、9至35個核堿基、9至30個核堿基、9至25個核堿基、9至20個核堿基、9至15個核堿基、10至50個核堿基、10至40個核堿基、10至35個核堿基、10至30個核堿基、10至25個核堿基、10至20個核堿基、10至15個核堿基、11至50個核堿基、11至40個核堿基、11至35個核堿基、11至30個核堿基、11至25個核堿基、11至20個核堿基、11至15個核堿基、12至50個核堿基、12至40個核堿基、12至35個核堿基、12至30個核堿基、12至25個核堿基、12至20個核堿基或12至15個核堿基組成。

在實施方案中，該反義寡聚體與編碼所述蛋白質(zhì)的ric前mrna的靶向部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％互補。在實施方案中，該反義寡聚體與選自seqidno:1-102的ric前mrna的一部分結(jié)合。

在實施方案中，該反義寡聚體被包含在包含賦形劑的藥物組合物中。

本文描述了從每一個均與編碼靶蛋白或功能rna的ric前mrna的靶區(qū)域雜交的一組反義寡聚體中鑒定反義寡聚體的方法，該反義寡聚體通過誘導保留內(nèi)含子從所述ric前mrna中組成性剪接來增加編碼該靶蛋白或功能rna的mrna的量，其中所述ric前mrna包含至少一個保留內(nèi)含子，其中該組中的反義寡聚體以每1至5個核苷酸進行平鋪(tile)，并且其中該組中的反義寡聚體與在以下序列內(nèi)的ric前mrna雜交，該序列在：所述至少一個保留內(nèi)含子的5’剪接位點上游約100個核苷酸至所述至少一個保留內(nèi)含子的5’剪接位點下游約100個核苷酸；或所述至少一個保留內(nèi)含子的3’剪接位點上游約100個核苷酸至所述至少一個保留內(nèi)含子的3’剪接位點下游約100個核苷酸；所述方法包括：a)將該組中的第一反義寡聚體遞送至包含該ric前mrna的細胞；b)在第一反義寡聚體所遞送到的細胞中測量ric前mrna的量和測量編碼該靶蛋白或功能rna的mrna的量；c)在對照細胞中測量ric前mrna的量和測量編碼靶蛋白或功能rna的mrna的量；以及d)比較在b和c中所測得的ric前mrna和編碼靶蛋白或功能rna的mrna的量；其中根據(jù)與對照細胞相比，在第一反義寡聚體所遞送到的細胞中觀察到ric前mrna的量減少和觀察到編碼靶蛋白或功能rna的mrna的量增加，將第一反義寡聚體鑒定為通過誘導所述至少一種保留內(nèi)含子從ric前mrna中組成性剪接而增加編碼該靶蛋白或功能rna的mrna的量的反義寡聚體；以及根據(jù)需要采用該組反義寡聚體中另外的反義寡聚體來重復步驟a到d，以鑒定通過誘導保留內(nèi)含子從ric前mrna中組成性剪接而增加細胞中來自基因的mrna的量的反義寡聚體。

本文還描述了鑒定用于治療病況的反義寡聚體(aso)的方法，其中該病況由基因產(chǎn)物的產(chǎn)生量不足所導致，該方法包括：鑒定來自具有該病況的受試者的細胞核中至少一種ric前mrna的存在，其中該ric前mrna包含至少一個保留內(nèi)含子且由編碼該基因產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄，并且其中所鑒定的ric前mrna在完全剪接為成熟mrna時編碼完全功能性或部分功能性形式的基因產(chǎn)物；a)制備每一個均與所述至少一個ric前mrna的靶區(qū)域雜交的一組aso，其中該組中的反義寡聚體以每1至5個核苷酸進行平鋪，并且其中該組中的反義寡聚體與在以下序列內(nèi)的至少一種ric前mrna雜交，該序列在：所述至少一個保留內(nèi)含子的5’剪接位點上游約100個核苷酸至所述至少一個保留內(nèi)含子的5’剪接位點下游約100個核苷酸；或所述至少一個保留內(nèi)含子的3’剪接位點上游約100個核苷酸至所述至少一個保留內(nèi)含子的3’剪接位點下游約100個核苷酸；b)將該組aso中的第一aso遞送至包含所述至少一個ric前mrna的細胞；c)在第一反義寡聚體所遞送到的細胞中測量ric前mrna的量和測量編碼該基因產(chǎn)物的mrna的量；d)在對照細胞中測量ric前mrna的量和測量編碼該基因產(chǎn)物的mrna的量；以及e)比較步驟c和d中得到的值；其中根據(jù)與對照細胞相比，在第一反義寡聚體所遞送到的細胞中觀察到ric前mrna的量減少和觀察到編碼該基因產(chǎn)物的mrna的量增加，將第一反義寡聚體鑒定為通過誘導所述至少一種保留內(nèi)含子從ric前mrna中組成性剪接而增加編碼該基因產(chǎn)物的mrna的量的反義寡聚體；以及根據(jù)需要采用該組反義寡聚體中另外的反義寡聚體來重復步驟a到e，以鑒定通過誘導保留內(nèi)含子從ric前mrna中組成性剪接而增加編碼細胞中來自基因的基因產(chǎn)物的mrna的量的反義寡聚體；以及對于通過誘導保留內(nèi)含子從ric前mrna中組成性剪接而增加細胞中編碼所述基因產(chǎn)物的mrna的量的反義寡聚體，進一步測試其增加由細胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的量的能力。

援引并入

本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用并入本文，其程度如同特別且單獨地指出每一個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用并入。

附圖說明

并未打算按比例來繪制附圖。附圖僅是說明性的并且不是實現(xiàn)本發(fā)明所需的。出于清楚的目的，可以不將每一個組分都標在每張圖中。在所述附圖中：

圖1示出了示例性的含保留內(nèi)含子(ric)的前mrna轉(zhuǎn)錄物的示意圖。用-3e至-1e和+1至+6(標有“e”的數(shù)字是外顯子的而未標記的數(shù)字是內(nèi)含子的)的加下劃線字母(字母為核苷酸；大寫字母：外顯子部分，小寫字母：內(nèi)含子部分)指示5’剪接位點共有序列。用-15至-1和+1e(標有“e”的數(shù)字是外顯子的而未標記的數(shù)字是內(nèi)含子的)的加下劃線字母(字母為核苷酸；大寫字母：外顯子部分，小寫字母：內(nèi)含子部分)指示3’剪接位點共有序列。用于aso篩選的內(nèi)含子靶區(qū)域包含相對于保留內(nèi)含子的5’剪接位點(左側(cè)箭頭)的+6至相對于保留內(nèi)含子的3’剪接位點(右側(cè)箭頭)的-16的核苷酸。在實施方案中，用于aso篩選的內(nèi)含子靶區(qū)域包含相對于保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6至+100和相對于保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-16至-100的核苷酸。外顯子靶區(qū)域包含位于保留內(nèi)含子的5’剪接位點側(cè)翼的外顯子中的+2e至-4e和位于保留內(nèi)含子的3’剪接位點側(cè)翼的外顯子中的+2e至-4e的核苷酸。“n”或“n”表示任何核苷酸，“y”表示嘧啶。所示出的序列代表哺乳動物剪接位點的共有序列，并且單獨的內(nèi)含子和外顯子不需要在每個位置匹配該共有序列。

圖2a-2b示出了核基因輸出定向增加(tango)方法的示意圖。圖2a顯示了分為細胞核和細胞質(zhì)區(qū)室的細胞。在細胞核中，由外顯子(矩形)和內(nèi)含子(連接線)組成的靶基因的前mrna轉(zhuǎn)錄物經(jīng)歷剪接以生成mrna，并且該mrna被輸出到細胞質(zhì)并翻譯為靶蛋白。對于該靶基因，內(nèi)含子1的剪接是低效的且含保留內(nèi)含子(ric)的前mrna主要在細胞核中積累，并且如果輸出到細胞質(zhì)則降解，導致無靶蛋白產(chǎn)生。圖2b示出了分為細胞核和細胞質(zhì)區(qū)室的相同細胞的實例。用反義寡聚體(aso)處理促進了內(nèi)含子1的剪接并導致mrna的增加，該增加的mrna繼而翻譯為更高水平的靶蛋白。

圖3示出了利用如實施例1所述的rt-pcr篩選7-外顯子/6-內(nèi)含子基因的內(nèi)含子保留的實例的示意圖。編號矩形表示通過表示內(nèi)含子的線連接的外顯子。弓形箭頭指示剪接事件。短的水平條表示用來評估內(nèi)含子保留的引物對。正向引物用“f”指示而反向引物則用“r”指示，即，f1和r1、f2和r2、f3和r3、f4和r4、f5和r5以及f6和r6對。當這樣的內(nèi)含子存在且觀察到相鄰內(nèi)含子被剪接掉(去除)時，該內(nèi)含子被鑒定為保留內(nèi)含子。

圖4示出了利用如實施例2所述的rt-pcr篩選以確認7-外顯子/6-內(nèi)含子基因的內(nèi)含子保留的實例的示意圖。編號矩形表示通過表示內(nèi)含子的線連接的外顯子。弓形箭頭指示剪接事件。短的水平條表示用來評估內(nèi)含子保留的引物對。正向引物用“f”標記而反向引物則用“r1”、“r2”或“r3”標記。當這樣的內(nèi)含子存在且觀察到一個或多個相鄰內(nèi)含子被剪接掉(去除)時，所述內(nèi)含子被鑒定為保留內(nèi)含子。

圖5示出了測定內(nèi)含子去除效率的示例性核糖核酸酶保護測定(rpa)的示意圖。

圖6a-6e示出了如實施例1所述鑒定prpf31和rb1基因中的內(nèi)含子保留事件。圖6a示出了prpf31基因的示意圖，其中編號矩形表示外顯子且中間連線表示內(nèi)含子。正向(“f”)和反向(“r”)引物由短線表示。下面是示出對應于prpf31中內(nèi)含子保留事件的rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。該產(chǎn)物在1.5％溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠中分離。頂部凝膠對應于來自hela細胞的細胞核部分的產(chǎn)物，而底部凝膠則對應于來自293t細胞的細胞核部分的產(chǎn)物。星號指示對于內(nèi)含子保留事件的正確產(chǎn)物(按大小)。圖6b示出了rb1基因的示意圖，其中編號矩形表示外顯子且中間連線表示內(nèi)含子。下面是顯示對應于rb1中內(nèi)含子保留事件的來自hela細胞核提取物的rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。該rt-pcr產(chǎn)物在1.5％溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠中分離。圖6c示出了對應于rb1中內(nèi)含子保留事件的來自293t細胞核提取物的rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。圖6d示出了對應于prpf31和rb1中內(nèi)含子保留事件的來自arpe-19細胞核提取物的rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。rt-pcr產(chǎn)物在1.5％溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠中分離。圖6e示出了對應于prpf31和rb1中內(nèi)含子保留事件的來自arpe-19細胞質(zhì)提取物的rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。ivs：間插序列(內(nèi)含子)。

圖7a-7b示出了如實施例2所述鑒定prpf31和rb1基因中的內(nèi)含子保留事件。圖7a示出了對應于prpf31中內(nèi)含子保留事件的rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。來自arpe-19細胞核提取物的rt-pcr產(chǎn)物在1.5％溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠中分離。圖7b示出了對應于rb1中內(nèi)含子保留事件的rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。來自arpe-19細胞核提取物的rt-pcr產(chǎn)物在1.5％溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠中分離。星號指示利用所示引物對針對內(nèi)含子保留事件的正確產(chǎn)物(按大小)。ivs：間插序列(內(nèi)含子)。

圖8a-8c示出了如實施例3所述通過經(jīng)由剪接位點誘變提升剪接效率而增加的基因表達。圖8a示出了hbb報道基因的示意圖，其包括表示外顯子的編號矩形。繪制標記出內(nèi)含子-外顯子邊界的實際hbb剪接位點序列。用星號指示的剪接位點序列內(nèi)的核苷酸顯示通過將剪接位點序列帶入共有序列(在hbb剪接位點正下方的序列)的定點誘變而引入的核苷酸置換的位置。a：ivs15’剪接位點突變體，b：ivs13’剪接位點突變體，c：ivs25’剪接位點突變體，d：ivs23’剪接位點突變體。ab、cd、ac和bd：組合突變體。圖8b示出了野生型(wt)和突變hbb報道基因的放射性rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。該rt-pcr產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠中分離。圖8c示出了相對于gfp歸一化的對應于hbb轉(zhuǎn)錄物的條帶強度的柱狀圖。以相對于wthbb產(chǎn)物的倍數(shù)變化進行繪圖。黑線指示比率為1，沒有變化。

圖9a-9c示出了如實施例3所述，靶向hbbivs15’剪接位點下游緊鄰序列的aso增加了hbbmrna。圖9a示出了hbb報道基因的示意圖。編號矩形表示外顯子，并且中間連線表示內(nèi)含子。橙色線指示ivs1+6aso(“+6”)，灰色線指示ivs1+7aso(“+7”)。黑色線指示在hbb轉(zhuǎn)錄物的pcr擴增中使用的正向(“f”)和反向(“r”)引物。圖9b呈現(xiàn)了未處理的(-)、模擬處理的(rim、rnaimax或ep、endoporter)或用所示濃度的非靶向(nt)或ivs1+72′-o-me(凝膠的左側(cè)部分)或pmo(凝膠的右側(cè)部分)aso處理的野生型hbb報道基因的放射性rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。該rt-pcr產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠中分離。圖9c示出了相對于gfp歸一化的對應于hbb轉(zhuǎn)錄物的條帶強度的柱狀圖。以相對于來自模擬處理的細胞的產(chǎn)物的倍數(shù)變化進行繪圖。綠柱對應于用ivs+72′-o-measo處理，而橙柱對應于用ivs+7pmoaso處理。黑線指示比率為1，沒有變化。

圖10a-10c示出了如實施例4所述，靶向hbbivs15’剪接位點下游緊鄰序列的ivs1+72′-o-measo增加了gfp-hbb-t7蛋白水平。圖10a示出了已整合在u2os細胞的基因組中的gfp-hbb-t7報道基因的示意圖。標有“gfp”的矩形表示gfp的開放讀框，編號矩形表示hbb外顯子，中間連線表示內(nèi)含子，而標有“t7”的矩形表示編碼t7標簽的序列。標有“+7”的線指示ivs1+7aso。圖10b呈現(xiàn)了模擬處理的(rim、rnaimax)或用濃度為50nm的ivs1+72′-o-measo處理的野生型gfp-hbb-t7報道基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的代表性凝膠。該蛋白質(zhì)產(chǎn)物在4-20％sds-聚丙烯酰胺凝膠上分離。采用抗gfp和β微管蛋白的抗體來檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物。圖10c示出了來自兩個生物復制品的相對于β微管蛋白歸一化的對應于gfp-hbb-t7蛋白的條帶強度的柱狀圖。以相對于來自模擬處理的細胞的產(chǎn)物的倍數(shù)變化進行繪圖。黑線指示比率為1，沒有變化。

圖11示出了如實施例5所述，在ucsc基因組瀏覽器中所顯現(xiàn)的，利用rna測序(rnaseq)鑒定adamts13基因中的內(nèi)含子保留事件。頂部圖幅(panel)示出了對應于在thle-3(人肝上皮)細胞中表達且位于細胞質(zhì)(頂部)或細胞核部分(底部)中的adamts13轉(zhuǎn)錄物的讀數(shù)密度。在該幅圖的底部，按比例示出了adamts13基因的所有參考序列(refseq.)同種型的圖示。讀數(shù)密度顯示為峰。最高的讀數(shù)密度對應于外顯子(黑框)，而對于任一細胞部分中的大多數(shù)內(nèi)含子(帶箭頭的線)均未觀察到讀數(shù)。與細胞質(zhì)部分相比，對于細胞核部分中的內(nèi)含子25和27檢測到較高的讀數(shù)密度(箭頭所指)，這表明內(nèi)含子25和27的剪接效率低，導致了內(nèi)含子保留。含保留內(nèi)含子的前mrna轉(zhuǎn)錄物保留在細胞核中而不向外輸出到細胞質(zhì)中。底部的圖片詳細地示出了對于thle-3細胞中的內(nèi)含子25的讀數(shù)密度。

圖12示出了如實施例6所述，經(jīng)由放射性rt-pcr驗證生物信息學分析。圖12描繪了驗證圖11所示生物信息學預測的放射性rt-pcr測定的示意圖。編號矩形表示外顯子，并且中間連線表示內(nèi)含子。黑線指示在adamts-13轉(zhuǎn)錄物的pcr擴增中使用的正向(“f1”)和反向(“r1”)引物，其產(chǎn)生兩種產(chǎn)物：內(nèi)含子25保留的(652bp)和正確剪接的(187bp)產(chǎn)物。下方示出在5％聚丙烯酰胺凝膠中分離的來自a172(成膠質(zhì)細胞瘤，左側(cè))和hepg2(肝細胞癌，右側(cè))細胞的細胞核和細胞質(zhì)部分的放射性rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。星號指示正確的產(chǎn)物(按大小)。結(jié)果顯示了對應于兩個細胞系的細胞核部分中的內(nèi)含子25保留的產(chǎn)物的條帶，該產(chǎn)物不存在于兩個細胞質(zhì)部分中。右側(cè)表格中則示出了根據(jù)放射性rt-pcr和rnaseq實驗按內(nèi)含子保留百分比(pir)計算的adamts13內(nèi)含子25保留的量化總結(jié)。

圖13示出了如實施例7所述，利用2′-o-measo(ps主鏈)，針對5’剪接位點下游緊鄰或3’剪接位點上游緊鄰的adamts13ivs25靶向序列進行的aso步移(walk)的圖示。將aso設計為通過一次移位5個核苷酸來覆蓋這些區(qū)域。按比例繪制外顯子24至29和內(nèi)含子序列。

圖14描繪了如實施例8所述的靶向內(nèi)含子25的aso步移的結(jié)果。在頂部，代表性凝膠示出了hepg2細胞中用濃度為60nm的模擬處理的(-，僅rnaimax)、經(jīng)smn-對照aso處理的或如圖13所述靶向內(nèi)含子25的2′-o-measo處理的adamts13的放射性rt-pcr產(chǎn)物。來自3個獨立實驗的相對于β肌動蛋白歸一化的對應于adamts13產(chǎn)物的條帶的量化以相對于smn-對照-aso處理的產(chǎn)物的倍數(shù)變化繪制在下面的柱狀圖中。黑線指示比率為1，沒有變化。星號指示導致mrna水平增加最多的aso。

圖15示出了如實施例9所述，adam-ivs25+21、adam-ivs25+26(兩種最佳靶向aso)以及adam-ivs-46(一種導致adamts13轉(zhuǎn)錄物減少的aso)的劑量-響應曲線。在頂部圖幅中，代表性凝膠顯示了來自模擬處理的、所示濃度的smn-對照、adam-ivs25+21、adam-ivs25+26或adam-ivs-46處理的hepg2細胞的放射性rt-pcradamts13產(chǎn)物。該rt-pcr產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠中分離。相對于β肌動蛋白歸一化的對應于adamts13產(chǎn)物的條帶的量化以相對于模擬處理的產(chǎn)物的倍數(shù)變化繪制在下面的柱狀圖中。黑線指示比率為1，沒有變化。

圖16圖示了如實施例10所述，用adam-ivs25+21和adam-ivs25+26aso處理hepg2細胞而導致的adamts13蛋白的增加。在頂部圖幅中，代表性凝膠顯示了來自模擬處理的、所示濃度的adam-ivs25+21或adam-ivs25+26處理的hepg2細胞的adamts13蛋白產(chǎn)物。該蛋白質(zhì)產(chǎn)物在8％sds-聚丙烯酰胺凝膠上分離。采用抗adamts-13和α微管蛋白的抗體來檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物。下方的柱狀圖示出了相對于α微管蛋白歸一化的對應于來自adam-ivs25+21處理的細胞的adamts-13蛋白水平的條帶強度的量化。以相對于來自模擬處理的細胞的產(chǎn)物的倍數(shù)變化進行繪圖。黑線指示比率為1，沒有變化。adam-ivs25+21以劑量依賴性的方式增加adamts13蛋白產(chǎn)物。

圖17示出了如實施例11所述，利用2′-o-me、5’-me-胞嘧啶aso，針對在adam-ivs25+21和adam-ivs25+26aso的區(qū)域中的adamts13ivs25靶向序列進行的aso微步移(microwalk)的圖示。將aso設計為通過一次移位1個核苷酸來覆蓋該區(qū)域。按比例繪制外顯子24至29和內(nèi)含子序列。

圖18描繪了如實施例12所述，靶向內(nèi)含子25中adam-ivs25+21和adam-ivs25+26區(qū)域的aso微步移的結(jié)果。在頂部，代表性凝膠示出了hepg2中用濃度為60nm的模擬處理的(-)、經(jīng)smn-對照aso處理的或2′-o-me、5’-me-胞嘧啶aso(如圖17描述)處理的adamts13的放射性rt-pcr產(chǎn)物。來自2個獨立實驗的相對于β肌動蛋白歸一化的對應于adamts13產(chǎn)物的條帶的量化以相對于模擬處理的產(chǎn)物的倍數(shù)變化繪制在下方的柱狀圖中。黑線指示比率為1，沒有變化。兩個淡灰色的柱指示圖14和圖15中描述的ivs252′-o-measoadam-ivs25+21和adam-ivs25+26。

圖19示出了如實施例13所述，在ucsc基因組瀏覽器中顯現(xiàn)的，利用rna測序(rnaseq)來鑒定tsc1基因中的內(nèi)含子保留事件。頂部圖幅示出了對應于在hcn(原代人皮質(zhì)神經(jīng)元)細胞中表達且位于細胞質(zhì)(頂部)或細胞核部分(底部)中的tsc1轉(zhuǎn)錄物的讀數(shù)密度。在該幅圖的底部，按比例示出了tsc1基因的所有參考序列同種型的圖示。讀數(shù)密度顯示為峰。最高的讀數(shù)密度對應于外顯子(黑框)，而對于任一細胞部分中的大多數(shù)內(nèi)含子(帶箭頭的線)均未觀察到讀數(shù)。與細胞質(zhì)部分相比，對于細胞核部分中的內(nèi)含子5、10和11檢測到較高的讀數(shù)密度(箭頭所指)，這表明內(nèi)含子5、10和11的剪接效率低，導致了內(nèi)含子保留。含保留內(nèi)含子的前mrna轉(zhuǎn)錄物保留在細胞核中而不向外輸出到細胞質(zhì)中。在底部圖片中則詳細示出了對于hcn細胞和ast(原代人星形細胞)細胞的內(nèi)含子10的讀數(shù)密度。

圖20示出了如實施例14所述驗證圖19中所示生物信息學預測的放射性rt-pcr測定的示意圖。編號矩形表示外顯子，并且中間連線表示內(nèi)含子。黑線指示在tsc1轉(zhuǎn)錄物的pcr擴增中使用的正向(“f1”)和反向(“r1”)引物，其產(chǎn)生兩種產(chǎn)物：內(nèi)含子10保留的(617bp)和正確剪接的(278bp)產(chǎn)物。下方是顯示在5％聚丙烯酰胺凝膠中分離的來自a172(成膠質(zhì)細胞瘤)細胞的細胞核和細胞質(zhì)部分的放射性rt-pcr產(chǎn)物的代表性凝膠。結(jié)果示出了對應于a172細胞的細胞核部分中的內(nèi)含子10保留的產(chǎn)物的條帶，該產(chǎn)物在細胞質(zhì)部分中顯著減少。條帶的量化表明約36％的tsc1轉(zhuǎn)錄物含有內(nèi)含子10并且表明該產(chǎn)物保留在細胞核中。此外，如對于adamts13所示，放射性rt-pcr結(jié)果驗證了生物信息學預測。右側(cè)表格示出了根據(jù)放射性rt-pcr和rnaseq實驗按內(nèi)含子保留百分比(pir)計算的tsc1內(nèi)含子10保留的量化總結(jié)。

圖21示出了如實施例15所述，利用2′-o-measo(ps主鏈)，針對5’剪接位點下游緊鄰或3’剪接位點上游緊鄰的tsc1ivs10靶向序列進行的aso步移的圖示。將aso設計為通過一次移位5個核苷酸來覆蓋這些區(qū)域。按比例繪制tsc1外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

圖22描繪了如實施例16所述的靶向內(nèi)含子10的aso步移的結(jié)果。在頂部，代表性凝膠示出了a172細胞中用濃度為60nm的模擬處理的(-)、經(jīng)smn-對照aso處理的或如圖21所述靶向內(nèi)含子10的2′-o-measo處理的tsc1的放射性rt-pcr產(chǎn)物。來自2個獨立實驗的相對于β肌動蛋白歸一化的對應于tsc1產(chǎn)物的條帶的量化以相對于模擬處理的產(chǎn)物的倍數(shù)變化繪制在下方的柱狀圖中。黑線指示比率為1，沒有變化。星號指示導致tsc1mrna水平增加的aso。

圖23示出了如實施例17所述針對tsc1-ivs10+31aso的劑量-響應曲線。在頂部圖幅中，代表性凝膠示出了來自模擬處理的、所示濃度的smn-對照或tsc1-ivs10+31處理的a172細胞的放射性rt-pcrtsc1產(chǎn)物。該rt-pcr產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠中分離。相對于β肌動蛋白歸一化的對應于tsc1產(chǎn)物的條帶的量化以相對于模擬處理的產(chǎn)物的倍數(shù)變化繪制在左下方的柱狀圖中。相對于模擬處理的產(chǎn)物的相同實驗的rt-qpcr結(jié)果繪制在右側(cè)柱狀圖上，以證實放射性rt-pcr結(jié)果。黑線指示比率為1，沒有變化。

圖24圖示了如實施例18所述，用tsc1-ivs10+31aso處理a172細胞而導致的tsc1蛋白的增加。在頂部圖幅中，代表性凝膠示出了來自模擬處理的、所示濃度的smn-對照或tsc1-ivs10+31aso處理的a172細胞的tsc1蛋白產(chǎn)物。該蛋白產(chǎn)物在10％sds-聚丙烯酰胺凝膠上分離。采用抗tsc1和α微管蛋白的抗體來檢測該蛋白產(chǎn)物。下方的柱狀圖示出了相對α微管蛋白歸一化的對應于來自tsc1-ivs10+31處理的細胞的tsc1蛋白的條帶強度的量化。以相對于來自模擬處理的細胞的產(chǎn)物的倍數(shù)變化進行繪圖。黑線指示比率為1，沒有變化。tsc1-ivs10+31增加了tsc1蛋白產(chǎn)物。

圖25示出了如實施例19所述，在ucsc基因組瀏覽器中顯現(xiàn)的，采用rna測序(rnaseq)鑒定impdh1基因中的內(nèi)含子保留事件。頂部圖幅示出了對應于在arpe19(人視網(wǎng)膜上皮)細胞中表達且位于細胞質(zhì)(頂部)或細胞核部分(底部)中的impdh1轉(zhuǎn)錄物的讀數(shù)密度。在該幅圖的底部，按比例示出了impdh1基因的所有參考序列同種型的圖示。讀數(shù)密度顯示為峰。最高的讀數(shù)密度對應于外顯子(黑框)，而對于任一細胞部分中的大多數(shù)內(nèi)含子(帶箭頭的線)均未觀察到讀數(shù)。與細胞質(zhì)部分相比，對于細胞核部分中的內(nèi)含子14檢測到較高的讀數(shù)密度(箭頭所指)，這表明內(nèi)含子14的剪接效率低，導致了內(nèi)含子保留。含保留內(nèi)含子的前mrna轉(zhuǎn)錄物保留在細胞核中而未向外輸出到細胞質(zhì)。在底部圖片中詳細示出了對于arpe19細胞的內(nèi)含子14的讀數(shù)密度。

圖26示出了使用如實施例20所述的2′-o-measo(ps主鏈)，針對5’剪接位點下游緊鄰或3’剪接位點上游緊鄰的impdh1ivs14靶向序列進行的aso步移的圖示。將aso設計為通過一次移位5個核苷酸來覆蓋這些區(qū)域，除非在aso中存在一段四個鳥嘌呤。按比例繪制impdh1外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

圖27描繪了如實施例21所述的靶向內(nèi)含子14的aso步移的結(jié)果。在頂部，代表性凝膠示出了arpe19細胞中用濃度為60nm的模擬處理的(-)、經(jīng)smn-對照aso處理的或如圖21所述靶向內(nèi)含子14的2′-o-measo處理的impdh1的放射性rt-pcr產(chǎn)物。來自2個獨立實驗的相對于β肌動蛋白歸一化的對應于impdh1產(chǎn)物的條帶量化以相對于模擬處理的產(chǎn)物的倍數(shù)變化繪制在下方的柱狀圖中。黑線指示比率為1，沒有變化。星號指示導致impdh1mrna水平增加最多的aso。

圖28示出了如實施例22所述，用所示濃度的imp-ivs14+48aso處理arpe19細胞而導致的impdh1基因表達水平以劑量依賴性方式的增加。來自arpe-19細胞的impdh1(內(nèi)含子14保留的和正確剪接的)和β肌動蛋白的放射性rt-pcr產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠上分離。左側(cè)柱狀圖證實了與模擬處理的細胞相比，相對于來自imp-ivs14+48aso處理的細胞的總轉(zhuǎn)錄物(內(nèi)含子14保留的和正確剪接的)所計算的內(nèi)含子保留百分比(pir)的劑量依賴性減少(兩個獨立實驗)。來自兩個獨立實驗的正確剪接的轉(zhuǎn)錄物水平相對于模擬處理的細胞的倍數(shù)變化繪制在中間的圖中，其示出了impdh1轉(zhuǎn)錄物水平的劑量依賴性增加。進行rt-qpcr(右側(cè)柱狀圖)并將所得值相對于β肌動蛋白進行歸一化。以四個生物復制品相對于模擬處理的impdh1產(chǎn)物的倍數(shù)變化進行繪圖，確認了放射性rt-pcr結(jié)果。

圖29示出了如實施例23所述，經(jīng)由arpe19細胞中所示濃度的imp-ivs14+48aso靶向而獲得的impdh1蛋白水平的增加。來自arpe-19細胞的蛋白質(zhì)裂解物在4-20％sds-聚丙烯酰胺凝膠上分離。采用抗impdh1、β肌動蛋白和β連環(huán)蛋白的抗體來檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物。將impdh1蛋白條帶的強度相對于β肌動蛋白條帶的強度進行歸一化，并計算相對于來自四個生物復制品的模擬處理的產(chǎn)物的倍數(shù)變化，并且繪制在下方的柱狀圖中。

圖30示出了如實施例24所述，利用2′-o-me、5’-me-胞嘧啶aso，針對imp-ivs14+48aso的區(qū)域中的impdh1ivs14靶向序列進行的aso微步移的圖示。將aso設計為通過一次移位1個核苷酸來覆蓋該區(qū)域。按比例繪制impdh1外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

圖31示出了如實施例25所述，如圖30所示的微步移導致的mpdh1表達水平的增加。對從arpe-19細胞中提取的總rna進行rt–qpcr，所述總rna在60nm的aso濃度下進行處理。將impdh1基因的ct值相對于ct值β肌動蛋白(左側(cè))和rpl32(右側(cè))管家基因進行歸一化，并將相對于來自模擬處理的細胞的產(chǎn)物的倍數(shù)變化繪制在柱狀圖中。該微步移鑒定了進一步增加impdh1轉(zhuǎn)錄物水平的兩種另外的aso。

圖32示出了如實施例26所述，在ucsc基因組瀏覽器中顯現(xiàn)的，利用rna測序(rnaseq)鑒定pkd1基因中的內(nèi)含子保留事件。頂部圖幅示出了對應于在原代人腎上皮細胞(ren)中表達且位于細胞質(zhì)(頂部)或細胞核部分(底部)中的pkd1轉(zhuǎn)錄物的讀數(shù)密度。在該幅圖的底部，按比例示出了pkd1基因的參考序列同種型的圖示。讀數(shù)密度示出為峰。最高的讀數(shù)密度對應于外顯子(黑框)，而對于任一細胞部分中的大多數(shù)內(nèi)含子(帶箭頭的線)均未觀察到讀數(shù)。與細胞質(zhì)部分相比，對于細胞核部分中的內(nèi)含子32、33、37和38檢測到較高的讀數(shù)密度(箭頭所指)，這表明這些內(nèi)含子的剪接效率低，導致了內(nèi)含子保留。含保留內(nèi)含子的前mrna轉(zhuǎn)錄物保留在細胞核中而未向外輸出到細胞質(zhì)中。在底部圖片中詳細示出了對于ren細胞的內(nèi)含子37的讀數(shù)密度。

圖33示出了如實施例27所述，利用2′-o-measo(ps主鏈)，針對5’剪接位點下游緊鄰或3’剪接位點上游緊鄰的pkd1ivs37靶向序列進行的aso步移的圖示。將aso設計為通過一次移位5個核苷酸來覆蓋這些區(qū)域，除非在aso中存在一段四個鳥嘌呤。按比例繪制pkd1外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

圖34描繪了如實施例28所述的靶向內(nèi)含子37的aso步移的結(jié)果。在頂部，代表性凝膠示出了hek293(人胚腎上皮)細胞中用濃度為60nm的模擬處理的(c)、經(jīng)smn-對照aso處理的或如圖33所述靶向內(nèi)含子37的2′-o-measo處理的pkd1的放射性rt-pcr產(chǎn)物。來自2個獨立實驗的相對于β肌動蛋白歸一化的對應于pkd1產(chǎn)物的條帶量化以相對于模擬處理的產(chǎn)物的倍數(shù)變化繪制在下方的柱狀圖中。黑線指示比率為1，沒有變化。星號指示導致pkd1mrna水平增加最多的aso。

圖35示出了如實施例29所述，利用所示濃度的pkd1-ivs37aso處理hek293細胞而導致的pkd1基因表達水平以劑量依賴性方式的增加。來自hek293細胞的pkd1(內(nèi)含子37保留的和正確剪接的)和β肌動蛋白的放射性rt-pcr產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠上分離。左側(cè)柱狀圖證實了與模擬處理的細胞相比，相對于來自pkd1-ivs37+29aso處理的細胞的總轉(zhuǎn)錄物(內(nèi)含子37保留的和正確剪接的)所計算的內(nèi)含子保留百分比(pir)的劑量依賴性減少(兩個獨立實驗)。來自兩個獨立實驗的正確剪接的轉(zhuǎn)錄物水平相對于模擬處理的細胞的倍數(shù)變化繪制在中間的圖中，其示出了pkd1轉(zhuǎn)錄物水平的增加。進行rt-qpcr(右側(cè)柱狀圖)并將所得值相對于β肌動蛋白進行歸一化。以四個生物復制品相對于模擬處理的pkd1產(chǎn)物的倍數(shù)變化進行繪圖，確認了放射性rt-pcr結(jié)果并且示出了pkd1轉(zhuǎn)錄物水平的劑量依賴性增加。

圖36示出了如實施例30所述，經(jīng)由hek293細胞中所示濃度的pkd1-ivs37+29aso靶向而獲得的pkd1蛋白水平的增加。將hek293固定和透化處理，并用抗pkd1抗體或igg同種型對照進行處理。在每一種情況下針對10,000個處理的細胞進行流式細胞術(shù)分析，并對熒光強度進行繪圖。計算相對于模擬處理的(未轉(zhuǎn)染的)產(chǎn)物的倍數(shù)變化并將其繪制在下方的柱狀圖中，表明用pkd1-ivs37+29aso處理后pkd1水平的增加。

圖37示出了如實施例31所述，在ucsc基因組瀏覽器中顯現(xiàn)的，利用rna測序(rnaseq)鑒定ikbkap基因中的內(nèi)含子保留事件。頂部圖幅示出了對應于在arpe19、ast、原代人支氣管上皮細胞(bron)、hcn、ren和thle3細胞中表達且位于細胞質(zhì)(每一個細胞系的頂部)或細胞核部分(每一個細胞系的底部)中的pkd1轉(zhuǎn)錄物的讀數(shù)密度。在該幅圖的底部，按比例示出了ikbkap基因的所有參考序列同種型的圖示。讀數(shù)密度顯示為峰。最高的讀數(shù)密度對應于外顯子(黑框)，而對于任一細胞部分中的大多數(shù)內(nèi)含子(帶箭頭的線)均未觀察到讀數(shù)。與細胞質(zhì)部分相比，對于細胞核部分中的內(nèi)含子7和8檢測到較高的讀數(shù)密度(箭頭所指)，這表明這些內(nèi)含子的剪接效率低，導致了內(nèi)含子保留。含保留內(nèi)含子的前mrna轉(zhuǎn)錄物保留在細胞核中而未向外輸出到細胞質(zhì)中。在底部圖中詳細顯示了對于所有分析的細胞的內(nèi)含子7和8的讀數(shù)密度。

圖38分別示出了如實施例32所述，arpe-19、hela和u2os細胞系中的ikbkap內(nèi)含子7保留水平。從arpe-19、hela和u2os細胞中提取細胞核和細胞質(zhì)rna部分，并將它們相應的放射性rt-pcr產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠上分離。編號矩形表示外顯子，并且中間連線表示內(nèi)含子。結(jié)果示出了對應于三種細胞系的細胞核部分中的內(nèi)含子7保留的產(chǎn)物的條帶，該產(chǎn)物不存在于相應的細胞質(zhì)部分中。條帶的量化表明約35％的ikbkap轉(zhuǎn)錄物含有內(nèi)含子7并且表明該產(chǎn)物保留在細胞核中。再者，放射性rt-pcr結(jié)果驗證了生物信息學預測。右側(cè)表格中顯示了根據(jù)放射性rt-pcr以及rnaseq實驗按相對于總轉(zhuǎn)錄物(內(nèi)含子7保留的和正確剪接的)的內(nèi)含子保留百分比(pir)計算的ikbkap內(nèi)含子7保留的量化總結(jié)。

圖39示出了如實施例33所述，利用2′-o-measo(ps主鏈)，針對5’剪接位點下游緊鄰或3’剪接位點上游緊鄰的ikbkapivs7(頂部)和ivs8(底部)靶向序列進行的aso步移的圖示。將aso設計為通過一次移位5個核苷酸來覆蓋這些區(qū)域。按比例繪制ikbkap外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

圖40示出了如實施例34所述，經(jīng)由如圖39所示內(nèi)含子7(頂部)和8(底部)的特異性aso靶向而獲得的ikbkap基因表達水平的增加。從用濃度為60nm的模擬處理的、smn-對照aso處理的或每一種aso處理的arpe-19細胞中提取細胞質(zhì)rna。進行rt-qpcr以測量ikbkap表達水平，并將來自ikbkap的ct值相對于β肌動蛋白產(chǎn)物的相應ct值進行歸一化。以相對于模擬物處理產(chǎn)物的倍數(shù)變化進行繪圖。

圖41表明如實施例35所述，在用所示濃度的ikb-ivs7+26或ikb-ivs8-16aso或用各為45nm(總計90nm)的兩種aso的組合處理的細胞中，ikbkap轉(zhuǎn)錄物水平以劑量依賴性方式的增加。將利用來自arpe-19細胞的細胞質(zhì)rna的對應于外顯子6-8(ikb-ivs7+26，頂部)或外顯子8-10(ikb-ivs8-16，底部)的放射性rt-pcr產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠上分離。ikbkap的表達通過測量條帶強度予以量化，并將所述值相對于β-肌動蛋白的值進行歸一化。以相對于模擬處理的細胞的產(chǎn)物的來自兩個生物復制品的倍數(shù)變化進行繪圖，并且將其顯示在每個代表性凝膠右側(cè)的柱狀圖中。

圖42示出了如實施例36所述，在用所示濃度的ikb-ivs7+26或ikb-ivs8-16aso或用各為45nm(總計90nm)的兩種aso的組合處理的arpe19細胞中，ikap蛋白水平的劑量依賴性增加。從arpe-19細胞中提取蛋白質(zhì)裂解物并在4-20％sds-聚丙烯酰胺凝膠上分離。采用抗ikap和β連環(huán)蛋白的抗體來檢測分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。將ikap蛋白條帶的強度相對于β連環(huán)蛋白條帶的強度進行歸一化，并相對于模擬處理的細胞計算兩個生物復制品的倍數(shù)變化，并繪制在下方的柱狀圖中。

序列

本申請包括核苷酸序列seqidno:1-374，并且這些核苷酸序列在權(quán)利要求書之前的表2至表8和表11至表20中列出。表11至表20中以seqidno:1-102示出的核苷酸序列是可被反義寡聚體通過本文所述方法予以靶向的序列的實例。表2至表8中以seqidno:103-374示出的核苷酸序列是可用于本文所述方法的反義寡聚體的實例。在所有的表格中，大寫字母代表外顯子序列而小寫字母代表內(nèi)含子序列。

具體實施方式

百分之八十五(85％)的人類蛋白質(zhì)編碼基因具有至少一個內(nèi)含子；每個基因的內(nèi)含子的平均數(shù)目為八，且內(nèi)含子數(shù)目可在1至316的范圍內(nèi)。單獨的內(nèi)含子以不同的效率從初級轉(zhuǎn)錄物中剪接，并且在大多數(shù)情況下只有完全剪接的mrna才通過核孔輸出以供隨后在細胞質(zhì)中翻譯。在細胞核中可檢測到未剪接的及部分剪接的轉(zhuǎn)錄物。一般認為，未完全剪接的轉(zhuǎn)錄物的細胞核保留是防止細胞質(zhì)中可翻譯為蛋白質(zhì)的潛在有毒mrna的積累的機制。對于一些基因，在細胞質(zhì)中翻譯之前，最低效的內(nèi)含子的剪接是在基因表達中的轉(zhuǎn)錄后限速步驟。如果對于基因表達的細胞核階段限速的內(nèi)含子剪接可更有效地進行，則完全剪接的成熟mrna的穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生量以及相應蛋白質(zhì)的翻譯可增加。此類方法還將幫助上調(diào)靶基因的表達，它具有大量臨床和研究應用。增加基因的輸出(正常和/或突變等位基因)可用于補償減少其基因產(chǎn)物例如蛋白質(zhì)或功能rna的活性量的任何突變。許多遺傳病和遺傳失調(diào)是蛋白質(zhì)產(chǎn)生量減少或產(chǎn)生僅具有部分功能的蛋白質(zhì)的結(jié)果。

如本文所用，術(shù)語“包含”或其變化形式如“包括”或“含有”應理解為指示包含任何所述特征(例如在反義寡聚體的情況下，包含限定的核堿基序列)，但不排除任何其他特征。因此，如本文所用，術(shù)語“包含”是包含性的，并且不排除另外的未引用的特征(例如，在反義寡聚體的情況下，存在其他未述及的核堿基)。

在本文提供的任何組合物和方法的實施方案中，“包含”可以用“基本上由...組成”或“由...組成”代替。本文采用短語“基本上由...組成”來表示需要指定的特征(例如，核堿基序列)以及實質(zhì)上不影響要求保護的發(fā)明的特性或功能的那些特征。如本文所用，術(shù)語“由...組成”用來指示僅存在所述特征(例如，核堿基序列)(因此在由指定核堿基序列組成的反義寡聚體的情況下，排除其他未述及的核堿基的存在)。

核基因輸出的定向增加

本文描述了增加靶蛋白的表達的方法，其被稱為核基因輸出的定向增加(tango)。該方法包括使具有(包含)含保留內(nèi)含子的前mrna(ric前mrna)的細胞與互補于ric前mrna的靶向部分的反義寡聚體(aso)相接觸，該ric前mrna包含保留內(nèi)含子，位于5’剪接位點側(cè)翼的外顯子，位于3’剪接位點側(cè)翼的外顯子，并且編碼靶蛋白。aso與ric前mrna的所述部分的雜交導致在保留內(nèi)含子的剪接位點(5’剪接位點或3’剪接位點)處增強的剪接，并且隨后增加了靶蛋白產(chǎn)生量。

術(shù)語“前mrna”和“前mrna轉(zhuǎn)錄物”可互換使用，是指含有至少一個內(nèi)含子的任何前mrna種類。前mrna或前mrna轉(zhuǎn)錄物可包含5’-7-甲基鳥苷帽和/或聚a尾部。在一些實施方案中，前mrna轉(zhuǎn)錄物不包含5’-7-甲基鳥苷帽和/或聚a尾部。前mrna轉(zhuǎn)錄物在未被翻譯為蛋白質(zhì)(或從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中)時為非生產(chǎn)性的信使rna(mrna)分子。

如本文所用，“含保留內(nèi)含子的前mrna”(“ric前mrna”)是含有至少一個保留內(nèi)含子的前mrna轉(zhuǎn)錄物。該ric前mrna含有保留內(nèi)含子、位于該保留內(nèi)含子的5’剪接位點側(cè)翼的外顯子、位于該保留內(nèi)含子的3’剪接位點側(cè)翼的外顯子，并且該ric前mrna編碼靶蛋白?！皉ic前mrna編碼靶蛋白”被理解為當完全剪接時編碼靶蛋白?！氨Ａ魞?nèi)含子”是當由相同基因編碼的一個或多個其他內(nèi)含子如相鄰內(nèi)含子已經(jīng)從同一前mrna轉(zhuǎn)錄物中剪接掉時，存在于該前mrna轉(zhuǎn)錄物中的任何內(nèi)含子。在一些實施方案中，保留內(nèi)含子為編碼靶蛋白的ric前mrna中最豐富的內(nèi)含子。在實施方案中，保留內(nèi)含子為細胞中編碼靶蛋白的基因所轉(zhuǎn)錄的一群ric前mrna中最豐富的內(nèi)含子，其中該組ric前mrna包含兩個或更多個保留內(nèi)含子。在實施方案中，靶向編碼靶蛋白的ric前mrna群中最豐富的內(nèi)含子的反義寡聚體誘導將該群中兩個或更多個保留內(nèi)含子剪接掉，包括該反義寡聚體靶向或結(jié)合的保留內(nèi)含子。在實施方案中，由此產(chǎn)生編碼靶蛋白的成熟mrna。術(shù)語“成熟mrna”和“完全剪接的mrna”在本文可互換使用，以描述編碼靶蛋白的完全加工的mrna(例如，從細胞核輸出到細胞質(zhì)中并翻譯為靶蛋白的mrna)或完全加工的功能rna。術(shù)語“生產(chǎn)性mrna”還可以用來描述編碼靶蛋白的完全加工的mrna。

在一些實施方案中，所靶向的區(qū)域在保留內(nèi)含子中，該保留內(nèi)含子是編碼靶蛋白的ric前mrna中第二豐富的內(nèi)含子。例如，由于第二豐富的保留內(nèi)含子的核苷酸序列的獨特性，將aso設計為靶向特定核苷酸序列的便利性，和/或用aso靶向內(nèi)含子導致的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的增量，所以可以靶向第二豐富的保留內(nèi)含子而非最豐富的保留內(nèi)含子。在實施方案中，該保留內(nèi)含子為細胞中編碼靶蛋白的基因所轉(zhuǎn)錄的ric前mrna群中第二豐富的內(nèi)含子，其中該群ric前mrna包含兩個或更多個保留內(nèi)含子。在實施方案中，靶向編碼靶蛋白的該群ric前mrna中第二豐富的內(nèi)含子的反義寡聚體誘導將該群中的兩個或更多個保留內(nèi)含子剪接掉，包括該反義寡聚體靶向或結(jié)合的保留內(nèi)含子。在實施方案中，由此產(chǎn)生編碼靶蛋白的完全剪接(成熟)的mrna。

在實施方案中，反義寡聚體與ric前mrna中非保留內(nèi)含子內(nèi)的靶向區(qū)域互補。在實施方案中，ric前mrna的靶向部分在相對于該非保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6至+100區(qū)域內(nèi)；或在相對于該非保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-16至-100區(qū)域內(nèi)。在實施方案中，ric前mrna的靶向部分在相對于該非保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+100至相對于該非保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-100區(qū)域內(nèi)。在用來確定區(qū)域或序列的位置時，“在...內(nèi)”被理解為包括所述位置處的殘基。例如，+6至+100區(qū)域包括位置+6和+100處的殘基。在實施方案中，由此產(chǎn)生編碼靶蛋白的完全剪接(成熟)的mrna。

在一些實施方案中，ric前mrna的保留內(nèi)含子是低效剪接的內(nèi)含子。如本文所用，“低效剪接”可指與ric前mrna中另一剪接位點處的剪接頻率相比，與保留內(nèi)含子相鄰的剪接位點(5’剪接位點或3’剪接位點)處相對低頻率的剪接。術(shù)語“低效剪接”還可以指剪接位點處剪接的相對速率或動力學，其中“低效剪接的”內(nèi)含子可以在與ric前mrna中另一內(nèi)含子相比較慢的速率下被剪接或去除。

在一些實施方案中，在位于5’剪接位點側(cè)翼的外顯子的-3e至-1e和保留內(nèi)含子的+1至+6處的9-核苷酸序列與相應的野生型序列相同。在一些實施方案中，在保留內(nèi)含子的-15至-1和位于3’剪接位點側(cè)翼的外顯子的+1e處的16核苷酸序列與相應的野生型序列相同。如本文所用，“野生型序列”是指在ncbi生物和科學信息儲存庫(由nationalcenterforbiotechnologyinformation,nationallibraryofmedicine,8600rockvillepike,bethesda,mdusa20894運行)中登錄的公開參考基因組中的靶基因的核苷酸序列。如本文所用，用“e”表示的核苷酸位置表示該核苷酸存在于外顯子的序列中(例如，位于5’剪接位點側(cè)翼的外顯子或位于3’剪接位點側(cè)翼的外顯子)。

所述方法包括使細胞接觸與編碼靶蛋白或功能rna的前mrna的一部分互補的aso，從而導致靶蛋白或功能rna的表達增加。如本文所用，“接觸”或施用于細胞是指提供與該細胞緊鄰的aso從而使得aso與細胞相互作用的任何方法。與aso接觸的細胞將該aso吸收或轉(zhuǎn)運到該細胞中。所述方法包括使病況或疾病相關(guān)或病況或疾病有關(guān)的細胞與本文描述的任何aso相接觸。在一些實施方案中，該aso可以進一步修飾或附接(例如，共價附接)到另一分子，以將該aso靶向至細胞類型，增強該aso與病況或疾病相關(guān)或病況或疾病有關(guān)的細胞之間的接觸，或增強該aso的吸收。

如圖2a所示，在細胞核中，由外顯子和內(nèi)含子組成的前mrna轉(zhuǎn)錄物經(jīng)歷剪接，以生成可從該細胞的細胞核輸出到細胞質(zhì)中的mrna，在細胞質(zhì)中它被翻譯為蛋白質(zhì)。在含有至少一個低效剪接內(nèi)含子(保留內(nèi)含子)的前mrna轉(zhuǎn)錄物的實例中，存在ric前mrna，它被保持在細胞核中，并且如果它被輸出到細胞質(zhì)則不翻譯為蛋白質(zhì)而是降解。不希望受到任何特定理論的束縛，在與前mrna轉(zhuǎn)錄物的靶向部分互補的aso的存在下，保留內(nèi)含子的剪接得到增強，從而也增加了可輸出并翻譯為蛋白質(zhì)的mrna的量(圖2b)。

如本文所用，術(shù)語“增加蛋白質(zhì)產(chǎn)生量”或“增加靶蛋白的表達”意指增加細胞中由mrna翻譯的蛋白質(zhì)(例如，靶蛋白)的量。“靶蛋白”可以是需要增加表達/產(chǎn)生量的任何蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，該靶蛋白是疾病相關(guān)蛋白質(zhì)，如表1中示出的任何蛋白質(zhì)。例如，使表達ric前mrna的細胞接觸與ric前mrna轉(zhuǎn)錄物的靶向部分互補的aso導致由該前mrna編碼的蛋白質(zhì)(例如，靶蛋白)的量有可測得的增加。測量或檢測蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且包括例如蛋白質(zhì)印跡法、流式細胞術(shù)、免疫熒光顯微術(shù)和elisa。

在一些實施方案中，使細胞接觸與ric前mrna轉(zhuǎn)錄物的靶向部分互補的aso，與在不存在該aso/不存在處理的情況下由細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量相比，導致所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(例如，靶蛋白)的量增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％。在實施方案中，與對照化合物產(chǎn)生的靶蛋白的量相比，該反義寡聚體所接觸的細胞產(chǎn)生的靶蛋白的總量增加至約1.1倍至約10倍、約1.5倍至約10倍、約2倍至約10倍、約3倍至約10倍、約4倍至約10倍、約1.1倍至約5倍、約1.1倍至約6倍、約1.1倍至約7倍、約1.1倍至約8倍、約1.1倍至約9倍、約2倍至約5倍、約2倍至約6倍、約2倍至約7倍、約2倍至約8倍、約2倍至約9倍、約3倍至約6倍、約3倍至約7倍、約3倍至約8倍、約3倍至約9倍、約4倍至約7倍、約4倍至約8倍、約4倍至約9倍，至少約1.1倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍或至少約10倍。對照化合物可以是例如不與ric前mrna的靶向部分互補的寡核苷酸。

在一些實施方案中，使細胞與互補于ric前mrna轉(zhuǎn)錄物的靶向部分的aso相接觸導致編碼靶蛋白或功能rna的mrna(包括編碼該靶蛋白或功能rna的成熟mrna)的量增加。在一些實施方案中，與在不存在該aso/不存在處理的情況下由細胞所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量相比，編碼靶蛋白或功能rna的mrna或編碼靶蛋白或功能rna的成熟mrna的量增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％。在實施方案中，與未處理的細胞例如未處理的細胞或用對照化合物處理的細胞中產(chǎn)生的成熟rna的量相比，在反義寡聚體所接觸的細胞中產(chǎn)生的編碼靶蛋白或功能rna的mrna或編碼靶蛋白或功能rna的成熟mrna的總量增加至約1.1倍至約10倍、約1.5倍至約10倍、約2倍至約10倍、約3倍至約10倍、約4倍至約10倍、約1.1倍至約5倍、約1.1倍至約6倍、約1.1倍至約7倍、約1.1倍至約8倍、約1.1倍至約9倍、約2倍至約5倍、約2倍至約6倍、約2倍至約7倍、約2倍至約8倍、約2倍至約9倍、約3倍至約6倍、約3倍至約7倍、約3倍至約8倍、約3倍至約9倍、約4倍至約7倍、約4倍至約8倍、約4倍至約9倍，至少約1.1倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍或至少約10倍。對照化合物可以是例如不與ric前mrna的靶向部分互補的寡核苷酸。

在實施方案中，使細胞與互補于ric前mrna轉(zhuǎn)錄物的靶向部分的aso相接觸導致功能rna的量增加。在一些實施方案中，與在不存在aso/不存在處理的情況下由細胞所產(chǎn)生的功能rna的量相比，功能rna的量增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％。在實施方案中，與未處理的細胞例如未處理的細胞或用對照化合物處理的細胞中產(chǎn)生的功能rna的量相比，該反義寡聚體所接觸的細胞中產(chǎn)生的功能rna的總量增加至約1.1倍至約10倍、約1.5倍至約10倍、約2倍至約10倍、約3倍至約10倍、約4倍至約10倍、約1.1倍至約5倍、約1.1倍至約6倍、約1.1倍至約7倍、約1.1倍至約8倍、約1.1倍至約9倍、約2倍至約5倍、約2倍至約6倍、約2倍至約7倍、約2倍至約8倍、約2倍至約9倍、約3倍至約6倍、約3倍至約7倍、約3倍至約8倍、約3倍至約9倍、約4倍至約7倍、約4倍至約8倍、約4倍至約9倍，至少約1.1倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍或至少約10倍。對照化合物可以是例如不與ric前mrna的靶向部分互補的寡核苷酸。可利用本文提供的任何方法來增加功能rna，例如不編碼蛋白質(zhì)的mrna如非蛋白質(zhì)編碼rna的產(chǎn)生量。在一些實施方案中，功能rna或非蛋白質(zhì)編碼rna與病況例如疾病或病癥相關(guān)。

保留內(nèi)含子從ric前mrna中的組成性剪接

本文提供的方法和反義寡核苷酸組合物可用于通過增加編碼靶蛋白或功能rna的mrna或編碼靶蛋白或功能rna的成熟mrna的水平，來增加例如在具有由該靶蛋白或功能rna的量或活性缺陷引起的病況的受試者的細胞中靶蛋白或功能rna的表達。特別地，本文所述的方法和組合物誘導保留內(nèi)含子從編碼靶蛋白或功能rna的ric前mrna轉(zhuǎn)錄物中的組成性剪接，從而增加編碼該靶蛋白或功能rna的mrna，或編碼該靶蛋白或功能rna的成熟mrna的水平，并增加該靶蛋白或功能rna的表達。

保留內(nèi)含子從ric前mrna中的組成性剪接將該保留內(nèi)含子從該ric前mrna中正確地去除，其中該保留內(nèi)含子具有野生型剪接序列。如本文所用，組成性剪接不包括保留內(nèi)含子從由具有以下突變的基因或等位基因轉(zhuǎn)錄的ric前mrna中的剪接，該突變引起由該基因或等位基因轉(zhuǎn)錄的前mrna的其它剪接或異常剪接。例如，利用本文提供的方法和反義寡核苷酸誘導的保留內(nèi)含子的組成性剪接并不校正前mrna中的異常剪接或并不影響前mrna的其它剪接，以導致靶蛋白或功能rna的表達增加。

在實施方案中，組成性剪接將保留內(nèi)含子從ric前mrna中正確地去除，其中該ric前mrna由野生型基因或等位基因或編碼完全功能性靶蛋白或功能rna的多態(tài)性基因或等位基因轉(zhuǎn)錄，并且其中該基因或等位基因不具有引起該保留內(nèi)含子的其它剪接或異常剪接的突變。

在一些實施方案中，保留內(nèi)含子從編碼靶蛋白或功能rna的ric前mrna中的組成性剪接將保留內(nèi)含子從編碼該靶蛋白或功能rna的ric前mrna中正確地去除，其中該ric前mrna由基因或等位基因轉(zhuǎn)錄，該基因或等位基因與由野生型等位基因產(chǎn)生相比以降低的水平產(chǎn)生靶基因或功能rna，并且其中該基因或等位基因不具有引起該保留內(nèi)含子的其它剪接或異常剪接的突變。在這些實施方案中，當與對應的野生型蛋白或功能rna相比時，組成性剪接的保留內(nèi)含子的正確去除導致功能性的靶蛋白或功能rna的產(chǎn)生。

在其他實施方案中，組成性剪接將保留內(nèi)含子從ric前mrna中正確地去除，其中該ric前mrna由基因或等位基因轉(zhuǎn)錄，該基因或等位基因編碼與對應的野生型蛋白或功能rna相比以功能降低的形式產(chǎn)生的靶蛋白或功能rna，并且其中該基因或等位基因不具有引起該保留內(nèi)含子的選擇性剪接或異常剪接的突變。在這些實施方案中，當與對應的野生型蛋白或功能rna相比時，組成性剪接的保留內(nèi)含子的正確去除導致部分功能性的靶蛋白或部分功能性的功能rna的產(chǎn)生。

通過組成性剪接“正確去除”保留內(nèi)含子是指去除整個內(nèi)含子，而不去除外顯子的任何部分。

在實施方案中，本文描述的或在任何本文所述方法中使用的反義寡聚體并不是通過調(diào)節(jié)由編碼功能rna或靶蛋白的基因轉(zhuǎn)錄的前mrna的其它剪接或異常剪接來增加編碼該靶蛋白或功能rna的mrna的量、該靶蛋白的量或該功能rna的量?？梢岳萌魏我阎姆治鰎na種類的序列和長度的方法，例如，通過rt-pcr以及使用本文別處和文獻中描述的方法，來測量其它剪接或異常剪接的調(diào)節(jié)。在實施方案中，根據(jù)所剪接的感興趣種類的量增加或減少至少10％或至1.1倍來確定其它或異常剪接的調(diào)節(jié)。在實施方案中，如本文關(guān)于在本發(fā)明的方法中測定編碼靶蛋白或功能rna的mrna的增加所描述的，根據(jù)增加或減少至少10％至100％或至1/1.1至1/10的水平來確定調(diào)節(jié)。

在實施方案中，所述方法是一種通過部分剪接野生型前mrna而產(chǎn)生ric前mrna的方法。在實施方案中，該方法是一種通過部分剪接野生型前mrna而產(chǎn)生ric前mrna的方法。在實施方案中，該ric前mrna由全長前mrna的部分剪接而產(chǎn)生。在這些實施方案中，與具有野生型剪接位點序列的保留內(nèi)含子的剪接相比，全長前mrna可在保留內(nèi)含子的剪接位點處具有不損害保留內(nèi)含子的正確剪接的多態(tài)性。

在實施方案中，編碼靶蛋白或功能rna的mrna是全長成熟mrna或野生型成熟mrna。在這些實施方案中，與由野生型成熟mrna編碼的靶蛋白或功能rna的活性相比，全長成熟mrna可具有不影響由成熟mrna編碼的靶蛋白或功能rna的活性的多態(tài)性。

反義寡聚體

本公開內(nèi)容的一方面是包含通過與ric前mrna的靶向部分結(jié)合而加強剪接的反義寡聚體的組合物。如本文所用，術(shù)語“aso”和“反義寡聚體”可互換使用，并指包含核堿基的寡聚體如多核苷酸，該寡聚體通過watson-crick堿基配對或擺動堿基配對(g-u)與靶核酸(例如，ric前mrna)序列雜交。aso可具有互補于靶序列的確切序列或近似的互補性(例如，足以結(jié)合靶序列和加強剪接位點處的剪接的互補性)。將aso設計為使得它們與靶核酸(例如，前mrna轉(zhuǎn)錄物的靶向部分)結(jié)合(雜交)并在生理條件下保持雜交。通常，如果它們與預期(靶向)核酸序列之外的位點雜交，則它們與有限數(shù)目的非靶核酸的序列(一些非靶核酸的位點)雜交。aso的設計可以考慮前mrna轉(zhuǎn)錄物的靶向部分的核酸序列，或基因組或細胞前mrna或轉(zhuǎn)錄物組中其他位置中的足夠類似的核酸序列的存在，使得aso將結(jié)合其他位點并引起“脫靶”效應的可能性有限。本領(lǐng)域已知的，例如在作為wo2015/035091公開的名稱為“reducingnonsense-mediatedmrnadecay”的pct申請?zhí)杙ct/us2014/054151中的任何反義寡聚體可用來實施本文所述的方法。

在一些實施方案中，aso與靶核酸或ric前mrna的靶向部分“特異性雜交”或?qū)ζ錇椤疤禺惖摹?。通常，此類雜交的發(fā)生伴隨著基本大于37℃，優(yōu)選至少50℃，并且通常為60℃至約90℃的tm。這樣的雜交優(yōu)選對應于嚴格的雜交條件。在給定的離子強度和ph下，tm為50％的靶序列與互補寡核苷酸雜交時的溫度。

當雜交在兩個單鏈多核苷酸之間的反平行結(jié)構(gòu)中發(fā)生時，寡聚體如寡核苷酸彼此“互補”。如果雜交可在第一多核苷酸的一條鏈與第二多核苷酸之間發(fā)生，則雙鏈多核苷酸可與另一個多核苷酸“互補”?；パa性(一個多核苷酸與另一個互補的程度)是按照在相對鏈中根據(jù)普遍接受的堿基配對原則預計彼此形成氫鍵的堿基的比例(例如，百分比)而可量化的。反義寡聚體(aso)的序列不必與其靶核酸的序列100％互補才能雜交。在某些實施方案中，aso可包含與其靶向的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)域至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列互補性。例如，寡聚體化合物的20個核堿基中的18個與靶區(qū)域互補并將因此特異性雜交的aso將表現(xiàn)出90％的互補性。在該實例中，其余非互補的核堿基可與互補的核堿基聚集在一起或散布，并且不必彼此相接或與互補的核堿基相接。常規(guī)地可利用blast程序(基本局部比對檢索工具)和本領(lǐng)域已知的powerblast程序(altschul等人,j.mol.biol.,1990,215,403-410；zhang和madden,genomeres.,1997,7,649-656)來確定aso與靶核酸的區(qū)域的互補性百分比。

aso不需要與靶序列中的所有核堿基雜交，并且與之雜交的核堿基可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。aso可以在前mrna轉(zhuǎn)錄物的一個或多個區(qū)段上雜交，使得介于中間或相鄰的區(qū)段不參與該雜交事件(例如，可形成環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。在某些實施方案中，aso與靶前mrna轉(zhuǎn)錄物中不連續(xù)的核堿基雜交。例如，aso可以與前mrna轉(zhuǎn)錄物中被不與aso雜交的一個或多個核堿基隔開的核堿基雜交。

本文所述的aso包含與在ric前mrna的靶部分中存在的核堿基互補的核堿基。術(shù)語aso包括寡核苷酸以及任何其他包含能夠與靶mrna上的互補核堿基雜交的核堿基但不包含糖部分如肽核酸(pna)的寡聚體分子。aso可包含天然存在的核苷酸、核苷酸類似物、修飾的核苷酸或前述兩個或三個的任意組合。術(shù)語“天然存在的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。術(shù)語“修飾的核苷酸”包括具有修飾的或取代的糖基團和/或具有修飾的主鏈的核苷酸。在一些實施方案中，aso的所有核苷酸是修飾的核苷酸。與本文所述的方法和組合物相容的aso的化學修飾或aso的組分對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并且可在例如第8,258,109b2號美國專利、第5,656,612號美國專利、第2012/0190728號美國專利公開以及dias和stein,mol.cancerther.2002,1,347-355中找到，其均通過引用它們的全文并入本文。

aso的核堿基可以是任何天然存在的、未修飾的核堿基如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，或任何合成或修飾的核堿基，其十分類似于未修飾的核堿基，使得其與靶前mrna上存在的核堿基能夠氫鍵鍵合。修飾的核堿基的實例包括但不限于次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5,6-二氫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。

本文所述的aso還包含連接寡聚體的組分的主鏈結(jié)構(gòu)。術(shù)語“主鏈結(jié)構(gòu)”和“寡聚體連接”可互換使用并指該aso的單體之間的連接。在天然存在的寡核苷酸中，主鏈包含連接寡聚體的糖部分的3’-5’磷酸二酯鍵。本文所述的aso的主鏈結(jié)構(gòu)或寡聚體連接可包括(但不限于)硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、氨基磷酸酯(phosphoramidate)等。參見，例如laplanche等人nucleicacidsres.14:9081(1986)；stec等人j.am.chem.soc.106:6077(1984)，stein等人nucleicacidsres.16:3209(1988)，zon等人anticancerdrugdesign6:539(1991)；zon等人oligonucleotidesandanalogues:apracticalapproach,第87-108頁(f.eckstein編著,oxforduniversitypress,oxfordengland(1991))；stec等人,第5,151,510號美國專利；uhlmannandpeymanchemicalreviews90:543(1990)。在一些實施方案中，aso的主鏈結(jié)構(gòu)不含有磷而含有肽鍵，例如在肽核酸(pna)中，或含有連接基團，包括氨基甲酸酯、酰胺以及直鏈烴基團和環(huán)狀烴基團。在一些實施方案中，主鏈修飾是硫代磷酸酯鍵。在一些實施方案中，主鏈修飾是氨基磷酸酯鍵。

本文所述的任何aso可含有包含如天然存在的核苷酸中存在的核糖或脫氧核糖的糖部分，或含有包括嗎啉環(huán)在內(nèi)的經(jīng)修飾的糖部分或糖類似物。經(jīng)修飾的糖部分的非限制性實例包括2'取代，如2'-o-甲基(2'-o-me)、2'-o-甲氧乙基(2'moe)、2'-o-氨基乙基、2'f；n3’->p5’氨基磷酸酯、2'二甲基氨氧基乙氧基、2'二甲基氨基乙氧基乙氧基、2'-胍、2'-o-胍乙基、氨基甲酸酯修飾的糖和雙環(huán)修飾的糖。在一些實施方案中，該糖部分修飾選自2′-o-me、2’f和2’moe。在一些實施方案中，該糖部分修飾是額外的橋鍵，如在鎖定核酸(lna)中。在一些實施方案中，該糖類似物含有嗎啉環(huán)，如磷二酰胺嗎啉基(pmo)。在一些實施方案中，該糖部分包含呋喃核糖基或2’呋喃脫氧核糖基修飾。在一些實施方案中，該糖部分包含2’4’-約束的2’o-甲氧乙基(cmoe)修飾。在一些實施方案中，該糖部分包含cet2’,4’約束的2’o-乙基bna修飾。在一些實施方案中，該糖部分包含三環(huán)dna(tcdna)修飾。在一些實施方案中，該糖部分包含乙烯核酸(ena)修飾。在一些實施方案中，該糖部分包含mce修飾。修飾是本領(lǐng)域已知的并且描述在文獻中，例如，jarver等人,2014,“achemicalviewofoligonucleotidesforexonskippingandrelateddrugapplications,”nucleicacidtherapeutics24(1):37-47，其通過引用并入本文用于此目的。

在一些實例中，aso的每個單體以相同的方式修飾，例如aso的主鏈的每個連接包含硫代磷酸酯鍵或每個核糖糖部分包含2’o-甲基修飾。存在于aso的每個單體組分上的此類修飾被稱為“均一修飾”。在一些實例中，可能需要不同修飾的組合，例如，aso可包含磷二酰胺鍵和含有嗎啉環(huán)(嗎啉基)的糖部分的組合。aso的不同修飾的組合被稱為“混合修飾”或“混合化學”。

在一些實施方案中，所述aso包含一個或多個主鏈修飾。在一些實施方案中，該aso包含一個或多個糖部分修飾。在一些實施方案中，該aso包含一個或多個主鏈修飾和一個或多個糖部分修飾。在一些實施方案中，該aso包含2’moe修飾和硫代磷酸酯主鏈。在一些實施方案中，該aso包含磷二酰胺嗎啉基(pmo)。在一些實施方案中，該aso包含肽核酸(pna)。本文所述的任何aso或aso的任何組分(例如，核堿基、糖部分、主鏈)均可進行修飾，以便獲得aso的所需性質(zhì)或活性或減少aso的不需要的性質(zhì)或活性。例如，aso或任何aso的一個或多個組分可被修飾為增強與前mrna轉(zhuǎn)錄物上靶序列的結(jié)合親和力；減少與任何非靶序列的結(jié)合；減少被細胞核酸酶(即，核糖核酸酶h)的降解；改善aso向細胞中和/或向細胞的細胞核中的吸收；改變aso的藥代動力學或藥效學；以及調(diào)節(jié)aso的半衰期。

在一些實施方案中，所述aso由2'-o-(2-甲氧乙基)(moe)硫代磷酸酯修飾的核苷酸組成。由此類核苷酸組成的aso尤其適合于本文公開的方法；具有此類修飾的寡聚體已顯示出具有顯著增強的對核酸酶降解的抗性和增加的生物利用度，使得它們適合于例如在本文所述的一些實施方案中的口服遞送。參見，例如，geary等人,jpharmacolexpther.2001；296(3):890-7；geary等人,jpharmacolexpther.2001；296(3):898-904。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉合成aso的方法。備選地或另外地，aso可從商業(yè)來源獲得。

除非另有規(guī)定，否則單鏈核酸(例如，前mrna轉(zhuǎn)錄物、寡核苷酸、aso等)序列的左手端為5’端，并且單鏈或雙鏈核酸序列的左手方向被稱為5’方向。類似地，核酸序列(單鏈或雙鏈)的右手端或右手方向為3’端或3’方向。通常，核酸中5’到參考點的區(qū)域或序列被稱為“上游”，而核酸中3’到參考點的區(qū)域或序列被稱為“下游”。通常，mrna的5’方向或5’端是啟動或起始密碼子所處的位置，而3’端或3’方向是終止密碼子所處的位置。在一些方面，在核酸中參考點上游的核苷酸可以用負數(shù)加以標明，而在參考點下游的核苷酸則可以用正數(shù)加以標明。例如，參考點(例如，mrna中的外顯子-外顯子接合點)可標為“零”點，并且直接相鄰且在該參考點上游的核苷酸標為“負一”，例如，“-1”，而直接相鄰且在該參考點下游的核苷酸標為“正一”，例如，“+1”。

在其他實施方案中，所述aso互補于(且結(jié)合)在ric前mrna中保留內(nèi)含子的5’剪接位點下游(在3’方向)的ric前mrna的靶向部分(例如，相對于5’剪接位點的以正數(shù)標明的方向)(圖1)。在一些實施方案中，該aso互補于在相對于保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6至+100區(qū)域內(nèi)的ric前mrna的靶向部分。在一些實施方案中，該aso不互補于相對于5’剪接位點的+1至+5核苷酸(位于5’剪接位點下游的前五個核苷酸)。在一些實施方案中，該aso可互補于在相對于保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6至+50之間核苷酸區(qū)域內(nèi)的ric前mrna的靶向部分。在一些方面，該aso互補于在相對于保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6至+90、+6至+80、+6至+70、+6至+60、+6至+50、+6至+40、+6至+30或+6至+20區(qū)域內(nèi)的靶向部分。

在一些實施方案中，該aso互補于在ric前mrna中保留內(nèi)含子的3’剪接位點上游(5’相對的)的ric前mrna的靶向部分(例如，在以負數(shù)標明的方向)(圖1)。在一些實施方案中，該aso互補于在相對于保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-16至-100區(qū)域內(nèi)的ric前mrna的靶向部分。在一些實施方案中，該aso不互補于相對于3’剪接位點的-1至-15核苷酸(位于3’剪接位點上游的前15個核苷酸)。在一些實施方案中，該aso互補于在相對于保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-16至-50區(qū)域內(nèi)的ric前mrna的靶向部分。在一些方面，該aso互補于在相對于保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-16至-90、-16至-80、-16至-70、-16至-60、-16至-50、-16至-40或-16至-30區(qū)域內(nèi)的靶向部分。

在實施方案中，ric前mrna的靶向部分在相對于保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+100至相對于保留內(nèi)含子的3’剪接位點的-100的區(qū)域內(nèi)。

在一些實施方案中，所述aso互補于在保留內(nèi)含子的5’剪接位點側(cè)翼(上游)的外顯子內(nèi)的ric前mrna的靶向部分(圖1)。在一些實施方案中，該aso互補于在保留內(nèi)含子的5’剪接位點側(cè)翼的外顯子中+2e至-4e區(qū)域內(nèi)的ric前mrna的靶向部分。在一些實施方案中，該aso不互補于相對于保留內(nèi)含子的5’剪接位點的-1e至-3e核苷酸。在一些實施方案中，該aso互補于在相對于保留內(nèi)含子的5’剪接位點的-4e至-100e、-4e至-90e、-4e至-80e、-4e至-70e、-4e至-60e、-4e至-50e、-4至-40e、-4e至-30e或-4e至-20e區(qū)域內(nèi)的ric前mrna的靶向部分。

在一些實施方案中，該aso互補于在保留內(nèi)含子的3’剪接位點側(cè)翼(下游)的外顯子內(nèi)的ric前mrna的靶向部分(圖1)。在一些實施方案中，該aso互補于在保留內(nèi)含子的3’剪接位點側(cè)翼的外顯子中+2e至-4e區(qū)域內(nèi)的ric前mrna的靶向部分。在一些實施方案中，該aso不互補于相對于保留內(nèi)含子的3’剪接位點的+1e核苷酸。在一些實施方案中，該aso互補于在相對于保留內(nèi)含子的3’剪接位點的+2e至+100e、+2e至+90e、+2e至+80e、+2e至+70e、+2e至+60e、+2e至+50e、+2e至+40e、+2e至+30e或+2至+20e區(qū)域內(nèi)的ric前mrna的靶向部分。該aso可以是適合于特異性結(jié)合和有效加強剪接的任何長度。在一些實施方案中，該aso由8至50個核堿基組成。例如，該aso的長度可以為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45或50個核堿基。在一些實施方案中，該aso由多于50個核堿基組成。在一些實施方案中，該aso的長度為8至50個核堿基、8至40個核堿基、8至35個核堿基、8至30個核堿基、8至25個核堿基、8至20個核堿基、8至15個核堿基、9至50個核堿基、9至40個核堿基、9至35個核堿基、9至30個核堿基、9至25個核堿基、9至20個核堿基、9至15個核堿基、10至50個核堿基、10至40個核堿基、10至35個核堿基、10至30個核堿基、10至25個核堿基、10至20個核堿基、10至15個核堿基、11至50個核堿基、11至40個核堿基、11至35個核堿基、11至30個核堿基、11至25個核堿基、11至20個核堿基、11至15個核堿基、12至50個核堿基、12至40個核堿基、12至35個核堿基、12至30個核堿基、12至25個核堿基、12至20個核堿基、12至15個核堿基、13至50個核堿基、13至40個核堿基、13至35個核堿基、13至30個核堿基、13至25個核堿基、13至20個核堿基、14至50個核堿基、14至40個核堿基、14至35個核堿基、14至30個核堿基、14至25個核堿基、14至20個核堿基、15至50個核堿基、15至40個核堿基、15至35個核堿基、15至30個核堿基、15至25個核堿基、15至20個核堿基、20至50個核堿基、20至40個核堿基、20至35個核堿基、20至30個核堿基、20至25個核堿基、25至50個核堿基、25至40個核堿基、25至35個核堿基或25至30個核堿基。在一些實施方案中，該aso的長度為18個核苷酸。在一些實施方案中，該aso的長度為15個核苷酸。在一些實施方案中，該aso的長度為25個核苷酸。

在一些實施方案中，使用具有不同化學但與ric前mrna的相同靶向部分互補的兩個或更多個aso。在一些實施方案中，使用與ric前mrna的不同靶向部分互補的兩個或更多個aso。

在實施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸經(jīng)化學連接至一個或多個部分或綴合物，例如，增強該寡核苷酸的活性或細胞吸收的靶向部分或其他綴合物。此類部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如，膽固醇部分、膽固醇基部分、脂肪鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基、多胺或聚乙二醇鏈或金剛烷乙酸。在公開的文獻中已描述了包含親脂性部分的寡核苷酸和制備方法。在實施方案中，該反義寡核苷酸與某部分綴合，該部分包括但不限于無堿基核苷酸、聚醚、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物，例如，n-乙酰半乳糖胺(galnac)、n-ac-葡糖胺(glunac)或甘露糖(例如，甘露糖-6-磷酸酯)、脂質(zhì)或聚烴化合物。如本領(lǐng)域理解的和文獻中描述的，例如可使用連接體將綴合物與構(gòu)成反義寡核苷酸的任何核苷酸中的一個或多個在糖、堿基或磷酸基團上若干位置的任何一處連接。連接體可包括二價或三價分支連接體。在實施方案中，該綴合物附接至該反義寡核苷酸的3’端。制備寡核苷酸綴合物的方法描述在例如第8,450,467號美國專利，“carbohydrateconjugatesasdeliveryagentsforoligonucleotides”中，其通過引用并入本文。

在一些實施方案中，被aso靶向的核酸是在細胞如真核細胞中表達的ric前mrna。在一些實施方案中，術(shù)語“細胞”可指細胞群體。在一些實施方案中，該細胞在受試者中。在一些實施方案中，該細胞從受試者中分離。在一些實施方案中，該細胞是離體的。在一些實施方案中，該細胞是病況或疾病有關(guān)的細胞或細胞系。在一些實施方案中，該細胞在體外(例如，在細胞培養(yǎng)物中)。

藥物組合物

包含所述組合物的反義寡核苷酸且用于任何所述方法的藥物組合物或制劑可根據(jù)制藥工業(yè)中公知的和公開文獻中描述的常規(guī)技術(shù)進行制備。在實施方案中，用于治療受試者的藥物組合物或制劑包含有效量的上述任何反義寡聚體，或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或酯，以及藥學上可接受的稀釋劑。藥物制劑的反義寡聚體可進一步包含藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。

藥學上可接受的鹽適用于與人和低等動物的組織相接觸而沒有不當?shù)亩拘浴⒋碳?、變態(tài)反應等，并且對應合理的受益/風險比。參見，例如，s.m.berge等人,j.pharmaceuticalsciences,66:1-19(1977)，其通過引用并入本文用于此目的。所述鹽可以在化合物的最終分離和純化期間原位制備，或通過使游離堿官能與合適的有機酸反應予以單獨制備。藥學上可接受的、無毒的酸加成鹽的實例是氨基基團與無機酸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或與有機酸如乙酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸所形成的鹽，或通過利用其他記錄的方法如離子交換形成的鹽。其他藥學上可接受的鹽包括己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一酸鹽、戊酸鹽等。代表性的堿金屬或堿土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂鹽等。視情況而定，另外的藥學上可接受的鹽包括利用抗衡離子如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低級烷基磺酸根和芳基磺酸根與銨、季銨和胺陽離子形成的無毒鹽。

在實施方案中，將組合物配制為許多可能劑型中的任何一種，例如但不限于片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。在實施方案中，將組合物在水性、非水性或混合介質(zhì)中配制為懸浮液。水性懸浮液可進一步含有增加該懸浮液的粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。該懸浮液還可以含有穩(wěn)定劑。在實施方案中，本發(fā)明的藥物制劑或組合物包括但不限于溶液、乳液、微乳液、泡沫或含脂質(zhì)體的制劑(例如，陽離子型或非陽離子型脂質(zhì)體)。

本發(fā)明的藥物組合物或制劑可包含視情況而定的且本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的或公開文獻中描述的一種或多種滲透促進劑、載體、賦形劑或其他活性或非活性成分。在實施方案中，脂質(zhì)體還包括空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體，例如，包含一種或多種特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體。這些特化脂質(zhì)導致具有延長的循環(huán)壽命的脂質(zhì)體。在實施方案中，空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體包含一種或多種糖酯，或用一種或多種親水性聚合物如聚乙二醇(peg)部分來衍生。在實施方案中，所述藥物制劑或組合物中包含表面活性劑。在藥物產(chǎn)品、制劑和乳液中使用表面活性劑是本領(lǐng)域公知的。在實施方案中，本發(fā)明采用滲透促進劑來實現(xiàn)反義寡核苷酸的有效遞送，例如，以幫助跨細胞膜的擴散和/或加強親脂性藥物的滲透性。在實施方案中，該滲透促進劑是表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑或非螯合非表面活性劑。

在實施方案中，所述藥物制劑包含多種反義寡核苷酸。在實施方案中，該反義寡核苷酸與另一種藥物或治療劑聯(lián)合施用。在實施方案中,該反義寡核苷酸通過本領(lǐng)域已知的任何方法與能夠促進該反義寡核苷酸跨越血腦屏障滲透的一種或多種藥劑一起施用。例如，在第6,632,427號美國專利，"adenoviral-vector-mediatedgenetransferintomedullarymotorneurons"中描述了通過將腺病毒載體施用于肌肉組織中的運動神經(jīng)元來遞送藥劑，其通過引用并入本文。例如，在第6,756,523號美國專利，"adenovirusvectorsforthetransferofforeigngenesintocellsofthecentralnervoussystemparticularlyinbrain"中描述了將載體直接遞送至腦，例如，紋狀體、丘腦、海馬體或黑質(zhì)體，其通過引用并入本文。

在實施方案中，所述反義寡核苷酸與提供所需藥物或藥效學性質(zhì)的藥劑連接或綴合。在實施方案中，該反義寡核苷酸與本領(lǐng)域已知的物質(zhì)例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體偶聯(lián)以促進跨越血腦屏障的滲透或轉(zhuǎn)運。在實施方案中，該反義寡核苷酸與病毒載體連接，例如，以使該反義化合物更有效或增加跨越血腦屏障的轉(zhuǎn)運。在實施方案中，通過輸注糖，例如內(nèi)消旋赤蘚醇、木糖醇、d(+)半乳糖、d(+)乳糖、d(+)木糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、l(-)果糖、d(-)甘露醇、d(+)葡萄糖、d(+)阿拉伯糖、d(-)阿拉伯糖、纖維二糖、d(+)麥芽糖、d(+)棉子糖、l(+)鼠李糖、d(+)蜜二糖、d(-)核糖、側(cè)金盞花醇、d(+)阿拉伯糖醇、l(-)阿拉伯糖醇、d(+)巖藻糖、l(-)巖藻糖、d(-)來蘇糖、l(+)來蘇糖和l(-)來蘇糖，或氨基酸，例如谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和?；撬?，來幫助滲透性血腦屏障破壞。用于加強血腦屏障滲透的方法和材料描述在例如第4,866,042號美國專利，"methodforthedeliveryofgeneticmaterialacrossthebloodbrainbarrier"，第6,294,520號美國專利，"materialforpassagethroughtheblood-brainbarrier"，以及第6,936,589號美國專利，"parenteraldeliverysystems"中，其每一個均通過引用并入本文。

在實施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸經(jīng)化學連接至一個或多個部分或綴合物，例如，增強該寡核苷酸的活性或細胞吸收的靶向部分或其他綴合物。此類部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如，膽固醇部分、膽固醇基部分、脂肪鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基、多胺或聚乙二醇鏈或金剛烷乙酸。在公開的文獻中已描述了包含親脂性部分的寡核苷酸和制備方法。在實施方案中，該反義寡核苷酸與某部分綴合，該部分包括但不限于無堿基核苷酸、聚醚、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物，例如，n-乙酰半乳糖胺(galnac)、n-ac-葡糖胺(glunac)或甘露糖(例如，甘露糖-6-磷酸酯)、脂質(zhì)或聚烴化合物。如本領(lǐng)域理解的和文獻中描述的，例如可使用連接體將綴合物與構(gòu)成反義寡核苷酸的任何核苷酸中的一個或多個在糖、堿基或磷酸基團上若干位置的任何一處連接。連接體可包括二價或三價支鏈連接體。在實施方案中，該綴合物附接至該反義寡核苷酸的3’端。制備寡核苷酸綴合物的方法描述在例如第8,450,467號美國專利，“carbohydrateconjugatesasdeliveryagentsforoligonucleotides”中，其通過引用并入本文。

疾病和病癥

與由包含至少一個內(nèi)含子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個內(nèi)含子)的前mrna編碼的蛋白質(zhì)或功能rna的產(chǎn)生量或活性降低相關(guān)的任何病況，例如，疾病或病癥，可通過本文提供的方法和組合物予以治療。待治療的疾病或病癥可以是單倍性不足的結(jié)果，其中基因的一個等位基因編碼功能(野生型)蛋白質(zhì)而該基因的一個等位基因被突變且編碼非功能性蛋白質(zhì)或具有降低功能/部分功能的蛋白質(zhì)。其他疾病或病癥可由半合子缺失引起，其中基因的一個等位基因丟失且由該基因的另一個等位基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量不足。其他疾病或病癥可能由亞等位基因突變引起，其中編碼蛋白質(zhì)的基因被突變，導致產(chǎn)生了具有部分功能的蛋白質(zhì)。

在一些實施方案中，本文所述方法用來增加功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量。如本文所用，術(shù)語“功能性”是指消除疾病的任何一種或多種癥狀所需的蛋白質(zhì)的活性的量或功能。在一些實施方案中，所述方法用來增加部分功能性蛋白質(zhì)或rna的產(chǎn)生量。如本文所用，術(shù)語“部分功能性”是指低于消除或預防疾病的任何一種或多種癥狀所需的活性量或功能的蛋白質(zhì)或rna的任何活性量或功能。在一些實施方案中，部分功能性蛋白質(zhì)或rna將具有比完全功能性蛋白質(zhì)或rna低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、85％、至少90％或至少95％的活性。

在實施方案中，所述方法是一種增加具有編碼靶蛋白或功能rna的ric前mrna的受試者細胞表達該靶蛋白或功能rna的方法，其中該受試者具有由該靶蛋白或功能rna的活性的量缺陷而引起的病況，并且其中該靶蛋白或功能rna的量缺陷由該靶蛋白或功能rna的單倍性不足而引起。在這樣的實施方案中，受試者具有編碼功能性靶蛋白或功能性的功能rna的第一等位基因，和不產(chǎn)生該靶蛋白或功能rna的第二等位基因。在另一個這樣的實施方案中，受試者具有編碼功能性靶蛋白或功能性的功能rna的第一等位基因，和編碼非功能性靶蛋白或非功能性的功能rna的第二等位基因。在這些實施方案的任何一個中，所述反義寡聚體與由第一等位基因(編碼功能性靶蛋白)轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的靶向部分結(jié)合，從而誘導保留內(nèi)含子從該ric前mrna中組成性剪接，并引起編碼靶蛋白或功能rna的mrna的水平增加，以及在受試者細胞中該靶蛋白或功能rna的表達增加。

在相關(guān)的實施方案中，所述方法是一種增加具有編碼靶蛋白或功能rna的ric前mrna的受試者細胞表達該靶蛋白或功能rna的方法，其中該受試者具有由常染色體隱性失常引起的病況，該常染色體隱性失常由該靶蛋白或功能rna的量或功能缺陷而導致。在這些實施方案中，受試者具有：

a.第一突變體等位基因，由其

i)產(chǎn)生該靶蛋白或功能rna的水平與由野生型等位基因產(chǎn)生相比降低，

ii)產(chǎn)生與對應的野生型蛋白相比功能降低的形式的該靶蛋白或功能rna，或

iii)不產(chǎn)生該靶蛋白或功能rna；以及

b.第二突變體等位基因，由其

i)產(chǎn)生該靶蛋白或功能rna的水平與從野生型等位基因產(chǎn)生相比降低，

ii)產(chǎn)生與對應的野生型蛋白相比功能降低的形式的該靶蛋白或功能rna，或

iii)不產(chǎn)生該靶蛋白或功能rna，并且

其中所述ric前mrna由第一等位基因和/或第二等位基因轉(zhuǎn)錄。在這些實施方案中，所述反義寡聚體與由第一等位基因或第二等位基因所轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的靶向部分結(jié)合，從而誘導保留內(nèi)含子從該ric前mrna中的組成性剪接，并引起編碼靶蛋白或功能rna的mrna的水平增加，以及在受試者細胞中靶蛋白或功能rna的表達增加。在這些實施方案中，由保留內(nèi)含子從ric前mrna中組成性剪接導致表達水平增加的靶蛋白或功能rna為與對應的野生型蛋白相比功能降低的形式(部分功能性)，或與對應的野生型蛋白相比具有完全功能的形式(完全功能性)。

在實施方案中，如本文別處所述，當與在對照細胞(例如，未用反義寡聚體處理的細胞或用不與ric前mrna的靶向部分結(jié)合的反義寡聚體處理的細胞)中產(chǎn)生的編碼靶蛋白的mrna、該靶蛋白或功能rna的量相比時，編碼該靶蛋白的mrna、該靶蛋白或該功能rna的水平增加至1.1至10倍。

在實施方案中，由靶蛋白的量或活性缺陷或功能rna的量或活性缺陷引起的病況不是由aso所靶向的保留內(nèi)含子的其它或異常剪接所引起的病況。在實施方案中，由靶蛋白的量或活性缺陷或功能rna的量或活性缺陷引起的病況不是由在編碼該靶蛋白或功能rna的ric前mrna中的任何保留內(nèi)含子的其它或異常剪接所引起的病況。

表1提供了疾病和靶基因的實例，所述靶基因與可利用本文提供的方法和組合物治療的每種疾病相關(guān)。

表1

在一些實施方案中，編碼引起疾病的蛋白質(zhì)的前mrna轉(zhuǎn)錄物被本文所述的aso所靶向。在一些實施方案中，編碼不引起疾病的蛋白質(zhì)的前mrna轉(zhuǎn)錄物被所述aso所靶向。例如，作為特定途徑中第一蛋白質(zhì)突變或缺陷的結(jié)果的疾病可通過靶向編碼第二蛋白質(zhì)的前mrna，從而增加該第二蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量來改善。在一些實施方案中，第二蛋白質(zhì)的功能能夠補償?shù)谝坏鞍踪|(zhì)的突變或缺陷。

可將本文提供的任何組合物施用于個體?！皞€體”可與“受試者”或“患者”互換使用。個體可以是哺乳動物，例如人或動物，如非人靈長類、嚙齒動物、兔、大鼠、小鼠、馬、驢、山羊、貓、狗、牛、豬或綿羊。在一些實施方案中，個體是人。在其他的實施方案中，個體可以是另一種真核生物，如植物。在一些實施方案中，將本文提供的組合物施用于離體細胞。

在一些實施方案中，將本文提供的組合物作為治療疾病或病癥的方法施用于個體。在一些實施方案中，該個體患有遺傳病，如本文所述的任何疾病。在一些實施方案中，該個體處于患有疾病如本文所述的任何疾病的風險中。在一些實施方案中，該個體處于患有由蛋白質(zhì)的量不足或蛋白質(zhì)的活性不足引起的疾病或病癥的增加的風險中。如果個體處于患有蛋白質(zhì)的量不足或蛋白質(zhì)的活性不足引起的疾病或病癥的“增加的風險”中，則該方法包括預防性或防范性處理。例如，個體可能由于該疾病的家族史而處于患有這樣的疾病或病癥的增加的風險中。通常，處于患有這樣的疾病或病癥的增加的風險中的個體受益于防范性處理(例如，通過預防或延遲該疾病或病癥的發(fā)作或進展)。

表2提供了用于通過靶向由hbb基因轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的區(qū)域來增加由hbb基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量的aso的序列的非限制性列表。

表2.靶向hbb基因的aso的列表

表3提供了用于通過靶向由prpf31基因轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的區(qū)域來增加由prpf31基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量的aso的序列的非限制性列表。

表3.靶向prpf31基因的aso的列表

表4提供了用于通過靶向由adamts13基因轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的區(qū)域來增加由adamts13基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量的aso的序列的非限制性列表。

表4.靶向adamts13基因的aso的列表

表5提供了用于通過靶向由tsc1基因轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的區(qū)域來增加由tsc1基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量的aso的序列的非限制性列表。

表5.靶向tsc1基因的aso的列表

表6提供了用于通過靶向由impdh1基因轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的區(qū)域來增加由impdh1基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量的aso的序列的非限制性列表。

表6.靶向impdh1基因的aso的列表

表7提供了用于通過靶向由pkd1基因轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的區(qū)域來增加由pkd1基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量的aso的序列的非限制性列表。

表7.靶向pkd1基因的aso的列表

表8提供了用于通過靶向由ikbkap基因轉(zhuǎn)錄的ric前mrna的區(qū)域來增加由ikbkap基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量的aso的序列的非限制性列表。

表8.靶向ikbkap基因的aso的列表

鑒定保留內(nèi)含子的方法

在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)還包括鑒定(確定)當相鄰(上游或下游)內(nèi)含子從細胞中的前mrna中剪接掉時前mrna轉(zhuǎn)錄物中的保留內(nèi)含子的方法。在一個實例中，可通過以下方法測量外顯子剪接和連接以及每個內(nèi)含子從靶基因中去除的程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，可以使用任何方法來確定內(nèi)含子是否相對于從前mrna轉(zhuǎn)錄物中剪接掉的相鄰內(nèi)含子而保留在前mrna轉(zhuǎn)錄物中，以及靶內(nèi)含子是否相對于在由相同基因編碼的前mrna內(nèi)的一個或多個其他內(nèi)含子而在較大程度上得以保留。

i.篩選保留內(nèi)含子

可利用從細胞或組織(例如，疾病相關(guān)細胞)中分離出的細胞核rna進行內(nèi)含子保留的第一輪篩選，并通過逆轉(zhuǎn)錄酶-pcr(rt-pcr)進行分析，例如，以研究由靶基因編碼的前rna。靶基因可以是含有至少一個內(nèi)含子且編碼與疾病或病癥相關(guān)的或懷疑相關(guān)的或引起疾病或病癥的蛋白質(zhì)或功能rna的任何基因。對于rt-pcr分析，通過設計一系列引物對評估由基因編碼的前mrna中保留的每一個內(nèi)含子，其中該引物對中的一個引物針對該靶前mrna的內(nèi)含子的區(qū)域是特異性的，并且該引物對中的另一個引物針對外顯子的區(qū)域是特異性的，該外顯子區(qū)域為該內(nèi)含子上游或下游的兩個外顯子(圖3)。在一些實施方案中，上游或正向引物可與內(nèi)含子(例如，圖3中外顯子1與2之間的內(nèi)含子)內(nèi)的區(qū)域互補和雜交；而下游或反向引物可與位于與所評估的內(nèi)含子相距兩個外顯子的外顯子內(nèi)(例如在如圖3所示的外顯子3內(nèi))的區(qū)域互補和雜交?；蛘撸嫌位蛘蛞锟膳c外顯子內(nèi)(例如，圖3中在外顯子2中)的區(qū)域互補和雜交；而下游或反向引物可與距正向引物兩個外顯子的內(nèi)含子內(nèi)(例如在如圖3所示的外顯子3與4之間的內(nèi)含子內(nèi))的區(qū)域互補和雜交?？舍槍γ恳粋€由基因編碼的內(nèi)含子來重復引物對的設計。

采用每一個引物對進行rt-pcr后，通過本領(lǐng)域已知的任何方法分析rt-pcr產(chǎn)物，例如，在瓊脂糖凝膠中分離和可視化。如果存在靶內(nèi)含子，則預期的rt-pcr產(chǎn)物的近似大小可根據(jù)基因和/或前mrna的核酸序列來估算。rt-pcr分析不存在產(chǎn)物表明，靶內(nèi)含子不存在且已從前mrna中去除/剪接，因此在所測試的條件下其并非保留內(nèi)含子。rt-pcr反應存在約等于估算的產(chǎn)物大小的產(chǎn)物表明，靶內(nèi)含子存在于前mrna中且在測試條件下未從前mrna中去除/剪接，此類內(nèi)含子被稱為“保留內(nèi)含子”。

在需要對許多前rna或在整個轉(zhuǎn)錄物組水平上進行分析的實例中，可通過rna-seq或任何其他高通量轉(zhuǎn)錄分析方法來分析內(nèi)含子保留的篩選。利用合適的深度測序讀數(shù)的定位和統(tǒng)計方法進行rna-seq分析，來測定整個轉(zhuǎn)錄物組中的內(nèi)含子保留事件。

ii.內(nèi)含子保留事件的確認

可進行前mrna內(nèi)的內(nèi)含子的第二輪篩選以利用諸如rt-pcr等方法來確認內(nèi)含子保留事件。可再次評估在上述第一輪篩選時被鑒定為保留內(nèi)含子的每一個內(nèi)含子。對于rt-pcr分析，通過設計引物對來評估由基因編碼的前mrna中保留的每一個保留內(nèi)含子，其中該引物對中的一個引物針對該靶前mrna的內(nèi)含子的區(qū)域是特異性的，并且該引物對中的另一個引物針對外顯子的區(qū)域是特異性的，該外顯子區(qū)域為該內(nèi)含子上游或下游的三個、四個或五個外顯子(圖4)。在圖4所示的示意圖中，待評估的保留內(nèi)含子位于外顯子1與2之間。上游或正向引物針對一個區(qū)域是特異性的，并在該保留內(nèi)含子內(nèi)雜交，而下游或反向引物被設計為與外顯子4、外顯子5和外顯子6中的區(qū)域雜交，這些外顯子分別與該保留內(nèi)含子相距3、4和5個外顯子。利用所述正向引物和每一個所述反向引物進行rt-pcr反應。

rt-pcr后，通過本領(lǐng)域已知的任何方法分析rt-pcr產(chǎn)物，例如，在瓊脂糖凝膠中分離和可視化。根據(jù)來自每一個反應的rt-pcr產(chǎn)物的分子大小，可以確定除所測試的內(nèi)含子(以上鑒定的保留內(nèi)含子)之外每一個內(nèi)含子(例如，外顯子2與3、3與4以及4與5之間的內(nèi)含子)是否也得到保留。當已去除/剪接一個或多個相鄰內(nèi)含子時被發(fā)現(xiàn)保留的保留內(nèi)含子可被稱為“低效剪接內(nèi)含子”。

iii.測定內(nèi)含子剪接效率

可以進一步評估相對于相同前mrna中被去除/剪接的其他內(nèi)含子被鑒定為持久內(nèi)含子或低效剪接內(nèi)含子的由靶基因編碼的前mrna中的任何內(nèi)含子，以測定內(nèi)含子保留的比例或效率。

可通過進行測定如核糖核酸酶保護測定來評估內(nèi)含子以測定內(nèi)含子保留的效率(圖5)。設計一對rna探針(例如，放射性標記的rna探針)，其中每一個探針對跨越保留內(nèi)含子和相鄰外顯子的末端的區(qū)域是特異性的。例如，rna探針被設計為與跨越保留內(nèi)含子的5’端和保留內(nèi)含子上游的外顯子的3’端的區(qū)域雜交；而第二rna探針被設計為與跨越保留內(nèi)含子的3’端和保留內(nèi)含子下游的外顯子的5’端的區(qū)域雜交。在一些實施方案中，與該內(nèi)含子雜交的探針部分的長度為至少100個核苷酸，而與該外顯子雜交的探針部分的長度為至少50個核苷酸(圖5)。在探針與前mrna的區(qū)域雜交形成雙鏈rna的區(qū)域的條件下，將從疾病相關(guān)細胞、組織或細胞系中提取的核rna與rna探針對一起溫育。前mrna和rna探針的混合物用降解單鏈rna的核糖核酸酶如核糖核酸酶a和/或核糖核酸酶t1進行消化。雙鏈rna不被降解。

通過本領(lǐng)域已知的任何方法分析核糖核酸酶消化反應，例如，在瓊脂糖凝膠中分離和可視化。對應于rna探針全長(例如，150個核苷酸)的rna分子的量指示前mrna中存在的保留內(nèi)含子的量。對應于消化的rna探針的rna分子(例如，長度為約50個核苷酸的rna分子)的量代表當與rna探針雜交的內(nèi)含子不存在于前mrna中時(例如，被剪接掉)剪接的rna的量。內(nèi)含子保留(全長rna探針的量，例如，100個核苷酸的rna分子)與剪接rna(降解的rna探針的量，例如，50個核苷酸的rna分子)的比例指示內(nèi)含子的剪接效率。相對于相同前mrna的其他內(nèi)含子的比例為最高的前mrna的內(nèi)含子指示該內(nèi)含子是由靶基因編碼的前mrna的最低效剪接內(nèi)含子或最高保留內(nèi)含子。

鑒定增強剪接的aso的方法

本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括用于鑒定(確定)增強靶前mrna(特別是靶內(nèi)含子處)的剪接的aso的方法?？珊Y選與前mrna的靶區(qū)域內(nèi)的不同核苷酸特異性雜交的aso以鑒定(確定)增加靶內(nèi)含子的剪接速度和/或程度的aso。在一些實施方案中，該aso可阻斷或干擾剪接阻抑物/沉默基因的結(jié)合位點?？衫帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來鑒定(確定)當與內(nèi)含子的靶區(qū)域雜交時導致所需效果(例如，提高的剪接、蛋白質(zhì)或功能rna產(chǎn)生)的aso。這些方法還可用于鑒定通過與位于保留內(nèi)含子側(cè)翼的外顯子中或非保留內(nèi)含子中的靶向區(qū)域結(jié)合而增強保留內(nèi)含子的剪接的aso。以下提供了可采用的方法的實例。

被稱為aso“步移”的一輪篩選可采用被設計為與前mrna的靶區(qū)域雜交的aso來進行。例如，aso步移中所用的aso可從保留內(nèi)含子的5’剪接位點上游約100個核苷酸(例如，位于靶/保留內(nèi)含子上游的外顯子序列的一部分)至該靶/保留內(nèi)含子的5’剪接位點下游約100個核苷酸，和/或從該保留內(nèi)含子的3’剪接位點上游約100個核苷酸至該靶/保留內(nèi)含子的3’剪接位點下游約100個核苷酸(例如，位于該靶/保留內(nèi)含子下游的外顯子序列的一部分)以每5個核苷酸進行平鋪。例如，長度為15個核苷酸的第一aso可設計為與相對于靶/保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+6至+20核苷酸特異性雜交。將第二aso設計為與相對于靶/保留內(nèi)含子的5’剪接位點的+11至+25核苷酸特異性雜交。將aso設計為跨越前mrna的靶區(qū)域。在實施方案中，aso可更緊密地平鋪，例如，每1個、2個、3個或4個核苷酸。此外，aso可從5’剪接位點下游的100個核苷酸至3’剪接位點上游的100個核苷酸進行平鋪。

例如，通過轉(zhuǎn)染將一個或多個aso或?qū)φ誥so(具有錯義序列——預期不與靶區(qū)域雜交的序列——的aso)遞送至表達靶前mrna(例如，本文別處所述的ric前mrna)的疾病相關(guān)細胞系中。如本文所述(參見“內(nèi)含子保留事件的鑒定”)，可通過本領(lǐng)域已知的任何方法，例如通過使用跨越剪接點的引物的逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)-pcr，評估每一個aso的剪接誘導效果。與在對照aso處理的細胞中相比，在aso處理的細胞中使用跨越剪接點的引物產(chǎn)生的rt-pcr產(chǎn)物的減少或不存在表明靶內(nèi)含子的剪接已得到加強。在一些實施方案中，可利用本文所述的aso來提高剪接效率、剪接的與未剪接的前mrna之比、剪接速度或剪接程度。還可以評估由靶前mrna編碼的蛋白質(zhì)或功能rna的量以確定每一個aso是否均獲得所需效果(例如，增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)生量)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知用于評估和/或量化蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的任何方法，如蛋白質(zhì)印跡法、流式細胞術(shù)、免疫熒光顯微術(shù)和elisa。

可利用被設計為與前mrna的靶區(qū)域雜交的aso來進行被稱為aso“微步移”的第二輪篩選。aso微步移中所用的aso以每隔1個核苷酸進行平鋪，以進一步精修當與aso雜交時導致剪接增強的前mrna的核苷酸序列。

借助于aso“微步移”，包括以1-nt步長間隔的aso以及更長的aso(通常為18-25nt)，更詳細地探索了由促進靶內(nèi)含子的剪接的aso所限定的區(qū)域。

如上對于aso步移所述，通過將一個或多個aso或?qū)φ誥so(具有錯亂(scrambled)序列——預期不與靶區(qū)域雜交的序列——的aso)例如通過轉(zhuǎn)染遞送至表達靶前mrna的疾病相關(guān)細胞系中來進行aso微步移。如本文所述(參見“內(nèi)含子保留事件的鑒定”)，可通過本領(lǐng)域已知的任何方法，例如通過采用跨越剪接點的引物的逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)-pcr，評估每一個aso的剪接誘導效果。與在對照aso處理的細胞中相比，在aso處理的細胞中采用跨越剪接點的引物所產(chǎn)生的rt-pcr產(chǎn)物的減少或不存在表明靶內(nèi)含子的剪接已經(jīng)得到增強。在一些實施方案中，可利用本文所述的aso來提高剪接效率、已剪接的與未剪接的前mrna之比、剪接速度或剪接程度。還可以評估由靶前mrna編碼的蛋白質(zhì)或功能rna的量以確定每一個aso是否均達到所需效果(例如，增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)生量)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知用于評估和/或量化蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的任何方法，如蛋白質(zhì)印跡法、流式細胞術(shù)、免疫熒光顯微術(shù)和elisa。

當與前mrna的區(qū)域雜交時導致增強的剪接和增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的aso可利用動物模型，例如已敲入全長人基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，或在疾病的人源化小鼠模型中進行體內(nèi)測試。合適的aso施用途徑可根據(jù)需要遞送aso的疾病和/或細胞類型而變化。例如，可通過玻璃體內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射或靜脈內(nèi)注射來施用aso。施用后，可評估模型動物的細胞、組織和/或器官，以通過例如由本領(lǐng)域已知和本文所述的方法評價剪接(效率、速度、程度)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生量來確定aso治療的效果。動物模型還可以是疾病或疾病嚴重程度的任何表型或行為指示。

實施例

本發(fā)明將通過以下實施例更具體地加以說明。然而，應當理解，本發(fā)明不以任何方式由這些實施例來限制。

實施例1：內(nèi)含子保留事件是基因固有的，并且是非生產(chǎn)性的

利用本文所述方法對prpf31(11型視網(wǎng)膜色素變性)和rb1(視網(wǎng)膜母細胞瘤)基因中的內(nèi)含子保留事件進行第一輪篩選(圖3)。簡而言之，從hela(人上皮宮頸腺癌)和293t(人胚腎上皮)細胞的細胞核部分以及arpe-19(人視網(wǎng)膜)細胞的細胞核和細胞質(zhì)部分中分離出rna提取物。采用來自每一個所述細胞類型的rna提取物進行逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)。簡而言之，采用寡核苷酸dt進行cdna合成以僅生成聚arna(完全轉(zhuǎn)錄的rna)的dna拷貝，并進行pcr以評估prpf31和rb1轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留。該pcr產(chǎn)物在1.5％溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上分離(圖6a-圖6d)。結(jié)果顯示在測試的三種細胞系中的每一個的細胞核中兩個基因(prpf31和rb1)的若干內(nèi)含子保留事件(由黑色星號標記)(圖6a-圖6d)。

表9和表10列出了在分別針對prpf31和rb1測試的三種細胞系中發(fā)生的所有內(nèi)含子保留事件。在所有三種細胞系中發(fā)生的事件(存在或不存在內(nèi)含子保留)用星號指示。所述表格顯示在這三種細胞系間存在非常高的一致性，這表明內(nèi)含子保留事件是基因固有的，并且不受不同細胞環(huán)境的影響。

為了討論這些事件是否為非生產(chǎn)性的(即能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)產(chǎn)生)，采用arpe-19細胞的細胞質(zhì)部分進行rt-pcr(圖6e)。結(jié)果顯示，大多數(shù)所觀察到的內(nèi)含子保留事件不存在于arpe-19細胞的細胞質(zhì)中(圖6e，星號標記條帶應在的位置)，正如預期的，表明內(nèi)含子保留事件導致轉(zhuǎn)錄物保留在細胞核中或在細胞質(zhì)中被無義介導的mrna分解所降解，并因此是非生產(chǎn)性的轉(zhuǎn)錄物。

表9：prpf31基因中內(nèi)含子保留事件的結(jié)果的總結(jié)。“是”指示存在內(nèi)含子保留；“否”指示不存在內(nèi)含子保留；“？”指示無法作出結(jié)論的結(jié)果。在三種細胞系之間存在一致性的情況以星號標記。

表10.rb1基因中內(nèi)含子保留事件的結(jié)果的總結(jié)?！笆恰敝甘敬嬖趦?nèi)含子保留；“否”指示不存在內(nèi)含子保留。在三種細胞系之間存在一致性的情況以星號標記。

實施例2：內(nèi)含子保留事件的確認

使用本文所述方法對prpf31(11型視網(wǎng)膜色素變性)和rb1(視網(wǎng)膜母細胞瘤)基因中的內(nèi)含子保留事件進行第二輪篩選(圖4)。簡而言之，如實施例1中所述采用來自arpe-19(人視網(wǎng)膜)細胞的細胞核rna提取物進行逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)。在該實施例中，在其中從前mrna中剪接掉(去除)超過一個內(nèi)含子的情況下評估內(nèi)含子保留。結(jié)果顯示與圖6a-圖6d的結(jié)果相比，兩個基因(prpf31和rb1)的內(nèi)含子保留事件(用黑色星號標記)均較少(圖7a-圖7b)，減少了候選內(nèi)含子保留事件的數(shù)目。

實施例3：經(jīng)由內(nèi)含子區(qū)域的誘變或aso靶向而提高的剪接效率增加了基因表達

我們旨在提高與β地中海貧血有關(guān)的hbb(人β珠蛋白)基因的兩個內(nèi)含子中每一個的剪接效率，并評估這是否會導致轉(zhuǎn)錄物水平增加。整個hbb開放讀框被克隆在小基因報道基因中。將突變引入兩個內(nèi)含子的5’和3’剪接位點，以便將它們帶入完全共有序列。圖8a示出了hbb基因和在剪接位點處引入的突變的示意圖。使用fugene轉(zhuǎn)染試劑將在每個剪接位點處攜帶突變以及這些突變的組合的小基因報道基因獨立地轉(zhuǎn)染至hek293(人胚腎上皮)細胞中24小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，僅改善內(nèi)含子1(ivs1)的5’剪接位點的突變增加了hbb轉(zhuǎn)錄物水平(圖8b)。對應于突變小基因的hbbpcr產(chǎn)物的條帶強度的量化相對于gfp的條帶強度進行歸一化，并相對于野生型hbb進行繪圖。這些柱條表明，當內(nèi)含子1的剪接效率提高時，hbb的表達水平增加超過2倍(圖8c)。我們先前已觀察到，hbb內(nèi)含子1是低效剪接的并且是該基因中的限速內(nèi)含子(數(shù)據(jù)未示出)。我們在此證明了通過提高低效剪接內(nèi)含子的剪接效率可以獲得基因表達的顯著增加。

目的是確定我們是否還可以通過利用aso提高hbb內(nèi)含子1的剪接效率來獲得hbb-報道基因(小基因)表達的增加。為此，生成18聚體2′-o-measo以靶向在位置+7處開始的內(nèi)含子1，以及生成兩個18聚體pmo-aso以靶向分別在相對于5’剪接點的位置+6和+7處開始的內(nèi)含子1(圖9a；表2，分別為seqidno:104和105)。首先利用fugene轉(zhuǎn)染試劑用野生型hbb小基因報道基因和gfp(作為轉(zhuǎn)染對照)共轉(zhuǎn)染hek293細胞。四個小時后，利用rnaimax(rim)(invitrogen)或endoporter(ep)(genetools)遞送試劑，對細胞進行未轉(zhuǎn)染、模擬轉(zhuǎn)染或用每一種靶向aso或非靶向aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染。使用如圖9b所示濃度漸增的aso進行實驗達48小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，具有兩種化學的+7靶向aso增加了hbb轉(zhuǎn)錄物水平(圖9b)。對于+6pmo-aso獲得了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的hbbpcr產(chǎn)物的條帶強度相對于gfp進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化hbbpcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，兩種靶向aso(+6和+7)使hbb轉(zhuǎn)錄物水平增加了將近50％(圖9c)。這些結(jié)果表明，利用aso提高hbb基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例4：經(jīng)由靶向內(nèi)含子區(qū)域的aso而提高的剪接效率增加了蛋白質(zhì)產(chǎn)生量

為了檢測用+72′-o-measo靶向hbb內(nèi)含子1時蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，我們生成了由上游側(cè)翼為gfp開放讀框且下游側(cè)翼為編碼t7標簽的序列的hbb小基因構(gòu)成的報道基因構(gòu)建體(圖10a)。將該報道基因整合在模擬內(nèi)源基因的u2os細胞的基因組中。模擬轉(zhuǎn)染或用+72′-o-measo轉(zhuǎn)染表達gfp-hbb-t7報道基因的u2os細胞，并通過蛋白質(zhì)印跡法分析蛋白質(zhì)提取物。簡而言之，來自兩個獨立生物復制品的蛋白質(zhì)提取物在4-20％sds-聚丙烯酰胺凝膠上運行，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。為了證明蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，采用抗gfp抗體來檢測來自gfp-hbb-t7報道基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，并采用抗β微管蛋白抗體來檢測作為加樣對照的β微管蛋白。圖10b示出了蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其表明在用+72′-o-measo處理時增加了gfp-hbb-t7蛋白質(zhì)(底部條帶)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的gfp-hbb-t7蛋白質(zhì)的條帶強度相對于內(nèi)源性β微管蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化gfp-hbb-t7蛋白質(zhì)條帶進行繪圖。

該分析的結(jié)果表明，靶向aso(+7)使gfp-hbb-t7蛋白水平增加超過2.5倍(圖10c)。這些結(jié)果證實，通過使用靶向限速內(nèi)含子的5’剪接位點下游區(qū)域的aso來提升剪接效率導致了靶蛋白產(chǎn)生量的增加，如圖2所示。

實施例5：利用新一代測序通過rnaseq來鑒定adamts13轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留事件

我們使用新一代測序進行全轉(zhuǎn)錄物組鳥槍法測序，以概略顯示由adamts13基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，從而鑒定內(nèi)含子保留事件。為此目的，我們從thle-3(人肝上皮)細胞的細胞核和細胞質(zhì)部分中分離出聚a+rna，并使用illumina的truseqstrandedmrna文庫制備試劑盒來構(gòu)建cdna文庫。對該文庫進行對-端測序，產(chǎn)生了定位到人類基因組的100個核苷酸讀數(shù)(2009年2月，grch37/hg19組裝體)。針對adamts13的測序結(jié)果顯示在圖11中。簡而言之，圖11示出了使用由ucsc基因組信息學組(centerforbiomolecularscience&engineering,universityofcalifornia,santacruz,1156highstreet,santacruz,ca95064)運行并由例如rosenbloom等人,2015,“theucscgenomebrowserdatabase:2015update,”nucleicacidsresearch43,databaseissue(doi:10.1093/nar/gku1177)描述的ucsc基因組瀏覽器顯現(xiàn)的定位讀數(shù)，并且可通過峰值信號推測讀數(shù)的覆蓋范圍和數(shù)目。峰高指示由特定區(qū)域中讀數(shù)的密度給出的表達水平。所有adamts13同種型的示意圖(按比例繪制)由ucsc基因組瀏覽器(讀數(shù)信號下面)來提供，使得峰值可與adamts13外顯子和內(nèi)含子區(qū)域相匹配。根據(jù)此顯示，我們鑒定了在thle-3細胞的細胞核部分中具有高讀數(shù)密度，但在這些細胞的細胞質(zhì)部分中具有極低讀數(shù)至無讀數(shù)的兩個內(nèi)含子(25和27，由箭頭指示)(如圖11的底部圖示中的內(nèi)含子25所示)。這表明這兩個內(nèi)含子均被保留并且含內(nèi)含子25和內(nèi)含子27的轉(zhuǎn)錄物仍然在細胞核中。這提示這些含保留內(nèi)含子(ric)的adamts13前mrna是非生產(chǎn)性的，因為它們不向外輸出至細胞質(zhì)。

實施例6：通過adamts13的rnaseq分析所鑒定的內(nèi)含子保留事件的驗證

利用本文所述的方法進行adamts13(血栓性血小板減少性紫癜)基因中內(nèi)含子25-保留事件的驗證(圖12)。簡而言之，如實施例1中所述采用來自a172(人成膠質(zhì)細胞瘤)和hepg2(人肝細胞癌)細胞的細胞核和細胞質(zhì)rna提取物進行放射性逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)。在本實施例中，使用導致含內(nèi)含子25的轉(zhuǎn)錄物和正確剪接的轉(zhuǎn)錄物二者擴增的位于外顯子25和外顯子27中的引物來評估內(nèi)含子保留。產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠中運行，并通過磷成像進行可視化。以對應于含內(nèi)含子25的產(chǎn)物的條帶強度相對于總轉(zhuǎn)錄物(含內(nèi)含子的加上正確剪接的)的內(nèi)含子保留百分比(pir)來計算內(nèi)含子25保留水平。條帶的量化表明約80％的adamts13轉(zhuǎn)錄物含有內(nèi)含子25并且該產(chǎn)物保留在細胞核中。此外，放射性rt-pcr結(jié)果驗證了生物信息學預測，證實rnaseq結(jié)果的生物信息學分析是鑒定內(nèi)含子保留事件的有力工具。

實施例7：靶向adamts13的內(nèi)含子25的aso步移的設計

將aso步移設計為利用本文所述方法靶向內(nèi)含子25(圖13)。用2’-o-merna(ps主鏈)、以5個核苷酸間隔移位的18聚體aso(除了1種aso——adam-ivs25-47以外，以避免一段四個鳥嘌呤)靶向內(nèi)含子255’剪接位點下游緊鄰的跨越+6至+58核苷酸的區(qū)域和內(nèi)含子253’剪接位點上游緊鄰的跨越-16至-79核苷酸的區(qū)域(圖13；表4，seqidno:150至167)。根據(jù)內(nèi)含子調(diào)節(jié)元件集中于剪接位點相鄰的序列中的知識選擇了這些靶區(qū)域。

實施例8：經(jīng)由adamts13內(nèi)含子25的aso靶向而提高的剪接效率增加了轉(zhuǎn)錄物水平

為了確定我們是否可以通過利用aso提高adamts13內(nèi)含子25的剪接效率來獲得adamts13表達的增加，我們采用了本文所述的方法(圖14)。為此，利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，對hepg2細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用圖13和表4中描述的靶向aso，seqidno:150至167中的每一種或非靶向smn-aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染。利用60nmaso(如圖14所示)進行實驗達48小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，+21和+26靶向aso增加了adamts13轉(zhuǎn)錄物水平(圖14)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的adamts13pcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自經(jīng)對照aso處理的細胞的歸一化adamts13pcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，兩種靶向aso(+21和+26)使adamts13轉(zhuǎn)錄物水平增加將近2.5倍(圖14)。這些結(jié)果表明，利用aso提高adamts13基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例9：靶向adamts13內(nèi)含子25的aso的劑量響應效應

為了確定+21和+26aso以及表現(xiàn)出相反效應的-46aso的劑量響應效應(圖14)，我們采用了本文所述的方法(圖15)。利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，如圖15所示以濃度漸增的方式對hepg2細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用三種aso中的每一種或非靶向smn-aso對照獨立地轉(zhuǎn)染48小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，+21和+26靶向aso與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比增加了adamts13轉(zhuǎn)錄物水平，而-46aso與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比則降低了adamts13轉(zhuǎn)錄物水平(圖15)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的adamts13pcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自經(jīng)對照aso處理的細胞的歸一化adamts13pcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，兩種靶向aso(+21和+26)使adamts13轉(zhuǎn)錄物水平增加將近2.5倍(圖15)。這些結(jié)果確認，利用aso提高adamts13基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例10：經(jīng)由adamts13內(nèi)含子25的aso靶向而提高的剪接效率增加了蛋白質(zhì)水平

為了檢測在用+21或+26aso靶向adamts13內(nèi)含子25后蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，我們采用了本文所述的方法(圖16)。利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，如圖16所示以濃度漸增的方式對hepg2細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用三種aso中的每一種或非靶向smn-aso對照單獨轉(zhuǎn)染48小時。簡而言之，來自經(jīng)hepg2處理的細胞的蛋白質(zhì)提取物在8％sds-聚丙烯酰胺凝膠上運行，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。為了證明蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，采用抗adamts13抗體或抗α微管蛋白抗體分別檢測adamts13和作為加樣對照的α微管蛋白。圖16示出了蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其表明在用+21或+26aso處理后adamts13(頂部圖幅)以劑量依賴性的方式增加。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的adamts13蛋白質(zhì)的條帶強度相對于內(nèi)源性α微管蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化adamts13蛋白質(zhì)條帶進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，靶向aso(+21和+26)使adamts13蛋白水平增加至超過3倍(圖16)。這些結(jié)果證實，通過采用靶向adamts13內(nèi)含子25(限速內(nèi)含子)的5’剪接位點下游的區(qū)域的aso來提升剪接效率導致了靶蛋白產(chǎn)生量的增加，如圖2所示。

實施例11：靶向adamts13內(nèi)含子25的+21至+26區(qū)域的aso微步移的設計

將aso微步移設計為利用本文所述方法靶向內(nèi)含子25的+21至+26區(qū)域(圖17)。用2’-o-me、5’-me-胞嘧啶rna(ps主鏈)、以1個核苷酸間隔移位的18聚體aso靶向內(nèi)含子25的5’剪接位點下游的跨越+17至+46的區(qū)域(圖17；表4，seqidno:184至197)。根據(jù)所觀察到的aso+21和+26的效果(圖16)來選擇靶區(qū)域。

實施例12：經(jīng)由adamts13內(nèi)含子25+21至+26區(qū)域的aso微步移靶向而提高的剪接效率增加轉(zhuǎn)錄物水平

為了確定我們是否可以通過利用微步移aso提高adamts13內(nèi)含子25的剪接效率來獲得adamts13表達的增加，我們采用了本文所述的方法(圖18)。為此，利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，對hepg2細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用圖17以及表4中seqidno:184至197所描述的靶向aso中的每一種或非靶向smn-aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染。利用60nmaso(如圖18所示)進行實驗達48小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso以及兩種原始的+21和+26aso(淡灰色柱條，圖18)相比，具有5’-me-胞嘧啶的+21和+25靶向aso進一步增加了adamts13轉(zhuǎn)錄物水平。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的adamts13pcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自經(jīng)對照aso處理的細胞的歸一化adamts13pcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，兩種靶向aso(+21和+25)使adamts13轉(zhuǎn)錄物水平增加至將近2.0倍(圖18)。這些結(jié)果表明，利用aso提高adamts13基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致了基因表達的增加，并且通過微步移精修靶區(qū)域可導致鑒定更有效的aso。

實施例13：使用新一代測序通過rnaseq鑒定tsc1轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留事件

我們使用新一代測序進行全轉(zhuǎn)錄物組鳥槍法測序，以概略顯示由tsc1基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，從而鑒定內(nèi)含子保留事件。為此，我們從原代人星形細胞(ast)和原代人皮質(zhì)神經(jīng)元(hcn)細胞的細胞核和細胞質(zhì)部分中分離出聚a+rna，并使用illumina的truseqstrandedmrna文庫制備試劑盒構(gòu)建cdna文庫。對該文庫進行對-端測序，產(chǎn)生了定位到人類基因組的100個核苷酸的讀數(shù)(2009年2月，grch37/hg19組裝體)。tsc1的測序結(jié)果顯示在圖19中。簡而言之，圖19顯示了利用ucsc基因組瀏覽器所顯現(xiàn)的定位讀數(shù)，并且讀數(shù)的覆蓋范圍和數(shù)目可通過峰值信號來推測。峰高指示由特定區(qū)域中讀數(shù)的密度給出的表達水平。所有tsc1同種型的示意圖(按比例繪制)由ucsc基因組瀏覽器(讀數(shù)信號下面)提供，使得峰值可與tsc1外顯子和內(nèi)含子區(qū)域相匹配。根據(jù)此顯示，我們鑒定了在ast和hcn細胞的細胞核部分中具有高讀數(shù)密度，但在這些細胞的細胞質(zhì)部分中具有極低讀數(shù)至無讀數(shù)的三個內(nèi)含子(5、10和11，由箭頭指示)(如圖19的底部圖示中的內(nèi)含子10所示)。這表明兩個內(nèi)含子均被保留，并且含內(nèi)含子5、內(nèi)含子10和內(nèi)含子11的轉(zhuǎn)錄物仍然在細胞核中。這提示這些含保留內(nèi)含子(ric)的tsc1前mrna是非生產(chǎn)性的，因為它們未向外輸出至細胞質(zhì)。

實施例14：通過tsc1的rnaseq分析所鑒定的內(nèi)含子保留事件的驗證

利用本文所述的方法進行tsc1(復合型結(jié)節(jié)性硬化癥1)基因中內(nèi)含子10-保留事件的驗證(圖20)。簡而言之，如實施例1中所述利用來自a172(人成膠質(zhì)細胞瘤)細胞的細胞核和細胞質(zhì)rna提取物進行放射性逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)。在該實施例中，利用導致含內(nèi)含子10的轉(zhuǎn)錄物和正確剪接的轉(zhuǎn)錄物均擴增的位于外顯子9和外顯子11中的引物來評估內(nèi)含子保留。產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠中運行，并通過磷成像進行可視化。以對應于含內(nèi)含子10的產(chǎn)物的條帶強度相對于總轉(zhuǎn)錄物(含內(nèi)含子的加上正確剪接的)的內(nèi)含子保留百分比(pir)來計算內(nèi)含子10保留水平。條帶的量化表明約36％的tsc1轉(zhuǎn)錄物含有內(nèi)含子10并且該產(chǎn)物保留在細胞核中。此外，放射性rt-pcr結(jié)果驗證了生物信息學預測，證實rnaseq結(jié)果的生物信息學分析是鑒定內(nèi)含子保留事件的有力工具。

實施例15：靶向tsc1的內(nèi)含子10的aso步移的設計

將aso步移設計為利用本文所述方法靶向內(nèi)含子10(圖21)。用2’-o-merna(ps主鏈)、以5個核苷酸間隔移位的18聚體aso靶向內(nèi)含子10的5’剪接位點下游緊鄰的跨越+6至+58核苷酸的區(qū)域和內(nèi)含子10的3’剪接位點上游緊鄰的跨越-16至-68核苷酸的區(qū)域(圖21；表5，seqidno:214至229)。根據(jù)內(nèi)含子調(diào)節(jié)元件集中于剪接位點相鄰的序列中的知識選擇了這些靶區(qū)域。

實施例16：經(jīng)由tsc1內(nèi)含子10的aso靶向而提高的剪接效率增加轉(zhuǎn)錄物水平

為了確定我們是否可以通過利用aso提高tsc1內(nèi)含子10的剪接效率來獲得tsc1表達的增加，我們采用了本文所述的方法(圖22)。為此，利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，對a172細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用圖21以及表5中seqidno:214至229所描述的的靶向aso中的每一種或非靶向smn-aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染。利用60nmaso(如圖22所示)進行實驗達48小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，+31靶向aso增加了tsc1轉(zhuǎn)錄物水平(圖22)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的tsc1pcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化tsc1pcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，若干種aso(包括+31)使tsc1轉(zhuǎn)錄物水平增加至將近1.5倍(圖22)。這些結(jié)果表明，利用aso提高tsc1基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例17：靶向tsc1內(nèi)含子10的aso的劑量響應效應

為了確定+31aso的劑量響應效應，我們采用了本文所述的方法(圖23)。使用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，如圖23所示以濃度漸增的方式對a172細胞進行模擬轉(zhuǎn)染或用+31aso或非靶向smn-aso對照獨立轉(zhuǎn)染達72小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，+31靶向aso增加了tsc1轉(zhuǎn)錄物水平(圖23)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的tsc1pcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化tsc1pcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，+31靶向aso使tsc1轉(zhuǎn)錄物水平以劑量依賴性的方式增加至將近2.0倍(圖23)。利用tsc1轉(zhuǎn)錄物中別處的引物通過rtqpcr確認了這些結(jié)果，顯示了至3倍的增加以及對aso處理的劑量依賴性響應。這些結(jié)果確認，利用aso提高tsc1基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例18：經(jīng)由tsc1內(nèi)含子10的aso靶向而提高的剪接效率增加蛋白質(zhì)水平

為了檢測在用+31aso靶向tsc1內(nèi)含子10后蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，我們采用了本文所述的方法(圖24)。利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，如圖24所示以濃度漸增的方式對a172細胞進行模擬轉(zhuǎn)染或用+31aso或非靶向smn-aso對照獨立轉(zhuǎn)染72小時。簡而言之，來自經(jīng)a172處理的細胞的蛋白質(zhì)提取物在10％sds-聚丙烯酰胺凝膠上運行，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。為了證明蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，采用抗tsc1抗體或抗α微管蛋白抗體分別檢測tsc1和作為加樣對照的α微管蛋白。圖24顯示了蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其表明在用30和60nm的+31aso處理后tsc1(頂部圖幅)以劑量依賴性的方式增加。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的tsc1蛋白的條帶強度相對于內(nèi)源性α微管蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化tsc1蛋白條帶進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，靶向aso(+31)使tsc1蛋白水平增加超過2倍(圖24)。這些結(jié)果證實，通過利用靶向tsc1內(nèi)含子10(限速內(nèi)含子)的5’剪接位點下游的區(qū)域的aso來提升剪接效率導致了靶蛋白產(chǎn)生量的增加，如圖2所示。

實施例19：利用新一代測序通過rnaseq鑒定impdh1轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留事件

我們利用新一代測序進行全轉(zhuǎn)錄物組鳥槍法測序，以概略顯示由impdh1基因(10型視網(wǎng)膜色素變性)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，從而鑒定內(nèi)含子保留事件。為此目的，我們從arpe-19(人視網(wǎng)膜上皮)細胞的細胞核和細胞質(zhì)部分中分離出聚a+rna，并利用illumina的truseqstrandedmrna文庫制備試劑盒來構(gòu)建cdna文庫。對該文庫進行對-端測序，產(chǎn)生了定位到人類基因組的100個核苷酸的讀數(shù)(2009年2月，grch37/hg19組裝體)。impdh1的測序結(jié)果顯示在圖25中。簡而言之，圖25顯示了利用ucsc基因組瀏覽器顯現(xiàn)的定位讀數(shù)，并且讀數(shù)的覆蓋范圍和數(shù)目可通過峰值信號來推斷。峰高指示由特定區(qū)域中讀數(shù)的密度給出的表達水平。所有impdh1同種型的示意圖(按比例繪制)由ucsc基因組瀏覽器(讀數(shù)信號下面)來提供，使得峰值可與impdh1外顯子和內(nèi)含子區(qū)域相匹配。根據(jù)此顯示，我們鑒定了在arpe-19細胞的細胞核部分中具有高讀數(shù)密度，但在這些細胞的細胞質(zhì)部分中沒有讀數(shù)的一個內(nèi)含子(14，由箭頭指示)(如圖25的底部圖示中的內(nèi)含子14所示)。這表明內(nèi)含子14被保留并且含內(nèi)含子14的轉(zhuǎn)錄物仍然在細胞核中。這提示含保留內(nèi)含子(ric)的impdh1前mrna是非生產(chǎn)性的，因為它未向外輸出至細胞質(zhì)。

實施例20：靶向impdh1的內(nèi)含子14的aso步移的設計

將aso步移設計為利用本文所述方法靶向內(nèi)含子14(圖26)。用2’-o-merna(ps主鏈)、以5個核苷酸間隔移位的18聚體aso(除了1種aso——imp-ivs14+18以外，以避免一段四個鳥嘌呤)來靶向內(nèi)含子14的5’剪接位點下游緊鄰的跨越+6至+65核苷酸的區(qū)域和內(nèi)含子14的3’剪接位點上游緊鄰的跨越-16至-68核苷酸的區(qū)域(圖26；表6，seqidno:246至261)。根據(jù)內(nèi)含子調(diào)節(jié)元件集中于剪接位點相鄰的序列中的知識選擇了這些靶區(qū)域。

實施例21：經(jīng)由impdh1內(nèi)含子14的aso靶向而提高的剪接效率增加轉(zhuǎn)錄物水平

為了確定我們是否可以通過利用aso提高impdh1內(nèi)含子14的剪接效率來獲得impdh1表達的增加，我們采用了本文所述的方法(圖27)。為此，利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，對arpe-19細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用圖26和表6中seqidno:246至261所描述的靶向aso中的每一種或非靶向smn-aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染。利用60nmaso(如圖27所示)進行實驗達48小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，+48靶向aso增加了impdh1轉(zhuǎn)錄物水平(圖27)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的impdh1pcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自經(jīng)對照aso處理的細胞的歸一化impdh1pcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，靶向aso(+48)使impdh1轉(zhuǎn)錄物水平增加4.0倍(圖27)。這些結(jié)果表明，利用aso提高impdh1基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例22：靶向impdh1內(nèi)含子14的aso+48的劑量響應效應

為了確定+48aso的劑量響應效應，我們采用了本文所述的方法(圖28)。利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，如圖28所示以濃度漸增的方式對arpe-19細胞進行模擬轉(zhuǎn)染或用+48aso或非靶向smn-aso對照獨立轉(zhuǎn)染72小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，+48靶向aso以劑量依賴性的方式增加了impdh1轉(zhuǎn)錄物水平(圖28)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的impdh1pcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化impdh1pcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，靶向aso(+48)使impdh1轉(zhuǎn)錄物水平增加將近1.5倍(圖28，中間圖)。利用impdh1轉(zhuǎn)錄物中別處的引物通過rtqpcr證實了這些結(jié)果，顯示了2.5倍的增加以及對aso處理的劑量依賴性響應(圖28，右圖)。此外，對于內(nèi)含子14保留計算pir(如實施例6所述)并對所述值進行繪圖，其表明隨著aso濃度和正確剪接的轉(zhuǎn)錄物增加，觀察到內(nèi)含子14保留的減少(圖28，左圖)。這些結(jié)果確認，利用aso提高impdh1基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例23：經(jīng)由impdh1內(nèi)含子14的aso靶向而提高的剪接效率增加蛋白質(zhì)水平

為了檢測在用+48aso靶向impdh1內(nèi)含子14后蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，我們采用了本文所述的方法(圖29)。利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，如圖29所示以濃度漸增的方式對arpe-19細胞進行模擬轉(zhuǎn)染或用+48aso或非靶向smn-aso對照獨立轉(zhuǎn)染72小時。簡而言之，來自經(jīng)arpe-19處理的細胞的蛋白質(zhì)提取物在4-20％sds-聚丙烯酰胺凝膠上運行，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。為了證明蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，采用抗impdh1抗體、抗β連環(huán)蛋白抗體或β肌動蛋白分別檢測impdh1，和作為加樣對照的β連環(huán)蛋白或β肌動蛋白。圖29顯示了蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其表明在用+48aso處理后impdh1以劑量依賴性的方式增加。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的impdh1蛋白的條帶強度相對于內(nèi)源性β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化impdh1蛋白條帶進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，靶向aso(+48)使impdh1蛋白水平增加至將近2.5倍(圖29)。這些結(jié)果證實，通過利用靶向impdh1內(nèi)含子14(限速內(nèi)含子)的5’剪接位點下游的區(qū)域的aso來提升剪接效率導致了靶蛋白產(chǎn)生量的增加，如圖2所示。

實施例24：靶向impdh1內(nèi)含子14的+48區(qū)域的aso微步移的設計

將aso微步移設計為利用本文所述方法靶向內(nèi)含子14的+44至+70區(qū)域(圖30)。用2’-o-me、5’-me-胞嘧啶rna(ps主鏈)、以1個核苷酸間隔移位的18聚體aso靶向內(nèi)含子14的5’剪接位點下游的跨越+44至+70的區(qū)域(圖30；表6，seqidno:262至271)。根據(jù)所觀察到的aso+48的效果(圖29)選擇了靶區(qū)域。

實施例25：經(jīng)由impdh1內(nèi)含子14+48區(qū)域的aso微步移靶向而提高的剪接效率增加轉(zhuǎn)錄物水平

為了確定我們是否可以通過利用微步移aso提高impdh1內(nèi)含子14的剪接效率來獲得impdh1表達的增加，我們采用了本文所述的方法(圖31)。為此，利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，對arpe-19細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用圖30和表6seqidno:262至271中所描述的靶向aso中的每一種或非靶向smn-aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染。利用60nmaso(如圖31所示)進行實驗達48小時。rt-qpcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso以及原始的+48aso相比，+46和+47靶向aso進一步增加了impdh1轉(zhuǎn)錄物水平(圖31)。該分析的結(jié)果表明，兩種靶向aso(+46和+47)使impdh1轉(zhuǎn)錄物水平增加至超過3.0倍(圖31)。這些結(jié)果表明，利用aso提高impdh1基因中限速內(nèi)含子的剪接速度導致了基因表達的增加，并且通過微步移精修靶區(qū)域可導致鑒定更有效的aso。

實施例26：利用新一代測序通過rnaseq鑒定pkd1轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留事件

我們利用新一代測序進行全轉(zhuǎn)錄物組鳥槍法測序，以概略顯示由pkd1基因(多囊腎病)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，從而鑒定內(nèi)含子保留事件。為此，我們從原代人腎上皮(ren)細胞的細胞核和細胞質(zhì)部分中分離出聚a+rna，并利用illumina的truseqstrandedmrna文庫制備試劑盒來構(gòu)建cdna文庫。對該文庫進行對-端測序，產(chǎn)生了定位到人類基因組的100個核苷酸的讀數(shù)(2009年2月，grch37/hg19組裝體)。pkd1的測序結(jié)果顯示在圖32中。簡而言之，圖32顯示了利用ucsc基因組瀏覽器顯現(xiàn)的定位讀數(shù)，并且讀數(shù)的覆蓋范圍和數(shù)目可通過峰值信號加以推斷。峰高指示由特定區(qū)域中讀數(shù)的密度給出的表達水平。所有pkd1同種型的示意圖(按比例繪制)由ucsc基因組瀏覽器(讀數(shù)信號下面)提供，使得峰值可與pkd1外顯子和內(nèi)含子區(qū)域相匹配。根據(jù)此顯示，我們鑒定了在ren細胞的細胞核部分中具有高讀數(shù)密度，但在這些細胞的細胞質(zhì)部分中具有極低讀數(shù)至無讀數(shù)的四個內(nèi)含子(32、33、37和38，由箭頭指示)(如圖32的底部圖示中的內(nèi)含子37所示)。這表明這四個內(nèi)含子均被保留并且含內(nèi)含子32、內(nèi)含子33、內(nèi)含子37和內(nèi)含子38的轉(zhuǎn)錄物仍然在細胞核中。這提示這些含保留內(nèi)含子(ric)的pkd1前mrna是非生產(chǎn)性的，因為它們未向外輸出至細胞質(zhì)。

實施例27：靶向pkd1的內(nèi)含子37的aso步移的設計

將aso步移設計為利用本文所述方法靶向內(nèi)含子37(圖33)。用2’-o-merna(ps主鏈)、以5個核苷酸間隔移位的18聚體aso(除了2種aso——pkd1-ivs37+8和+24以外，以避免一段四個鳥嘌呤)靶向內(nèi)含子375’剪接位點下游緊鄰的跨越+6至+66核苷酸的區(qū)域和內(nèi)含子373’剪接位點上游緊鄰的跨越-16至-51核苷酸的區(qū)域(圖33；表7，seqidno:297至312)。根據(jù)內(nèi)含子調(diào)節(jié)元件集中于剪接位點相鄰的序列中的知識選擇了這些靶區(qū)域。

實施例28：經(jīng)由pkd1內(nèi)含子37的aso靶向而提高的剪接效率增加轉(zhuǎn)錄物水平

為了確定我們是否可以通過利用aso提高pkd1內(nèi)含子37的剪接效率來獲得pkd1表達的增加，我們采用了本文所述的方法(圖34)。為此，利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，對hek293細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用圖33和表7中seqidno:297至312所描述的靶向aso中的每一種或非靶向smn-aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染。利用60nmaso(如圖34所示)進行實驗達48小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，+29靶向aso增加了pkd1轉(zhuǎn)錄物水平(圖34)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的pkd1pcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化pkd1pcr產(chǎn)物進行繪圖。來自該分析的結(jié)果表明，+29aso使pkd1轉(zhuǎn)錄物水平增加至1.8倍(圖34)。這些結(jié)果表明，利用aso提高pkd1基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例29：靶向pkd1內(nèi)含子37的aso的劑量響應效應

為了確定+29aso的劑量-響應效應，我們采用了本文所述的方法(圖35)。利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，如圖35所示以濃度漸增的方式對hek293細胞進行模擬轉(zhuǎn)染或用+29aso或非靶向smn-aso對照獨立轉(zhuǎn)染48小時。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，+29靶向aso增加了pkd1轉(zhuǎn)錄物水平(圖35)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的pkd1pcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化pkd1pcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，+29靶向aso使pkd1轉(zhuǎn)錄物水平以劑量依賴性的方式增加至超過2.0倍(圖35，中間圖)。使用pkd1轉(zhuǎn)錄物中別處的引物通過rtqpcr確認了這些結(jié)果，顯示了超過2倍的增加以及對aso處理的劑量依賴性響應(圖35，右圖)。此外，對于內(nèi)含子37保留計算pir(如實施例6所述)并對所述值進行繪圖，其表明隨著aso濃度和正確剪接的轉(zhuǎn)錄物增加，觀察到內(nèi)含子37保留的減少(圖35，左圖)。這些結(jié)果確認，利用aso提高pkd1基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例30：經(jīng)由pkd1內(nèi)含子37的aso靶向而提高的剪接效率增加蛋白質(zhì)水平

為了檢測在用+29aso靶向pkd1內(nèi)含子37后蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，我們采用了本文所述的方法(圖36)。利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，如圖36所示以濃度漸增的方式對hek293細胞進行模擬轉(zhuǎn)染或用+29aso或非靶向smn-aso對照獨立轉(zhuǎn)染72小時。簡而言之，將細胞固定和透化處理，并用抗pkd1抗體或igg同種型對照抗體進行處理。通過流式細胞術(shù)計數(shù)10,000個細胞來分析細胞。圖36顯示了熒光強度/細胞計數(shù)的圖，其表明與模擬處理(未處理)的細胞相比，aso濃度越高的細胞具有越強的pkd1信號。由對應于經(jīng)+29aso處理的細胞的熒光強度相對于對應于模擬處理的細胞的熒光強度的倍數(shù)變化進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，靶向aso(+29)使pkd1蛋白水平增加至將近1.5倍(圖36)。這些結(jié)果證實，通過利用靶向pkd1內(nèi)含子37(限速內(nèi)含子)的5’剪接位點下游的區(qū)域的aso來提升剪接效率導致了靶蛋白產(chǎn)生量的增加，如圖2所示。

實施例31：利用新一代測序通過rnaseq鑒定ikbkap轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留事件

我們利用新一代測序進行全轉(zhuǎn)錄物組鳥槍法測序，以概略顯示由ikbkap基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，從而鑒定內(nèi)含子保留事件。為此目的，我們從arpe-19、ast、人支氣管上皮(bron)、hcn、ren和thle-3細胞的細胞核和細胞質(zhì)部分中分離出聚a+rna，并利用illumina的truseqstrandedmrna文庫制備試劑盒來構(gòu)建cdna文庫。對該文庫進行對-端測序，產(chǎn)生了定位到人類基因組的100個核苷酸的讀數(shù)(2009年2月，grch37/hg19組裝體)。ikbkap的測序結(jié)果顯示在圖37中。簡而言之，圖37顯示了利用ucsc基因組瀏覽器顯現(xiàn)的定位讀數(shù)，并且讀數(shù)的覆蓋范圍和數(shù)目可通過峰值信號加以推斷。峰高指示由特定區(qū)域中讀數(shù)的密度給出的表達水平。所有ikbkap同種型的示意圖(按比例繪制)由ucsc基因組瀏覽器(讀數(shù)信號下面)提供，使得峰值可與ikbkap外顯子和內(nèi)含子區(qū)域相匹配。根據(jù)此顯示，我們鑒定了在所有測序細胞的細胞核部分中具有高讀數(shù)密度，但在這些細胞的細胞質(zhì)部分中沒有讀數(shù)的2個內(nèi)含子(7和8，由箭頭指示)(如圖37的底部圖示中的兩個內(nèi)含子所示)。這表明內(nèi)含子7和8均被保留并且含內(nèi)含子7和內(nèi)含子8的轉(zhuǎn)錄物仍然在細胞核中。這提示含保留內(nèi)含子(ric)的ikbkap前mrna是非生產(chǎn)性的，因為它們未向外輸出至細胞質(zhì)。

實施例32：通過ikbkap的rnaseq分析鑒定的內(nèi)含子保留事件的驗證

利用本文所述的方法進行ikbkap(家族性自主神經(jīng)功能異常)基因中內(nèi)含子7-保留事件的驗證(圖38)。簡而言之，如實施例1中所述采用來自arpe-19、hela和u2os細胞的細胞核和細胞質(zhì)rna提取物進行放射性逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)。在該實施例中，利用導致含內(nèi)含子7的轉(zhuǎn)錄物和正確剪接的轉(zhuǎn)錄物均擴增的位于外顯子6和外顯子8中的引物來評估內(nèi)含子保留。產(chǎn)物在5％聚丙烯酰胺凝膠中運行，并通過磷成像進行可視化。以對應于含內(nèi)含子7的產(chǎn)物的條帶強度相對于總轉(zhuǎn)錄物(含內(nèi)含子的加上正確剪接的)的內(nèi)含子保留百分比(pir)來計算內(nèi)含子7保留水平。條帶的量化表明約35％的ikbkap轉(zhuǎn)錄物含有內(nèi)含子7并且該產(chǎn)物保留在細胞核中。此外，放射性rt-pcr結(jié)果驗證了生物信息學預測，證實rnaseq結(jié)果的生物信息學分析是鑒定內(nèi)含子保留事件的有力工具。

實施例33：靶向ikbkap的內(nèi)含子7和8的aso步移的設計

將aso步移設計為利用本文所述方法靶向內(nèi)含子7(頂部圖幅)或內(nèi)含子8(底部圖幅)(圖39)。用2’-o-merna(ps主鏈)、以5個核苷酸間隔移位的18聚體aso靶向內(nèi)含子7或8的5’剪接位點下游緊鄰的跨越+6至+58核苷酸的區(qū)域和內(nèi)含子7或8的3’剪接位點上游緊鄰的跨越-16至-68核苷酸的區(qū)域(圖39；表8，seqidno:329至360)。根據(jù)內(nèi)含子調(diào)節(jié)元件集中于剪接位點相鄰的序列中的知識選擇了這些靶區(qū)域。

實施例34：經(jīng)由ikbkap內(nèi)含子7和8的aso靶向而提高的剪接效率增加轉(zhuǎn)錄物水平

為了確定我們是否可以通過利用aso提高ikbkap內(nèi)含子7或8的剪接效率來獲得ikbkap表達的增加，我們采用了本文所述的方法(圖40)。為此，利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，對arpe-19細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用圖39和表8中seqidno:329至360所描述的靶向aso中的每一種或非靶向smn-aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染。利用60nmaso(如圖40所示)進行實驗達48小時。相對于來自模擬處理的細胞的歸一化ikbkappcr產(chǎn)物而繪圖的rt-qpcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，ivs7+26靶向aso(頂部圖)以及ivs8+26和-16(底部圖)靶向aso增加了ikbkap轉(zhuǎn)錄物水平(圖40)。該分析表明，這些aso使ikbkap轉(zhuǎn)錄物水平增加將近1.2-1.6倍(圖40)。這些結(jié)果表明，利用aso提高ikbkap基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例35：靶向ikbkap內(nèi)含子7和8的aso的劑量響應效應

為了確定ivs7+26和ivs8-16aso的劑量-響應效應，我們采用了本文所述的方法(圖41)。利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，以濃度漸增的方式對arpe-19細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用ivs7+26或ivs8-16aso，或非靶向smn-aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染，或用各自45nm的兩種aso的組合轉(zhuǎn)染72小時(圖41)。放射性rt-pcr結(jié)果顯示，與模擬轉(zhuǎn)染或非靶向aso相比，ivs7+26或ivs8-16靶向aso以劑量依賴性的方式增加了ikbkap轉(zhuǎn)錄物水平(圖41)。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的ikbkappcr產(chǎn)物的條帶強度相對于β肌動蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化ikbkappcr產(chǎn)物進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，ivs7+26和ivs8-16靶向aso，并且它們的組合使ikbkap轉(zhuǎn)錄物水平以劑量依賴性的方式增加至2.0-2.5倍(圖40)。這些結(jié)果確認，利用aso提高ikbkap基因中限速內(nèi)含子的剪接效率導致基因表達增加。

實施例36：經(jīng)由ikbkap內(nèi)含子7或8的aso靶向而提高的剪接效率增加蛋白質(zhì)水平

為了分別檢測在用ivs7+26aso或ivs8-16aso靶向ikbkap內(nèi)含子7或8后蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，我們采用了本文所述的方法(圖42)。利用rnaimax(rim)(invitrogen)遞送試劑，以濃度漸增的方式對arpe-19細胞進行模擬轉(zhuǎn)染，或用ivs7+26aso或ivs8-16aso，或非靶向smn-aso對照獨立地進行轉(zhuǎn)染，或用各自45nm的兩種aso的組合轉(zhuǎn)染72小時(圖42)。簡而言之，來自經(jīng)arpe-19處理的細胞的蛋白質(zhì)提取物在4-20％sds-聚丙烯酰胺凝膠上運行，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。為了證明蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的增加，采用抗ikap抗體或抗β連環(huán)蛋白抗體分別檢測ikap，和作為加樣對照的β連環(huán)蛋白。圖42顯示了蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其表明在用ivs7+26aso或ivs8-16aso或兩種aso的組合處理后ikap以劑量依賴性的方式增加。將對應于來自靶向-aso轉(zhuǎn)染細胞的ikap蛋白的條帶強度相對于內(nèi)源性β連環(huán)蛋白進行歸一化，并相對于來自模擬處理的細胞的歸一化ikap蛋白質(zhì)條帶進行繪圖。該分析的結(jié)果表明，靶向asoivs7+26和ivs8-16使ikap蛋白水平增加至約3倍(圖42)。這些結(jié)果證實，通過利用靶向ikbkap內(nèi)含子7的5’剪接位點下游的區(qū)域或ikbkap內(nèi)含子8的3’剪接位點上游的區(qū)域的aso來提升剪接效率導致了靶蛋白產(chǎn)生量的增加，如圖2所述。

表11：prpf31靶序列

表12：rb1靶序列

表13：hbb靶序列

表14：hbg1/hbg2靶序列

表15：cftr靶序列

表16：adamts13靶序列

表17：tsc1靶序列

表18：impdh1靶序列

表19：pkd1靶序列

表20：ikbkap靶序列