相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2014年11月14日提交的標(biāo)題為treatmentofamyotrophiclateralsclerosis(als)withsirnastargetingsod-1的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/079,588、2015年8月31日提交的標(biāo)題為compositionsandmethodsoftreatingamyotrophiclateralsclerosis(als)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/211,992、2015年9月29日提交的標(biāo)題為compositionsandmethodsoftreatingamyotrophiclateralsclerosis(als)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/234,466的權(quán)益；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文。對(duì)序列表的參考本申請(qǐng)與電子形式的序列表一起提交。所述序列表作為2015年11月12日創(chuàng)建的標(biāo)題為1011pctsl.txt的文件提供，其大小為126,873字節(jié)。電子形式的序列表中的信息通過引用整體并入本文。本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)性多核苷酸，例如靶向超氧化物歧化酶1(sod1)基因的小干擾rna(sirna)分子，的組合物、方法和設(shè)計(jì)、制備、生產(chǎn)、使用的方法和/或制劑。本文中使用的“調(diào)節(jié)性多核苷酸”是起作用以調(diào)節(jié)(增加或降低)靶基因的水平或量(例如，mrna或蛋白水平)的任何核酸序列。sod1基因的靶向可以干擾sod1基因表達(dá)和sod1酶生產(chǎn)。在某些實(shí)施方案中，將編碼sirna分子的核酸序列插入重組腺伴隨病毒(aav)載體中。還公開了使用sirna分子抑制具有神經(jīng)變性疾病(例如肌萎縮性側(cè)索硬化(als))的受試者中的sod1基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
：肌萎縮性側(cè)索硬化(als)也被稱作盧·格里格病()lougehrig'sdisease)，是最致命的進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，其特征在于在初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、腦干和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(mn)的顯著損失。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失會(huì)破壞基礎(chǔ)性的基本動(dòng)作，諸如呼吸，并通常在診斷以后2～5年內(nèi)造成患者的死亡?；颊咧羞\(yùn)動(dòng)功能的進(jìn)行性衰退嚴(yán)重地破壞他們的呼吸能力，因而患者的存活需要某種形式的呼吸輔助。其它癥狀也包括手、臂、腿或吞咽肌的肌無力。有些患者(例如，ftd-als)還可能發(fā)生額顳葉癡呆。根據(jù)als協(xié)會(huì)，在美國每年診斷出大約5,600人患有als。als的發(fā)病率是每100,000人中2人，且據(jù)估測，多達(dá)30,000美國人在任何給定的時(shí)間可能患有該疾病。已經(jīng)描述了als的兩種形式：一種是散發(fā)的als(sals)，這是在美國最常見的als的形式，并占所有診斷的病例的90-95％；另一種是家族性的als(fals)，這發(fā)生在主要具有顯性遺傳的家族譜系中，且僅占美國所有病例的約5-10％。sals和fals在臨床上是不能辨別的。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞過程的紊亂發(fā)生在疾病發(fā)作以后，包括增加的er應(yīng)激、自由基(即，活性氧(ros))的產(chǎn)生、線粒體功能障礙、蛋白聚集、細(xì)胞凋亡、炎癥和谷氨酸鹽興奮性中毒，特別是在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(mn)中。als的原因是復(fù)雜的和不同的。一般而言，認(rèn)為als是一種復(fù)雜的遺傳性障礙，其中與環(huán)境暴露組合的多個(gè)基因聯(lián)合使得人成為易患的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了十多個(gè)與als有關(guān)的基因，包括sod-1(cu2+/zn2+超氧化物歧化酶)、tdp-43(tardbp、tardna結(jié)合蛋白-43)、fus(在肉瘤中融合/在肉瘤中轉(zhuǎn)移)、ang(血管生成素)、atxn2(共濟(jì)失調(diào)蛋白2(ataxin-2))、含有纈酪肽的蛋白(vcp)、optn(視神經(jīng)病變誘導(dǎo)基因(optineurin))和染色體9開放讀碼框72(c9orf72)中的非編碼ggggcc六核苷酸重復(fù)序列的擴(kuò)增。但是，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的確切機(jī)制仍然是難以捉摸的。目前，不存在als的治愈性治療。唯一的fda批準(zhǔn)的藥物是利魯唑，其拮抗谷氨酸鹽應(yīng)答以減少als的病理學(xué)發(fā)展。但是，已經(jīng)報(bào)道了處于早期階段的als患者的僅約3個(gè)月的壽命延長，尚未觀察到對(duì)于處于晚期階段的als患者而言的治療益處，這表明了患者的治療選擇的缺乏(bensimong等人,jneurol.2002,249,609-615)。因此，仍然需要可以有效地阻止疾病進(jìn)展的新治療策略。正在針對(duì)散發(fā)性和家族性als的潛在治療研究許多不同的策略。一個(gè)策略是基于可以促進(jìn)神經(jīng)元存活的神經(jīng)營養(yǎng)因子(諸如胰島素-樣生長因子i(igf-i)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(gdnf)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、colivelin和活性依賴性的神經(jīng)營養(yǎng)因子(adnf)衍生的肽)的神經(jīng)保護(hù)和/或再生作用。幾個(gè)研究證實(shí)，神經(jīng)營養(yǎng)因子在sod1轉(zhuǎn)基因小鼠中可以維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能性，因此改善運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。但是，這樣的治療經(jīng)常不能延長sod1小鼠的存活，從而提示，神經(jīng)營養(yǎng)因子不足以延長神經(jīng)元存活(參見yacila和sari,currmedchem.,2014,21(31),3583-3593的綜述)。als治療的另一個(gè)策略已經(jīng)聚焦于基于干細(xì)胞的療法。干細(xì)胞具有產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的潛力，由此替代als受影響的cns(諸如初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、腦干和脊髓)中的退化運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。已經(jīng)研究了從多種來源衍生出的干細(xì)胞，包括誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ipsc)、間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)(例如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bmsc)和脂肪細(xì)胞干細(xì)胞(asc))和神經(jīng)組織起源神經(jīng)干細(xì)胞(例如，胎兒脊神經(jīng)干細(xì)胞(nsc)、多能神經(jīng)祖細(xì)胞(npc))(例如，kimc等人,exp.neurobiol.,2014,23(3),207-214的綜述)。超氧化物歧化酶i型(sod1；cu2+/zn2+超氧化物歧化酶i型)基因中的突變是fals的最常見原因，占所有fals病例的約20-30％。最近的報(bào)告表明，sod1突變也可能與所有sals病例中的約4％有關(guān)(robberecht和philip,nat.rev.neurosci.,2013,14,248-264)。sod1有關(guān)的fals最可能不是由正常sod1活性的損失造成，而是由有毒功能的獲得造成。關(guān)于突變體sod1有關(guān)的fals毒性的假設(shè)之一提出，異常的sod1酶造成諸如過氧亞硝酸鹽或過氧化氫的小分子以產(chǎn)生破壞性的自由基。關(guān)于突變體sod1神經(jīng)毒性的其它假設(shè)包括蛋白酶體活性的抑制、線粒體損傷、rna加工的破壞和細(xì)胞內(nèi)聚集體的形成。突變體sod1變體和/或野生型sod1在als中的異常積累形成不溶性的纖絲狀聚集體，其被鑒別為病理性包涵體。聚集的sod1蛋白可以誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激(vehvilainenp等人,frontcellneurosci.,2014,8,126)和對(duì)細(xì)胞、特別是對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的其它毒性。這些發(fā)現(xiàn)表明，sod1可以是家族性和散發(fā)性als的潛在治療靶標(biāo)。可以減少在als患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的sod1蛋白的療法可能改善患者中的als的癥狀，例如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性以及肌無力和萎縮。目的在于阻止野生型和/或突變體sod1蛋白聚集的形成的試劑和方法可能阻止疾病進(jìn)展和允許改善als癥狀。近年來，rna干擾(rnai)介導(dǎo)的基因沉默已經(jīng)引起研究人員的興趣。在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)教導(dǎo)了靶向sod1基因的小雙鏈rna(小干擾rna)分子在治療als中的潛力(參見，例如，美國專利號(hào)7,632,938和美國專利公開號(hào)20060229268，其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。本發(fā)明開發(fā)了基于rna干擾的方案來抑制或阻止als患者中的sod1的表達(dá)，用于治療所述疾病。本發(fā)明提供了新的雙鏈rna(dsrna)構(gòu)建體和sirna構(gòu)建體以及它們的設(shè)計(jì)方法。另外，這些新的sirna構(gòu)建體可以是合成的分子或在用于遞送進(jìn)細(xì)胞中的表達(dá)載體(一條或兩條鏈)中編碼。這樣的載體包括但不限于腺伴隨病毒載體，例如任一種aav血清型的載體基因組，或其它病毒遞送媒介物，例如慢病毒等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及rna分子介導(dǎo)的基因特異性的對(duì)基因表達(dá)和蛋白生產(chǎn)的干擾。在本發(fā)明中還包括用于治療諸如肌萎縮性側(cè)索硬化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性疾病的方法。在本文表征的組合物中包括的sirna包括具有反義鏈(反義鏈)的dsrna，所述反義鏈具有長30個(gè)核苷酸或更少、通常19-24個(gè)核苷酸的區(qū)域，其與sod1基因的mrna轉(zhuǎn)錄物的至少部分基本上互補(bǔ)。本發(fā)明提供了短雙鏈rna分子，如小干擾rna(sirna)雙鏈體，其靶向sod1mrna以干擾sod1基因表達(dá)和/或sod1蛋白生產(chǎn)。本發(fā)明的sirna雙鏈體可以干擾sod1基因的兩個(gè)等位基因(不論sod1基因中的任何特定突變)，且可以特別地與在als疾病中發(fā)現(xiàn)的那些相互作用。在某些實(shí)施方案中，將這樣的sirna分子或所述sirna分子的單鏈插入要引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和/或其它周圍細(xì)胞中的腺伴隨病毒載體中。本發(fā)明的sirna雙鏈體包含雜交在一起從而形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的反義鏈和有義鏈，其中所述反義鏈與靶向的sod1基因的核酸序列互補(bǔ)，且其中所述有義鏈與靶向的sod1基因的核酸序列同源。在某些方面，所述反義鏈的5’末端具有5’磷酸酯基團(tuán)，且所述有義鏈的3’末端含有3’羥基。在其它方面，在每個(gè)鏈的3’末端處不存在核苷酸突出端、或者存在1或2個(gè)核苷酸突出端。根據(jù)本發(fā)明，靶向sod1基因的sirna雙鏈體的每個(gè)鏈?zhǔn)羌s19-25個(gè)核苷酸的長度，優(yōu)選約19個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸、21個(gè)核苷酸、22個(gè)核苷酸、23個(gè)核苷酸、24個(gè)核苷酸或25個(gè)核苷酸的長度。在某些方面，所述sirna可以是未修飾的rna分子。在其它方面，所述sirna可以含有至少一個(gè)修飾的核苷酸，諸如堿基、糖或主鏈修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，sirna或dsrna包括至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列。所述dsrna包括具有第一序列的有義鏈和具有第二序列的反義鏈。所述反義鏈包括與編碼sod1的mrna的至少部分基本上互補(bǔ)的核苷酸序列，且互補(bǔ)性區(qū)域是30個(gè)核苷酸或更少，和至少15個(gè)核苷酸的長度。通常，所述dsrna是19-24(例如，19-21)個(gè)核苷酸的長度。在某些實(shí)施方案中，所述dsrna是約15至約25個(gè)核苷酸的長度，且在其它實(shí)施方案中，所述dsrna是約25至約30個(gè)核苷酸的長度。在與表達(dá)sod1的細(xì)胞接觸后或在表達(dá)sod1的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后，所述dsrna使sod1基因的表達(dá)抑制或阻止至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％或更多，諸如當(dāng)通過如本文中所述的方法測定時(shí)。根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)aav載體，其包含編碼sirna雙鏈體、sirna雙鏈體的一條鏈或靶向sod1基因的dsrna的核酸，aav載體血清型可以是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8和/或aav-dj、及其變體。根據(jù)本發(fā)明，靶向als中的sod1基因的sirna雙鏈體或dsrna選自在表3、11或13中列出的sirna雙鏈體。優(yōu)選地，靶向als中的sod1基因的所述sirna雙鏈體或dsrna選自sirna雙鏈體：d-2757、d-2806、d-2860、d-2861、d-2875、d-2871、d-2758、d-2759、d-2866、d-2870、d-2823和d-2858。本發(fā)明也提供了藥物組合物，其包含至少一種靶向sod1基因的sirna雙鏈體和藥學(xué)上可接受的載體。在某些方面，將編碼sirna雙鏈體的核酸序列插入aav載體中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制/沉默細(xì)胞中的sod1基因表達(dá)的方法。因此，所述sirna雙鏈體或dsrna可以用于基本上抑制細(xì)胞中、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的sod1基因表達(dá)。在某些方面，sod1基因表達(dá)的抑制表示抑制至少約20％，優(yōu)選地抑制至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。因此，可以將靶向的基因的蛋白產(chǎn)物抑制至少約20％，優(yōu)選地抑制至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。所述sod1基因可以是野生型基因或具有至少一個(gè)突變的經(jīng)突變的sod1基因。因此，所述sod1蛋白是野生型蛋白或具有至少一個(gè)突變的突變多肽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或改善需要治療的受試者中與異常的sod1基因和/或sod1蛋白有關(guān)的肌萎縮性側(cè)索硬化的方法，所述方法包括：給所述受試者施用藥學(xué)有效量的至少一種靶向sod1基因的sirna雙鏈體，將所述sirna雙鏈體遞送進(jìn)靶向的細(xì)胞，抑制sod1基因表達(dá)和蛋白生產(chǎn)，和改善受試者中的als癥狀。在某些實(shí)施方案中，將aav載體施用給需要治療和/或改善als的受試者，所述aav載體包含編碼至少一種靶向sod1基因的sirna雙鏈體的核酸序列。aav載體血清型可以選自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10和aav-dj及其變體。在某些方面，als是與sod1突變有關(guān)的家族性als。在其它方面，als是以sod1蛋白的異常聚集或者sod1蛋白功能或定位的破壞(盡管非必然地作為基因突變的結(jié)果)為特征的散發(fā)性als。通過本發(fā)明的方法改善的als癥狀可以包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性、肌無力、肌肉僵硬、言語不清和/或呼吸困難。在某些實(shí)施方案中，可以將靶向sod1基因的所述sirna雙鏈體或dsrna或包含這樣的編碼sirna的分子的aav載體直接引入受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，例如，通過顱內(nèi)注射。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥物組合物用作單獨(dú)療法。在其它實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥物組合物用在聯(lián)合療法中。所述聯(lián)合療法可以是與一種或多種神經(jīng)保護(hù)劑(諸如小分子化合物、生長因子和激素，它們已經(jīng)針對(duì)它們對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了試驗(yàn))聯(lián)合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給有此需要的受試者施用治療有效量的本文描述的質(zhì)?；騛av載體來治療或改善肌萎縮性側(cè)索硬化的方法。所述als可以是家族性als或散發(fā)性als。附圖說明從附圖所示的本發(fā)明的特定實(shí)施方案的以下描述會(huì)明白前述和其它目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)，在附圖中，在不同的視圖中相同的附圖標(biāo)記表示相同的部件。附圖不一定按比例，而是將重點(diǎn)放在解釋本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案的原理。圖1的直方圖顯示了在aav載體中編碼的構(gòu)建體的活性。圖2的直方圖顯示了在aav載體中編碼的調(diào)節(jié)性多核苷酸的引導(dǎo)鏈在hek293t細(xì)胞中的活性。圖3的直方圖顯示了在aav載體中編碼的調(diào)節(jié)性多核苷酸的過客鏈在hek293t細(xì)胞中的活性。圖4的直方圖顯示了在aav載體中編碼的調(diào)節(jié)性多核苷酸的引導(dǎo)鏈在hela細(xì)胞中的活性。圖5的直方圖顯示了在aav載體中編碼的調(diào)節(jié)性多核苷酸的過客鏈在hela細(xì)胞中的活性。圖6是細(xì)胞內(nèi)aavdna的直方圖。圖7的直方圖顯示了在aav載體中編碼的構(gòu)建體在人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的活性。圖8的圖顯示了在u251mg細(xì)胞中的sod1的劑量依賴性的沉默。圖9的圖顯示了在人星形膠質(zhì)細(xì)胞中的sod1的劑量依賴性的沉默。圖10的圖顯示了在u251mg細(xì)胞中的sod1的沉默的時(shí)程。圖11包含圖11a、11b和11c，它們是顯示構(gòu)建體的劑量依賴性作用的圖。圖11a顯示了相對(duì)sod1表達(dá)。圖11b顯示了引導(dǎo)鏈的百分比。圖11c顯示了過客鏈的百分比。圖12的簡圖顯示了調(diào)節(jié)性多核苷酸(mp)相對(duì)于itr、內(nèi)含子(i)和聚腺苷酸(p)的位置。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)性多核苷酸，例如，作為治療劑的rna或dna分子。rna干擾介導(dǎo)的基因沉默可以特異性地抑制靶向的基因表達(dá)。本發(fā)明然后提供了靶向sod1基因的小雙鏈rna(dsrna)分子(小干擾rna、sirna)，包含這樣的sirna的藥物組合物，以及它們的設(shè)計(jì)方法。本發(fā)明也提供了它們用于抑制sod1基因表達(dá)和蛋白生產(chǎn)、用于治療神經(jīng)變性疾病(具體地，肌萎縮性側(cè)索硬化(als))的方法。本發(fā)明提供了靶向sod1mrna以干擾sod1基因表達(dá)和/或sod1蛋白生產(chǎn)的小干擾rna(sirna)雙鏈體(和編碼它們的調(diào)節(jié)性多核苷酸)。本發(fā)明的sirna雙鏈體可以干擾sod1基因的兩個(gè)等位基因(不論sod1基因中的任何特定突變)，且可以特別地與在als疾病中發(fā)現(xiàn)的那些相互作用。在某些實(shí)施方案中，將編碼這樣的sirna分子或所述sirna分子的單鏈的核酸序列插入腺伴隨病毒載體中并引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和/或其它周圍細(xì)胞中。本發(fā)明的編碼的sirna雙鏈體含有雜交在一起從而形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的反義鏈和有義鏈，其中所述反義鏈與靶向的sod1基因的核酸序列互補(bǔ)，且其中所述有義鏈與靶向的sod1基因的核酸序列同源。在某些方面，所述反義鏈的5’末端具有5’磷酸酯基團(tuán)，且所述有義鏈的3’末端含有3’羥基。在其它方面，在每個(gè)鏈的3’末端處不存在核苷酸突出端、或者存在1或2個(gè)核苷酸突出端。根據(jù)本發(fā)明，靶向sod1基因的sirna雙鏈體的每個(gè)鏈?zhǔn)羌s19-25、19-24或19-21個(gè)核苷酸的長度，優(yōu)選約19個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸、21個(gè)核苷酸、22個(gè)核苷酸、23個(gè)核苷酸、24個(gè)核苷酸或25個(gè)核苷酸的長度。在某些方面，所述sirna可以是未修飾的rna分子。在其它方面，所述sirna可以含有至少一個(gè)修飾的核苷酸，諸如堿基、糖或主鏈修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，sirna或dsrna包括至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列。所述dsrna包括具有第一序列的有義鏈和具有第二序列的反義鏈。所述反義鏈包括與編碼sod1的mrna的至少部分基本上互補(bǔ)的核苷酸序列，且所述互補(bǔ)性區(qū)域是30個(gè)核苷酸或更少，和至少15個(gè)核苷酸的長度。通常，所述dsrna是19-25、19-24或19-21個(gè)核苷酸的長度。在某些實(shí)施方案中，所述dsrna是約15至約25個(gè)核苷酸的長度，且在其它實(shí)施方案中，所述dsrna是約25至約30個(gè)核苷酸的長度。在與表達(dá)sod1的細(xì)胞接觸后，所述dsrna(無論是直接地施用還是在表達(dá)載體中編碼)使sod1基因的表達(dá)抑制至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％或更多，諸如當(dāng)通過如本文中所述的方法測定時(shí)。在本文表征的組合物中包括的sirna包含具有反義鏈(反義鏈)的dsrna，所述反義鏈具有30個(gè)核苷酸或更少、通常19-25、19-24或19-21個(gè)核苷酸長度的區(qū)域，其與sod1基因的mrna轉(zhuǎn)錄物的至少部分基本上互補(bǔ)。根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)aav載體，其包含靶向sod1基因的sirna雙鏈體的核酸、sirna雙鏈體的一條鏈或dsrna，aav載體血清型可以是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8和aav-dj及其變體。根據(jù)本發(fā)明，靶向als中的sod1基因的sirna雙鏈體或編碼的dsrna選自在表3中列出的sirna雙鏈體。在某些實(shí)施方案中，靶向als中的sod1基因的所述sirna雙鏈體或dsrna選自sirna雙鏈體：d-2757、d-2806、d-2860、d-2861、d-2875、d-2871、d-2758、d-2759、d-2866、d-2870、d-2823和d-2858。本發(fā)明也提供了藥物組合物，其包含至少一種靶向sod1基因的sirna雙鏈體和藥學(xué)上可接受的載體。在某些方面，所述sirna雙鏈體由aav載體編碼。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制/沉默細(xì)胞中的sod1基因表達(dá)的方法。因此，可以使用所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna基本上抑制細(xì)胞中、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的sod1基因表達(dá)。在某些方面，sod1基因表達(dá)的抑制表示抑制至少約20％，諸如抑制至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，可以將靶向的基因的蛋白產(chǎn)物抑制至少約20％，優(yōu)選地抑制至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。所述sod1基因可以是野生型基因或含有至少一個(gè)突變的經(jīng)突變的sod1基因。因此，所述sod1蛋白是野生型蛋白或含有至少一個(gè)突變的經(jīng)突變的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna可以用于使sod1蛋白的表達(dá)減少至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，可以使sod1蛋白的表達(dá)減少50-90％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna可以用于使sod1mrna的表達(dá)減少至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，可以使sod1mrna的表達(dá)減少50-90％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna可以用于減少cns(例如，但不限于脊髓、前腦、中腦或后腦)的至少一個(gè)區(qū)域中的sod1蛋白和/或mrna的表達(dá)。在cns的至少一個(gè)區(qū)域中使sod1蛋白和/或mrna的表達(dá)減少至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，使脊髓中sod1蛋白和mrna的表達(dá)減少50-90％。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在需要治療的受試者中治療或改善與異常的sod1基因和/或sod1蛋白有關(guān)的肌萎縮性側(cè)索硬化的方法，所述方法包括：給所述受試者施用藥學(xué)有效量的至少一種靶向sod1基因的sirna雙鏈體或編碼sirna雙鏈體的核酸，將所述sirna雙鏈體(或編碼的雙鏈體)遞送進(jìn)靶向的細(xì)胞，抑制sod1基因表達(dá)和蛋白生產(chǎn)，和改善受試者中的als癥狀。在某些實(shí)施方案中，將aav載體施用給需要治療和/或改善als的受試者，所述aav載體包含至少一種靶向sod1基因的sirna雙鏈體的核酸序列。aav載體血清型可以選自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8(aavdj8)和aav-dj(aavdj)、及其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述aav載體血清型是aav2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述aav載體是aavdj。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述aav載體血清型是aavdj8。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明中可能有用的血清型可以是aav-dj8。aav-dj8的氨基酸序列可以包含兩個(gè)或更多個(gè)突變以便除去肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hbd)。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，在美國專利號(hào)7,588,772(其內(nèi)容通過引用整體并入本文)中描述為seqidno:1的aav-dj序列可以包含兩個(gè)突變:(1)r587q，其中在氨基酸587處的精氨酸(r；arg)被改變成谷氨酰胺(q；gln)，和(2)r590t，其中在氨基酸590處的精氨酸(r；arg)被改變成蘇氨酸(t；thr)。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，可以包含三個(gè)突變：(1)k406r，其中在氨基酸406處的賴氨酸(k；lys)被改變成精氨酸(r；arg)、(2)r587q，其中在氨基酸587處的精氨酸(r；arg)被改變成谷氨酰胺(q；gln)和(3)r590t，其中在氨基酸590處的精氨酸(r；arg)被改變成蘇氨酸(t；thr)。在某些方面，als是與sod1突變有關(guān)的家族性als。在其它方面，als是以sod1蛋白的異常聚集或者sod1蛋白功能和定位的破壞為特征的散發(fā)性als。通過本發(fā)明的方法改善的als癥狀可以包括、但不限于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性、肌無力、肌肉僵硬、言語不清和/或呼吸困難。在某些實(shí)施方案中，可以將靶向sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna或包含這樣的sirna分子的aav載體直接引入受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，例如，通過顱內(nèi)注射。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥物組合物用作單獨(dú)療法。在其它實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥物組合物用在聯(lián)合療法中。所述聯(lián)合療法可以是與一種或多種神經(jīng)保護(hù)劑(諸如小分子化合物、生長因子和激素，它們已經(jīng)針對(duì)它們對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了試驗(yàn))聯(lián)合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給有此需要的受試者施用治療有效量的本文描述的質(zhì)?；騛av載體來治療或改善肌萎縮性側(cè)索硬化的方法。所述als可以是家族性als或散發(fā)性als。在下面的伴隨描述中闡述了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。盡管與本文描述的那些類似或等同的任何材料和方法可以用在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選的材料和方法。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將從描述中顯而易見。在描述中，單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另外清楚地指明。除非另外定義，在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。在沖突的情況下，以本說明書為準(zhǔn)。肌萎縮性側(cè)索硬化(als)肌萎縮性側(cè)索硬化(als)(一種成年發(fā)作的神經(jīng)變性障礙)是一種以運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、腦干和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的選擇性死亡為特征的進(jìn)行性的和致命的疾病。als的發(fā)病率是約1.9/100,000。被診斷出als的患者發(fā)生以痙攣狀態(tài)、反射亢進(jìn)或反射減弱、肌束震顫、肌肉萎縮和麻痹為特征的進(jìn)行性肌肉表型。這些運(yùn)動(dòng)病損由肌肉的去神經(jīng)支配(由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失)造成。als的主要病理學(xué)特征包括：皮質(zhì)脊髓束的變性以及下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(lmn)或前角細(xì)胞的廣泛損失(ghatak等人,jneuropatholexpneurol.,1986,45,385-395)，初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中的betz細(xì)胞和其它錐體細(xì)胞的變性和損失(udaka等人,actaneuropathol,1986,70,289-295；maekawa等人,brain,2004,127,1237-1251)，和運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)和脊髓中的反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生(kawamata等人,amjpathol.,1992,140,691-707；和schiffer等人,jneurolsci.,1996,139,27-33)。由于呼吸缺陷和/或炎癥，als經(jīng)常在診斷以后3-5年內(nèi)是致命的(rowlandlp和shneibderna,nengl.j.med.,2001,344,1688-1700)。als的一種細(xì)胞標(biāo)志是蛋白性的、泛素化的、胞質(zhì)包涵體在退化運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和周圍細(xì)胞(例如，星形膠質(zhì)細(xì)胞)中的存在。泛素化的包涵體(即，露易小體樣包涵體或skein樣包涵體)是als中的包涵體的最常見的和特異性的類型，且見于脊髓和腦干的lmn中以及皮質(zhì)脊髓的上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(umn)中(matsumoto等人,jneurolsci.,1993,115,208-213；和sasak和maruyama,actaneuropathol.,1994,87,578-585)。已經(jīng)將幾種蛋白鑒別為包涵體的組分，包括泛素、cu/zn超氧化物歧化酶1(sod1)、外周蛋白和dorfin。神經(jīng)絲性包涵體經(jīng)常見于als中的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)的透明簇生包涵體(hci)和軸突‘球狀體’中。其它類型和更低特異性的包涵體包括在皮質(zhì)的上層中的布尼納小體(含有半胱氨酸蛋白酶抑制劑c的包涵體)和新月形包涵體(sci)。在als中看到的其它神經(jīng)病理學(xué)特征包括高爾基體的片段化、線粒體空泡形成和突觸末梢的超微結(jié)構(gòu)異常(fujita等人,actaneuropathol.2002,103,243-247)。另外，在額顳葉癡呆als(ftd-als)中，也觀察到皮質(zhì)萎縮(包括額葉和顳葉)，其可以在ftd-als患者中造成認(rèn)知損害。als是一種復(fù)雜的和多因素的疾病，并且多種機(jī)制被假定為als發(fā)病機(jī)制的原因，包括、但不限于蛋白降解的功能障礙、谷氨酸鹽興奮性中毒、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡、氧化性應(yīng)激、炎癥、蛋白錯(cuò)誤折疊和聚集、異常的rna代謝和改變的基因表達(dá)。約10％-15％的als病例具有該疾病的家族史，并且這些患者被稱作家族性als(fals)或遺傳患者，通常具有孟德爾顯性的遺傳模式和高外顯率。剩余者(大約85％-95％)被歸類為散發(fā)性als(sals)，因?yàn)樗鼈兣c記錄的家族史無關(guān)，但是相反被認(rèn)為是歸因于其它風(fēng)險(xiǎn)因素，包括、但不限于環(huán)境因素、遺傳多態(tài)性、體細(xì)胞突變和可能的基因-環(huán)境相互作用。在大多數(shù)情況下，家族性(或遺傳性)als作為常染色體顯性的疾病而遺傳，但是存在具有常染色體隱性的和x-連鎖的遺傳和不完全外顯率的系譜。散發(fā)性和家族性形式是臨床上不能辨別的，從而提示共同的發(fā)病機(jī)制。als中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的選擇性死亡的精確原因仍然是難以捉摸的。理解fals中的遺傳因素的進(jìn)展可能照亮該疾病的兩種形式。近年來，對(duì)als的遺傳原因的探究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了已知造成fals的超過10個(gè)不同基因中的突變。最常見的突變見于編碼cu/zn超氧化物歧化酶1(sod1；～20％)的基因(rosendr等人,nature,1993,362,59-62)，在肉瘤中融合/在脂肪肉瘤中翻譯(fus/tls；1-5％)和tdp-43(tardbp；1-5％)。近年來，將c9orf72基因中的六核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增(ggggcc)n鑒別為西方人群中的fals的最常見原因(～40％)(renton等人,nat.neurosci.,2014,17,17-23的綜述)。在als中突變的其它基因包括alsin(als2)、senataxin(setx)、囊泡相關(guān)的膜蛋白(vapb)和血管生成素(ang)。fals基因控制不同的細(xì)胞機(jī)制，從而提示，als的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的，且可能與幾個(gè)最后導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的不同過程相關(guān)。sod1是在哺乳動(dòng)物中鑒別和表征的三種人超氧化物歧化酶之一：銅-鋅超氧化物歧化酶(cu/znsod或sod1)、錳超氧化物歧化酶(mnsod或sod2)和細(xì)胞外的超氧化物歧化酶(ecsod或sod3)。sod1是153-殘基多肽的32kda同源二聚體，每個(gè)亞基具有一個(gè)銅-結(jié)合部位和一個(gè)鋅-結(jié)合部位，其由人染色體21上的sod1基因(genebank登記號(hào):nm_000454.4)編碼(參見表2)。sod1催化在結(jié)合的銅離子處超氧化物陰離子(o2-)向分子氧(o2)和過氧化氫(h2o2)的反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)sod1濃度是高的(范圍為10-100μm)，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)中的總蛋白質(zhì)含量的1％。該蛋白不僅定位在細(xì)胞質(zhì)中，而且定位在真核細(xì)胞的細(xì)胞核、溶酶體、過氧化物酶體和線粒體膜間隙中(lindenauj等人,glia,2000,29,25-34)。fals患者中的15-20％和所有als病例中的1-2％攜帶sod1基因中的突變。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分布在153個(gè)氨基酸的sod1多肽中的至少170個(gè)不同突變會(huì)造成als，且更新列表可以在als在線遺傳性數(shù)據(jù)庫(alsod)中找到(wroer等人,amyotrophlateralscler.,2008,9,249-250)。表1列出了als中的sod1的突變的一些例子。這些突變主要是單個(gè)氨基酸置換(即錯(cuò)義突變)，盡管缺失、插入和c-末端截短也會(huì)發(fā)生。不同的sod1突變表現(xiàn)出不同的地理分布模式。例如，具有由sod1基因突變造成的als的所有美國人中的40-50％具有特定突變ala4val(或a4v)。a4v突變通常與更嚴(yán)重的征象和癥狀有關(guān)，且存活期通常是2-3年。i113t突變是迄今在英國最常見的突變。在歐洲最流行的突變是d90a置換，且存活期經(jīng)常大于10年。表1.在als中的sod1突變的例子為了研究與sod1基因缺陷有關(guān)的神經(jīng)元死亡的機(jī)制，本領(lǐng)域開發(fā)了sod1有關(guān)的als的幾種嚙齒動(dòng)物模型，它們表達(dá)具有不同突變(包括錯(cuò)義突變、小缺失或插入)的人sod1基因。als小鼠模型的非限制性例子包括sod1g93a、sod1a4v、sod1g37r、sod1g85r、sod1d90a、sod1l84v、sod1i113t、sod1h36r/h48q、sod1g127x、sod1l126x和sod1l126deltt。存在兩種攜帶兩種不同人sod1突變的轉(zhuǎn)基因大鼠模型：sod1h46r和sod1g93r。這些嚙齒動(dòng)物als模型可以發(fā)生與人als患者類似的肌無力和反映人疾病的幾個(gè)特征的其它病原性特征，具體地是脊柱運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的選擇性死亡、蛋白包涵體在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的聚集和小神經(jīng)膠質(zhì)活化。本領(lǐng)域眾所周知，轉(zhuǎn)基因的嚙齒類動(dòng)物是人sod1相關(guān)的als疾病的良好模型，并提供用于研究疾病發(fā)病機(jī)制和開發(fā)疾病治療的模型。在動(dòng)物和細(xì)胞模型中的研究表明，sod1病原性變體通過功能的獲得而造成als。也就是說，當(dāng)被sod1突變改變時(shí)，超氧化物歧化酶獲得新的但是有害的性質(zhì)。例如，在als中的一些sod1突變的變體通過破壞氧化還原循環(huán)而增加氧化性應(yīng)激(例如，增加的有毒超氧化物殘余物的積累)。其它研究也表明，als中的一些sod1突變的變體可能獲得獨(dú)立于它的正常生理功能的有毒性質(zhì)(諸如錯(cuò)誤折疊的sod1變體的異常聚集)。在異常的氧化還原化學(xué)模型中，突變體sod1是不穩(wěn)定的且通過與非常規(guī)底物的異?；瘜W(xué)相互作用造成活性氧(ros)的過度產(chǎn)生。在蛋白毒性模型中，不穩(wěn)定的、錯(cuò)誤折疊的sod1聚集成細(xì)胞質(zhì)包涵體，從而隔離對(duì)于細(xì)胞過程而言關(guān)鍵性的蛋白。這兩種假設(shè)并不相互排斥。已經(jīng)證實(shí)，結(jié)合活性部位中的金屬的選定組氨酸殘基的氧化會(huì)介導(dǎo)sod1聚集。聚集的突變體sod1蛋白還可能誘導(dǎo)線粒體功能障礙(vehvilainenp等人,frontcellneurosci.,2014,8,126)、軸突運(yùn)輸?shù)牟p、異常的rna代謝、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞病理學(xué)和谷氨酸鹽興奮性中毒。在某些散發(fā)性als病例中，錯(cuò)誤折疊的野生型sod1蛋白見于患病的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，其形成與家族性als相關(guān)的sod1變體看到的那些類似的“有毒構(gòu)象”(rotunnoms和boscoda,frontcellneurosci.,2013,16,7,253)。這樣的證據(jù)提示，als是一種與其它神經(jīng)變性疾病(諸如阿爾茨海默氏病和帕金森病)類似的蛋白折疊疾病。目前，沒有治愈性治療可用于遭受als的患者。唯一的fda批準(zhǔn)的藥物利魯唑(谷氨酸鹽釋放的抑制劑)對(duì)als具有中度作用，僅使存活延長2-3個(gè)月(如果施用18個(gè)月)。不幸的是，施用利魯唑的患者不會(huì)經(jīng)歷疾病進(jìn)展的任何減慢或肌肉功能的改善。因此，利魯唑不代表治愈性的或甚至有效的治療。研究人員繼續(xù)尋找更好的治療劑。以前已經(jīng)試驗(yàn)了可能阻止或改善sod1聚集的治療方案。例如，阿莫氯醇(arimoclomol，一種羥胺衍生物)是靶向熱激蛋白的藥物，其是針對(duì)這些聚集體的細(xì)胞防御機(jī)制。研究證實(shí)，阿莫氯醇治療會(huì)改善sod1小鼠模型中的肌肉功能。靶向als中的一種或多種細(xì)胞缺陷的其它藥物可以包括：諸如他侖帕奈的ampa拮抗劑，β-內(nèi)酰胺抗生素(其可以減少谷氨酸鹽誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性中毒)；溴隱亭，其可以抑制氧化誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡(例如美國專利公開號(hào)20110105517；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)；1,3-二苯基脲衍生物或多重激酶抑制劑，其可以減少sod1基因表達(dá)(例如，美國專利公開號(hào)20130225642；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)；多巴胺激動(dòng)劑普拉克索和它的對(duì)映異構(gòu)體dexpramipexole，其可以改善線粒體中的氧化應(yīng)答；尼美舒利，其抑制環(huán)加氧酶(例如，美國專利公開號(hào)20060041022；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)；充當(dāng)自由基清除劑的藥物(例如美國專利號(hào):6,933,310和pct專利公開號(hào):wo2006075434；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文)。抑制異常的sod1蛋白聚集的另一個(gè)方案是沉默/抑制als中的sod1基因表達(dá)。已經(jīng)報(bào)道，用于突變的等位基因的特異性基因沉默的小干擾rna對(duì)于fals的治療而言是治療上有益的(例如，ralghgs等人,nat.medicine,2005,11(4),429-433；和raoulc等人,nat.medicine,2005,11(4),423-428；和maxwellmm等人,pnas,2004,101(9),3178-3183；和dingh等人,chinesemedicalj.,2011,124(1),106-110；和scharzds等人,plosgenet.,2006,2(9),e140；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在本領(lǐng)域中教導(dǎo)了靶向sod1基因并調(diào)節(jié)als中的sod1表達(dá)的許多其它rna治療劑。這樣的基于rna的藥劑包括反義寡核苷酸和雙鏈小干擾rna。參見，例如，wangh等人,jbiol.chem.,2008,283(23),15845-15852)；美國專利號(hào)7,498,316、7,632,938、7,678,895、7,951,784、7,977,314、8,183,219、8,309,533和8,586,554；和美國專利公開號(hào)2006/0229268和2011/0263680；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文。本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)性多核苷酸(例如，靶向sod1基因的sirna分子)以及它們的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)方法。具體地，本發(fā)明采用諸如腺伴隨病毒(aav)載體的病毒載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav載體可以增加活性劑向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的遞送。靶向sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼dsrna能夠在細(xì)胞內(nèi)顯著地抑制sod1基因表達(dá)(例如，mrna水平)；因此，改善sod1表達(dá)會(huì)在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)應(yīng)激，諸如蛋白的聚集和包涵體的形成、增加的自由基、線粒體功能障礙和rna代謝。這樣的sirna介導(dǎo)的sod1表達(dá)抑制可以用于治療als。根據(jù)本發(fā)明，用于治療和/或改善患者中的als的方法包括給患者的細(xì)胞施用有效量的aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。包含這樣的核酸序列的aav載體的施用將編碼造成sod1基因表達(dá)的抑制/沉默的sirna分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體(例如，編碼調(diào)節(jié)性多核苷酸的aav)會(huì)減少受試者中的突變體sod1的表達(dá)。突變體sod1的減少還可以減少有毒聚集體的形成，所述有毒聚集體可以造成毒性機(jī)制，例如，但不限于，氧化性應(yīng)激、線粒體功能障礙、受損的軸突運(yùn)輸、異常的rna代謝、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞病理學(xué)和/或谷氨酸鹽興奮性中毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體(例如，aav載體)會(huì)減少有此需要的受試者中的sod1的量，并因而提供如本文中所述的治療益處。本發(fā)明的組合物sirna分子本發(fā)明涉及用于治療神經(jīng)變性障礙的rna干擾(rnai)誘導(dǎo)的基因表達(dá)抑制。本文提供了靶向sod1基因的sirna雙鏈體或編碼的dsrna(在本文中共同地稱作“sirna分子”)。這樣的sirna雙鏈體或編碼的dsrna可以減少或沉默細(xì)胞(例如，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)中的sod1基因表達(dá)，由此改善als的癥狀，例如，但不限于，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡和肌肉萎縮。rnai(也被稱作轉(zhuǎn)錄后基因沉默(ptgs)、壓制或共抑制)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，其中rna分子以序列特異性的方式抑制基因表達(dá)，通常通過造成特定mrna分子的破壞。rnai的活性組分是短/小雙鏈rna(dsrna)，被稱作小干擾rna(sirna)，其通常含有15-30個(gè)核苷酸(例如，19-25、19-24或19-21個(gè)核苷酸)和2個(gè)核苷酸的3’突出端，且其匹配靶基因的核酸序列。這些短rna物質(zhì)可以通過dicer介導(dǎo)的較大dsrna的切割在體內(nèi)天然地產(chǎn)生，且它們在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是功能性的。天然表達(dá)的小rna分子(其被命名為微rna(mirna))通過調(diào)節(jié)mrna的表達(dá)而引起基因沉默。含有mirna的rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)靶向與mirna的5’區(qū)域(其被稱作種子區(qū)域)中的核苷酸2-7具有完美序列互補(bǔ)性的mrna，且其它堿基與它的3’區(qū)域配對(duì)。mirna介導(dǎo)的基因表達(dá)的下調(diào)可以由靶mrna的切割、靶mrna的翻譯抑制或mrna衰變造成。mirna靶向序列經(jīng)常位于靶mrna的3’-utr中。單個(gè)mirna可以靶向來自不同基因的超過100種轉(zhuǎn)錄物，且一種mrna可以由不同的mirna靶向?？梢栽隗w外設(shè)計(jì)和合成靶向特定mrna的sirna雙鏈體或dsrna，并引入細(xì)胞中用于活化rnai過程。elbashir等人證實(shí)，21-核苷酸的sirna雙鏈體(被稱作小干擾rna)能夠?qū)崿F(xiàn)有效的且特異性的基因敲降，而不在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(elbashirsm等人,nature,2001,411,494-498)。自從該最初報(bào)告以來，通過sirna實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的遺傳分析的有利工具快速地出現(xiàn)，并且具有產(chǎn)生新穎的治療劑的潛力。為了激活rnai，可以將體外合成的sirna分子引入細(xì)胞中。當(dāng)引入細(xì)胞中時(shí)，與內(nèi)源性dsrna類似的外源性sirna雙鏈體可以組裝以形成rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)，即一種便利在基因組中尋找與sirna雙鏈體的兩條鏈之一(即，反義鏈)互補(bǔ)的rna序列的多亞基復(fù)合物。在該過程中，sirna的有義鏈(或過客鏈)從所述復(fù)合物丟失，而sirna的反義鏈(或引導(dǎo)鏈)與它的互補(bǔ)rna匹配。具體地，含有sirna的risc復(fù)合物的靶標(biāo)是具有完美序列互補(bǔ)性的mrna。然后，sirna介導(dǎo)的基因沉默發(fā)生，從而切割、釋放和降解靶標(biāo)。sirna雙鏈體包含與靶mrna同源的有義鏈，且與靶mrna互補(bǔ)的反義鏈會(huì)提供在靶rna破壞效率方面與單鏈(ss)-sirna(例如反義鏈rna或反義寡核苷酸)的應(yīng)用相比多得多的優(yōu)點(diǎn)。在許多情況下，它要求更高的ss-sirna濃度以實(shí)現(xiàn)對(duì)應(yīng)雙鏈體的有效基因沉默效能。前述分子中的任一種可以由aav載體或載體基因組編碼。靶向sod1基因的sirna雙鏈體的設(shè)計(jì)和序列在本領(lǐng)域中已經(jīng)提出了一些關(guān)于設(shè)計(jì)sirna的指南。這些指南通常推薦制備19-核苷酸的雙鏈體化的區(qū)域、對(duì)稱的2-3個(gè)核苷酸的3’突出端、5-磷酸酯和3-羥基，它們靶向要沉默的基因中的一個(gè)區(qū)域。可能控制sirna序列偏好的其它規(guī)則包括但不限于(i)在反義鏈的5′末端處的a/u；(ii)在有義鏈的5′末端處的g/c；(iii)在反義鏈的5′末端三分之一中的至少5個(gè)a/u殘基；和(iv)超過9個(gè)核苷酸長度的任何gc段的缺失。根據(jù)這樣的考慮，與靶基因的具體序列一起，可以容易地設(shè)計(jì)抑制哺乳動(dòng)物靶基因表達(dá)所必需的非常有效的sirna分子。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)計(jì)了靶向人sod1基因的sirna分子(例如，sirna雙鏈體或編碼的dsrna)。這樣的sirna分子可以特別地抑制sod1基因表達(dá)和蛋白生產(chǎn)。在某些方面，設(shè)計(jì)了sirna分子并用于選擇性地“敲除”細(xì)胞中的sod1基因變體，即，在患有als疾病的患者中鑒別出的突變的sod1轉(zhuǎn)錄物(例如，在表1中的突變)。在某些方面，設(shè)計(jì)了sirna分子并用于選擇性地“敲降”細(xì)胞中的sod1基因變體。在其它方面，所述sirna分子能夠抑制或遏制sod1基因的野生型和突變的等位基因，而與sod1基因中的任何特定突變無關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的sirna分子包含有義鏈和互補(bǔ)的反義鏈，其中兩條鏈雜交在一起以形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。所述反義鏈與sod1mrna序列具有足夠的互補(bǔ)性以指導(dǎo)靶標(biāo)特異性的rnai，即，sirna分子具有足以觸發(fā)通過rnai機(jī)制或過程對(duì)靶mrna的破壞的序列。在某些實(shí)施方案中，所述反義鏈和靶mrna序列是100％互補(bǔ)的。所述反義鏈可以與靶mrna序列的任何部分是互補(bǔ)的。在其它實(shí)施方案中，所述反義鏈和靶mrna序列包含至少一個(gè)錯(cuò)配。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述反義鏈和所述靶mrna序列是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％互補(bǔ)的。根據(jù)本發(fā)明，所述sirna分子具有約10-50個(gè)或更多個(gè)核苷酸的長度，即，每個(gè)鏈包含10-50個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)。優(yōu)選地，所述sirna分子在每個(gè)鏈中具有約15-30(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個(gè)核苷酸的長度，其中所述鏈之一是與靶區(qū)域充分互補(bǔ)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述sirna分子具有約19-25、19-24或19-21個(gè)核苷酸的長度。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的sirna分子可以是合成的rna雙鏈體，其包含約19個(gè)核苷酸至約25個(gè)核苷酸、和在3'-端處的兩個(gè)突出核苷酸。在某些方面，所述sirna分子可以是未修飾的rna分子。在其它方面，所述sirna分子可以含有至少一個(gè)修飾的核苷酸，諸如堿基、糖或主鏈修飾。在其它實(shí)施方案中，可以在質(zhì)粒載體、病毒載體(例如，aav載體)、基因組或用于遞送給細(xì)胞的其它核酸表達(dá)載體中編碼本發(fā)明的sirna分子。可以使用dna表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)本發(fā)明的sirna雙鏈體或dsrna并實(shí)現(xiàn)靶基因的長期抑制。在一個(gè)方面，sirna雙鏈體的有義鏈和反義鏈通常通過短間隔序列連接，從而導(dǎo)致被稱作短發(fā)夾rna(shrna)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的表達(dá)。所述發(fā)夾被dicer識(shí)別和切割，從而產(chǎn)生成熟的sirna分子。根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)aav載體，其包含編碼靶向sod1mrna的sirna分子的核酸，aav載體血清型可以是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8和aav-dj及其變體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的sirna雙鏈體或編碼的dsrna抑制(或降解)靶mrna(即sod1)。因此，所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna可以用于基本上抑制細(xì)胞(例如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)中的sod1基因表達(dá)。在某些方面，sod1基因表達(dá)的抑制表示抑制至少約20％，優(yōu)選地抑制至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，可以將靶向的基因的蛋白產(chǎn)物抑制至少約20％，優(yōu)選地抑制至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。所述sod1基因可以是野生型基因或含有至少一個(gè)突變的經(jīng)突變的sod1基因。因此，所述蛋白是野生型蛋白或含有至少一個(gè)突變的經(jīng)突變的多肽。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)計(jì)了靶向人sod1基因的sirna雙鏈體或編碼的dsrna，并針對(duì)它們在培養(yǎng)的細(xì)胞中降低sod1mrna水平的能力進(jìn)行了試驗(yàn)。這樣的sirna雙鏈體包括在表3中列出的那些。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述sirna雙鏈體可以是sirna雙鏈體id：d-2757、d-2806、d-2860、d-2861、d-2875、d-2871、d-2758、d-2759、d-2866、d-2870、d-2823和d-2858。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna的3’莖臂可具有在引導(dǎo)鏈的3’末端下游的11個(gè)核苷酸，其與在5’莖臂中的過客鏈的5’末端的上游13個(gè)核苷酸中的11個(gè)具有互補(bǔ)性。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna可能具有半胱氨酸，其在調(diào)節(jié)性多核苷酸的3’莖臂的3’末端的下游6個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna包含引導(dǎo)鏈的mirna種子匹配(seedmatch)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna包含過客鏈的mirna種子匹配。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna不包含引導(dǎo)鏈或過客鏈的種子匹配。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna幾乎不具有引導(dǎo)鏈的顯著全長脫靶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna幾乎不具有過客鏈的顯著全長脫靶。靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna可能具有過客鏈的小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％6-10％的全長脫靶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna幾乎不具有引導(dǎo)鏈或過客鏈的顯著全長脫靶。靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna具有引導(dǎo)鏈或過客鏈的小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％6-10％的全長脫靶。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna具有高體外活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna具有低體外活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或dsrna在體外具有高引導(dǎo)鏈活性和低過客鏈活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna在體外具有高引導(dǎo)鏈活性和低過客鏈活性。由引導(dǎo)鏈實(shí)現(xiàn)的靶標(biāo)敲降(kd)可以是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。由引導(dǎo)鏈實(shí)現(xiàn)的靶標(biāo)敲降可以是60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、60-99％、60-99.5％、60-100％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、65-99％、65-99.5％、65-100％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-99％、70-99.5％、70-100％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％、75-99％、75-99.5％、75-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-99.5％、80-100％、85-90％、85-95％、85-99％、85-99.5％、85-100％、90-95％、90-99％、90-99.5％、90-100％、95-99％、95-99.5％、95-100％、99-99.5％、99-100％或99.5-100％。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，由引導(dǎo)鏈實(shí)現(xiàn)的靶標(biāo)敲降(kd)是大于70％。在一個(gè)實(shí)施方案中，過客鏈關(guān)于最近脫靶的ic50大于引導(dǎo)鏈關(guān)于靶標(biāo)的ic50的100倍。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，如果過客鏈關(guān)于最近脫靶的ic50大于引導(dǎo)鏈關(guān)于靶標(biāo)的ic50的100倍，那么就說靶向人sod1基因的所述sirna雙鏈體或編碼的dsrna在體外具有高引導(dǎo)鏈活性和低過客鏈活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引導(dǎo)鏈的5’加工具有在5’末端處的以下正確開始(correctstart)(n)：在體外或在體內(nèi)的時(shí)間的至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。作為非限制性實(shí)施例，所述引導(dǎo)鏈的5’加工是精確的且具有在5’末端處的以下正確開始(n)：在體外的時(shí)間的至少99％。作為非限制性實(shí)施例，所述引導(dǎo)鏈的5’加工是精確的且具有在5’末端處的以下正確開始(n)：在體內(nèi)的時(shí)間的至少99％。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的引導(dǎo)鏈與過客鏈(g:p)比率是體外或體內(nèi)1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。作為非限制性實(shí)施例，所述引導(dǎo)鏈與過客鏈比率是體外80:20。作為非限制性實(shí)施例，所述引導(dǎo)鏈與過客鏈比率是體內(nèi)80:20。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼所述dsrna的載體基因組的完整性是所述構(gòu)建體的全長的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或超過99％。sirna修飾在某些實(shí)施方案中，當(dāng)不作為前體或dna遞送時(shí)，可以化學(xué)修飾本發(fā)明的sirna分子，以調(diào)節(jié)rna分子的某些特征，例如，但不限于，增加sirna體內(nèi)穩(wěn)定性。所述化學(xué)修飾的sirna分子可以用在人治療用途中，且在不損害sirna分子的rnai活性的情況下得以改善。作為非限制性實(shí)施例，在有義鏈和反義鏈的3′和5′末端處修飾sirna分子。在某些方面，本發(fā)明的sirna雙鏈體含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，例如，但不限于，糖修飾的核苷酸、核苷堿基修飾和/或主鏈修飾。在某些方面，所述sirna分子可以含有組合的修飾，例如，組合的核苷堿基和主鏈修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的核苷酸可以是糖修飾的核苷酸。糖修飾的核苷酸包括但不限于2′-氟、2′-氨基和2′-硫修飾的核糖核苷酸，例如2′-氟修飾的核糖核苷酸。修飾的核苷酸可以在糖部分以及具有糖或其非核糖基的類似物的核苷酸上被修飾。例如，所述糖部分可以是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃型葡萄糖、吡喃型半乳糖、4′-硫核糖和其它糖、雜環(huán)或碳環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的核苷酸可以是核苷堿基修飾的核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的核苷酸可以是主鏈修飾的核苷酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的sirna雙鏈體還可以包含在主鏈上的其它修飾。本文中使用的正常的“主鏈”表示在dna或rna分子中重復(fù)地交替糖-磷酸序列。脫氧核糖/核糖在3'-羥基和5'-羥基處連接至酯連接中的磷酸酯基團(tuán)，也被稱作“磷酸二酯”鍵/接頭(po連接)。所述po主鏈可以被修飾為“硫代磷酸酯主鏈(ps連接)。在某些情況下，天然的磷酸二酯鍵可以被酰胺鍵替換，但是保持兩個(gè)糖單元之間的四個(gè)原子。這樣的酰胺修飾可以促進(jìn)寡核苷酸的固相合成和增加與sirna補(bǔ)體形成的雙鏈體的熱力學(xué)穩(wěn)定性。參見例如mesmaeker等人,pure&appl.chem.,1997,3,437-440；其內(nèi)容通過引用整體并入本文。經(jīng)修飾的堿基表示已經(jīng)通過一個(gè)或多個(gè)原子或基團(tuán)的替換或添加進(jìn)行修飾的核苷酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤、肌苷和辮苷。在核苷堿基部分上的修飾的一些例子包括但不限于單獨(dú)的或組合的烷基化的、鹵化的、硫醇鹽化的、胺化的、酰胺化的或乙?；膲A基。更具體的例子包括，例如，5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、n,n,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和具有在5位處的修飾的其它核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-鹵代胞苷、5-鹵代尿苷、4-乙?；?、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2,2-二甲基鳥苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脫氮核苷酸諸如7-脫氮-腺苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫尿苷、其它硫代堿基諸如2-硫尿苷和4-硫尿苷和2-硫胞苷、二氫尿苷、假尿苷、辮苷、古嘌苷、萘基和取代的萘基、任何o-和n-烷基化的嘌呤和嘧啶諸如n6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修飾的苯基諸如氨基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯、充當(dāng)g-夾核苷酸的經(jīng)修飾的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化的核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的核苷酸可以是僅在有義鏈上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的核苷酸可以是僅在反義鏈上。在某些實(shí)施方案中，所述修飾的核苷酸可以是在有義鏈和反義鏈中。在某些實(shí)施方案中，所述化學(xué)修飾的核苷酸不會(huì)影響反義鏈與靶mrna序列(諸如sod1mrna序列)配對(duì)的能力。載體在某些實(shí)施方案中，本文描述的sirna分子可以由諸如質(zhì)粒或病毒載體的載體編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述sirna分子由病毒載體編碼。病毒載體可以是，但不限于皰疹病毒(hsv)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、慢病毒載體等。在某些具體實(shí)施方案中，所述病毒載體是aav載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在某些實(shí)施方案中，靶向sod1基因的sirna雙鏈體可以由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼(參見，例如，美國專利號(hào)5,399,346、5,124,263、4,650,764和4,980,289；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文)。腺病毒載體腺病毒是可以被修飾以將核酸有效地遞送至多種體內(nèi)細(xì)胞類型的真核dna病毒，且已經(jīng)被廣泛地用在基因治療方案中，包括用于將基因靶向至神經(jīng)細(xì)胞。已經(jīng)描述了用于核酸治療劑的多種復(fù)制缺陷型腺病毒和最小腺病毒載體(參見，例如，pct專利公開號(hào)wo199426914、wo199502697、wo199428152、wo199412649、wo199502697和wo199622378；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入)。這樣的腺病毒載體也可以用于將本發(fā)明的sirna分子遞送至細(xì)胞。腺伴隨病毒(aav)載體腺伴隨病毒(aav)是一種依賴性的細(xì)小病毒(象其它細(xì)小病毒一樣)，其為具有約5000個(gè)核苷酸長度的基因組的單鏈無衣殼dna病毒，且其含有2個(gè)開放讀碼框，所述開放讀碼框編碼負(fù)責(zé)復(fù)制的蛋白(rep)和衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白(cap)。所述開放讀碼框側(cè)接兩個(gè)反向末端重復(fù)(itr)序列，它們充當(dāng)病毒基因組的復(fù)制起點(diǎn)。此外，所述aav基因組含有包裝序列，從而允許將病毒基因組包裝進(jìn)aav衣殼中。所述aav載體需要共助手(例如，腺病毒)以經(jīng)歷在受感染的細(xì)胞中的生產(chǎn)性感染。在沒有這樣的輔助功能存在下，aav病毒粒子基本上進(jìn)入宿主細(xì)胞并整合進(jìn)細(xì)胞的基因組中。因?yàn)閹讉€(gè)獨(dú)特的特征，已經(jīng)針對(duì)sirna遞送研究了aav載體。所述特征的非限制性例子包括(i)感染分裂的細(xì)胞和非分裂的細(xì)胞的能力；(ii)侵染性的廣宿主范圍，包括人細(xì)胞；(iii)野生型aav尚未與任何疾病相關(guān)，且尚未被證實(shí)在受感染的細(xì)胞中復(fù)制；(iv)細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)載體的免疫應(yīng)答的缺乏，和(v)在宿主染色體中的不整合性質(zhì)，由此減少長期表達(dá)的可能。此外，aav載體感染對(duì)改變細(xì)胞基因表達(dá)模式具有微小影響(stilwell和samulski等人,biotechniques,2003,34,148)。通常，用于sirna遞送的aav載體可以是復(fù)制缺陷型的重組病毒載體，因?yàn)樗鼈冊诓《净蚪M內(nèi)缺乏編碼功能性的rep和cap蛋白的序列。在某些情況下，有缺陷的aav載體可能缺乏大多數(shù)或所有的編碼序列，且基本上僅含有一個(gè)或兩個(gè)aavitr序列和一個(gè)包裝序列。aav載體還可以包含自互補(bǔ)的aav載體(scaav)。scaav載體含有兩條dna鏈，它們對(duì)合在一起以形成雙鏈dna。通過跳過第二條鏈合成，scaav允許在細(xì)胞中快速表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的aav載體是scaav。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的aav載體是ssaav。在本領(lǐng)域中公開了用于生產(chǎn)和/或修飾aav載體的方法，諸如假分型的aav載體(pct專利公開號(hào)wo200028004、wo200123001、wo2004112727、wo2005005610和wo2005072364，它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文)?？梢詮腶av的多種血清型制備或衍生出包含sirna分子的核酸序列的aav載體，所述血清型包括、但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8和aav-dj。在某些情況下，可以將aav的不同血清型混合在一起或與其它病毒類型混合以產(chǎn)生嵌合的aav載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav載體引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中?？梢孕揎梐av載體以增強(qiáng)遞送的效率?？梢杂行У匕b這樣的經(jīng)修飾的包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav載體，且可以用于以高頻率和最小毒性成功地感染靶細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav載體可以是人血清型aav載體。這樣的人aav載體可以源自任何已知的血清型，例如，源自血清型aav1-aav11中的任一種。作為非限制性例子，aav載體可以是：在aav1衍生的衣殼中的包含aav1衍生的基因組的載體；在aav2衍生的基因組中的包含aav2衍生的基因組的載體；在aav4衍生的衣殼中的包含aav4衍生的基因組的載體；在aav6衍生的衣殼中的包含aav6衍生的基因組的載體；或在aav9衍生的衣殼中的包含aav9衍生的基因組的載體。在其它實(shí)施方案中，包含用于編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav載體可以是假分型的雜合的或嵌合的aav載體，其含有源自至少兩種不同aav血清型的序列和/或組分。假分型的aav載體可以是包含源自一種aav血清型的aav基因組的載體和至少部分地源自一種不同aav血清型的衣殼蛋白。作為非限制性例子，這樣的假分型的aav載體可以是：在aav1衍生的衣殼中的包含aav2衍生的基因組的載體；或在aav6衍生的衣殼中的包含aav2衍生的基因組的載體；或在aav4衍生的衣殼中的包含aav2衍生的基因組的載體；或在aav9衍生的衣殼中的aav2衍生的基因組。以類似的方式，本發(fā)明考慮到任何雜合的或嵌合的aav載體。在其它實(shí)施方案中，可以使用包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav載體將sirna分子遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如，美國專利號(hào)6,180,613；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在某些方面，包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav載體還可以包含經(jīng)修飾的衣殼，所述衣殼包括來自非病毒起源的肽。在其它方面，所述aav載體可以含有cns特異性的嵌合衣殼以促進(jìn)編碼的sirna雙鏈體向腦和脊髓中的遞送。例如，可以構(gòu)建表現(xiàn)出cns向性的來自aav變體的帽核苷酸序列的比對(duì)以鑒別可變區(qū)(vr)序列和結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav載體可以編碼是多順反子分子的sirna分子。所述sirna分子可以另外包含在sirna分子的區(qū)域之間的一個(gè)或多個(gè)接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子(例如，但不限于，cmv、u6、cba或具有sv40內(nèi)含子的cba啟動(dòng)子)的下游。另外，編碼的sirna分子還可以在表達(dá)載體中位于多腺苷酸化序列的上游。作為非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子下游和/或多腺苷酸化序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個(gè)核苷酸內(nèi)。作為另外的非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子下游和/或多腺苷酸化序列上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個(gè)核苷酸內(nèi)。作為非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子下游和/或多腺苷酸化序列上游前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或超過25％的核苷酸內(nèi)。作為另外的非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子下游和/或多腺苷酸化序列上游前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％的核苷酸內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于多腺苷酸化序列的上游。另外，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子(例如，但不限于，cmv、u6、cba或具有sv40內(nèi)含子的cba啟動(dòng)子)的下游。作為非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子下游和/或多腺苷酸化序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個(gè)核苷酸內(nèi)。作為另外的非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子下游和/或多腺苷酸化序列上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個(gè)核苷酸內(nèi)。作為非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子下游和/或多腺苷酸化序列上游前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或超過25％的核苷酸內(nèi)。作為另外的非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于啟動(dòng)子下游和/或多腺苷酸化序列上游前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％的核苷酸內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以位于scaav中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以位于ssaav中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于flipitr的5’末端附近。在另外的實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于flipitr的3’末端附近。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于flopitr的5’末端附近。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于flopitr的3’末端附近。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于flipitr的5’末端和flopitr的3’末端之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于flipitr的3’末端和flipitr的5’末端之間(例如，flipitr的5’末端和flopitr的3’末端之間或者flopitr的3’末端和flipitr的5’末端之間的中途)。作為非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于itr(例如，flip或flopitr)的5’或3’末端下游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個(gè)核苷酸內(nèi)。作為非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于itr(例如，flip或flopitr)的5’或3’末端上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個(gè)核苷酸內(nèi)。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于itr(例如，flip或flopitr)的5’或3’末端下游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個(gè)核苷酸內(nèi)。作為另外的非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于itr(例如，flip或flopitr)的5’或3’末端上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個(gè)核苷酸內(nèi)。作為非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于itr(例如，flip或flopitr)的5’或3’末端上游前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或超過25％的核苷酸內(nèi)。作為另外的非限制性實(shí)施例，編碼的sirna分子可以在表達(dá)載體中位于itr(例如，flip或flopitr)的5’或3’末端下游前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％的核苷酸內(nèi)。表達(dá)載體在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體(例如，aav載體)可以包含至少一種調(diào)節(jié)性多核苷酸，所述調(diào)節(jié)性多核苷酸包含至少一種本文描述的表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包含，從itr至itr(按5’至3’)，itr、啟動(dòng)子、內(nèi)含子、調(diào)節(jié)性多核苷酸、聚腺苷酸序列和itr?；蚪M大小在一個(gè)實(shí)施方案中，包含編碼本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸的核酸序列的載體基因組可以是單鏈的或雙鏈的載體基因組。所述載體基因組的大小可以是小的、中等的、大的或最大的大小。另外，所述載體基因組可以包含啟動(dòng)子和聚腺苷酸尾巴。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含編碼本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸的核酸序列的載體基因組可以是小單鏈載體基因組。小單鏈載體基因組可以是2.7-3.5kb大小，諸如約2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5kb大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述小單鏈載體基因組可以是3.2kb大小。另外，所述載體基因組可以包含啟動(dòng)子和聚腺苷酸尾巴。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含編碼本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸的核酸序列的載體基因組可以是小雙鏈載體基因組。小雙鏈載體基因組可以是1.3-1.7kb大小，諸如約1.3、1.4、1.5、1.6和1.7kb大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述小雙鏈載體基因組可以是1.6kb大小。另外，所述載體基因組可以包含啟動(dòng)子和聚腺苷酸尾巴。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含編碼本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸(例如，sirna或dsrna)的核酸序列的載體基因組可以是中等單鏈載體基因組。中等單鏈載體基因組可以是3.6-4.3kb大小，諸如約3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2和4.3kb大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述中等單鏈載體基因組可以是4.0kb大小。另外，所述載體基因組可以包含啟動(dòng)子和聚腺苷酸尾巴。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含編碼本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸的核酸序列的載體基因組可以是中等雙鏈載體基因組。中等雙鏈載體基因組可以是1.8-2.1kb大小，諸如約1.8、1.9、2.0和2.1kb大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述中等雙鏈載體基因組可以是2.0kb大小。另外，所述載體基因組可以包含啟動(dòng)子和聚腺苷酸尾巴。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含編碼本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸的核酸序列的載體基因組可以是大單鏈載體基因組。大單鏈載體基因組可以是4.4-6.0kb大小，諸如約4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述大單鏈載體基因組可以是4.7kb大小。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述大單鏈載體基因組可以是4.8kb大小。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述大單鏈載體基因組可以是6.0kb大小。另外，所述載體基因組可以包含啟動(dòng)子和聚腺苷酸尾巴。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含編碼本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸的核酸序列的載體基因組可以是大雙鏈載體基因組。大雙鏈載體基因組可以是2.2-3.0kb大小，諸如約2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述大雙鏈載體基因組可以是2.4kb大小。另外，所述載體基因組可以包含啟動(dòng)子和聚腺苷酸尾巴。啟動(dòng)子本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，靶細(xì)胞可能需要特異性的啟動(dòng)子，包括、但不限于物種特異性的、可誘導(dǎo)的、組織特異性的或細(xì)胞周期特異性的啟動(dòng)子(parr等人,nat.med.3:1145-9(1997)；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是被認(rèn)為有效地驅(qū)動(dòng)調(diào)節(jié)性多核苷酸的表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是對(duì)正在靶向的細(xì)胞具有向性的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是提供凈荷(例如，調(diào)節(jié)性多核苷酸，例如，sirna或dsrna)在靶向的組織(例如，但不限于，神經(jīng)系統(tǒng)組織)中表達(dá)一段時(shí)間的弱啟動(dòng)子。表達(dá)可以持續(xù)1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、16小時(shí)、17小時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)、22小時(shí)、23小時(shí)、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、7個(gè)月、8個(gè)月、9個(gè)月、10個(gè)月、11個(gè)月、1年、13個(gè)月、14個(gè)月、15個(gè)月、16個(gè)月、17個(gè)月、18個(gè)月、19個(gè)月、20個(gè)月、21個(gè)月、22個(gè)月、23個(gè)月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超過10年的時(shí)間段。表達(dá)可以持續(xù)1-5小時(shí)、1-12小時(shí)、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2個(gè)月、1-4個(gè)月、1-6個(gè)月、2-6個(gè)月、3-6個(gè)月、3-9個(gè)月、4-8個(gè)月、6-12個(gè)月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述啟動(dòng)子是用于在神經(jīng)組織中持續(xù)表達(dá)凈荷的弱啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子可以是小于1kb的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超過800的長度。所述啟動(dòng)子可以具有200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之間的長度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子可以是兩個(gè)或更多個(gè)組分(例如，但不限于，cmv和cba)的組合。每個(gè)組分可以具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超過800的長度。每個(gè)組分可以具有200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之間的長度。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述啟動(dòng)子是382核苷酸的cmv-增強(qiáng)子序列和260核苷酸的cba-啟動(dòng)子序列的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含至少一個(gè)元件以增強(qiáng)靶標(biāo)特異性和表達(dá)(參見例如，powell等人.viralexpressioncassetteelementstoenhancetransgenetargetspecificityandexpressioningenetherapy,2015；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)特異性和表達(dá)的元件的非限制性例子包括啟動(dòng)子、內(nèi)源性mirna、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(pre)、多腺苷酸化(polya)信號(hào)序列和上游增強(qiáng)子(use)、cmv增強(qiáng)子和內(nèi)含子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含至少一個(gè)元件以增強(qiáng)靶標(biāo)特異性和表達(dá)(參見例如，powell等人.viralexpressioncassetteelementstoenhancetransgenetargetspecificityandexpressioningenetherapy,2015；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)，諸如啟動(dòng)子。在大多數(shù)組織中促進(jìn)其表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于人延伸因子1α-亞基(ef1α)、立即早期巨細(xì)胞病毒(cmv)、雞β-肌動(dòng)蛋白(cba)和它的衍生物cag、β葡糖醛酸糖苷酶(gusb)或泛素c(ubc)。組織特異性的表達(dá)元件可以用于將表達(dá)限制至特定細(xì)胞類型，例如，但不限于，可以用于將表達(dá)限制至神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)系統(tǒng)啟動(dòng)子。用于神經(jīng)元的組織特異性的表達(dá)元件的非限制性例子包括神經(jīng)元特異性的烯醇化酶(nse)、血小板衍生的生長因子(pdgf)、血小板衍生的生長因子b-鏈(pdgf-β)、突觸蛋白(syn)、甲基-cpg結(jié)合蛋白2(mecp2)、camkii、mglur2、nfl、nfh、nβ2、ppe、enk和eaat2啟動(dòng)子。用于星形膠質(zhì)細(xì)胞的組織特異性的表達(dá)元件的一個(gè)非限制性例子包括神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(gfap)和eaat2啟動(dòng)子。用于少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的組織特異性的表達(dá)元件的一個(gè)非限制性例子包括髓磷脂堿蛋白(mbp)啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含普遍存在的啟動(dòng)子。普遍存在的啟動(dòng)子的非限制性例子包括cmv、cba(包括衍生物cag、cbh等)、ef-1α、pgk、ubc、gusb(hgbp)和ucoe(hnrpa2b1-cbx3的啟動(dòng)子)。yu等人(molecularpain2011,7:63；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)使用慢病毒載體在大鼠drg細(xì)胞和原代drg細(xì)胞中評(píng)價(jià)了在cag、efiα、pgk和ubc啟動(dòng)子下egfp的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)ubc表現(xiàn)出比其它3種啟動(dòng)子更弱的表達(dá)，并且對(duì)于所有啟動(dòng)子而言存在僅10-12％神經(jīng)膠質(zhì)表達(dá)。soderblom等人(e.neuro2015；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)評(píng)價(jià)了在注射進(jìn)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中以后egfp在具有cmv和ubc啟動(dòng)子的aav8和具有cmv啟動(dòng)子的aav2中的表達(dá)。含有ubc或efiα啟動(dòng)子的質(zhì)粒的鼻內(nèi)施用表現(xiàn)出大于具有cmv啟動(dòng)子的表達(dá)的持久氣道表達(dá)(參見例如，gill等人,genetherapy2001,第8卷,1539-1546；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。husain等人(genetherapy2009；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)評(píng)價(jià)了具有hgusb啟動(dòng)子、hsv-1lat啟動(dòng)子和nse啟動(dòng)子的hβh構(gòu)建體，并發(fā)現(xiàn)hβh構(gòu)建體在小鼠腦中表現(xiàn)出比nse更弱的表達(dá)。passini和wolfe(j.virol.2001,12382-12392,其內(nèi)容通過引用整體并入本文)評(píng)價(jià)了在新生小鼠心室內(nèi)注射以后hβh載體的長期作用，并發(fā)現(xiàn)存在至少1年的持久表達(dá)。當(dāng)使用nf-l和nf-h啟動(dòng)子與cmv-lacz、cmv-luc、ef、gfap、henk、nachr、ppe、ppe+wpre、nse(0.3kb)、nse(1.8kb)和nse(1.8kb+wpre)進(jìn)行對(duì)比時(shí)，xu等人(genetherapy2001,8,1323-1332；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)發(fā)現(xiàn)了在所有腦區(qū)域中的低表達(dá)。xu等人發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子活性按遞減次序?yàn)閚se(1.8kb)、ef、nse(0.3kb)、gfap、cmv、henk、ppe、nfl和nfh。nfl是一種650核苷酸的啟動(dòng)子且nfh是一種920核苷酸的啟動(dòng)子，它們二者都不存在于肝中，但是nfh在感覺本體感受神經(jīng)元、腦和脊髓中是豐富的，且nfh存在于心臟中。scn8a是一種在drg、脊髓和腦中到處表達(dá)的470核苷酸的啟動(dòng)子，在海馬神經(jīng)元和小腦浦肯野細(xì)胞、皮質(zhì)、丘腦和下丘腦中看到特別高的表達(dá)(參見例如，drews等人.2007和raymond等人.2004；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含ubc啟動(dòng)子。所述ubc啟動(dòng)子可以具有300-350個(gè)核苷酸的大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述ubc啟動(dòng)子是332個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含gusb啟動(dòng)子。所述gusb啟動(dòng)子可以具有350-400個(gè)核苷酸的大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述gusb啟動(dòng)子是378個(gè)核苷酸。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述構(gòu)建體可以是aav-啟動(dòng)子-cmv/珠蛋白內(nèi)含子-hfxn-rbg，其中所述aav可以是自互補(bǔ)的，且所述aav可以是dj血清型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含nfl啟動(dòng)子。所述nfl啟動(dòng)子可以具有600-700個(gè)核苷酸的大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述nfl啟動(dòng)子是650個(gè)核苷酸。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述構(gòu)建體可以是aav-啟動(dòng)子-cmv/珠蛋白內(nèi)含子-hfxn-rbg，其中所述aav可以是自互補(bǔ)的，且所述aav可以是dj血清型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含nfh啟動(dòng)子。所述nfh啟動(dòng)子可以具有900-950個(gè)核苷酸的大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述nfh啟動(dòng)子是920個(gè)核苷酸。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述構(gòu)建體可以是aav-啟動(dòng)子-cmv/珠蛋白內(nèi)含子-hfxn-rbg，其中所述aav可以是自互補(bǔ)的，且所述aav可以是dj血清型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含scn8a啟動(dòng)子。所述scn8a啟動(dòng)子可以具有450-500個(gè)核苷酸的大小。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述scn8a啟動(dòng)子是470個(gè)核苷酸。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述構(gòu)建體可以是aav-啟動(dòng)子-cmv/珠蛋白內(nèi)含子-hfxn-rbg，其中所述aav可以是自互補(bǔ)的，且所述aav可以是dj血清型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含fxn啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含pgk啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含cba啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含cmv啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含肝或骨骼肌啟動(dòng)子。肝啟動(dòng)子的非限制性例子包括haat和tbg。骨骼肌啟動(dòng)子的非限制性例子包括結(jié)蛋白、mck和c5-12。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述aav載體包含增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和/或5’utr內(nèi)含子。所述增強(qiáng)子可以是，但不限于，cmv增強(qiáng)子，所述啟動(dòng)子可以是，但不限于，cmv、cba、ubc、gusb、nse、突觸蛋白(sunapsin)、mecp2和gfap啟動(dòng)子，且所述5’utr/內(nèi)含子可以是，但不限于，sv40和cba-mvm。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述組合使用的增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子可以是：(1)cmv增強(qiáng)子、cmv啟動(dòng)子、sv405’utr內(nèi)含子；(2)cmv增強(qiáng)子、cba啟動(dòng)子、sv405’utr內(nèi)含子；(3)cmv增強(qiáng)子、cba啟動(dòng)子、cba-mvm5’utr內(nèi)含子；(4)ubc啟動(dòng)子；(5)gusb啟動(dòng)子；(6)nse啟動(dòng)子；(7)突觸蛋白啟動(dòng)子；(8)mecp2啟動(dòng)子和(9)gfap啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述aav載體具有經(jīng)工程改造的啟動(dòng)子。內(nèi)含子在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體基因組包含至少一個(gè)元件以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)特異性和表達(dá)(參見例如，powell等人.viralexpressioncassetteelementstoenhancetransgenetargetspecificityandexpressioningenetherapy,2015；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)，諸如內(nèi)含子。內(nèi)含子的非限制性例子包括，mvm(67-97bp)、f.ix截短的內(nèi)含子1(300bp)、β-珠蛋白sd/免疫球蛋白重鏈剪接受體(250bp)、腺病毒剪接供體/免疫球蛋白剪接受體(500bp)、sv40晚期剪接供體/剪接受體(19s/16s)(180bp)和雜合腺病毒剪接供體/igg剪接受體(230bp)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)含子可以是100-500個(gè)核苷酸的長度。所述內(nèi)含子可以具有80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500的長度。所述啟動(dòng)子可以具有80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500之間的長度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述aav載體基因組可以包含啟動(dòng)子，例如，但不限于，cmv或u6。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，包含本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav的啟動(dòng)子是cmv啟動(dòng)子。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，包含本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的aav的啟動(dòng)子是u6啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述aav載體可以包含cmv和u6啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述aav載體可以包含cba啟動(dòng)子。引入細(xì)胞-合成的dsrna為了確保sirna分子(例如，sirna雙鏈體和dsrna)的化學(xué)和生物穩(wěn)定性，重要的是，將sirna分子遞送到靶細(xì)胞內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以包括但不限于哺乳動(dòng)物起源的細(xì)胞、人起源的細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞。核酸(包括sirna)在正常生理?xiàng)l件下在糖-磷酸主鏈上攜帶凈負(fù)電荷。為了進(jìn)入細(xì)胞，sirna分子必須與細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層發(fā)生接觸，所述脂質(zhì)雙層的首基也是帶負(fù)電荷的。sirna雙鏈體可以與允許它們穿過細(xì)胞膜的載體(諸如包裝顆粒)形成復(fù)合物以促進(jìn)sirna的細(xì)胞攝取。所述包裝顆粒可以包括但不限于脂質(zhì)體、納米顆粒、陽離子脂質(zhì)、聚乙烯亞胺衍生物、樹枝狀聚合物、碳納米管以及碳制成的納米顆粒與樹枝狀聚合物的組合。脂質(zhì)可以是陽離子脂質(zhì)和/或中性脂質(zhì)。除了充分確立的sirna分子和陽離子載體之間的親脂復(fù)合物以外，可以將sirna分子綴合至疏水部分，諸如膽固醇(例如，美國專利公開號(hào)20110110937；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。該遞送方法具有改善sirna分子的體外細(xì)胞攝取和體內(nèi)藥理學(xué)性能的潛力。本發(fā)明的sirna分子還可以共價(jià)地或非共價(jià)地綴合至某些陽離子的細(xì)胞穿透肽(cpp)，諸如mpg、transportan或penetratin(例如，美國專利公開號(hào)20110086425；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。引入細(xì)胞-aav載體使用多種方案中的任一種，例如，但不限于，病毒載體(例如，aav載體)，可以將本發(fā)明的sirna分子(例如，sirna雙鏈體)引入細(xì)胞中。這些病毒載體經(jīng)過工程改造和優(yōu)化以促進(jìn)sirna分子向不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的進(jìn)入。并且，一些合成的病毒載體具有將shrna整合進(jìn)細(xì)胞基因組中的能力，由此導(dǎo)致穩(wěn)定的sirna表達(dá)和靶基因的長期敲降。以此方式，將病毒載體工程改造為用于特異性遞送的媒介物，同時(shí)缺乏在野生型病毒中發(fā)現(xiàn)的有害復(fù)制和/或整合特征。在某些實(shí)施方案中，如下將本發(fā)明的sirna分子引入細(xì)胞中：使所述細(xì)胞與包含親脂載體和載體(例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列)的組合物接觸。在其它實(shí)施方案中，如下將所述sirna分子引入細(xì)胞中：用載體(例如，aav載體，其包含當(dāng)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄時(shí)能夠生產(chǎn)sirna分子的核酸序列)轉(zhuǎn)染或感染所述細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，如下將所述sirna分子引入細(xì)胞中：向所述細(xì)胞中注射載體，例如，aav載體，其包含當(dāng)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄時(shí)能夠生產(chǎn)sirna分子的核酸序列。在某些實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)染之前，可以向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染載體，例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。在其它實(shí)施方案中，通過電穿孔(例如美國專利公開號(hào)20050014264；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)，可以向細(xì)胞中遞送載體，例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。用于引入載體(例如，aav載體，其包含本文描述的sirna分子的核酸序列)的其它方法可以包括如在美國專利公開號(hào)20120264807(其內(nèi)容通過引用整體并入本文)中所述的光化學(xué)內(nèi)化。在某些實(shí)施方案中，本文描述的制劑可以含有至少一種載體，例如，aav載體，其包含編碼本文描述的sirna分子的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述sirna分子可以靶向在一個(gè)靶位處的sod1基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含多種載體，例如，aav載體，其每種均包含編碼靶向在不同靶位處的sod1基因的sirna分子的核酸序列。可以在2、3、4、5或超過5個(gè)部位處靶向sod1。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將載體(例如，aav載體，其來自任何有關(guān)的物種，例如，但不限于，人、狗、小鼠、大鼠或猴)引入細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將載體(例如，aav載體)引入與要治療的疾病有關(guān)的細(xì)胞中。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述疾病是als，且所述靶細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將載體(例如，aav載體)引入具有靶序列的高內(nèi)源性表達(dá)水平的細(xì)胞中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將載體(例如，aav載體)引入具有靶序列的低內(nèi)源性表達(dá)水平的細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是具有高aav轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的那些。藥物組合物和制劑除了所述藥物組合物(載體，例如，aav載體，其包含編碼sirna分子的核酸序列)以外，本文還提供了適合用于施用給人類的藥物組合物，技術(shù)人員會(huì)理解，這樣的組合物通常適合用于施用給任意其它動(dòng)物，例如，非人動(dòng)物，例如非人哺乳動(dòng)物。對(duì)適合施用給人類的藥物組合物進(jìn)行修改以便使所述組合物適合施用給各種動(dòng)物是被充分理解的，并且具有普通技術(shù)的獸醫(yī)藥理學(xué)家僅用普通(如果有的話)實(shí)驗(yàn)就可以設(shè)計(jì)和/或執(zhí)行這樣的修改。預(yù)見到對(duì)其施用藥物組合物的受試者包括但不限于人類和/或其它靈長類動(dòng)物；哺乳動(dòng)物，包括商業(yè)上相關(guān)的哺乳動(dòng)物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠和/或大鼠；和/或禽類，包括商業(yè)上相關(guān)的禽類，諸如家禽、雞、鴨、鵝和/或火雞。在某些實(shí)施方案中，將組合物施用給人類、人患者或受試者。為了本公開內(nèi)容的目的，短語“活性成分”通常表示合成的sirna雙鏈體、載體(例如，aav載體，其編碼sirna雙鏈體)，或表示由如本文中所述的載體遞送的sirna分子。通過藥理學(xué)領(lǐng)域中已知的或此后開發(fā)的任意方法，可以制備本文描述的藥物組合物的制劑。一般而言，這樣的制備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑和/或一種或多種其它助劑結(jié)合，和然后，如果必要的話和/或合乎需要的話，將產(chǎn)品分包、成形和/或包裝成期望的單次劑量或多次劑量單位。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分、藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或任何額外成分的相對(duì)量將變化，這取決于所治療的受試者的身份、大小和/或病癥，并且進(jìn)一步取決于要施用所述組合物的途徑?？梢允褂靡环N或多種賦形劑配制載體(例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列)，以：(1)增加穩(wěn)定性；(2)增加細(xì)胞轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)；(3)允許持久或延遲釋放；或(4)改變生物分布(例如，將病毒載體靶向至特定組織或細(xì)胞類型諸如腦和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)。本發(fā)明的制劑可以包括，但不限于，鹽水、脂質(zhì)樣物、脂質(zhì)體、脂質(zhì)納米顆粒、聚合物、脂復(fù)合物、芯-殼納米顆粒、肽、蛋白、用病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，用于移植進(jìn)受試者中)、納米顆粒模仿物和它們的組合。此外，使用自裝配的核酸納米顆?？梢耘渲票景l(fā)明的病毒載體。通過藥理學(xué)領(lǐng)域中已知的或此后開發(fā)的任意方法，可以制備本文描述的藥物組合物的制劑。一般而言，這樣的制備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑和/或一種或多種其它助劑結(jié)合。根據(jù)本公開內(nèi)容的藥物組合物可以散裝、作為單一單位劑量和/或作為多個(gè)單一單位劑量制備、包裝和/或銷售。本文中使用的“單位劑量”表示包含預(yù)定量的活性成分的藥物組合物的離散量。活性成分的量通常等于將要施用給受試者的活性成分的劑量，和/或這樣的劑量的合宜分?jǐn)?shù)，如這樣的劑量的二分之一或三分之一。根據(jù)本公開內(nèi)容的藥物組合物中的活性成分、藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或任何額外成分的相對(duì)量可以變化，這取決于正在治療的受試者的特性、大小和/或狀況，并且還取決于要施用所述組合物的途徑。例如，所述組合物可以包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。作為例子，所述組合物可以包含0.1％至100％、例如0.5至50％、1-30％、5-80％、至少80％(w/w)的活性成分。在某些實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％純的。在某些實(shí)施方案中，賦形劑被批準(zhǔn)用于人類和用于獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，賦形劑可以被美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)。在某些實(shí)施方案中，賦形劑可以屬于藥用級(jí)。在某些實(shí)施方案中，賦形劑可以滿足美國藥典(usp)、歐洲藥典(ep)、英國藥典和/或國際藥典的標(biāo)準(zhǔn)。本文中使用的賦形劑包括但不限于溶劑、分散介質(zhì)、稀釋劑或其它液體媒介物、分散或混懸助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑等的任意種和所有，只要它們適合于所希望的特定劑型。用于配制藥物組合物的各種賦形劑和用于制備組合物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第21版,a.r.gennaro,lippincott,williams&wilkins,baltimore,md,2006；通過引用整體并入本文)。在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)可以預(yù)見到常規(guī)賦形劑介質(zhì)的應(yīng)用，但是除了任何常規(guī)賦形劑介質(zhì)可能與物質(zhì)或它的衍生物不相容以外，諸如通過產(chǎn)生任何不希望的生物學(xué)效應(yīng)或另外以有害方式與藥物組合物的任意其它組分相互作用。示例性的稀釋劑包括但不限于碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉、乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化鈉、干燥的淀粉、玉米淀粉、糖粉等，和/或它們的組合。在某些實(shí)施方案中，所述制劑可以包含至少一種無活性成分。本文使用的術(shù)語“無活性成分”表示在制劑中包括的一種或多種無活性試劑。在某些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的制劑中可以使用的全部、沒有或一些無活性成分可以被美國食品和藥品管理局(fda)批準(zhǔn)。包含本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的載體的制劑可以包括陽離子或陰離子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包括金屬陽離子，例如，但不限于，zn2+、ca2+、cu2+、mg+和它們的組合。本文中使用的“藥學(xué)上可接受的鹽”表示公開的化合物的衍生物，其中通過將現(xiàn)有的酸或堿部分轉(zhuǎn)化成其鹽形式(例如，通過使游離堿基團(tuán)與合適的有機(jī)酸反應(yīng))來修飾母體化合物。藥學(xué)上可接受的鹽的例子包括但不限于堿性殘基如胺的無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽；酸性殘基如羧酸的堿鹽或有機(jī)鹽；等。代表性的酸加成鹽包括乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚糖酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽等。代表性的堿金屬或堿土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等，以及無毒的銨、季銨和胺陽離子，包括但不限于銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公開內(nèi)容的藥學(xué)上可接受的鹽包括形成的母體化合物的常規(guī)無毒鹽，例如，從無毒的無機(jī)或有機(jī)酸形成。本公開內(nèi)容的藥學(xué)上可接受的鹽可以通過常規(guī)化學(xué)方法從含有堿性或酸性部分的母體化合物合成。通常，通過使這些化合物的游離酸或堿形式與化學(xué)計(jì)量的量的適當(dāng)?shù)膲A或酸在水或有機(jī)溶劑或這兩者的混合物中反應(yīng)，可以制備這樣的鹽；通常，非水性介質(zhì)如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈是優(yōu)選的。合適的鹽的列表可在以下文獻(xiàn)中找到：remington’spharmaceuticalsciences,第17版,mackpublishingcompany,easton,pa.,1985,第1418頁,pharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse,p.h.stahl和c.g.wermuth(編),wiley-vch,2008,以及berge等人,journalofpharmaceuticalscience,66,1-19(1977)；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文。本文中使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的溶劑合物”是指這樣的本發(fā)明的化合物，其中合適的溶劑的分子摻入晶格中。合適的溶劑在施用的劑量是生理學(xué)上可耐受的。例如，通過從包括有機(jī)溶劑、水或其混合物的溶液結(jié)晶、重結(jié)晶或沉淀，可以制備溶劑合物。合適的溶劑的例子是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、二甲亞砜(dmso)、n,n’-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n’-二甲基乙酰胺(dmac)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(dmeu)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1h)-嘧啶酮(dmpu)、乙腈(acn)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸芐酯等。當(dāng)水是溶劑時(shí)，溶劑合物被稱作“水合物”。根據(jù)本發(fā)明，可以為了cns遞送配制載體，例如，aav載體，其包含本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。可以使用穿過血腦屏障的藥劑。例如，有些可以將sirna分子靶向至血腦屏障內(nèi)皮的細(xì)胞穿透肽可以用于配制靶向sod1基因的sirna雙鏈體(例如，mathupala,expertopintherpat.,2009,19,137-140；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。施用通過導(dǎo)致治療上有效的結(jié)果的任意途徑，可以施用載體，例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。這些包括但不限于腸內(nèi)(進(jìn)入腸)、胃腸內(nèi)、硬膜外(進(jìn)入硬腦膜物質(zhì))、口服(通過口腔)、透皮、硬膜外、大腦內(nèi)(進(jìn)入大腦)、腦室內(nèi)(進(jìn)入腦室)、皮內(nèi)(應(yīng)用在皮膚上)、真皮內(nèi)(進(jìn)入皮膚本身)、皮下(在皮膚下)、鼻施用(通過鼻)、靜脈內(nèi)(進(jìn)入靜脈)、靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)滴注、動(dòng)脈內(nèi)(進(jìn)入動(dòng)脈)、肌肉內(nèi)(進(jìn)入肌肉)、心內(nèi)(進(jìn)入心臟)、骨內(nèi)輸注(進(jìn)入骨髓)、鞘內(nèi)(進(jìn)入椎管)、腹膜內(nèi)(輸注或注射進(jìn)腹膜)、膀胱內(nèi)輸注、玻璃體內(nèi)(通過眼)、海綿竇內(nèi)注射(進(jìn)入病理性腔體)、腔內(nèi)(進(jìn)入陰莖的基底)、陰道內(nèi)施用、子宮內(nèi)、羊膜外施用、透皮(穿過完整皮膚擴(kuò)散用于全身分布)、透粘膜(穿過粘膜擴(kuò)散)、經(jīng)陰道、吹入法(嗅吸法)、舌下、唇下、灌腸劑、滴眼劑(在結(jié)膜上)、滴耳劑、耳(在耳朵中或通過耳朵)、含服(朝向臉頰)、結(jié)膜、皮膚、牙(至一個(gè)或多個(gè)牙)、電滲透、宮頸內(nèi)、endosinusial、氣管內(nèi)、體外、血液透析、滲入、間質(zhì)、腹部內(nèi)、羊膜內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、膽內(nèi)、支氣管內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)(在軟骨內(nèi))、脊尾內(nèi)(在馬尾內(nèi))、腦池內(nèi)(在小腦延髓池內(nèi))、角膜內(nèi)(在角膜內(nèi))、牙冠內(nèi)(dentalintracornal)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)(在冠狀動(dòng)脈內(nèi))、陰莖海綿體內(nèi)(intracorporuscavernosum)(在陰莖海綿體的可擴(kuò)張空間內(nèi))、椎間盤內(nèi)(在椎間盤內(nèi))、導(dǎo)管內(nèi)(在腺的導(dǎo)管內(nèi))、十二指腸內(nèi)(在十二指腸內(nèi))、硬膜內(nèi)(在硬膜內(nèi)或下)、表皮內(nèi)(至表皮)、食管內(nèi)(至食管)、胃內(nèi)(在胃內(nèi))、牙齦內(nèi)(在牙齦內(nèi))、回腸內(nèi)(在小腸的遠(yuǎn)側(cè)部分內(nèi))、病灶內(nèi)(在局部病灶內(nèi)或直接引入局部病灶)、管腔內(nèi)(在管腔內(nèi))、淋巴管內(nèi)(在淋巴內(nèi))、骨髓內(nèi)(在骨的骨髓腔內(nèi))、腦膜內(nèi)(在腦膜內(nèi))、眼內(nèi)(在眼內(nèi))、卵巢內(nèi)(在卵巢內(nèi))、心包內(nèi)(在心包內(nèi))、胸膜內(nèi)(在胸膜內(nèi))、前列腺內(nèi)(在前列腺內(nèi))、肺內(nèi)(在肺或它的支氣管內(nèi))、竇內(nèi)(在鼻或眼窩竇內(nèi))、椎管內(nèi)(在脊柱內(nèi))、滑膜內(nèi)(在關(guān)節(jié)的滑液腔內(nèi))、腱內(nèi)(在肌腱內(nèi))、睪丸內(nèi)(在睪丸內(nèi))、鞘內(nèi)(在腦脊髓軸的任何水平在腦脊液內(nèi))、胸腔內(nèi)(在胸腔內(nèi))、小管內(nèi)(在器官的管內(nèi))、腫瘤內(nèi)(在腫瘤內(nèi))、鼓室內(nèi)(在aurus介質(zhì)內(nèi))、血管內(nèi)(在一個(gè)或多個(gè)血管內(nèi))、心室內(nèi)(在心室內(nèi))、離子透入法(借助于電流，其中可溶性鹽的離子遷移進(jìn)身體的組織中)、沖洗(浸泡或沖洗開放性創(chuàng)傷或體腔)、喉頭(直接在喉上)、鼻胃(穿過鼻并進(jìn)入胃)、封閉敷裹技術(shù)(局部途徑施用，其然后被封閉該區(qū)域的敷料覆蓋)、眼(至外眼)、口咽(直接至口和咽)、胃腸外、經(jīng)皮、關(guān)節(jié)周、硬膜外、神經(jīng)周、牙周、直腸、呼吸(在呼吸道內(nèi)，為了局部或全身效應(yīng)通過口或鼻吸入)、眼球后(腦橋后或眼球后)、軟組織、蛛網(wǎng)膜下、結(jié)膜下、粘膜下、局部、經(jīng)胎盤(通過或穿過胎盤)、經(jīng)氣管(穿過氣管壁)、經(jīng)鼓膜(穿過或通過鼓室)、輸尿管(至輸尿管)、尿道(至尿道)、陰道、骶管阻滯、診斷、神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯、膽灌注、心臟灌注、體外光化學(xué)療法或脊柱。在具體實(shí)施方案中，可以以促進(jìn)載體或sirna分子進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)和透入運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的方式施用載體(例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列)的組合物。在某些實(shí)施方案中，通過肌肉注射可以施用載體，例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。rizvanov等人首次證實(shí)，靶向突變體人sod1mrna的sirna分子會(huì)被坐骨神經(jīng)吸收，向后運(yùn)輸至運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的核周體，并抑制sod1g93a轉(zhuǎn)基因的als小鼠中的突變體sod1mrna(rizvanovaa等人,exp.brainres.,2009,195(1),1-4；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。另一項(xiàng)研究也證實(shí)，表達(dá)針對(duì)突變體sod1基因的小發(fā)夾rna(shrna)的aav的肌肉遞送會(huì)在肌肉以及神經(jīng)支配的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中導(dǎo)致顯著的突變體sod1敲降(townec等人,molther.,2011；19(2):274-283；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在某些實(shí)施方案中，通過周圍注射和/或鼻內(nèi)遞送，可以給受試者施用表達(dá)本發(fā)明的sirna雙鏈體的aav載體。在本領(lǐng)域中公開了，sirna雙鏈體的aav載體的周圍施用可以運(yùn)輸至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，例如，運(yùn)輸至運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(例如，美國專利公開號(hào)20100240739和20100130594；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在其它實(shí)施方案中，通過顱內(nèi)遞送(參見，例如，美國專利號(hào)8,119,611；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)可以給受試者施用組合物，其包含至少一種載體，例如，aav載體，所述載體包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列?？梢砸匀我膺m合形式(作為液體溶液或混懸液，作為適合用于液體溶液或在液體溶液中的混懸液的固體形式)施用載體，例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列?？梢杂萌我膺m當(dāng)?shù)暮退帉W(xué)上可接受的賦形劑配制sirna雙鏈體?？梢砸浴爸委熒嫌行У摹绷渴┯幂d體，例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列，所述“治療上有效的”量即這樣的量：其足以減輕和/或預(yù)防至少一種與疾病有關(guān)的癥狀，或提供受試者的病癥的改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以治療有效量將所述載體(例如，aav載體)施用給cns，以改善患有als的受試者的功能和/或存活。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，可以鞘內(nèi)施用所述載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以sirna雙鏈體或dsrna的治療有效量將所述載體(例如，aav載體)施用給受試者(例如，通過鞘內(nèi)施用而施用至受試者的cns)，以靶向脊髓和/或腦干中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述sirna雙鏈體或dsrna可以減少sod1蛋白或mrna的表達(dá)。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述sirna雙鏈體或dsrna可以抑制sod1和減少sod1介導(dǎo)的毒性。sod1蛋白和/或mrna以及sod1介導(dǎo)的毒性的減少可以幾乎沒有伴有增強(qiáng)的炎癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以治療有效量將所述載體(例如，aav載體)施用給受試者(例如，施用至受試者的cns)，以減慢受試者的功能衰退(例如，通過使用已知的諸如als功能評(píng)級(jí)量表(alsfrs)的評(píng)價(jià)方法確定)和/或延長受試者的不依賴于呼吸機(jī)的存活(例如，降低的死亡率或?qū)粑С值男枰?。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，可以鞘內(nèi)施用所述載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以治療有效量將所述載體(例如，aav載體)施用至小腦延髓池，以轉(zhuǎn)導(dǎo)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和/或星形膠質(zhì)細(xì)胞。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，可以鞘內(nèi)施用所述載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用鞘內(nèi)輸注可以以治療有效量施用所述載體(例如，aav載體)，以轉(zhuǎn)導(dǎo)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和/或星形膠質(zhì)細(xì)胞。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，可以鞘內(nèi)施用所述載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以配制包含調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體，例如，aav載體。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，可以優(yōu)化制劑的堿度和/或滲透壓以確保在中樞神經(jīng)系統(tǒng)或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的區(qū)域或組分中的最佳藥物分布。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過單途徑施用可以將包含調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體(例如，aav載體)遞送給受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過多位點(diǎn)施用途徑可以將包含調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體(例如，aav載體)遞送給受試者。可以在2、3、4、5或超過5個(gè)部位給受試者施用包含調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體，例如，aav載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用推注輸注可以給受試者施用包含本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體，例如，aav載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用在數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)或數(shù)天的時(shí)間段內(nèi)的持久遞送可以給受試者施用包含本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體，例如，aav載體。根據(jù)受試者、分布、制劑或另一種遞送參數(shù)，可以改變輸注速率。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于多位點(diǎn)遞送，所述導(dǎo)管可以位于脊柱中的超過一個(gè)位點(diǎn)處。可以以連續(xù)和/或推注輸注來遞送包含調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體，例如，aav載體。每個(gè)遞送位點(diǎn)可以是不同的定量施用方案，或相同的定量施用方案可以用于每個(gè)遞送位點(diǎn)。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述遞送位點(diǎn)可以是在頸和腰區(qū)域中。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述遞送位點(diǎn)可以是在頸區(qū)域中。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述遞送位點(diǎn)可以是在腰區(qū)域中。在一個(gè)實(shí)施方案中，在遞送包含本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體(例如，aav載體)之前，可以針對(duì)脊柱解剖學(xué)和病理學(xué)分析受試者。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，與沒有脊柱側(cè)凸的受試者相比，具有脊柱側(cè)凸的受試者可以具有不同的定量施用方案和/或?qū)Ч芪恢?。在一個(gè)實(shí)施方案中，在包含調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體(例如，aav載體)的遞送過程中，受試者的脊柱取向可以與地面垂直。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在包含調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體(例如，aav載體)的遞送過程中，受試者的脊柱取向可以與地面平行。在一個(gè)實(shí)施方案中，在包含調(diào)節(jié)性多核苷酸的載體(例如，aav載體)的遞送過程中，受試者的脊柱可以相對(duì)于地面成角。受試者的脊柱相對(duì)于地面的角度可以是至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或180度。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇遞送方法和持續(xù)時(shí)間以提供在脊髓中的廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，使用鞘內(nèi)遞送來提供沿著脊髓的嘴-尾長度的廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，多位點(diǎn)輸注會(huì)提供沿著脊髓的嘴-尾長度的更均勻轉(zhuǎn)導(dǎo)。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，延長的輸注會(huì)提供沿著脊髓的嘴-尾長度的更均勻轉(zhuǎn)導(dǎo)。定量施用通過使用有效地減輕、預(yù)防和/或治療sod1相關(guān)障礙(例如，als)的任何量，可以將本發(fā)明的藥物組合物施用給受試者。所要求的確切量將在受試者之間變化，這取決于受試者的物種、年齡和總體狀況、疾病的嚴(yán)重程度、具體組合物、它的施用模式、它的活性模式等。通常以易于施用和劑量均勻的單位劑型配制本發(fā)明的組合物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的組合物的每日總用量可以由主治醫(yī)師在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。對(duì)于任何特定患者的具體治療有效性將取決于多種因素，包括正在治療的障礙和障礙的嚴(yán)重程度；使用的具體化合物的活性；所用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食；采用的sirna雙鏈體的施用時(shí)間、施用途徑和排泄速率；治療的持續(xù)時(shí)間；與所用的具體化合物組合或同時(shí)使用的藥物；和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的類似因素。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者的年齡和性別可以用于確定本發(fā)明的組合物的劑量。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，較老的受試者可以接受與較年輕的受試者相比更大劑量(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超過90％)的組合物。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，較年輕的受試者可以接受與較老的受試者相比更大劑量(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超過90％)的組合物。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，女性受試者可以接受與男性受試者相比更大劑量(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超過90％)的組合物。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，男性受試者可以接受與女性受試者相比更大劑量(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超過90％)的組合物。在某些具體實(shí)施方案中，根據(jù)疾病狀況、受試者和治療策略可以改變用于遞送本發(fā)明的sirna雙鏈體的aav載體的劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物向細(xì)胞的遞送包含由[vg/小時(shí)＝ml/小時(shí)*vg/ml]定義的遞送速度，其中vg是病毒基因組，vg/ml是組合物濃度，且ml/小時(shí)是延長的遞送的速度。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物向細(xì)胞的遞送可以包含約1x106vg至約1x1016vg/受試者之間的總濃度。在某些實(shí)施方案中，遞送可以包含約1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、2.1x1011、2.2x1011、2.3x1011、2.4x1011、2.5x1011、2.6x1011、2.7x1011、2.8x1011、2.9x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、7.1x1011、7.2x1011、7.3x1011、7.4x1011、7.5x1011、7.6x1011、7.7x1011、7.8x1011、7.9x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、3x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012、4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、8.1x1012、8.2x1012、8.3x1012、8.4x1012、8.5x1012、8.6x1012、8.7x1012、8.8x1012、8.9x1012、9x1012、1x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016vg/受試者的組合物濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物向細(xì)胞的遞送可以包含每位受試者約1x106vg/kg至約1x1016vg/kg之間的總濃度。在某些實(shí)施方案中，遞送可以包含約1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、2.1x1011、2.2x1011、2.3x1011、2.4x1011、2.5x1011、2.6x1011、2.7x1011、2.8x1011、2.9x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、7.1x1011、7.2x1011、7.3x1011、7.4x1011、7.5x1011、7.6x1011、7.7x1011、7.8x1011、7.9x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、3x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012、4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、8.1x1012、8.2x1012、8.3x1012、8.4x1012、8.5x1012、8.6x1012、8.7x1012、8.8x1012、8.9x1012、9x1012、1x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016vg/kg的組合物濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，每劑可以施用約105-106個(gè)病毒基因組(單位)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物向細(xì)胞的遞送可以包含約1x106vg/ml至約1x1016vg/ml之間的總濃度。在某些實(shí)施方案中，遞送可以包含約1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、3.1x1012、3.2x1012、3.3x1012、3.4x1012、3.5x1012、3.6x1012、3.7x1012、3.8x1012、3.9x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012、4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、9x1012、1x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016vg/ml的組合物濃度。在某些實(shí)施方案中，通過使用多次施用(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多次施用)，可以遞送期望的sirna雙鏈體劑量。當(dāng)采用多次施用時(shí)，可以使用分次定量施用方案諸如本文描述的那些。本文中使用的“分次劑量”是將單一單位劑量或總每日劑量分成兩個(gè)或更多個(gè)劑量，例如，單一單位劑量的兩次或更多次施用。本文中使用的“單一單位劑量”是在一個(gè)劑量/在一個(gè)時(shí)間/單個(gè)途徑/單個(gè)接觸點(diǎn)(即，單個(gè)施用事件)中施用的任何調(diào)節(jié)性多核苷酸治療劑的劑量。本文中使用的“總每日劑量”是在24小時(shí)時(shí)間段中給出或開處方的量。它可以作為單一單位劑量施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，將包含本發(fā)明的調(diào)節(jié)性多核苷酸的病毒載體在分次劑量中施用給受試者?？梢栽趦H緩沖液中或在本文描述的制劑中配制它們。治療als的方法在本發(fā)明中提供了向細(xì)胞中引入載體(例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列)的方法，所述方法包括：向所述細(xì)胞中引入足以使靶sod1mrna的降解發(fā)生的量的任何載體，由此激活細(xì)胞中的靶標(biāo)特異性的rnai。在某些方面，所述細(xì)胞可以是干細(xì)胞、諸如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)元、肌細(xì)胞和諸如星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在本發(fā)明中公開了在需要治療的受試者中治療與異常的sod1功能有關(guān)的als的方法。所述方法任選地包括給所述受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物至少包含載體，例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述sirna分子可以沉默sod1基因表達(dá)，抑制sod1蛋白生產(chǎn)，和減輕受試者中的als的一種或多種癥狀，從而在治療上治療als。在某些實(shí)施方案中，向受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)施用組合物，所述組合物包含載體，例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。在其它實(shí)施方案中，向受試者的肌肉施用組合物，所述組合物包含載體，例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列。具體地，可以將載體(例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列)遞送進(jìn)特定類型的靶向的細(xì)胞，包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，包括少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞；和/或包圍神經(jīng)元的其它細(xì)胞，諸如t細(xì)胞。在人als患者和動(dòng)物sod1als模型中的研究暗示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能障礙和死亡中起早期作用。在周圍的保護(hù)性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的正常sod1可以阻止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，即使突變體sod1存在于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中(例如，philips和rothstein,exp.neurol.,2014年5月22日.pii:s0014-4886(14)00157-5的綜述；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在某些具體實(shí)施方案中，所述載體(例如，aav載體，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列)可以用作als的療法。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的組合物作為用于治療als的單獨(dú)治療劑或聯(lián)合治療劑施用。所述載體(例如，aav載體，其編碼靶向sod1基因的sirna雙鏈體)可以與一種或多種其它治療劑聯(lián)合使用。“與……聯(lián)合”不意圖暗示所述藥劑必須同時(shí)施用和/或?yàn)榱艘黄疬f送而配制，盡管這些遞送方法是在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。組合物可以與一種或多種其它的期望治療劑或醫(yī)學(xué)操作并行地、在其之前或之后施用。一般而言，每種試劑將以對(duì)該試劑確定的劑量和/或時(shí)間計(jì)劃來施用?？梢耘c所述載體(例如，aav載體，其編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列)聯(lián)合使用的治療劑可以是小分子化合物，所述小分子化合物是抗氧化劑、抗炎劑、抗細(xì)胞凋亡劑、鈣調(diào)節(jié)劑、抗谷氨酸能劑、結(jié)構(gòu)蛋白抑制劑和參與金屬離子調(diào)節(jié)的化合物?？梢耘c本文描述的載體聯(lián)合使用的、針對(duì)治療als試驗(yàn)過的化合物包括但不限于抗谷氨酸能劑：利魯唑、托吡酯、他侖帕奈、拉莫三嗪、右美沙芬、加巴噴丁和ampa拮抗劑；抗細(xì)胞凋亡劑:米諾環(huán)素、苯基丁酸鈉和阿莫氯醇；抗炎劑:神經(jīng)節(jié)苷脂、塞來考昔、環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、血漿去除術(shù)(plasmaphoresis)、醋酸格拉替雷和沙利度胺；頭孢曲松(berry等人,plosone,2013,8(4))；β-內(nèi)酰胺抗生素；普拉克索(一種多巴胺激動(dòng)劑)(wang等人,amyotrophiclateralscler.,2008,9(1),50-58)；在美國專利公開號(hào)20060074991中的尼美舒利；在美國專利公開號(hào)20130143873中公開的二氮嗪)；在美國專利公開號(hào)20080161378中公開的吡唑酮衍生物；抑制氧化性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的自由基清除劑，諸如溴隱亭(美國專利公開號(hào)20110105517)；在pct專利公開號(hào)2013100571中討論的氨基甲酸苯酯化合物；在美國專利號(hào)6,933,310和8,399,514和美國專利公開號(hào)20110237907和20140038927中公開的神經(jīng)保護(hù)性化合物；和在美國專利公開號(hào)20070185012中教導(dǎo)的糖肽；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文?？梢耘c所述載體(例如，aav載體，其編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列)一起用在聯(lián)合療法中的治療劑可以是可保護(hù)神經(jīng)元損失的激素或變體，諸如促腎上腺皮質(zhì)激素(acth)或其片段(例如，美國專利公開號(hào)20130259875)；雌激素(例如，美國專利號(hào)6,334,998和6,592,845)；它們中的每一篇的內(nèi)容通過引用整體并入本文。神經(jīng)營養(yǎng)因子可以與所述載體(例如，aav載體，其編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列)一起用在聯(lián)合療法中用于治療als。通常，將神經(jīng)營養(yǎng)因子定義為促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長、分化、增殖和/或成熟或者刺激增加的神經(jīng)元活性的物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括向需要治療的受試者遞送一種或多種營養(yǎng)因子。營養(yǎng)因子可以包括但不限于igf-i、gdnf、bdnf、ctnf、vegf、colivelin、扎利羅登、促甲狀腺素釋放激素和adnf、及其變體。在一個(gè)方面，所述載體(例如，aav載體，其編碼至少一種靶向sod1基因的sirna雙鏈體的核酸序列)可以與諸如aav-igf-i(vincent等人,neuromolecularmedicine,2004,6,79-85；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)和aav-gdnf(wang等人,jneurosci.,2002,22,6920-6928；其內(nèi)容通過引用整體并入本文)的表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子的aav載體共同施用。在某些實(shí)施方案中，將用于治療als的本發(fā)明的組合物靜脈內(nèi)地、肌肉內(nèi)地、皮下地、腹膜內(nèi)地、鞘內(nèi)地和/或心室內(nèi)地施用給有需要的受試者，從而允許sirna分子或包含sirna分子的載體穿過血腦屏障和血液脊髓屏障中的一個(gè)或兩個(gè)。在某些方面，所述方法包括(使用例如輸液泵和/或遞送支架)向受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)直接施用(例如，心室內(nèi)地施用和/或鞘內(nèi)地施用)治療有效量的組合物，其包含編碼本發(fā)明的sirna分子的核酸序列的載體，例如，aav載體。所述載體可以用于沉默或抑制sod1基因表達(dá)，和/或減輕受試者中的als的一種或多種癥狀，從而在治療上治療als。在某些方面，在治療的受試者中改善als的癥狀，包括但不限于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性、肌無力、肌肉萎縮、肌肉僵硬、呼吸困難、言語不清、肌束震顫發(fā)生、額顳葉癡呆和/或早產(chǎn)兒死亡。在其它方面，將本發(fā)明的組合物應(yīng)用于腦和脊髓中的一個(gè)或兩個(gè)。在其它方面，改善肌肉協(xié)調(diào)和肌肉功能中的一個(gè)或兩個(gè)。在其它方面，延長受試者的存活。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體(例如，編碼本發(fā)明的sirna的aav載體)向受試者的施用可降低受試者的cns中的突變體sod1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體(例如，aav載體)向受試者的施用可降低受試者的cns中的野生型sod1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體(例如，aav載體)向受試者的施用可降低受試者的cns中的突變體sod1和野生型sod1?？梢允筩ns、cns的一個(gè)區(qū)域或受試者的cns的特定細(xì)胞中的突變體和/或野生型sod1降低約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述載體(例如，aav載體)可使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(例如，腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)和/或星形膠質(zhì)細(xì)胞中的野生型sod1的表達(dá)降低至少50％。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述載體(例如，aav載體)可使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(例如，腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)和/或星形膠質(zhì)細(xì)胞中的突變體sod1的表達(dá)降低至少50％。作為另一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述載體(例如，aav載體)可使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(例如，腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)和/或星形膠質(zhì)細(xì)胞中的野生型sod1和突變體sod1的表達(dá)降低至少50％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體(例如，aav載體)向受試者的施用將減少脊髓中的突變體和/或野生型sod1的表達(dá)，且突變體和/或野生型sod1的表達(dá)的減少將減少受試者中的als的效應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將所述載體(例如，aav載體)施用給處于als的早期階段的受試者。早期階段癥狀包括但不限于無力的和軟的或僵硬的、緊的和痙攣的肌肉，肌肉的抽筋和顫搐(肌束震顫)，肌肉大小的損失(萎縮)，疲勞，差的平衡，言語不清，抓握無力，和/或行走時(shí)絆倒。所述癥狀可以限于單個(gè)身體區(qū)域，或輕度癥狀可以影響超過一個(gè)區(qū)域。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述載體(例如，aav載體)的施用可以減輕als的嚴(yán)重程度和/或癥狀的發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將所述載體(例如，aav載體)施用給處于als的中期階段的受試者。als的中期階段包括但不限于與早期階段相比更普遍的肌肉癥狀，一些肌肉是麻痹的，而其它肌肉是虛弱的或未受影響的，持續(xù)的肌肉顫搐(肌束震顫)、不使用的肌肉可能造成攣縮，此時(shí)關(guān)節(jié)變硬、疼痛且有時(shí)變形，吞咽肌的虛弱可能造成噎塞和較大困難的進(jìn)食和控制唾液，呼吸肌的虛弱可以造成呼吸功能不全(其當(dāng)躺下時(shí)可以是顯著的)，和/或受試者可能具有失控的和不適當(dāng)?shù)男蚩薜陌l(fā)作(假延髓病侵襲)。作為一個(gè)非限制性實(shí)施例，所述載體(例如，aav載體)的施用可以減輕als的嚴(yán)重程度和/或癥狀的發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將所述載體(例如，aav載體)施用給處于als的晚期階段的受試者。als的晚期階段包括但不限于大部分麻痹的隨意肌，幫助移動(dòng)空氣進(jìn)出肺的肌肉被嚴(yán)重?fù)p傷，活動(dòng)性非常受限，差的呼吸可以造成疲勞、模糊思維、頭痛和對(duì)感染或疾病(例如，肺炎)的易感性，言語困難，并且用嘴吃或喝可能是不可能的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體(例如，aav載體)可以用于治療患有als的受試者，所述受試者具有c9orf72突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體(例如，aav載體)可以用于治療患有als的受試者，所述受試者具有tdp-43突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體(例如，aav載體)可以用于治療患有als的受試者，所述受試者具有fus突變。定義除非另外說明，否則以下術(shù)語和短語具有下面描述的含義。所述定義無意在性質(zhì)上成為限制性的，且用于提供本發(fā)明的某些方面的更清楚理解。本文使用的術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和‘寡核苷酸”表示由多脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-d-核糖)或多核糖核苷酸(含有d-核糖)組成的任意核酸聚合物，或任意其它類型的多核苷酸(其為嘌呤或嘧啶堿基或經(jīng)修飾的嘌呤或嘧啶堿基的n糖苷)。在術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之間無意區(qū)分長度，且這些術(shù)語將互換使用。這些術(shù)語僅表示分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因而，這些術(shù)語包括雙鏈和單鏈dna，以及雙鏈和單鏈rna。本文使用的術(shù)語“rna”或“rna分子”或“核糖核酸分子”表示核糖核苷酸的聚合物；術(shù)語“dna”或“dna分子”或“脫氧核糖核酸分子”表示脫氧核糖核苷酸的聚合物。可以天然地合成(例如，分別通過dna復(fù)制和dna的轉(zhuǎn)錄)或化學(xué)地合成dna和rna。dna和rna可以是單鏈的(即，分別是ssrna或ssdna)或多鏈的(例如，雙鏈的，即，分別是dsrna和dsdna)。本文中使用的術(shù)語“mrna”或“信使rna”表示編碼一個(gè)或多個(gè)多肽鏈的氨基酸序列的單鏈rna。本文使用的術(shù)語“rna干擾”或“rnai”表示由rna分子介導(dǎo)的序列特異性的調(diào)節(jié)機(jī)制，其導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的蛋白編碼基因的表達(dá)的抑制或干擾或“沉默”。rnai已經(jīng)在許多類型的生物中觀察到，包括植物、動(dòng)物和真菌。rnai天然地發(fā)生在細(xì)胞中以除去外來rna(例如，病毒rna)。天然rnai通過從游離dsrna切割的片段進(jìn)行，其將降解機(jī)制引導(dǎo)至其它類似的rna序列。rnai由rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)控制，且由細(xì)胞質(zhì)中的短/小dsrna分子起始，其中它們與催化性的risc組分argonaute相互作用?？梢詫srna分子外源地引入細(xì)胞中。外源dsrna通過激活核糖核酸酶蛋白dicer而起始rnai，所述dicer結(jié)合和切割dsrna以產(chǎn)生21-25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈片段，其在每個(gè)末端上具有幾個(gè)未配對(duì)的突出端堿基。這些短雙鏈片段被稱作小干擾rna(sirna)。本文使用的術(shù)語“短干擾rna”、“小干擾rna”或“sirna”表示能夠指導(dǎo)或介導(dǎo)rnai的包含約5-60個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)的rna分子(或rna類似物)。優(yōu)選地，sirna分子包含約15-30個(gè)核苷酸或核苷酸類似物，諸如約16-25個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)，約18-23個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)，約19-22個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)(例如，19、20、21或22個(gè)核苷酸或核苷酸類似物)，約19-25個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)，和約19-24個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)。術(shù)語“短”sirna表示包含5-23個(gè)核苷酸、優(yōu)選21個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)(例如，19、20、21或22個(gè)核苷酸)的sirna。術(shù)語“長”sirna表示包含24-60個(gè)核苷酸、優(yōu)選約24-25個(gè)核苷酸(例如，23、24、25或26個(gè)核苷酸)的sirna。在某些情況下，短sirna可以包括少于19個(gè)核苷酸，例如，16、17或18個(gè)核苷酸，或少至5個(gè)核苷酸，前提條件是，較短的sirna保留介導(dǎo)rnai的能力。同樣地，在某些情況下，長sirna可以包括超過26個(gè)核苷酸，例如，27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60個(gè)核苷酸，前提條件是，較長的sirna保留介導(dǎo)rnai或翻譯抑制的能力，無需進(jìn)一步加工(例如，酶促加工)成短sirna。sirna可以是單鏈rna分子(ss-sirna)或包含有義鏈和反義鏈的雙鏈rna分子(ds-sirna)，所述有義鏈和反義鏈雜交以形成被稱作sirna雙鏈體的雙鏈體結(jié)構(gòu)。本文使用的術(shù)語sirna分子的“反義鏈”或“第一鏈”或“引導(dǎo)鏈”表示這樣的鏈：其與為了沉默而靶向的基因的mrna的約10-50個(gè)核苷酸(例如，約15-30、16-25、18-23或19-22個(gè)核苷酸)的段基本上互補(bǔ)。所述反義鏈或第一鏈具有與期望的靶mrna序列足夠互補(bǔ)的序列以指導(dǎo)靶標(biāo)特異性的沉默，例如，足以觸發(fā)rnai機(jī)制或過程對(duì)期望的靶mrna的破壞的互補(bǔ)性。本文使用的術(shù)語sirna分子的“有義鏈”或“第二條鏈”或“過客鏈”表示與反義鏈或第一鏈互補(bǔ)的鏈。sirna分子的反義鏈和有義鏈發(fā)生雜交以形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。本文中使用的“sirna雙鏈體”包括與為了沉默而靶向的基因的mrna的約10-50個(gè)核苷酸的段具有足夠互補(bǔ)性的sirna鏈和與所述sirna鏈具有足夠互補(bǔ)性以形成雙鏈體的sirna鏈。本文使用的術(shù)語“互補(bǔ)的”表示多核苷酸彼此形成堿基對(duì)的能力。堿基對(duì)通常由反向平行的多核苷酸鏈中的核苷酸單元之間的氫鍵形成?；パa(bǔ)的多核苷酸鏈可以以沃森-克里克方式(例如，a至t、a至u、c至g)或以允許形成雙鏈體的任意其它方式形成堿基對(duì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，當(dāng)使用rna而不是dna時(shí)，尿嘧啶(而不是胸腺嘧啶)是被認(rèn)為與腺苷互補(bǔ)的堿基。但是，當(dāng)在本發(fā)明的上下文中提及u時(shí)，暗示置換t的能力，除非另有說明。完美互補(bǔ)性或100％互補(bǔ)性表示這樣的情形：其中一個(gè)多核苷酸鏈的每個(gè)核苷酸單元都可以與第二個(gè)多核苷酸鏈的核苷酸單元形成氫鍵。小于完美互補(bǔ)性表示這樣的情形：其中兩個(gè)鏈的一些(但是并非全部)核苷酸單元可以彼此形成氫鍵。例如，對(duì)于兩個(gè)20-聚體，如果在每個(gè)鏈上的僅兩個(gè)堿基對(duì)可以彼此形成氫鍵，那么所述多核苷酸鏈表現(xiàn)出10％互補(bǔ)性。在相同的例子中，如果在每個(gè)鏈上的18個(gè)堿基對(duì)可以彼此形成氫鍵，那么所述多核苷酸鏈表現(xiàn)出90％互補(bǔ)性。本文使用的術(shù)語“基本上互補(bǔ)的”是指，所述sirna具有足以結(jié)合期望的靶mrna和觸發(fā)靶mrna的rna沉默的序列(例如，在反義鏈中)。本文中使用的“靶向”是指設(shè)計(jì)和選擇核酸序列的過程，所述核酸序列將與靶核酸雜交并誘導(dǎo)期望的效應(yīng)。術(shù)語“基因表達(dá)”表示這樣的過程：核酸序列通過該過程發(fā)生成功轉(zhuǎn)錄和(在大多數(shù)情況下)翻譯以產(chǎn)生蛋白或肽。為了清楚起見，當(dāng)提及“基因表達(dá)”的測量時(shí)，這應(yīng)當(dāng)被理解為是指，可以測量轉(zhuǎn)錄的核酸產(chǎn)物(例如，rna或mrna)或翻譯的氨基酸產(chǎn)物(例如，多肽或肽)。測量rna、mrna、多肽和肽的量或水平的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。本文使用的術(shù)語“突變”表示基因的結(jié)構(gòu)的任何變化，其導(dǎo)致可以傳遞至后代的變體(也稱為“突變體”)形式?；蛑械耐蛔兛梢杂蒬na中的單個(gè)堿基的改變造成，或者由基因或染色體的更大段的缺失、插入或重排造成。本文使用的術(shù)語“載體”是指運(yùn)輸、轉(zhuǎn)導(dǎo)異源分子(諸如本發(fā)明的sirna分子)或以其它方式充當(dāng)異源分子(諸如本發(fā)明的sirna分子)的載體的任何分子或部分?！安《据d體”是包含一個(gè)或多個(gè)多核苷酸區(qū)域的載體，所述多核苷酸區(qū)域編碼或包含目標(biāo)分子，例如，轉(zhuǎn)基因，編碼一個(gè)多肽或多個(gè)多肽的多核苷酸，或調(diào)節(jié)性核酸諸如小干擾rna(sirna)。病毒載體通常用于將遺傳物質(zhì)遞送進(jìn)細(xì)胞中。經(jīng)常為了特定應(yīng)用修飾病毒載體。病毒載體的類型包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺伴隨病毒載體。本文中使用的術(shù)語“腺伴隨病毒”或“aav”或“aav載體”表示包含或源自腺相關(guān)載體的組分并且適合用于感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞、優(yōu)選人細(xì)胞的任何載體。術(shù)語aav載體通常表示aav型病毒顆?；虿《玖Ｗ?，其包含編碼sirna雙鏈體的核酸分子。所述aav載體可以源自不同血清型，包括血清型的組合(即，“假分型的”aav)，或源自不同基因組(例如，單鏈的或自互補(bǔ)的)。另外，所述aav載體可以是復(fù)制缺陷的和/或靶向的。本文中使用的短語“抑制基因的表達(dá)”是指造成基因的表達(dá)產(chǎn)物的量的減少。所述表達(dá)產(chǎn)物可以是從基因轉(zhuǎn)錄的rna分子(例如mrna)或從基因轉(zhuǎn)錄的rna所翻譯成的多肽。通常，mrna水平的降低會(huì)導(dǎo)致從其翻譯的多肽的水平的降低。通過使用用于測量mrna或蛋白的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以確定表達(dá)的水平。本文使用的術(shù)語“體外”表示在人工環(huán)境中，例如在試管或反應(yīng)容器中、在細(xì)胞培養(yǎng)物中、在培養(yǎng)皿等中，發(fā)生的事件，而不是在生物(例如，動(dòng)物、植物或微生物)內(nèi)發(fā)生的事件。本文使用的術(shù)語“體內(nèi)”表示在生物(例如，動(dòng)物、植物或微生物或其細(xì)胞或組織)內(nèi)發(fā)生的事件。本文使用的術(shù)語“修飾的”表示本發(fā)明的分子的改變的狀態(tài)或結(jié)構(gòu)?？梢砸栽S多方式修飾分子，所述方式包括在化學(xué)上、在結(jié)構(gòu)上和在功能上。本文使用的術(shù)語“合成的”是指通過人手生產(chǎn)、制備和/或制造。本發(fā)明的多核苷酸或多肽或其它分子的合成可以是化學(xué)或酶促的。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”表示將外源核酸引入細(xì)胞中的方法。轉(zhuǎn)染的方法包括但不限于化學(xué)方法、物理處理和陽離子脂質(zhì)或混合物。可以轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中的藥劑的列表較大，且包括但不限于sirna、有義序列和/或反義序列、編碼一個(gè)或多個(gè)基因并被組織進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒中的dna、蛋白、蛋白片段和更多。本文中使用的“脫靶”表示對(duì)任意一種或多種靶標(biāo)、基因和/或細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的任何非目的效果。本文中使用的短語“藥學(xué)上可接受的”在本文中用于表示這樣的化合物、物質(zhì)、組合物和/或劑型：在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，其適用于接觸人類和動(dòng)物的組織，而沒有過度的毒性、刺激、變應(yīng)性應(yīng)答或其它問題或并發(fā)癥，與合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。本文使用的術(shù)語藥劑的“有效量”是這樣的量：所述量足以實(shí)現(xiàn)有益的或期望的結(jié)果，例如，臨床結(jié)果，且這樣，“有效量”取決于它所應(yīng)用的上下文。例如，在施用治療als的藥劑的上下文中，藥劑的有效量是例如這樣的量：與在不施用所述藥劑的情況下得到的應(yīng)答相比，所述量足以實(shí)現(xiàn)如本文中定義的als的治療。本文使用的術(shù)語“治療有效量”是指要遞送的藥劑(例如，核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預(yù)防劑等)的量，當(dāng)施用給遭受或易患感染、疾病、障礙和/或病癥的受試者時(shí)，所述量足以治療、診斷、預(yù)防所述感染、疾病、障礙和/或病癥，改善其癥狀，和/或延遲其發(fā)作。本文使用的術(shù)語“受試者”或“患者”表示可以給其施用根據(jù)本發(fā)明的組合物的任何生物，例如，為了實(shí)驗(yàn)、診斷、預(yù)防和/或治療目的。典型受試者包括動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物諸如小鼠、大鼠、兔、諸如黑猩猩和其它猿類和猴物種的非人靈長類動(dòng)物和人類)和/或植物。本文使用的術(shù)語“預(yù)防”表示延遲或領(lǐng)先病癥或疾病的發(fā)作、發(fā)展或進(jìn)展一段時(shí)間，包括數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。本文中使用的術(shù)語“治療”表示用于治愈或改善疾病的一個(gè)或多個(gè)具體操作的應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，具體操作是一種或多種藥學(xué)試劑的施用。在本發(fā)明的上下文中，具體操作是一種或多種sirna雙鏈體或編碼的靶向sod1基因的dsrna的施用。本文使用的術(shù)語“改善”表示減輕病癥或疾病的至少一種指標(biāo)的嚴(yán)重程度。例如，在神經(jīng)變性障礙的上下文中，改善包括神經(jīng)元損失的減少。本文使用的術(shù)語“施用”表示給受試者提供藥學(xué)試劑或組合物。本文使用的術(shù)語“神經(jīng)變性”表示一種導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的病理性狀態(tài)。大數(shù)目的神經(jīng)學(xué)障礙共享神經(jīng)變性作為一種共同的病理學(xué)狀態(tài)。例如，阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓病和肌萎縮性側(cè)索硬化(als)都造成慢性神經(jīng)變性，其以在數(shù)年的時(shí)間段內(nèi)緩慢的進(jìn)行性神經(jīng)細(xì)胞死亡為特征，而急性神經(jīng)變性以神經(jīng)細(xì)胞死亡的突然發(fā)作為特征，所述突然發(fā)作是因?yàn)槿毖?諸如中風(fēng))或創(chuàng)傷(諸如創(chuàng)傷性腦損傷)，或者是因?yàn)橛擅撍枨驶騽?chuàng)傷(例如由脊髓損傷或多發(fā)性硬化造成)導(dǎo)致的軸突橫斷。在某些神經(jīng)學(xué)障礙中，主要一類神經(jīng)元細(xì)胞是變性的，例如，在als中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性。等同方案和范圍本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到或使用不超過例行實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定根據(jù)本文描述的發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同方案。本發(fā)明的范圍無意限于上面的描述，而是如所附權(quán)利要求所述。在權(quán)利要求中，諸如“一個(gè)”、“一種”和“所述”的冠詞可以是指一個(gè)/種或超過一個(gè)/種，除非指示相反情形或以其它方式從上下文顯而易見。如果群體成員中的一個(gè)、超過一個(gè)或所有成員存在于指定的產(chǎn)品或過程中、在指定的產(chǎn)品或過程中使用或以其它方式與指定的產(chǎn)品或過程相關(guān)，則認(rèn)為滿足在一組的一個(gè)或多個(gè)成員之間包括“或”的權(quán)利要求或描述，除非指示相反情形或以其它方式從上下文顯而易見。本發(fā)明包括這樣的實(shí)施方案，其中所述組的剛好一個(gè)成員存在于給定產(chǎn)品或方法中、用于給定產(chǎn)品或方法中或者以其它方式與給定產(chǎn)品或方法相關(guān)。本發(fā)明包括這樣的實(shí)施方案，其中所述組成員中的超過一個(gè)或全部都存在于給定產(chǎn)品或方法中、用于給定產(chǎn)品或方法中或者以其它方式與給定產(chǎn)品或方法相關(guān)。還應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語“包含”意圖是開放式的，并且允許但不要求包括額外的要素或步驟。因此，當(dāng)在本文中使用術(shù)語“包含”時(shí)，還包括和公開術(shù)語“由……組成”。在給出范圍的情況下，包括端點(diǎn)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，除非另外指示或以其它方式從上下文和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的理解顯而易見，以范圍表述的數(shù)值在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中可呈現(xiàn)處于所述范圍內(nèi)的任何具體數(shù)值或子范圍，其精確至該范圍的下限單位的十分之一，除非上下文另外清楚地指明。另外，應(yīng)當(dāng)理解，可以從任意一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求中明確地排除落在現(xiàn)有技術(shù)內(nèi)的本發(fā)明的任何特定實(shí)施方案。因?yàn)檫@樣的實(shí)施方案被視為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，所以可以排除它們，即使所述排除并未在本文中明確地闡明。可以因?yàn)槿魏卧驈娜我庖豁?xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求排除本發(fā)明的組合物的任何特定實(shí)施方案(例如，任何抗生素、治療劑或活性成分；任何生產(chǎn)方法；任何使用方法等)，無論是否與現(xiàn)有技術(shù)的存在相關(guān)。應(yīng)當(dāng)理解，已經(jīng)使用的詞語是描述而不是限制的詞語，并且可以在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出變化，而不背離在它的更寬方面的本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神。盡管已經(jīng)就幾個(gè)描述的實(shí)施方案而言相當(dāng)詳盡地且相當(dāng)特定地描述了本發(fā)明，但是無意將本發(fā)明限于任何這樣的細(xì)節(jié)或?qū)嵤┓桨富蛉魏尉唧w實(shí)施方案，而是應(yīng)當(dāng)參考所附權(quán)利要求來解釋本發(fā)明，從而考慮到現(xiàn)有技術(shù)提供這類權(quán)利要求的最廣泛的可能解釋，并因此有效地包括本發(fā)明的預(yù)期范圍。實(shí)施例實(shí)施例1.sod1sirna設(shè)計(jì)和合成sod1sirna設(shè)計(jì)進(jìn)行sirna設(shè)計(jì)以鑒別靶向人sod1基因的sirna。所述設(shè)計(jì)使用如表2中所述的針對(duì)人((genebank登記號(hào)nm_000454.4(seqidno:1))、食蟹猴((genebank登記號(hào)xm_005548833.1)，來自ncbirefseq中心(63版)(seqidno:2))和恒河猴(sod1轉(zhuǎn)錄物ensmmut00000002415(seqidno:3)，來自ensembl計(jì)劃(75版))的sod1轉(zhuǎn)錄物。表2.sod1基因序列將sirna雙鏈體設(shè)計(jì)成對(duì)于反義鏈的位置2-18與人sod1轉(zhuǎn)錄物具有100％同一性，且對(duì)于反義鏈的位置2-18與非人靈長類動(dòng)物sod1轉(zhuǎn)錄物具有部分或100％同一性。在所有sirna雙鏈體中，將反義鏈的位置1工程改造為u，且將有義鏈的位置19工程改造為c，以便在該位置使雙鏈體不配對(duì)。sod1sirna序列選擇基于預(yù)測的反義鏈對(duì)人、食蟹猴和恒河猴sod1基因的選擇性，以及在mirbase20.0中在反義鏈的位置2-7處的種子序列與人序列的匹配的缺乏，合成了共計(jì)169個(gè)反義和169個(gè)有義人sod1衍生的寡核苷酸并形成雙鏈體(表3)。然后針對(duì)內(nèi)源性sod1基因表達(dá)(sod1mrna水平)的體外抑制活性試驗(yàn)了sirna雙鏈體。表3.人sod1dsrna的有義和反義鏈序列sod1sirna合成根據(jù)氨基亞磷酸酯寡聚化化學(xué)，在abi3900合成儀(appliedbiosystems)上裝配寡核糖核苷酸。固體支持物是加載了2’-脫氧-胸苷(購自glenresearch,sterling,virginia,usa)的聚苯乙烯，以提供0.2μmol的合成規(guī)模。輔助合成試劑dna和rna氨基亞磷酸酯得自safcproligo(hamburg,德國)。具體地，使用具有2’-o-叔丁基二甲基甲硅烷基的尿苷(u)、胸苷(dt)、4-n-乙?；?cac)、6-n-苯甲酰基腺苷(abz)和2-n-異丁基鳥苷(gibu)的5’-o-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-o-(2-氰基乙基-n,n-二異丙基)氨基亞磷酸酯單體來構(gòu)建寡聚體序列。通過采用5-乙基硫代-1h-四唑(ett)作為活化劑(在乙腈中0.5m)，所有氨基亞磷酸酯(在乙腈中70mm)的偶聯(lián)時(shí)間是3min。在合成儀上合成序列，并除去最終的二甲氧基三苯甲基保護(hù)基(“dmt除去”合成)。固相合成結(jié)束后，將寡核糖核苷酸從固體支持物切割并使用甲胺水溶液(40％)和甲胺在乙醇中的溶液(33％)的1:1(v/v)混合物去保護(hù)。在45℃保持90分鐘以后，將溶液用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)稀釋，并加入三乙胺三氫氟酸鹽(tea.hf)。在45℃溫育2小時(shí)以后，將寡核糖核苷酸用1mnaoac以及丙酮和乙醇4:1(v/v)的混合物沉淀。將沉淀物溶解在1mnacl水溶液中，并通過尺寸排阻色譜法脫鹽。這通過使用配有hitrap5ml柱(gehealthcare)的aktapurifierhplc系統(tǒng)(gehealthcare,freiburg,德國)完成。通過maldi質(zhì)譜法或esi質(zhì)譜法證實(shí)寡核糖核苷酸的同一性。為了從rna單鏈產(chǎn)生sirna，將等摩爾量的互補(bǔ)有義鏈和反義鏈混合，并在20mmnacl、4mm磷酸鈉ph6.8緩沖液中退火。在使用之前冷凍儲(chǔ)存sirna。實(shí)施例2.用于人sod1mrna抑制的sod1sirna的體外篩選通過使用bdna(分支dna)測定來定量sod1mrna，針對(duì)hela細(xì)胞中內(nèi)源性sod1表達(dá)的抑制測定了靶向人sod1的sirna(描述在表3中)。將來自雙劑量測定的結(jié)果用于選擇sod1dsrna雙鏈體的子集，將其用于在4類培養(yǎng)的細(xì)胞中的劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)以計(jì)算ic50。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞得自atcc(與lgcstandards合伙的atcc,wesel,德國)，并在保濕培養(yǎng)箱中于37℃、5％co2的氣氛下在補(bǔ)充含有10％胎牛血清(來自gibco/lifetechnologies的超低igg)和1％青霉素/鏈霉素(biochromgmbh,berlin,德國)的ham氏f-12培養(yǎng)基(biochromgmbh,berlin,德國)中培養(yǎng)。對(duì)于使用sirna的轉(zhuǎn)染，將hela細(xì)胞以19,000-20,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96-孔板中。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，用lipofectamine2000(invitrogen/lifetechnologies)進(jìn)行sirna的轉(zhuǎn)染。對(duì)于雙劑量篩選，使用1nm或0.1nm的sod1sirna濃度。用10、2.5、0.6、0.16、0.039、0.0098、0.0024、0.0006、0.00015和0.000038nm的sod1sirna濃度進(jìn)行劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)。用螢光素酶sirna、aha-1sirna、plgfsirna或無關(guān)sirna的對(duì)照混合物轉(zhuǎn)染對(duì)照孔。分支dna測定-quantigene2.0與sirna一起溫育24小時(shí)以后，除去培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在150μl裂解混合物(1體積裂解混合物，2體積無核酸酶的水)中裂解，然后在53℃溫育60分鐘。然后將80μl工作探針集合(workingprobeset)sod1(基因靶標(biāo))和90μl工作探針集合gapdh(內(nèi)源對(duì)照)和20μl或10μl細(xì)胞裂解物加入捕獲平板中。將捕獲平板在55℃(對(duì)于sod1)和53℃(對(duì)于gapdh)溫育(大約16-20小時(shí))。次日，將捕獲平板用至少300μl1x洗滌緩沖液(無核酸酶的水、緩沖液組分1和洗滌緩沖液組分2)洗滌3次(在最后一次洗滌后，將平板翻轉(zhuǎn)并將它在清潔的紙巾上印跡)。將100μl擴(kuò)增器前工作試劑(pre-amplifierworkingreagent)加入sod1捕獲平板，將其用鋁箔密封并在55℃溫育1小時(shí)。溫育1小時(shí)以后，重復(fù)洗滌步驟，然后將100μl擴(kuò)增器工作試劑(amplifierworkingreagent)加入sod1和gapdh捕獲平板。在55℃(sod1)或53℃(gapdh)溫育1小時(shí)以后，重復(fù)洗滌和干燥步驟，并加入100μl標(biāo)記探針。將捕獲平板在50℃(sod1)或53℃(gapdh)溫育1小時(shí)。然后將平板用1x洗滌緩沖液洗滌并干燥，然后將100μl底物加入捕獲平板。在暗處溫育30分鐘以后使用1420發(fā)光計(jì)數(shù)器(wallacvictorlight,perkinelmer,rodgau-jügesheim,德國)讀出發(fā)光。bdna數(shù)據(jù)分析對(duì)于每種sod1sirna或?qū)φ誷irna，平行地轉(zhuǎn)染四個(gè)孔，且從每個(gè)孔收集各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。對(duì)于每個(gè)孔，將sod1mrna水平歸一化至gapdhmrna水平。將給定的sod1sirna的活性表達(dá)為在處理的細(xì)胞中的sod1mrna濃度(歸一化至gapdhmrna)相對(duì)于在對(duì)照孔中取平均值的sod1mrna濃度(歸一化至gapdhmrna)的百分比。表4提供了來自體外hela篩選的結(jié)果，其中在1nm或0.1nm測試了sod1sirna，其序列給出在表3中。對(duì)于每種sod1sirna，在處理的細(xì)胞中剩余的sod1mrna(歸一化至gapdhmrna)相對(duì)于對(duì)照的平均百分比以及標(biāo)準(zhǔn)差顯示在表4中。許多在1nm的sod1sirna有效地使hela細(xì)胞中的sod1mrna水平降低超過80％。此外，許多在0.1nm的sod1sirna有效地使hela細(xì)胞中的sod1mrna水平降低超過80％。表4.sod1sirna在hela細(xì)胞中關(guān)于sod1基因表達(dá)抑制活性的體外篩選的雙劑量結(jié)果在劑量-應(yīng)答實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)了12種在0.1nm在hela細(xì)胞中最有活性的sod1sirna。表5提供了這12種選擇的sod1sirna在hela細(xì)胞中的ic50濃度，其導(dǎo)致相對(duì)于對(duì)照的50％sod1mrna抑制。這12種sod1sirna在該實(shí)驗(yàn)范例中是特別有效的，并表現(xiàn)出1-8pm之間的ic50值。表5.sod1sirna在hela細(xì)胞中關(guān)于sod1基因表達(dá)抑制活性的體外測定的ic50結(jié)果在下面表6中詳細(xì)呈現(xiàn)了用于鑒別這12種sod1sirna的ic50的來自hela細(xì)胞的劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)。測定所有12種sirna在hela細(xì)胞中具有pmic50。在表5中的sod1sirna的ic50數(shù)據(jù)是在下面表6中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)的總結(jié)。表6.12種sod1sirna在hela細(xì)胞中的劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)實(shí)施例3.在sh-sy5y細(xì)胞、u87細(xì)胞和原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞中選擇的sod1sirna針對(duì)內(nèi)源性sod1mrna表達(dá)的體外篩選sh-sy5y細(xì)胞得自atcc(與lgcstandards合伙的atcc,wesel,德國)，并在保濕培養(yǎng)箱中于37℃、5％co2的氣氛下在補(bǔ)充含有15％fcs(來自gibco/lifetechnologies的超低igg)、1％l-谷氨酰胺(biochromgmbh,berlin,德國)和1％青霉素/鏈霉素(biochromgmbh,berlin,德國)的dulbecco氏mem(biochromgmbh,berlin,德國)中培養(yǎng)。u87mg細(xì)胞得自atcc(與lgcstandards合伙的atcc,wesel,德國)，并在保濕培養(yǎng)箱中于37℃、5％co2的氣氛下在補(bǔ)充含有10％fcs(來自gibco/lifetechnologies的超低igg)和1％青霉素/鏈霉素(biochromgmbh,berlin,德國)的atcc配制的eagle氏最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(與lgcstandards合伙的atcc,wesel,德國)中培養(yǎng)。原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞得自lonza(lonzasalesltd,basel,瑞士)，并在保濕培養(yǎng)箱中于37℃、5％co2的氣氛下在補(bǔ)充了agmsinglequotkit(lonzasalesltd,basel,瑞士)的abm基礎(chǔ)培養(yǎng)基(lonzasalesltd,basel,瑞士)中培養(yǎng)。除了用于sh-sy5y細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine2000(invitrogen/lifetechnologies)、用于u87細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑為rnaimax(invitrogen/lifetechnologies)和用于原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine2000(invitrogen/lifetechnologies)以外，以與關(guān)于hela細(xì)胞描述的方式類似的方式，執(zhí)行用12種選擇的sirna(d-2757、d-2806、d-2860、d-2861、d-2875、d-2871、d-2758、d-2759、d-2866、d-2870、d-2823、d-2858)對(duì)sh-sy5y細(xì)胞、u87mg細(xì)胞和原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染以及用bdna對(duì)sod1和gapdhmrna水平的定量。分別在下面表7、8和9中詳細(xì)呈現(xiàn)了用于鑒別這12種sod1sirna(d-2757、d-2806、d-2860、d-2861、d-2875、d-2871、d-2758、d-2759、d-2866、d-2870、d-2823、d-2858)的ic50的、來自sh-sy5y細(xì)胞、u87mg細(xì)胞和原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞的劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)。確定所有12種sirna在u87細(xì)胞中具有pmic50。ic50值提供在表10中。在原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞中的ic50通常高于在sh-sy5y和u87mg細(xì)胞中的。表7.12種sod1sirna在sh-sy5y細(xì)胞中的劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)表8.12種sod1sirna在u87mg細(xì)胞中的劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)表9.12種sod1sirna在原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞中的劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)在表10中的sod1sirna的ic50數(shù)據(jù)是在表7、8和9中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)的總結(jié)。表10.sod1sirna在sh-sy5y細(xì)胞、u87mg細(xì)胞和原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞中關(guān)于sod1基因表達(dá)抑制活性的體外測定的ic50結(jié)果實(shí)施例4.靶向sod1的sirna將發(fā)現(xiàn)有效的sod1sirna的過客-引導(dǎo)鏈雙鏈體工程改造成表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)或神經(jīng)元細(xì)胞系的細(xì)胞中。即使在sirna敲降研究中使用的突出端是對(duì)于sirna而言規(guī)范的dtdt，所述構(gòu)建體中的突出端可以包含任何二核苷酸突出端。使用的細(xì)胞可以是原代細(xì)胞或源自誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ips細(xì)胞)。然后測量sod1敲降，并執(zhí)行深度測序以確定從在表達(dá)載體中施用的每種構(gòu)建體加工成的確切過客和引導(dǎo)鏈。計(jì)算引導(dǎo)與過客鏈比率以確定敲降的效率，例如，rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)加工的敲降的效率。將n-末端測序以確定切割位點(diǎn)和確定靶標(biāo)的均勻切割百分比。如所預(yù)期的，切割高于90％。在一個(gè)平行研究中共轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞以分析sod1的體外敲降。使用螢光素酶構(gòu)建體作為對(duì)照來確定脫靶效應(yīng)。再次執(zhí)行深度測序。實(shí)施例5.靶向sod1的過客和引導(dǎo)序列根據(jù)本發(fā)明，設(shè)計(jì)了sod1sirna。這些給出在表11a和11b中。過客和引導(dǎo)鏈描述在表中。在表11a和11b中，序列的名稱的“mir”組分不一定對(duì)應(yīng)mirna基因的序列編號(hào)(例如，voymir-101是該序列的名稱，且不一定意味著mir-101是該序列的部分)。表11a.過客和引導(dǎo)序列(5’-3’)表11b.過客和引導(dǎo)序列(5’-3’)實(shí)施例6.在aav-mirna載體中的sod1sirna構(gòu)建體將在表11中列出的sod1sirna的過客-引導(dǎo)鏈雙鏈體工程改造成aav-mirna表達(dá)載體。構(gòu)建體(從itr至itr，以5’至3’列舉)包含突變體itr、啟動(dòng)子(cmv、u6或cb6啟動(dòng)子(其包括cmvie增強(qiáng)子、cba啟動(dòng)子和sv40內(nèi)含子)、來自表11的過客和引導(dǎo)鏈(具有在過客和引導(dǎo)鏈之間的環(huán)、在過客鏈之前的5’側(cè)接區(qū)域和在引導(dǎo)鏈之后的3’側(cè)接區(qū)域)、兔珠蛋白聚腺苷酸和野生型itr。執(zhí)行體外和體內(nèi)研究以測試aav-mirna表達(dá)載體的效力。實(shí)施例7.構(gòu)建體在hela細(xì)胞中的活性在hela中轉(zhuǎn)染在實(shí)施例6中描述的7種sod1sirna構(gòu)建體(voymir-103、voymir-105、voymir-108、voymir-114、voymir-119、voymir-120和voymir-127)和雙鏈mcherry的對(duì)照，以測試所述構(gòu)建體的活性。a.過客和引導(dǎo)鏈活性將7種sod1sirna構(gòu)建體和雙鏈mcherry的對(duì)照轉(zhuǎn)染進(jìn)hela細(xì)胞中。48小時(shí)以后，評(píng)價(jià)內(nèi)源性mrna表達(dá)。所有7種sod1sirna構(gòu)建體表現(xiàn)出引導(dǎo)鏈的高活性(具有75-80％敲降)和過客鏈的低至無的活性。sod1sirna候選載體的引導(dǎo)鏈表現(xiàn)出高活性，產(chǎn)生75-80％的sod1敲降，而過客鏈表現(xiàn)出小至無的活性。b.構(gòu)建體對(duì)sod1的活性將7種sod1sirna構(gòu)建體和雙鏈mcherry的對(duì)照(dscherry)以1e4vg/細(xì)胞、1e3vg/細(xì)胞或1e2vg/細(xì)胞的moi轉(zhuǎn)染進(jìn)hela細(xì)胞中。72小時(shí)以后，評(píng)價(jià)內(nèi)源性mrna表達(dá)。所有7種sod1sirna構(gòu)建體在1e3vg/細(xì)胞表現(xiàn)出有效的敲降。大多數(shù)sod1sirna構(gòu)建體表現(xiàn)出高活性(75-80％敲降)，如在圖1中所示。實(shí)施例8.構(gòu)建體在hek細(xì)胞中的活性將在實(shí)施例6中描述的30種sod1sirna構(gòu)建體(voymir-102.860、voymir-102.861、voymir-102.866、voymir-102.870、voymir-102.823、voymir-104.860、voymir-104.861、voymir-104.866、voymir-104.870、voymir-104.823、voymir-109.860、voymir-109.861、voymir-109.866、voymir-109.870、voymir-109.823、voymir-114.860、voymir-114.861、voymir-114.866、voymir-114.870、voymir-114.823、voymir-116.860、voymir-116.861、voymir-116.866、voymir-116.870、voymir-116.823、voymir-127.860、voymir-127.861、voymir-127.866、voymir-127.870、voymir-127.823)以及voymir-114和雙鏈mcherry的對(duì)照轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中，以測試所述構(gòu)建體的活性。a.過客和引導(dǎo)鏈在hek293中的活性將30種構(gòu)建體和2種對(duì)照轉(zhuǎn)染進(jìn)hek293t細(xì)胞中。24小時(shí)以后，評(píng)價(jià)內(nèi)源性mrna表達(dá)。大多數(shù)構(gòu)建體表現(xiàn)出引導(dǎo)鏈的高活性(圖2)和過客鏈的低至無的活性(圖3)。b.過客和引導(dǎo)鏈在hela中的活性將30種構(gòu)建體和2種對(duì)照轉(zhuǎn)染進(jìn)hela細(xì)胞中。48小時(shí)以后，評(píng)價(jià)內(nèi)源性mrna表達(dá)。大多數(shù)構(gòu)建體表現(xiàn)出引導(dǎo)鏈的高活性(圖4)和過客鏈的低至無的活性(圖5)。c.hela和hek293相關(guān)性30種構(gòu)建體的敲降在hela和hek293細(xì)胞之間是類似的。30種構(gòu)建體表現(xiàn)出構(gòu)建體的引導(dǎo)鏈的敲降(參見圖2和4)。構(gòu)建體的大多數(shù)引導(dǎo)鏈表現(xiàn)出70-90％敲降。d.衣殼選擇將來自hela和hek293的前列(top)構(gòu)建體包裝進(jìn)aav中并經(jīng)歷hela感染。為了確定最佳的aav以包裝構(gòu)建體，將包裝在aav2或aav-dj8中的mcherry以10vg/細(xì)胞、1e2vg/細(xì)胞、1e3vg/細(xì)胞、1e4vg/細(xì)胞或1e5vg/細(xì)胞的moi感染進(jìn)hela細(xì)胞中，并在40小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)。選擇aav2作為衣殼來包裝頂構(gòu)建體。e.aav2生產(chǎn)將來自hela和hek293的前列構(gòu)建體包裝進(jìn)aav2(1.6kb)中，且還包裝了雙鏈mcherry的對(duì)照(dsmcherry)。包裝的構(gòu)建體在分析之前經(jīng)歷idoixanol純化。aav滴度顯示在表12中。表12.aav滴度轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)hela細(xì)胞中的sod1敲降的作用顯示在圖6中。另外，在hela細(xì)胞中，較大的moi(1.0e+04相對(duì)于1.0e+05)沒有表現(xiàn)出對(duì)于每種構(gòu)建體而言增加的敲降。f.構(gòu)建體在人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞(hmnp)中的活性將在實(shí)施例8e中描述的前18種pri-mirna構(gòu)建體和mcherry的對(duì)照以10e5的moi感染進(jìn)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖(hmnp)細(xì)胞中。48小時(shí)以后，評(píng)價(jià)內(nèi)源性mrna表達(dá)。約一半的構(gòu)建體給出hmnp中的sod1的大于50％沉默，且其中4種給出大于70％沉默(圖7)。g.用于體內(nèi)研究的構(gòu)建體選擇選擇前12種構(gòu)建體，它們具有對(duì)靶序列的重大作用和對(duì)盒的微小作用。將包裝在aav-rh10衣殼中的這些構(gòu)建體配制成注射劑并施用在哺乳動(dòng)物中以研究所述構(gòu)建體的體內(nèi)作用。實(shí)施例9.構(gòu)建體的體外研究將包裝在aav2中的在實(shí)施例8d中描述的18種構(gòu)建體和mcherry對(duì)照用于該研究。對(duì)于該研究，將在培養(yǎng)基(500mldmem/f-12glutamaxtm補(bǔ)充物(lifetechnologies,目錄號(hào)10565-018)、50mlfbs(lifetechnologies,目錄號(hào)16000-044,批號(hào)：1347556)、5mlmem非必需氨基酸溶液(100x)(目錄號(hào)11140-050)和5mlhepes(1m)(lifetechnologies,目錄號(hào)15630-080))中的hek293t細(xì)胞(fisherscientific,目錄號(hào)hcl4517)、在培養(yǎng)基(500mldmem/f-12glutamaxtm補(bǔ)充物(lifetechnologies,目錄號(hào)10565-018)、50mlfbs(lifetechnologies,目錄號(hào)16000-044,批號(hào)：1347556)、5mlmem非必需氨基酸溶液(100x)(目錄號(hào)11140-050)和5mlhepes(1m)(lifetechnologies,目錄號(hào)15630-080))中的u251mg細(xì)胞(p18)(sigma,目錄號(hào)09063001-1vl)，或在培養(yǎng)基(補(bǔ)充了agmsinglequotkitsuppl.&growthfactors(lonza,目錄號(hào)cc-4123)的abm基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml(lonza,目錄號(hào)cc-3186))中的正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞(ha)(lonza,目錄號(hào)cc-2565)用于測驗(yàn)構(gòu)建體。接種hek293t細(xì)胞(5x10e4個(gè)細(xì)胞/孔，在96孔板中)、u251mg細(xì)胞(2x10e4個(gè)細(xì)胞/孔，在96孔板中)和ha細(xì)胞(2x10e4個(gè)細(xì)胞/孔，在96孔板中)，且用于感染細(xì)胞的moi是1.0e+05。48小時(shí)以后，分析細(xì)胞，結(jié)果顯示在表13中。表13.相對(duì)sod1mrna水平對(duì)于大多數(shù)構(gòu)建體，在hek293t細(xì)胞中看到大于80％敲降。超過一半的構(gòu)建體在u251mg細(xì)胞中和在ha細(xì)胞中表現(xiàn)出大于80％敲降。實(shí)施例10.劑量依賴性的sod1降低將在實(shí)施例8e中描述的前18種pri-mirna構(gòu)建體中的4種和mcherry的對(duì)照以1.0e+02、1.0e+03、1.0e+04、1.0e+05或1.0e+06的moi轉(zhuǎn)染進(jìn)人星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系(u251mg)或原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞(ha)中。48小時(shí)以后，評(píng)價(jià)內(nèi)源性mrna表達(dá)，且劑量依賴性的沉默顯示在圖8(u251mg)和圖9(ha)中。對(duì)于所有構(gòu)建體，劑量的增加也與敲降的sod1mrna的量的增加相關(guān)聯(lián)。實(shí)施例11.sod1敲降的時(shí)程將兩種pri-mirna構(gòu)建體(voymir-120和voymir-122)、sod1sirna的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照轉(zhuǎn)染進(jìn)人星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系(u251mg)中。確定相對(duì)sod1mrna60小時(shí)，如在圖10中所示。在nucleofector轉(zhuǎn)染以后，對(duì)于兩種初級(jí)-mir構(gòu)建體都看到70-75％的hsod1敲降，在12-24小時(shí)窗口中看到最大敲降。實(shí)施例12.sod1敲降和站立百分比將voymir-104以50pm、100pm和150pm的濃度轉(zhuǎn)染進(jìn)hela細(xì)胞中，并與未處理的(ut)細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比。在36、72、108和144小時(shí)確定相對(duì)sod1mrna、引導(dǎo)鏈的百分比和過客鏈的百分比，如在圖11a-11c中所示。最高濃度(150pm)表現(xiàn)出表達(dá)的最大減少，但是所有3種劑量表現(xiàn)出sod1表達(dá)的顯著減少。實(shí)施例13.靶向sod1的構(gòu)建體為dogsod1設(shè)計(jì)構(gòu)建體，且所述構(gòu)建體給出在表14中。在本發(fā)明所靶向的區(qū)域中，dogsod1是與人100％保守的。在表中描述了過客和引導(dǎo)序列。在表14中，序列的名稱的“mir”組分不一定對(duì)應(yīng)mirna基因的序列編號(hào)(例如，dvoymir-102是該序列的名稱，且不一定意味著mir-102是該序列的部分)。表14.dog序列(5’-3’)實(shí)施例14.調(diào)節(jié)性多核苷酸的位置的影響a.對(duì)病毒滴度的影響將sirna分子(voymir-114或voymir-126)在6個(gè)不同位置插入表達(dá)載體(基因組大小2400個(gè)核苷酸；scaav)中，如在圖12中所示。在圖12中，“itr”是反向末端重復(fù)，“i”代表內(nèi)含子，“p”是聚腺苷酸且“mp”是包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸。對(duì)于6個(gè)位置和對(duì)于對(duì)照(沒有調(diào)節(jié)性多核苷酸的構(gòu)建體；scaav)，使用taqmanpcr評(píng)價(jià)了病毒滴度，結(jié)果顯示在表15中。表15.病毒滴度b.對(duì)基因組完整性的影響將sirna分子(voymir-114)在6個(gè)不同位置插入表達(dá)載體(基因組大小2400個(gè)核苷酸；scaav)和沒有調(diào)節(jié)性多核苷酸的對(duì)照(scaav)中，如在圖12中所示。在圖12中，“itr”是反向末端重復(fù)，“i”代表內(nèi)含子，“p”是聚腺苷酸且“mp”是包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸。從經(jīng)純化的aav制品提取病毒基因組并在中性瓊脂糖凝膠上跑膠。在所有構(gòu)建體中看到截短的基因組，且截短的基因組的近似百分比(總數(shù)的百分比)顯示在表16中。表16.截短的基因組位置6具有最大數(shù)目的截短的基因組，而位置4和5具有最小量的截短的基因組。c.對(duì)敲降效率的影響將sirna分子(voymir-114)在6個(gè)不同位置插入表達(dá)載體(aav2)(基因組大小2400個(gè)核苷酸；scaav)中，如在圖12中所示。在圖12中，“itr”是反向末端重復(fù)，“i”代表內(nèi)含子，“p”是聚腺苷酸且“mp”是包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸。在1x104vg/細(xì)胞、1x103vg/細(xì)胞和1x102vg/細(xì)胞進(jìn)行hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在感染后72小時(shí)確定sod1mrna表達(dá)(作為對(duì)照(egfp)的百分比)，結(jié)果顯示在表17中。表17.sod1表達(dá)位置3具有最高的sod1mrna表達(dá)(作為對(duì)照的％)，且位置4具有最低的sod1mrna表達(dá)(作為對(duì)照的％)。實(shí)施例15.基因組大小的影響a.對(duì)病毒滴度的影響將sirna分子(voymir-114)在位置1、2、5和6處插入表達(dá)載體(基因組大小2kb；scaav)中，如在圖12中所示。在圖12中，“itr”是反向末端重復(fù)，“i”代表內(nèi)含子，“p”是聚腺苷酸且“mp”是包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸。將沒有sirna分子的雙鏈對(duì)照(基因組大小1.6kb；scaav對(duì)照)和雙鏈表達(dá)載體(scaavmir114；itr(105核苷酸)-啟動(dòng)子(～900個(gè)核苷酸)-包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸(158個(gè)核苷酸)-聚腺苷酸序列(127個(gè)核苷酸)和itr)進(jìn)行對(duì)比，以及不含sirna分子的對(duì)照(egfp；scaav)。使用taqmanpcr評(píng)價(jià)病毒滴度，結(jié)果顯示在表18中。表18.病毒滴度構(gòu)建體大小病毒滴度(vg/15-cm盤)位置12kb9.5e+10位置22kb1.2e+11scaavmir1141.6kb1.1e+11位置52kb2.4e+10位置62kb1.1e+11對(duì)照2kb2.2e+11用位置5構(gòu)建體看到最低病毒滴度，用位置2構(gòu)建體看到最大值。b.對(duì)基因組完整性的影響將sirna分子(voymir-114)在位置1、2、5和6處插入表達(dá)載體(基因組大小2kb；scaav)中，如在圖12中所示。在圖12中，“itr”是反向末端重復(fù)，“i”代表內(nèi)含子，“p”是聚腺苷酸且“mp”是包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸。將沒有sirna分子的雙鏈對(duì)照(基因組大小1.6kb；scaav對(duì)照)和雙鏈表達(dá)載體(scaavmir114；itr(105核苷酸)-啟動(dòng)子(～900個(gè)核苷酸)-包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸(158個(gè)核苷酸)-聚腺苷酸序列(127個(gè)核苷酸)和itr)進(jìn)行對(duì)比，以及不含sirna分子的對(duì)照(egfp；scaav)。在所有構(gòu)建體中看到截短的基因組，且截短的基因組的近似百分比(總數(shù)的百分比)顯示在表19中。表19.截短的基因組確定所有構(gòu)建體具有一些截短的基因組。進(jìn)行另一項(xiàng)研究以確定不同的sirna分子的影響。將voymir-114和voymir-126在位置3處插入單獨(dú)的表達(dá)載體(基因組大小1.6kb；scaav)中，如在圖12中所示。在圖12中，“itr”是反向末端重復(fù)，“i”代表內(nèi)含子，“p”是聚腺苷酸且“mp”是包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸。對(duì)于voymir-114構(gòu)建體，載體基因組(1526個(gè)核苷酸)的5’末端與調(diào)節(jié)性多核苷酸的中心(柔性環(huán)的中央)之間的距離是1115個(gè)核苷酸。對(duì)于voymir-126構(gòu)建體，載體基因組(1626個(gè)核苷酸)的5’末端與調(diào)節(jié)性多核苷酸的中心(柔性環(huán)的中央)之間的距離是1164個(gè)核苷酸。對(duì)于voymir-114構(gòu)建體，病毒滴度(vg/15-cm盤)是約1.1e+11。對(duì)于voymir-126構(gòu)建體，內(nèi)含子探針病毒滴度(vg/15-cm盤)是約1.2e+12。對(duì)照是約2.1e+11(vg/15-cm盤)。voymir-114具有約20％截短的基因組，voymir-126具有約15％截短的基因組，且對(duì)照具有約5％截短的基因組。實(shí)施例16.單鏈構(gòu)建體的影響a.對(duì)病毒滴度的影響將sirna多核苷酸(voymir-114)在位置1、3和5處插入表達(dá)載體(基因組大小4.7kb；ssaav)中，如在圖12中所示，并且也試驗(yàn)了不含sirna多核苷酸的對(duì)照(基因組大小2kb；ssaav)。在圖12中，“itr”是反向末端重復(fù)，“i”代表內(nèi)含子，“p”是聚腺苷酸且“mp”是包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸。使用taqmanpcr評(píng)價(jià)病毒滴度，結(jié)果顯示在表20中。表20.病毒滴度位置3顯示出最大病毒滴度，其次是位置1，然后是位置5。b.對(duì)基因組完整性的影響將sirna分子(voymir-114)在位置1、3和5處插入表達(dá)載體(基因組大小4.7kb；ssaav)中，如在圖12中所示，并且也試驗(yàn)了不含調(diào)節(jié)性多核苷酸的對(duì)照(基因組大小2kb；ssaav)。在圖12中，“itr”是反向末端重復(fù)，“i”代表內(nèi)含子，“p”是聚腺苷酸且“mp”是包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸。從經(jīng)純化的aav制品提取病毒基因組并在中性瓊脂糖凝膠上跑膠。在所有構(gòu)建體中看到截短的基因組，且截短的基因組的近似百分比(總數(shù)的百分比)顯示在表21中。表21.截短的基因組構(gòu)建體總數(shù)的％位置148位置330位置572對(duì)照0位置5具有最大數(shù)目的截短的基因組，而位置3具有最小量的截短的基因組。c.對(duì)敲降效率的影響將sirna分子(voymir-114)在位置1、3和5處插入表達(dá)載體(基因組大小4.7kb；ssaav)中，如在圖12中所示，并且存在不含sirna分子的單鏈對(duì)照(基因組大小2kb；ssaav對(duì)照)、沒有sirna分子的雙鏈對(duì)照(基因組大小1.6kb；scaav對(duì)照)和具有sirna分子的雙鏈表達(dá)載體(基因組大小2.4kb；scaavmir114)。在圖12中，“itr”是反向末端重復(fù)，“i”代表內(nèi)含子，“p”是聚腺苷酸且“mp”是包含sirna分子的調(diào)節(jié)性多核苷酸。在1x104vg/細(xì)胞、1x103vg/細(xì)胞和1x102vg/細(xì)胞進(jìn)行hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在感染后72小時(shí)確定sod1mrna表達(dá)(作為對(duì)照(egfp)的百分比)，結(jié)果顯示在表22中。表22.sod1表達(dá)位置3具有最高的sod1mrna表達(dá)(作為對(duì)照的％)，然后是位置1，具有最低sod1mrna表達(dá)(作為對(duì)照的％)的單鏈構(gòu)建體是位置5。所述單鏈構(gòu)建體都沒有象具有sirna多核苷酸的雙鏈對(duì)照一樣低的敲降效率。實(shí)施例17.sod1體內(nèi)敲降為了評(píng)價(jià)pri-mirna的體內(nèi)生物活性，將自互補(bǔ)的pri-mirna(voymir-114.806、voymir127.806、voymir102.860、voymir109.860、voymir114.860、voymir116.860、voymir127.860、voymir102.861、voymir104.861、voymir109.861、voymir114.861、voymir109.866、voymir116.866或voymir127.866)包裝在具有cba啟動(dòng)子的aav-dj中。在小鼠中，通過10分鐘紋狀體內(nèi)輸注施用這些包裝的pri-mirna或僅媒介物的對(duì)照(含有5％山梨醇和0.001％f-68的磷酸鹽緩沖鹽水)。表達(dá)人sod1且具有大約20-30g體重的雌性或雄性tg(sod1)3cje/j小鼠(jacksonlaboratory,barharbor,me)接受5ul靶向紋狀體的試驗(yàn)物的單側(cè)注射(前后位+0.5mm,中側(cè)位+2mm，相對(duì)于前囟點(diǎn)；背腹3.8mm，相對(duì)于頭蓋骨表面)。以0.5ul/min注射試驗(yàn)物(每種試驗(yàn)物5只動(dòng)物)。使用具有33號(hào)針的、預(yù)填充的泵調(diào)節(jié)的hamilton微注射器(1701型，10μl)。在注射后1、2、3、4或6周，將動(dòng)物處死，取出腦，將來自1mm冠板(coronalslab)的同側(cè)紋狀體(包括輸注部位)以及來自鄰近1mm冠板的紋狀體組織切開并快速冷凍。將小鼠組織樣品裂解，并定量人sod1蛋白水平以及sod1和小鼠gapdh(mgapdh)mrna水平。通過elisa(ebioscience(affymetrix,sandiego,ca))定量sod1蛋白水平，并通過bca分析(thermofisherscientific,waltham,ma)定量總蛋白水平。對(duì)于每個(gè)組織樣品，將歸一化至總蛋白的sod1蛋白水平計(jì)算為2次測定的平均值。將這些歸一化的sod1蛋白水平進(jìn)一步歸一化至媒介物組，然后平均化以得到組(治療)平均值。通過qrt-pcr定量sod1和mgapdhmrna水平。對(duì)于每個(gè)組織樣品，將sod1/mgapdh的比率(歸一化的sod1mrna水平)計(jì)算為3次測定的平均值。然后將這些比率平均化以得到組(治療)平均值。將這些組平均值進(jìn)一步歸一化至媒介物組。在非人靈長類動(dòng)物中，通過鞘內(nèi)腰椎推注施用試驗(yàn)物(1x1013-3x1013vg的包裝在具有cba啟動(dòng)子的aav-dj中的pri-mirna)或媒介物。具有大約2.5-8.5kg體重的雌性食蟹猴(成束猴，crresearchmodelhouston,houston,tx)接受植入的單個(gè)鞘內(nèi)導(dǎo)管，所述導(dǎo)管的尖部位于腰椎處。以大約60分鐘間隔施用試驗(yàn)物(每種試驗(yàn)物4只動(dòng)物)，包括3次1ml快速推注(1ml/分鐘)。在施用后4-6周，將動(dòng)物處死，并將選擇的組織收獲用于生物分析和組織學(xué)評(píng)價(jià)。針對(duì)用包裝在具有cba啟動(dòng)子的aav-dj中的pri-mirna治療以后的抑制，相對(duì)于媒介物組評(píng)估sod1蛋白和mrna水平。實(shí)施例18.使用voymir-114.806的體內(nèi)sod1敲降在tg(sod1)3cje/j小鼠中，實(shí)施例17所述，voymir-114.806包裝在具有cba啟動(dòng)子的aavdj中。通過單側(cè)紋狀體內(nèi)施用，給小鼠施用3.7x109vg的劑量。1或2周以后，不存在歸一化的sod1蛋白水平的顯著下降；歸一化的sod1蛋白水平在1和2周以后分別是媒介物對(duì)照組的98±11％(標(biāo)準(zhǔn)差)和98±10％。截至第3周，voymir-114.806使歸一化的sod1蛋白水平降低至媒介物對(duì)照組的84±9.0％，這是統(tǒng)計(jì)上顯著的(p<0.05，具有dunnett氏事后分析的單因素方差分析)。截至第4和6周，voymir-114.806使歸一化的sod1蛋白水平分別降低至媒介物對(duì)照組的73±7.9％(p<0.0001)和75±7.4％(p<0.0001)。這些結(jié)果證實(shí)，包裝在具有cba啟動(dòng)子的aav-dj中的voymir-114.806在體內(nèi)下調(diào)sod1蛋白水平中是有效的。另外，這些結(jié)果證實(shí)，低至3.7x109vg的包裝在具有cba啟動(dòng)子的aavdj中的voymir-114.806的總紋狀體內(nèi)劑量導(dǎo)致sod1蛋白水平的顯著下調(diào)。盡管已經(jīng)就幾個(gè)描述的實(shí)施方案而言相當(dāng)詳盡地且相當(dāng)特定地描述了本發(fā)明，但是無意將本發(fā)明限于任何這樣的細(xì)節(jié)或?qū)嵤┓桨富蛉魏尉唧w實(shí)施方案，而是應(yīng)當(dāng)參考所附權(quán)利要求來解釋本發(fā)明，從而考慮到現(xiàn)有技術(shù)提供這類權(quán)利要求的最廣泛的可能解釋，并因此有效地包括本發(fā)明的預(yù)期范圍。在本文中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過引用整體并入。如果出現(xiàn)矛盾，以本說明書及其中的定義為準(zhǔn)。另外，段落標(biāo)題、材料、方法和實(shí)施例僅僅是示例性的，且無意成為限制性的。序列表<110>沃雅戈治療公司<120>治療肌萎縮性側(cè)索硬化(als)的組合物和方法<130>2057.1011pct<140>pct/2015/xxxxxx<141>2015-11-13<150>62/234,466<151>2015-09-29<150>62/211,992<151>2015-08-31<150>62/079,588<151>2014-11-14<160>396<170>patentin3.5版<210>1<211>981<212>dna<213>智人<400>1gtttggggccagagtgggcgaggcgcggaggtctggcctataaagtagtcgcggagacgg60ggtgctggtttgcgtcgtagtctcctgcagcgtctggggtttccgttgcagtcctcggaa120ccaggacctcggcgtggcctagcgagttatggcgacgaaggccgtgtgcgtgctgaaggg180cgacggcccagtgcagggcatcatcaatttcgagcagaaggaaagtaatggaccagtgaa240ggtgtggggaagcattaaaggactgactgaaggcctgcatggattccatgttcatgagtt300tggagataatacagcaggctgtaccagtgcaggtcctcactttaatcctctatccagaaa360acacggtgggccaaaggatgaagagaggcatgttggagacttgggcaatgtgactgctga420caaagatggtgtggccgatgtgtctattgaagattctgtgatctcactctcaggagacca480ttgcatcattggccgcacactggtggtccatgaaaaagcagatgacttgggcaaaggtgg540aaatgaagaaagtacaaagacaggaaacgctggaagtcgtttggcttgtggtgtaattgg600gatcgcccaataaacattcccttggatgtagtctgaggccccttaactcatctgttatcc660tgctagctgtagaaatgtatcctgataaacattaaacactgtaatcttaaaagtgtaatt720gtgtgactttttcagagttgctttaaagtacctgtagtgagaaactgatttatgatcact780tggaagatttgtatagttttataaaactcagttaaaatgtctgtttcaatgacctgtatt840ttgccagacttaaatcacagatgggtattaaacttgtcagaatttctttgtcattcaagc900ctgtgaataaaaaccctgtatggcacttattatgaggctattaaaagaatccaaattcaa960actaaaaaaaaaaaaaaaaaa981<210>2<211>465<212>dna<213>成束猴<400>2atggcgatgaaggccgtgtgcgtgttgaagggcgacagcccagtgcagggcaccatcaat60ttcgagcagaaggaaagtaatggaccagtgaaggtgtggggaagcattacaggattgact120gaaggcctgcatggattccatgttcatcagtttggagataatacacaaggctgtaccagt180gcaggtcctcactttaatcctctatccagacaacacggtgggccaaaggatgaagagagg240catgttggagacctgggcaatgtgactgctggcaaagatggtgtggccaaggtgtctttc300gaagattctgtgatctcgctctcaggagaccattccatcattggccgcacattggtggtc360catgaaaaagcagatgacttgggcaaaggtggaaatgaagaaagtaaaaagacaggaaac420gctggaggtcgtctggcttgtggtgtaattgggatcgcccaataa465<210>3<211>464<212>dna<213>恒河猴<400>3at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223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>385gcagguccucacuuuaaugcc21<210>386<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>386gauuaaagugaggaccugcuu21<210>387<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>387ggcaaugugacugcugacccc21<210>388<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>388ugucagcagucacauugccuu21<210>389<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>389gcagguccucacuuuaauucc21<210>390<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>390ggcaaugugacugcugaugcc21<210>391<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>391gcagguccucacuuuaauccc21<210>392<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>392ggcaaugugacugcugauacc21<210>393<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>393gcagguccugacuuuaauccc21<210>394<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>394ggcaaugugucugcugauacc21<210>395<211>22<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>395gauuaaagugaggaccugcuuu22<210>396<211>22<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>396ugucagcagucacauugccuuu22權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種腺伴隨病毒(aav)載體，其包含位于2個(gè)反向末端重復(fù)序列(itr)之間的核酸序列，其中所述核酸序列當(dāng)被表達(dá)時(shí)抑制或遏制細(xì)胞中的sod1的基因表達(dá)，其中所述核酸序列包含有義鏈序列和反義鏈序列，其中所述有義鏈序列包含與在表3、表11或表14中列出的序列的核苷酸序列相差不超過3個(gè)核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，且所述反義鏈序列包含與在表3、表11或表14中列出的序列的核苷酸序列相差不超過3個(gè)核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中所述有義鏈序列和反義鏈序列共享至少4個(gè)核苷酸長度的互補(bǔ)性區(qū)域。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的aav載體，其中所述核酸序列包含sirna雙鏈體的有義鏈序列和反義鏈序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的aav載體，其中所述sirna雙鏈體選自由sirna雙鏈體idno.d-2741至idno.d-2985組成的組。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的aav載體，其中所述sirna雙鏈體選自由sirnaid:d-2757、d-2806、d-2860、d-2861、d-2875、d-2871、d-2758、d-2759、d-2866、d-2870、d-2823和d-2858的核酸序列組成的組。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的aav載體，其中所述互補(bǔ)性區(qū)域是至少17個(gè)核苷酸的長度。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的aav載體，其中所述互補(bǔ)性區(qū)域是在19-21個(gè)核苷酸的長度之間。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的aav載體，其中所述互補(bǔ)性區(qū)域是19個(gè)核苷酸的長度。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的aav載體，其中所述有義鏈序列和所述反義鏈序列獨(dú)立地是30個(gè)核苷酸或更少。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的aav載體，其中所述有義鏈序列和所述反義鏈序列中的至少一個(gè)包含至少1個(gè)核苷酸的3’突出端。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的aav載體，其中所述有義鏈序列和所述反義鏈序列中的至少一個(gè)包含至少2個(gè)核苷酸的3’突出端。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的aav載體，其中所述aav載體包含選自由aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8和aav-dj及其變體組成的組的衣殼血清型。12.一種抑制細(xì)胞中sod1基因表達(dá)的方法，所述方法包括給所述細(xì)胞施用組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的aav載體。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞。16.一種治療和/或改善需要治療的受試者中的肌萎縮性側(cè)索硬化(als)的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的aav載體。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中抑制或遏制sod1的表達(dá)。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述sod1是野生型sod1、具有至少一個(gè)突變的經(jīng)突變的sod1，或者野生型sod1和具有至少一個(gè)突變的經(jīng)突變的sod1二者。19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中將sod1的表達(dá)抑制或遏制約20%至約100%。20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述als是具有經(jīng)鑒別的sod1基因突變的家族性als。21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述als是散發(fā)性als。22.一種抑制細(xì)胞中的sod1基因表達(dá)的方法，其中sod1基因包括造成細(xì)胞內(nèi)的功能效應(yīng)獲得的突變，所述方法包括給所述細(xì)胞施用組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的aav載體。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)前第1頁12