相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2014年12月8日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/089,118的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及從哺乳動物細(xì)胞中收集線粒體，線粒體的濃縮以及濃縮的線粒體制劑的用途。相關(guān)技術(shù)的描述線粒體是在大多數(shù)真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的膜結(jié)合的細(xì)胞器。線粒體的直徑范圍為0.5至1.0μm。線粒體為大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)事件提供三磷酸腺苷(atp)形式的能量。線粒體還在離子穩(wěn)態(tài)、程序性細(xì)胞死亡和適應(yīng)性發(fā)熱中具有重要功能。線粒體功能障礙已經(jīng)牽涉許多病理生理過程，如衰老，神經(jīng)變性疾病，糖尿病，肥胖癥和不育癥。衰老與線粒體功能降低有關(guān)，特別是在非復(fù)制細(xì)胞如成熟卵母細(xì)胞中，線粒體功能降低被認(rèn)為是大齡婦女生育率下降的一個(gè)原因。盡管細(xì)胞的大部分dna包含在細(xì)胞核中，但線粒體具有其自己的獨(dú)立基因組。此外，與核染色體dna不同，每個(gè)線粒體中存在多個(gè)線粒體基因組拷貝，體細(xì)胞中平均每個(gè)細(xì)胞器有5個(gè)mtdna基因組。線粒體dna(mtdna)是母本遺傳的雙鏈環(huán)狀基因組，其編碼37個(gè)基因，其中13個(gè)編碼涉及呼吸和氧化磷酸化的多肽。人中期卵母細(xì)胞估計(jì)有100,000-200,000個(gè)線粒體。tzeng等人(2004),fertil.steril.82(s2),s53。與真核生物核dna不同，mtdna缺少非編碼內(nèi)含子和組蛋白，并且更容易受到線粒體基質(zhì)中高濃度的活性氧(ros)和自由基的損傷。由于持續(xù)暴露于ros，卵母細(xì)胞線粒體累積mtdna突變和缺失。隨著衰老，線粒體基因組對ros的暴露增加，這降低了線粒體功能，并導(dǎo)致卵母細(xì)胞中能量可用性的降低。為了改善衰老卵母細(xì)胞的生殖結(jié)果，已經(jīng)嘗試將線粒體濃縮物注入卵母細(xì)胞以增加線粒體功能，從而增加受精率和/或增強(qiáng)胚胎發(fā)育。例如，來自年輕小鼠卵母細(xì)胞的線粒體已被轉(zhuǎn)移到成熟的老年卵母細(xì)胞中。perez等人(2000),nature,403:500-1。然而，來自非自體細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移導(dǎo)致線粒體異質(zhì)性(即，相同細(xì)胞中不同的線粒體基因組)和異常小鼠表型。人類嘗試執(zhí)行卵質(zhì)從年輕供體卵子到來自較老患者的低質(zhì)量卵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移(即，包含線粒體的卵母細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移)由于這種方法在后代中引起線粒體異質(zhì)性而沒有持續(xù)下去。brenner等人(2001),fertil.steril.74:573-8；barrit等人(2001),hum.reprod.16:513-16。線粒體從自體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中將避免供體和受體mtdna的異質(zhì)性問題。線粒體收集的現(xiàn)有技術(shù)方法已經(jīng)產(chǎn)生具有較低濃度線粒體和/或較不純化的線粒體和/或較大比例的受損線粒體(例如破壞線粒體外膜的完整性，和/或部分喪失線粒體的呼吸和/或能量產(chǎn)生功能)的線粒體制劑。因此，本領(lǐng)域仍然需要用于制備具有高比例功能性線粒體的濃縮線粒體制劑的更好方法。發(fā)明概述本發(fā)明部分地依賴于在不使用染料、發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)或其它物理、化學(xué)或代謝標(biāo)記物的情況下收集和濃縮線粒體的方法的發(fā)現(xiàn)。特別地，該方法利用反相離心法，其中含線粒體的重相保持在旋轉(zhuǎn)軸的近側(cè)，輕相位保持在旋轉(zhuǎn)軸的遠(yuǎn)側(cè)，并允許在相邊界處收集濃縮的線粒體制劑。線粒體制劑的特征在于優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的濃縮程度和線粒體功能。濃縮的線粒體制劑可用于各種應(yīng)用，包括用于線粒體轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中(“autologousgermlinemitochondrialenergytransfer”smoraugmentsm,ovascience,inc.,waltham,ma)用于體外受精。augmentsm方法包括將包含來自哺乳動物雌性生殖系干細(xì)胞或卵原干細(xì)胞(oogonialstemcell，osc)的線粒體或從osc的后代獲得的線粒體的組合物轉(zhuǎn)移到自體卵母細(xì)胞中，由此制備用于ivf或人工授精的卵母細(xì)胞。augmentsm方法描述于2012年4月13日提交的題為“compositesandmethodsforautologousgermlinemitochondrialenergytransfer”的wo2012/142500中，其全部內(nèi)容并入本文。一方面，本公開內(nèi)容涉及用于產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑的方法，其包括(a)離心底部封閉的管，所述管包含(i)在管的靠近旋轉(zhuǎn)軸的部分中的包含線粒體懸浮液的重相；(ii)在管的遠(yuǎn)離旋轉(zhuǎn)軸的部分中的輕相；和(iii)重相和輕相之間的相界面。在這些方法中，底部封閉的管以足以使線粒體懸浮液中的線粒體在輕相和重相之間的界面處的重相中形成濃縮的線粒體層而不引起輕相和重相的反轉(zhuǎn)的速度和時(shí)間離心。方法還包括(b)收集包含至少一部分濃縮的線粒體層的流體體積以產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑。另一方面，本公開內(nèi)容涉及用于產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑的方法，其包括(a)將包含線粒體懸浮液的第一流體體積引入到底部開口的管中。所述方法還包括(b)將第二流體體積引入到管中，其中所述第二流體的密度小于第一流體，從而形成在管的一部分中的包含第一流體和線粒體懸浮液的重相、在管的另一部分中的包含第二流體的輕相以及在重相和輕相之間的相界面。所述方法還包括(c)將靠近輕相的管端部封閉以形成底部封閉的管；和(d)將底部封閉的管放置在離心機(jī)中，其中封閉端遠(yuǎn)離旋轉(zhuǎn)軸。所述方法還包括(e)以足以使線粒體懸浮液中的線粒體在輕相和重相之間的界面處的重相中形成濃縮的線粒體層而不引起輕相和重相的反轉(zhuǎn)的速度和時(shí)間離心底部封閉的管。所述方法還包括(f)收集包含至少一部分濃縮的線粒體層的流體體積以產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，在將第二流體引入管之前，將第一流體引入至管中。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，重相是水相。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，重相通過化學(xué)、機(jī)械或聲波裂解及隨后的離心獲得。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，輕相是有機(jī)相。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，輕相包含生物相容性油。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，生物相容性油輕相選自礦物油，石蠟油，輕油，細(xì)胞培養(yǎng)油和icsi油。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，濃縮的線粒體制劑的濃度為每皮升至少一個(gè)線粒體。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，濃縮的線粒體制劑的線粒體濃度為每皮升1至10000個(gè)線粒體；每皮升50至10000個(gè)線粒體；每皮升100至10000個(gè)線粒體；每皮升150至10000個(gè)線粒體；每皮升200至10000個(gè)線粒體；每皮升250至10000個(gè)線粒體；每皮升300至100000個(gè)線粒體；每皮升400至10000個(gè)線粒體；每皮升450至10000線粒體；每皮升500至10000個(gè)線粒體。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，管在重相和輕相之間的界面處的內(nèi)徑小于1μm。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，將管以小于10,000g的速率離心。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，將管以7,500和12,500×g的速率離心。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，在將第二流體體積引入底部開口的管之后，將所述管的靠近輕相的部分熱封穿過包含輕相的部分，以形成底部封閉的管。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，管包括選自以下的材料：聚乙烯(pe)，高密度聚乙烯(hdpe)，低密度聚乙烯(ldpe)，聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)，聚丙烯(pp)，聚氯乙烯(pvc)，聚偏二氯乙烯(pvdc)，聚苯乙烯(ps)，高抗沖聚苯乙烯(hips)，丙烯腈丁二烯苯乙烯，聚酰胺，聚碳酸酯，聚氨酯和尼龍。在一些實(shí)施方案中，在所公開的方法中，濃縮的線粒體制劑中至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％的線粒體是具有功能的。另一方面，本公開內(nèi)容涉及包含含有每皮升至少一個(gè)線粒體的溶液的濃縮的線粒體制劑。在一些實(shí)施方案中，在所公開的制劑中，溶液包含每皮升1至10,000個(gè)線粒體。在一些實(shí)施方案中，在所公開的制劑中，該溶液包含每皮升1至10000個(gè)線粒體；每皮升50至10000個(gè)線粒體；每皮升100至10000個(gè)線粒體；每皮升150至10000個(gè)線粒體；每皮升200至10000個(gè)線粒體；每皮升250至10000個(gè)線粒體；每皮升300至100000線粒體；每皮升400至10000個(gè)線粒體；每皮升450至10000線粒體；每皮升500至10000個(gè)線粒體。在一些實(shí)施方案中，在所公開的制劑中，制劑還包含一定體積的生物相容性油。在一些實(shí)施方案中，在所公開的制劑中，至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％的線粒體是具有功能的。下面示出和描述了本公開內(nèi)容的這些和其它方面和實(shí)施方案。通過檢查以下附圖和詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解其它系統(tǒng)、方法和特征。旨在將所有這些附加的系統(tǒng)，方法和特征包括在本說明書內(nèi)，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并由所附權(quán)利要求保護(hù)。附圖說明以下附圖是本發(fā)明的實(shí)施方案的舉例說明，其并不意味著限制權(quán)利要求所涵蓋的本發(fā)明的范圍。圖1是顯示用于產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑的方法的一些實(shí)施方案的示意圖。圖2是顯示用于產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑的方法的其它實(shí)施方案的示意圖。詳細(xì)描述本公開內(nèi)容涉及線粒體從哺乳動物細(xì)胞的收集，線粒體的濃縮以及濃縮的線粒體制劑的用途。定義本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語，除非另有定義，旨在具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文中使用的技術(shù)的引用意圖是指本領(lǐng)域通常理解的技術(shù)，包括對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的等效或后續(xù)開發(fā)的技術(shù)的那些技術(shù)或替代的變化。此外，為了更清楚和簡明地描述本發(fā)明的主題，提供了在說明書和所附權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語的以下定義。如本文所用，關(guān)于離心的術(shù)語“反相”意味著密度較低或較輕的流體相在離心管的遠(yuǎn)離旋轉(zhuǎn)軸的部分(“底部”)中并且密度較高或較重的流體在離心管的靠近旋轉(zhuǎn)軸的部分(“頂部”)中。因?yàn)樵陔x心后，較密或較重的相通常位于管的遠(yuǎn)端部分，所以當(dāng)輕相位于遠(yuǎn)端而重相位于近端時(shí)，這些相被稱為是“反轉(zhuǎn)的”。如本文所使用的，術(shù)語“重相”是指離心管中的流體層，其在單位體積中比同一管中的另一相更密或更重。術(shù)語“重”和“更密”在本文中可互換使用。在具有兩個(gè)流體相的離心中，重相通常是水性的，但這不是必需的。如本文所使用的，術(shù)語“輕相”是指離心管中的流體層，其在單個(gè)體積中比同一管中的另一相更不密或更輕。術(shù)語“更不密”和“更輕”在本文中可互換使用。在具有兩個(gè)流體相的離心中，輕相通常是有機(jī)的(例如油)，但這不是必需的。如本文所用，術(shù)語“水相”是指其中水是主要溶劑的流體相，但可能存在可與水混溶的其它極性組分。水相也可以包括各種溶質(zhì)和懸浮顆粒。值得注意的是，在本發(fā)明中，水相可以包括線粒體。如本文所用，術(shù)語“有機(jī)相”是指其中基本上非極性有機(jī)分子是主要溶劑的流體相，盡管可能存在可與主要有機(jī)溶劑混溶的其它非極性組分。有機(jī)相也可以包括各種溶質(zhì)和懸浮顆粒。如本文所用，術(shù)語“底部封閉的管”是指可以接收流體并在離心過程中保留流體的任何容器。底部封閉的管可以具有各種形狀，并且可以用各種術(shù)語來表示，包括離心管，試管，樣品管，封閉管，小瓶，比色皿，封閉移液管等。底部封閉的管可以通過封閉底部開口的管的一端，例如通過堵塞、壓接(crimping)或熱封管的一端來產(chǎn)生。如本文所用，術(shù)語“體外受精”和縮寫“ivf”是指其中卵母細(xì)胞在雌性體外受精的任何輔助生殖技術(shù)。ivf包括其中卵母細(xì)胞與容器諸如培養(yǎng)皿或具有孔的板中的精子混合以允許受精(有或者沒有去除透明帶)的程序，以及涉及卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)精子注射(icsi)的過程。如本文所用，術(shù)語“生物相容性”和“藥學(xué)上可接受的”是指物質(zhì)在其存在的濃度下對活細(xì)胞或細(xì)胞器無毒性，并且當(dāng)給予哺乳動物時(shí)是生理上可耐受的并且不產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏、發(fā)熱或類似的不期望的反應(yīng)。如本文所用，術(shù)語“載體(carrier)”是指與化合物一起施用的稀釋劑，佐劑，賦形劑或媒介物。生物相容性或藥學(xué)上可接受的載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，例如礦物油，植物油等。水或其它水性溶液，鹽水溶液，葡萄糖水溶液和甘油溶液可用作載體，特別是用于可注射溶液。合適的載體描述于remington'spharmaceuticalsciences,18thed.,ewmartin(ed.),mackpublishingco.,easton,pa.。如本文所用，術(shù)語“約”或“近似”表示所引用數(shù)值的百分之十(10％)以內(nèi)。如本文所用，術(shù)語“增加”或“減少”意指相對于參考狀態(tài)分別至少10％更多或更少。如本文所使用的，除非上下文另有明確指出，術(shù)語“一個(gè)”是指一個(gè)或多個(gè)。如本文所使用的，除非上下文另有明確指示，否則術(shù)語“或”是指包含性的“和/或”而不是指排除性的“任一個(gè)/或”。一般考慮本發(fā)明部分地依賴于用于收集和濃縮線粒體的方法的開發(fā)。在一些實(shí)施方案中，該方法提供了相比一些現(xiàn)有技術(shù)方法(其損害或喪失了較大百分比的線粒體)產(chǎn)生具有更完整、可用的線粒體的濃縮線粒體制劑。此外，在一些實(shí)施方案中，所述方法提供線粒體制劑的產(chǎn)生，其中線粒體的濃度大于現(xiàn)有技術(shù)中實(shí)現(xiàn)的濃度。此外，該方法提供產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑，而不用例如發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、抗體或其它可檢測和可選擇的標(biāo)記物標(biāo)記線粒體。此外，該方法提供產(chǎn)生基本上不含分子標(biāo)簽如發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、抗體或其它可檢測和可選擇標(biāo)記的濃縮線粒體制劑。反相離心本發(fā)明使用反相離心來產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑。本發(fā)明的方法包括對底部封閉的管進(jìn)行離心，其中存在在管的頂部(即，靠近旋轉(zhuǎn)軸的管的部分)的包含線粒體懸浮液的重相，在管的底部(即，遠(yuǎn)離旋轉(zhuǎn)軸的管的部分)的輕相，以及在重相和輕相之間的相界面。將管以足以使線粒體懸浮液中的線粒體在輕相和重相之間的界面處的重相中形成濃縮的線粒體層的速度和時(shí)間離心。然而，必須控制離心速度和時(shí)間，以防止輕相和重相反轉(zhuǎn)至其正常構(gòu)型(即在底部的重相和在頂部的輕相)。如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯的，相反轉(zhuǎn)的可能性隨離心速度(即，增加g力)，增加離心時(shí)間，增加離心管直徑以及增加重相和輕相的密度差異而增加。確定速度、時(shí)間、直徑和密度的適當(dāng)組合只需要常規(guī)實(shí)驗(yàn)。在從全細(xì)胞產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑的整個(gè)過程中，可以采用相對離心力(rcf)或離心機(jī)“速度”的各種不同的值。例如，在沉積全細(xì)胞中，rcf值可以在500-1500g的范圍內(nèi)。裂解后，可以使用在500-1500g范圍內(nèi)的rcf的第一次沉降來沉淀較大的細(xì)胞器或膜片段而沒有沉淀線粒體。除去上清液后，可以將上清液再次離心，此時(shí)在5000-12500g(例如7000-10000g)的范圍內(nèi)的rcf產(chǎn)生包含沉淀中的線粒體的粗級分?？梢詫⒊恋砦镌?000-12500g范圍內(nèi)的rcf重懸和沉淀多次，以提高線粒體沉淀的純度。最后，對于反相離心，可以將線粒體沉淀重懸于重相中，并再次以7500-12500g(例如10000g)范圍內(nèi)的rcf離心，以在相邊界處產(chǎn)生濃縮的線粒體沉淀。離心后，收集包含至少一部分濃縮的線粒體層的流體體積以產(chǎn)生濃縮的線粒體制劑?？梢酝ㄟ^例如在重相和輕相之間的界面處吸移線粒體層來收集該層。雖然優(yōu)選僅收集線粒體層，但是對于某些應(yīng)用，收集少量的輕相是可接受的。例如，如下所述，在涉及與ivf處理結(jié)合的線粒體轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞的應(yīng)用中，可以將濃縮的線粒體制劑置于板或盤上并被有機(jī)流體層(例如icsi油)覆蓋以防止蒸發(fā)。因此，在這種應(yīng)用中，少量的輕相流體可能與重相流體分離并且合并在覆蓋的有機(jī)流體中。在一些實(shí)施方案中，在制備用于離心的反轉(zhuǎn)相期間形成底部封閉的管。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：將包含線粒體懸浮液的第一流體體積引入到底部開口的管中，然后將第二流體體積引入到所述管中。第一和第二流體分別形成在管的一部分中的包含第一流體和線粒體懸浮液的重相和在管的另一部分中的包含第二流體的輕相，并且限定在所述重相和輕相之間的相界面。然后將靠近輕相的管端部封閉以形成底部封閉的管。在一些實(shí)施方案中，管被封閉穿過輕相(即，在輕相內(nèi)產(chǎn)生封閉，使得部分輕相從管中排除)。然后如此形成的底部封閉的管可以放置在離心機(jī)中，其中封閉端遠(yuǎn)離旋轉(zhuǎn)軸，并且可以如上所述離心，以產(chǎn)生濃縮的線粒體層。然后如上所述通過收集濃縮的線粒體層獲得濃縮的線粒體制劑。線粒體懸浮液和重相流體線粒體懸浮液可以通過本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法制備。例如，可以化學(xué)或機(jī)械裂解全細(xì)胞(例如新鮮獲得或解凍的冷凍細(xì)胞)以釋放細(xì)胞質(zhì)，并且粗裂解物可以被認(rèn)為是線粒體懸浮液。然而，優(yōu)選地，在使用本發(fā)明的反相離心之前，將粗裂解物進(jìn)一步加工以進(jìn)行純化和制備。線粒體分離的現(xiàn)有技術(shù)方法可以在例如tzeng等人(2004),fertil.steril.82(s2),s53；yamaguchi等人(2007),celldeathdiffer.14:616-624；和shufaro等人(2012),fertil.steril.98(1):166-72中找到?？梢允褂眠@些方法來產(chǎn)生第一線粒體懸浮液，然后可以應(yīng)用本發(fā)明的反相離心方法。或者，線粒體懸浮液可以基本上如下文實(shí)施例中所述制備。在一些實(shí)施方案中，線粒體懸浮液是水性懸浮液。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包括通過例如已通過小鼠胚胎測試(mea)(例如，charlesriverlaboratories，wilmington，ma)的注射用水(wfi)或等同物(例如，用于輔助生殖技術(shù)(art)的水，irvinescientificusa，santaana，ca)或其它生物相容性或藥學(xué)上可接受的載體(例如葡萄糖，蔗糖，甘油，檸檬酸鹽)產(chǎn)生的非致熱的高純度等級的水。在一些實(shí)施方案中，線粒體懸浮液由分離的卵原干細(xì)胞(osc)產(chǎn)生。osc可以如例如wo2005/121321，美國專利號7,955,846和美國專利號8,652,840中所述獲得。離心管本發(fā)明的離心管可以是具有足夠小的內(nèi)徑以防止在離心過程中相的反轉(zhuǎn)的任何底部封閉的管。在一些實(shí)施方案中，底部封閉的管是移液管或微量吸管或收集管，其已經(jīng)在一端被封閉(載入重相和輕相之前或之后)。管能夠容納至少1μl，5μl，10μl，20μl，30μl，40μl或50μl的液體體積，并且可以容納高達(dá)100μl，150μl，200μl，250μl，300μl，500μl以上的更大體積。在一些實(shí)施方案中，管具有從1μm，10μm，20μm，40μm，50μm，60μm，70μm，80μm，90μm或100μm到150μm以上的內(nèi)徑(在相邊界處測量)。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)徑(在相邊界處測量)為25-250μm，50-150μm或75-100μm。注意，內(nèi)徑不需要是恒定的，并且錐形管被考慮用于本發(fā)明(例如，以下實(shí)施例中描述的80μm微量移液管(cookmedical，bloomington，in))。管可以由玻璃，塑料和/或任何半柔性管制成。如本文所用，術(shù)語“塑料”是指能夠被模塑、擠出或澆鑄成形狀和膜的通過聚合制備的各種合成或半合成有機(jī)固體中的任何一種。塑料材料包括但不限于聚乙烯(pe)，高密度聚乙烯(hdpe)，低密度聚乙烯(ldpe)，聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)，聚丙烯(pp)，聚氯乙烯(pvc)，聚偏二氯乙烯(pvdc)，聚苯乙烯(ps)，高抗沖聚苯乙烯(hips)，丙烯腈丁二烯苯乙烯，聚酰胺，聚碳酸酯，聚氨酯和尼龍。在一些實(shí)施方案中，例如，通過封閉聚碳酸酯移液管(例如，微量移液管，cookmedical，bloomington，in)或玻璃移液管(例如drummondscientificcompany，broomall，pa)的底部形成底部封閉的管。在一些實(shí)施方案中，底部封閉的管可以放置在一個(gè)或多個(gè)其它管、套管、吸管、保持器或適配器(例如離心管)內(nèi)，以在離心機(jī)的轉(zhuǎn)子組件內(nèi)保持和/或緩沖底部封閉的管。輕相流體本發(fā)明的輕相流體可以包含一種或多種不同的有機(jī)化合物，要求是輕相能夠與重相形成相邊界，其防止線粒體在所使用的離心速度下進(jìn)入輕相。在一些實(shí)施方案中，輕相流體包含一種或多種生物相容性油，包括但不限于礦物油(例如，cas8042-47-5，sigmaaldrich，st.louis，mo；sagemediaoilfortissueculture，catalog#art-4008，origioa/s，denmark)，輕油，石蠟油和已獲得銷售批準(zhǔn)(例如美國fda的510(k)接受)的任何其它體外受精(ivf)培養(yǎng)油(例如icsi油)。可以單獨(dú)使用或組合使用的具有比等滲溶液更高的滲透壓的其它有機(jī)流體包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶液，蔗糖和蔗糖聚合物(例如sigma-aldrich，st.louis，mo)溶液，膠體二氧化硅顆粒(例如，sigma-aldrich，st.louis，mo)溶液等。在一些實(shí)施方案中，輕相流體具有超過250osm的重量摩爾滲透壓濃度。濃縮的線粒體制劑另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法制備的濃縮的線粒體制劑。在一些實(shí)施方案中，所述濃縮的線粒體制劑中的線粒體具有每皮升至少一個(gè)線粒體的濃度。在一些實(shí)施方案中，在所公開的制劑中，溶液包含每皮升1至10000個(gè)線粒體；每皮升50至10000個(gè)線粒體；每皮升100至10000個(gè)線粒體；每皮升150至10000個(gè)線粒體；每皮升200至10000個(gè)線粒體；每皮升250至10000個(gè)線粒體；每皮升300至100000線粒體；每皮升400至10000個(gè)線粒體；每皮升450至10000個(gè)線粒體；每皮升500至10000個(gè)線粒體。在一些實(shí)施方案中，濃縮的線粒體制劑中至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％的線粒體是具有功能的?！肮δ苄跃€粒體”是指具有生物活性的線粒體。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，包括通過氧化磷酸化(oxphos)atp測定、測量細(xì)胞色素c釋放、測量呼吸速率和/或目視檢查，可以測定濃縮的線粒體制劑中的功能性線粒體的百分比。在一些實(shí)施方案中，對濃縮的線粒體層進(jìn)行線粒體分析以確定功能性線粒體的百分比。目視檢查可以包括使用遠(yuǎn)場熒光顯微術(shù)；可以使用各種顯微技術(shù)和特異性熒光探針來染色線粒體，包括使用綠色熒光蛋白(gfp)，納米顯微術(shù)或超分辨率熒光，高分辨率電子顯微鏡和電子層析成像。marin-garcia(2013),“methodstostudymitochondrialstructureandfunction,”inmitochondriaandtheirroleincardiovasculardisease,springerus,newyork。評估線粒體功能的各種體外方法包括分光光度酶測定，atp產(chǎn)生的生物發(fā)光測量和氧消耗的極譜測量。電泳技術(shù)可用于評估線粒體功能。例如，可以使用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用western免疫印跡法來分析線粒體蛋白的含量。高度特異性和敏感的免疫檢測方法增強(qiáng)了電泳技術(shù)的應(yīng)用。線粒體蛋白的各種特異性抗體可用于免疫細(xì)胞化學(xué)和western免疫印跡分析。這些抗體包括atp合成酶亞單位，細(xì)胞色素c和細(xì)胞色素c氧化酶，pgc-1和mttfa。以下實(shí)施例舉例說明了實(shí)施本發(fā)明的一些優(yōu)選模式，但并不旨在限制所要求保護(hù)的發(fā)明的范圍?？梢允褂锰娲牧虾头椒▉慝@得類似的結(jié)果。實(shí)施例1產(chǎn)生線粒體懸浮液組織解離使用來自冷凍卵巢活組織檢查的組織作為線粒體的來源。進(jìn)行本領(lǐng)域已知的組織解離程序。使用本領(lǐng)域熟知的合適的無菌技術(shù)，在生物安全柜中進(jìn)行除了細(xì)胞分選的所有步驟。獲得三(3)個(gè)四孔板。在每個(gè)四孔板上，三個(gè)孔被標(biāo)記為“1”，“2”和“3”。每個(gè)源材料指定一個(gè)板。使用1000μl微量移液管，將冷凍保存培養(yǎng)基和保存培養(yǎng)基按照下表中的體積加入到每個(gè)平板的每個(gè)孔中，并且通過上下吹吸三到五次輕輕混合。培養(yǎng)基孔1孔2孔3冷凍保存600μl300μl0μl保存300μl600μl900μl制備以下材料：一瓶3.636ku/mldna酶i；一瓶400u/ml膠原酶(來自liberasemtfc/t試劑盒的2000mtf；rochediagnostics，indianapolis，in)；和一瓶1mg/ml的嗜熱菌蛋白酶(來自liberasemtfc/t試劑盒；rochediagnostics，indianapolis，in)。使用下表中的規(guī)格制備了標(biāo)記為“bss/dnase/liberase溶液”的c-管。將管置于37±1℃水浴中直至進(jìn)一步使用。將10ml不含mgcl2/cacl2的hbss的溶液等分到50ml錐形管中，并置于37±1℃水浴中直至進(jìn)一步使用。將合適數(shù)量的小瓶浸沒在液氮中。所有組織小瓶在環(huán)境溫度下通過空氣解凍同時(shí)解凍60秒。在60秒的空氣解凍后，將小瓶在37.0℃±1.0℃的水浴中同時(shí)孵育120秒。將小瓶消毒。使用無菌鑷子，將每片組織源材料從小瓶轉(zhuǎn)移到每個(gè)預(yù)先制備的4孔培養(yǎng)板的孔#1中。將一片組織放置在每個(gè)板中并完全浸沒在培養(yǎng)基中，并將源材料保持在每個(gè)標(biāo)記的孔#1中10分鐘。將源材料從每個(gè)標(biāo)記的孔#1轉(zhuǎn)移到每個(gè)標(biāo)記的孔#2，完全浸沒在培養(yǎng)基中，并保持在每個(gè)標(biāo)記的孔#2中10分鐘。將源材料從每個(gè)標(biāo)記的孔#2轉(zhuǎn)移到每個(gè)標(biāo)記的孔#3，完全浸沒在培養(yǎng)基中，并保持在每個(gè)標(biāo)記的孔#3中5分鐘。將所有源材料轉(zhuǎn)移到含有hbss/dnase/liberase溶液的c-管中。將c-管轉(zhuǎn)移到組織解離器(gentlemacstm，miltenyibiotec，bergischgladbach，de)中，并根據(jù)制造商的說明解離組織。細(xì)胞分選程序?yàn)榱藦穆殉步M織樣品獲得具有高百分比的功能性線粒體的細(xì)胞，使用針對vasa蛋白的抗體從存在于卵巢活檢組織中的其它細(xì)胞分類卵原干細(xì)胞(oscs)。使用玻璃5ml血清移液管，將解離的細(xì)胞混合物轉(zhuǎn)移到70μm的細(xì)胞過濾器中，將其置于50ml錐形管上。用4ml不含cacl2和mgcl2的溫?zé)醜bss沖洗c-管。使該沖洗體積通過過濾器。接下來，將來自50ml錐形管的6.75ml細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到標(biāo)有“2的過濾細(xì)胞1”的15ml錐形管中，并將等體積放在標(biāo)有“2的過濾細(xì)胞2”的15ml錐形管中。管在1200相對離心力(rcf)下在環(huán)境溫度(范圍：18.0-22.0℃)下離心10分鐘，其中制動器關(guān)閉(0)。將大部分上清液除去并轉(zhuǎn)移到標(biāo)有“第一上清液”的50ml錐形管中。用來自每個(gè)管的微量移液管除去任何殘留體積(約500μl)。使用250μl的2％嵌段溶液重新懸浮2的過濾細(xì)胞1中的沉淀。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到2的過濾細(xì)胞2管中的沉淀物。使用250μl的2％嵌段溶液沖洗2的過濾細(xì)胞1管。將沖洗體積轉(zhuǎn)移到2的過濾細(xì)胞1管中，并重新懸浮沉淀。觀察細(xì)胞懸浮液的可見團(tuán)塊。如果在移液后看到團(tuán)塊，則根據(jù)需要重新過濾細(xì)胞。測量并記錄2的過濾細(xì)胞2管中的體積。將240μl體積的1％洗滌溶液加入到標(biāo)有“細(xì)胞計(jì)數(shù)”的1.5ml微量離心管中。再次懸浮細(xì)胞懸浮液，將10μl細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5ml細(xì)胞計(jì)數(shù)管中。使用熒光活化細(xì)胞分選(facs)進(jìn)行細(xì)胞分選。使用500μl體積的1％洗滌溶液來清洗管線。將細(xì)胞計(jì)數(shù)管置于樣品裝載器中，并獲取樣品約2分鐘。使用本領(lǐng)域已知的方法計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。如果總細(xì)胞數(shù)大于7x106個(gè)細(xì)胞，則進(jìn)行步驟以將樣品分成兩半，使得樣品的一半冷凍保存，并將剩余的樣品染色并用于細(xì)胞分選(見下文)。如果總細(xì)胞數(shù)小于或等于7x106個(gè)細(xì)胞，則將細(xì)胞在室溫下用2％嵌段溶液孵育20分鐘。將初級抗體等分試樣解凍并在環(huán)境溫度(20℃±2.0℃)下以200×g(rcf)離心1分鐘，其中制動器設(shè)置在高(9)，以確保體積被局限在小瓶的底部。從重懸浮的細(xì)胞沉淀(“第一沉淀”)中取出2μl的體積，并轉(zhuǎn)移到標(biāo)記為“陰性對照”的新的15ml錐形管中。將體積為5ml的1％洗滌溶液加入陰性對照管。將計(jì)算體積的抗體加入到第一沉淀管中并充分混合。將管在黑暗中室溫孵育15分鐘。將體積為5ml的1％洗滌溶液加入到標(biāo)記為“抗體標(biāo)記的”細(xì)胞的15ml管中。將抗體標(biāo)記的細(xì)胞和陰性對照在室溫(20.0℃±2.0℃)下以1200×g(rcf)離心5分鐘，其中制動器設(shè)置在高(9)。制備含有“抗體標(biāo)記的細(xì)胞第一上清液”和“陰性對照上清液”的管。使用微量移液管，從含有抗體標(biāo)記的細(xì)胞的15ml錐形管中取出上清液，并轉(zhuǎn)移到適當(dāng)標(biāo)記的15ml錐形管中。使用375μl的1％洗滌溶液重新懸浮抗體標(biāo)記的細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到標(biāo)記為“抗體染色的細(xì)胞”的1.5ml微量離心管中。重懸抗體染色的細(xì)胞。觀察細(xì)胞懸浮液，并且如果團(tuán)塊可見，則根據(jù)需要使用過濾器重新過濾細(xì)胞。使用微量移液管，將上清液從陰性對照錐形管中取出并轉(zhuǎn)移到適當(dāng)標(biāo)記的15ml錐形管中。使用500μl的1％洗滌液將陰性對照試管中的細(xì)胞沉淀重新懸浮，并轉(zhuǎn)移到標(biāo)記為“陰性對照”的1.5ml微量離心管中。將500μl1％洗滌緩沖液的體積等分到標(biāo)記為“vasa+細(xì)胞”的新的15ml錐形管中。將500μl1％洗滌緩沖液的體積等分到另一個(gè)標(biāo)有“漂洗2”的15ml錐形管中。使用“陰性對照”，“抗體染色的細(xì)胞”，“漂洗2”和“vasa+細(xì)胞”管進(jìn)行細(xì)胞分選。使用sonyfacs機(jī)器進(jìn)行細(xì)胞分選，其中記錄規(guī)則字段設(shè)置為使事件限制為10000。將兩個(gè)空的15ml錐形管放置在分選收集保持器中，左和右分選門設(shè)置為“細(xì)胞”。停止極限設(shè)置為500次事件。將陰性對照細(xì)胞重新懸浮并加載到樣品加載區(qū)域中。通過更改樣品壓力調(diào)節(jié)事件發(fā)生率以實(shí)現(xiàn)每秒200-2000次事件。在alexafluor647檢測器設(shè)置中進(jìn)行了微小的調(diào)整，以確保事件在102和103之間。將細(xì)胞門(cellsgate)調(diào)整為包含背散射(bsc)相對前向散射(fsc)曲線圖中大約90％的事件。根據(jù)需要調(diào)整vasa+門(反映陽性染色的細(xì)胞)以不包含任何未染色的群體。將陰性對照樣品從樣品管保持器中取出并放在一邊。根據(jù)需要，進(jìn)行芯片對準(zhǔn)和分選校準(zhǔn)并再次執(zhí)行，隨后進(jìn)行探針和樣品線滅菌。取出15ml錐形管，并將vasa+管與1％洗滌溶液插入到分選室的左側(cè)分選位置。記錄規(guī)則字段被設(shè)置為事件計(jì)數(shù)為2000，樣品停止條件為“記錄”。每個(gè)門都設(shè)置為“所有事件”。壓力變化以維持每個(gè)讀數(shù)1500-2000個(gè)計(jì)數(shù)。將沖洗2管裝載到樣品管保持器上，用洗滌溶液清洗管線。將抗體染色的細(xì)胞管重新懸浮并裝載到樣品管保持器上。獲得抗體染色的細(xì)胞，并記錄事件。通過觀察點(diǎn)圖(af647相對bsc)，確認(rèn)事件發(fā)生在alexafluor647檢測器內(nèi)。數(shù)據(jù)采集得到確認(rèn)。將抗體染色的細(xì)胞從裝載區(qū)域中取出并儲存在防光區(qū)域。評估染色的細(xì)胞群體。代表特異性和非特異性染色的細(xì)胞群體的群體在點(diǎn)圖(af647相對bsc)中是可見的。進(jìn)行了調(diào)整，以確保陽性群體是可見的。vasa+門沿x軸(af647)遷移，以涵蓋預(yù)分選樣品門的主要的較高強(qiáng)度染色的細(xì)胞群體。記錄規(guī)則事件限制更改為10000000。分選限制更改為零(無停止限制)，分選模式更改為“yield”。左側(cè)的分選門被選為vasa+門。確保將vasa+細(xì)胞管置于收集保持器的左側(cè)。用“沖洗2”洗滌溶液清洗管線。將抗體染色細(xì)胞管中的細(xì)胞重新懸浮，將管裝載到樣品管保持器上，分選細(xì)胞，直至樣品管完全耗盡。在分選過程中，調(diào)整壓力以使事件發(fā)生率保持在每秒200-2000次事件。取出含有分選的vasa+級分的15mlfacs管，并測量體積。用1000μl的1％洗滌溶液沖洗15ml管的側(cè)面。使用以下步驟進(jìn)行osc冷凍。將冷凍保存控制器(crysalystmptc-9500,biostasys,inc.,nv)連接到冷凍保存室。將覆蓋的冷凍室放入液氮浴中。緩慢加入額外的液氮以增加體積，直到液氮離冷凍室頂部大約3cm。該程序具有以下設(shè)置：從18℃開始；最終溫度為-80℃，以1℃/分鐘的速度降低；在-80℃保持10分鐘；并在-80℃運(yùn)行信號結(jié)束。在5℃(范圍：2-8℃)下，將分選的vasa+細(xì)胞級分在1200rff下分選10分鐘，其中將制動器設(shè)置在中等(5)。如果在細(xì)胞分選之前將組織樣品分開，則從2-8℃儲存獲得含有預(yù)分選卵巢細(xì)胞的冷凍小瓶，并與vasa+細(xì)胞一起離心。去除上清液，用500μl冷凍保存培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。使用1000μl微量移液管，取出來自15ml錐形管的上清液，并轉(zhuǎn)移到15ml標(biāo)記為“第一vasa+上清液”的錐形管中。使用200μl移液管除去任何剩余體積，而不干擾沉淀。將沉淀物重新懸浮在500μl冷凍保存培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到冷凍小瓶中。將冷凍小瓶置于冷凍室中。程序完成后，將冷凍小瓶儲存在充滿液氮的杜瓦瓶中。線粒體分離程序如下進(jìn)行線粒體濃縮程序。根據(jù)下表中列出的規(guī)格制備20ml體積的1x分離緩沖液：組分分離緩沖液10％hsa水濃度1x2％1x體積(ml)10.01.09.0將組分加入到50ml錐形管中，混合，并將2-3ml等分到單獨(dú)的錐形管中，用于重懸浮和漂洗。將管標(biāo)記為“1x分離緩沖液”，并將其儲存在冰箱或金屬熱珠(labarmortmbeads,labarmorllc,cornelius,or)中。類似地，制備“hbss中的1％hsa”的管。制備hbss中的1％hsa的10ml體積，并將2-3ml等分到分開的錐形管中，用于重懸浮和漂洗。將管標(biāo)記為“hbss中的1％hsa”并儲存在冰箱或金屬熱珠中。將含有分選的vasa+級分的人osc的冷凍保存小瓶轉(zhuǎn)移到2l杜瓦瓶中，并將小瓶浸沒在液氮中。將小瓶在環(huán)境溫度下空氣解凍60秒。在60秒的空氣解凍后，將小瓶在37.0℃±1.0℃的水浴中孵育120秒。使用1000μl微量移液管，將小瓶中的整個(gè)體積緩慢轉(zhuǎn)移至標(biāo)有“解凍的vasa+級分”的1.5ml微量離心管中。使用1000μl血清移液管，用500μlhbss中的1％hsa沖洗冷凍小瓶；將沖洗液轉(zhuǎn)移到1.5ml微量離心管中。將vasa+級分沉淀物在1200×g(rcf)下在5.0℃(范圍：2.0-8.0℃)下離心10分鐘，其中制動器設(shè)置在高(9)。旋轉(zhuǎn)完成后，將管轉(zhuǎn)移到生物安全柜中。使用1000μl微量移液管，小心地取出來自1.5ml微量離心管的上清液，并轉(zhuǎn)移到標(biāo)有“第一vasa+上清液”的15ml錐形管中。除去任何剩余的體積而不干擾沉淀。將沉淀物輕輕地重懸浮于150μl冷的1x分離緩沖液中，并重新懸浮。將含有細(xì)胞懸浮液的1.5ml微量離心管放入臺式冷卻器模塊(minifridgeiitm,boekelscientific,feasterville,pa)或金屬熱珠中。使用20ml注射器獲得1x分離緩沖液的17-18ml等分試樣，并將注射器連接到轉(zhuǎn)移線-插管組件。將插管浸入1x隔離緩沖液中。將注射器組件裝載到注射器泵(harvardapparatus，holliston，ma)上，同時(shí)將插管浸入1x隔離緩沖液中。獲得第二個(gè)空的20ml注射器，并且拉取大約5ml的空氣以平衡泵。使用泵，將注射器中的剩余緩沖液排出到1x隔離緩沖容器中。使用泵，將1.5ml冷的1x分離緩沖液取回到注射器中，使用以下泵參數(shù)：泵模式：取回；流量(μl/sec)：max75；程序化體積(μl)：1500；和直徑/注射器尺寸：20.05mm/20cc。選擇具有下表中列出的參數(shù)的泵程序：將插管置于細(xì)胞懸浮液中，使其接觸管的底部。如果細(xì)胞沉降到管的底部，則根據(jù)需要用200μl移液管輕輕混合細(xì)胞懸浮液。開始泵以將細(xì)胞懸浮液取回注射器中。將插管轉(zhuǎn)移到干凈和冷的1.5ml微量離心管中。選擇具有下表中列出的參數(shù)的第二個(gè)泵程序：一旦泵程序結(jié)束，將注射器從泵中取出并與輸送管斷開。將插管(仍然連接到轉(zhuǎn)移管)留在冷的1.5ml微量離心管中。注射器，管道和插管被適當(dāng)?shù)貋G棄。兩個(gè)1.5ml微量離心管具有大致相等體積的裂解物。將兩個(gè)裂解物管(“裂解物1”和“裂解液2”在800xg(rcf)下在5.0℃(范圍2.0-8.0℃)下離心10分鐘，制動器設(shè)置在中等(5)。使用200μl移液管，將等體積的來自“裂解物2”管的上清液轉(zhuǎn)移到標(biāo)記有“上清液1”和“上清液2”的管中。將兩個(gè)上清液管以7000×g(rcf)在5±3℃(范圍：2-8℃)離心5分鐘，制動器設(shè)置在中等(5)。旋轉(zhuǎn)完成后，使用1000μl移液管，將上清液從兩個(gè)管中取出至標(biāo)有“線粒體高速離心上清液1”。使用200μl移液管吸頭除去任何殘留的上清液，而不干擾沉淀物。用200μl移液管在具有100μl冷的1x分離緩沖液的上清液1管中輕輕重懸沉淀物。使用相同的移液管吸頭，將懸浮液轉(zhuǎn)移到上清液2管中，將上清液1管用100μl冷1x分離緩沖液沖洗5-10次，將溶液轉(zhuǎn)移到上清液2管中。重新懸浮上清液2管中的沉淀，棄去空的上清液1管。將上清液2管在7000×g(rcf)下在5.0℃(范圍：2.0-8.0℃)下離心30分鐘，制動器設(shè)置在中等(5)。該管被重新標(biāo)記為“線粒體高速離心上清液2”。如果沉淀不粘附到管的壁和/或上清液沒有被除去，則進(jìn)行額外的離心。如果適用，上清液2管在5.0℃(范圍：2.0-8.0℃)下以700×g(rcf)離心10分鐘，制動器設(shè)置在中等(5)。使用200μl移液管，將上清液輕輕取出至標(biāo)有“線粒體高速離心上清液3”的管中。使用20μl微量移液管，將沉淀輕輕地重新懸浮在6μl冷的呼吸緩沖液中。將緩沖液上下吹吸5-10次以沖洗沉淀。測量微量離心管中的體積并轉(zhuǎn)移到標(biāo)記為“線粒體懸浮液”的冷的0.5ml冷凍小瓶中。將1μl懸浮液的體積轉(zhuǎn)移到0.5ml冷凍小瓶中用于定量聚合酶鏈反應(yīng)(qpcr)分析。qpcr分析證實(shí)了來自分離的osc的線粒體的存在。實(shí)施例2濃縮的線粒體制劑材料和設(shè)備如實(shí)施例1所述，線粒體溶液是通過從分離的osc(其也被稱為卵前體細(xì)胞或雌性生殖系干細(xì)胞)提取而獲得的自體線粒體制劑。將線粒體溶液保持在5℃±3℃直至進(jìn)一步處理。使用本文所述方法產(chǎn)生的濃縮的線粒體制劑用于各種應(yīng)用，包括但不限于augmentsm和ivf方法。ivf場所在ivf過程中使用特定于場所的標(biāo)準(zhǔn)ivf設(shè)備、材料和試劑。其它材料由ovascience，inc.提供，包括但不限于：用于臨床加工和augmentsm加工的材料和設(shè)備是本領(lǐng)域已知的。具有反轉(zhuǎn)的(水性)重和(有機(jī))輕層的線粒體制劑制備裝載線粒體溶液的管。在一些實(shí)施方案中，管是塑料管。使用10μl移液管，抽吸實(shí)施例1中制備的線粒體溶液并吹吸大約30次，以將溶液重新懸浮在小瓶中。使用移液管，取出2μl線粒體懸浮液，并分配到空的胞漿內(nèi)精子注射(icsi)板上。將含有線粒體懸浮液的小瓶保持在5℃±3℃。如圖1所示，將分配的2μl線粒體懸浮液120裝載到描繪為管110的80μm柔性微量移液管(80μmcookmedical,bloomington,in)中。在一些實(shí)施方案中，柔性微量移液管的大小為50μm至140μm。在一些實(shí)施方案中，可以使用各種移液管材料，包括玻璃、半柔性管和塑料。圖1中的層120是在管的近端部分中的含有線粒體懸浮液的水層。接下來，將約1cm的有機(jī)輕相引入到管110中。圖1中的層130是在管的遠(yuǎn)端部分中的含有有機(jī)流體的輕相。在此實(shí)施例中，有機(jī)流體是生物相容性油，特別是icsi油。在其它實(shí)施方案中，如上所述，有機(jī)流體可以是礦物油，石蠟油，輕油，ivf培養(yǎng)礦物油，pvp溶液或蔗糖溶液等。如圖1所示，在一些實(shí)施方案中，將填充的80μm管的輕相端熱封閉，使得末端開口的管成為底部封閉的管，如封閉件140所示。根據(jù)需要將熱封重復(fù)，并通過顯微鏡觀察驗(yàn)證了封閉的完整性。為了確保緊密地配合到離心機(jī)中，將更大的管150(例如，600μm撓性片)在管110(例如，80μmflexipet)的熱封閉端上滑動。超過管110(例如，80μmflexipet)的端部延伸的較大管150的多余長度被去除，如已被切割的管160所示。將管160滑入“冷凍保存吸管”170中，使得較大的管160接觸吸管的緩沖材料180(例如，棉塞)。將包含管110中的線粒體懸浮液的整個(gè)組件的冷凍保存吸管170置于4℃的微量離心機(jī)中。底部封閉的管110的孔防止或減少水層120和有機(jī)層130的反轉(zhuǎn)。在其它實(shí)施方案中，如圖2所示，具有水層120和有機(jī)層130的管110被裝配到緊密地配合到離心機(jī)中的適當(dāng)尺寸的管210。在這些方法中使用了本領(lǐng)域已知的通用預(yù)防措施。這些預(yù)防措施是感染控制的方法，其中所有人類血液、某些體液以及新鮮組織和人源細(xì)胞如同它們已知感染了hiv，hbv和/或其它血源性病原體那樣進(jìn)行處理。線粒體離心將如圖1中的管170和圖2中的管210所示的線粒體制劑管在4℃下以10000×g離心20分鐘，以在重相120和輕相130之間的界面處產(chǎn)生濃縮的線粒體層。在一些實(shí)施方案中，將管以小于10000g的速率離心。在一些實(shí)施方案中，以1000-5000g，2500-7500g，5000-10000或7500-12500g的速率離心。在一些實(shí)施方案中，離心的rcf值允許更短的離心時(shí)間，例如1-2分鐘，2-4分鐘，5-10分鐘或10-15分鐘。相反，較低的rcf值可能需要更長的離心時(shí)間。離心的速度和時(shí)間允許形成濃縮的線粒體層而不反轉(zhuǎn)水層和油層。在10000g下離心20分鐘后，從離心機(jī)中取出吸管，將管110滑出吸管170和切管160。將濃縮的線粒體層置于icsi板中，并用icsi油覆蓋。濃縮的線粒體層維持在5℃±3℃的溫度下用于augmentsm。重復(fù)這些步驟以產(chǎn)生額外的濃縮的線粒體層。在一些實(shí)施方案中，濃縮的線粒體制劑用于執(zhí)行使用本領(lǐng)域已知的方法的icsi。通過在每個(gè)中期ii卵母細(xì)胞顯微注射期間加入約1pl的濃縮的線粒體制劑來進(jìn)行icsi。在一些實(shí)施方案中，使用在每次中期ii卵母細(xì)胞顯微注射期間加入約1-3pl濃縮的線粒體的場所實(shí)踐進(jìn)行icsi。對于icsi，使用的濃縮線粒體制劑沉淀物的范圍為10nl-500nl。在一些實(shí)施方案中，濃縮的線粒體制劑的線粒體濃度為每皮升1至10000個(gè)線粒體。在一些實(shí)施方案中，在所公開的制劑中，溶液包含每皮升1至10000個(gè)線粒體；每皮升50至10000個(gè)線粒體；每皮升100至10000個(gè)線粒體；每皮升150至10000個(gè)線粒體；每皮升200至10000個(gè)線粒體；每皮升250至10000個(gè)線粒體；每皮升300至100000線粒體；每皮升400至10000個(gè)線粒體；每皮升450至10000線粒體；每皮升500至10000個(gè)線粒體。在一些實(shí)施方案中，管110在水層和有機(jī)層之間的界面處具有小于1μm的內(nèi)徑。在一些實(shí)施方案中，濃縮的線粒體制劑中至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％的線粒體被回收為功能性的，如qpcr測定。如本文所討論的，在一些實(shí)施方案中，濃縮的線粒體制劑用于各種受精方法，包括icsi和augment方法。等價(jià)物雖然已經(jīng)參考本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案具體示出和描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，在不脫離如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對其形式和細(xì)節(jié)進(jìn)行各種改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到或能夠使用不超過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定本文具體描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同物。這樣的等同物旨在包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12