本發(fā)明涉及在原核細(xì)胞中使用合成調(diào)節(jié)性srna精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的方法且更具體地涉及能夠通過調(diào)節(jié)srna表達(dá)水平或srna與hfq之間的結(jié)合親和力進(jìn)而精細(xì)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)來精細(xì)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的合成調(diào)節(jié)性srna。

背景技術(shù)：

與環(huán)境問題和有限資源消耗有關(guān)的事項(xiàng)近年來在全球范圍內(nèi)快速增加。因此，構(gòu)建環(huán)境友好和以可再生的生物體為基礎(chǔ)的產(chǎn)生系統(tǒng)作為這些事項(xiàng)的替代越來越引起人們的興趣。所述系統(tǒng)能夠如下構(gòu)建：調(diào)節(jié)生物體中的代謝途徑來優(yōu)化代謝流以產(chǎn)生所需代謝物，其中該過程需要多種分子生物學(xué)技術(shù)。有兩種主要技術(shù)用于調(diào)節(jié)代謝途徑，其中一種技術(shù)是增加生物合成過程所需要的酶的表達(dá)以加強(qiáng)代謝物產(chǎn)生所需要的代謝流，而另一種技術(shù)是阻斷用于細(xì)胞生長和其它代謝物產(chǎn)生的代謝流并缺失用于靶代謝物產(chǎn)生的基因。目前廣泛使用的基因敲除方法是待缺失的基因通過重組酶用任何具有同源序列的序列代替，由此使其功能喪失(datsenko等人,pnas,97(12):6640-6645,2000)。然而，該基因敲除方法具有多個問題。

首先，基因敲除方法需要數(shù)周至數(shù)月且基因表達(dá)僅能夠通過開-關(guān)調(diào)節(jié)且基因缺失需要對每種菌株進(jìn)行重復(fù)以應(yīng)用于數(shù)種菌株。因此，其為代謝工程化研究中最費(fèi)時的過程，其中多種情況必須通過實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。將突變引入到存在于染色體上的基因的啟動子中以弱化活性的方法或用多種能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的啟動子代替已有啟動子的方法用作調(diào)節(jié)和抑制基因表達(dá)水平的方法。然而，這些方法也通過與基因敲除方法相同或類似的過程實(shí)施且因此其具有基因敲除方法由于染色體重組而帶來的限制且與基因敲除方法不同，其還難以在突變啟動子所引起的表達(dá)水平被直接鑒定前預(yù)測結(jié)果。因此，這些方法與簡單的基因敲除方法相比可能需要更多的努力和時間。

為了克服該常規(guī)基因抑制方法的限制，已開發(fā)出短長度定制合成srna技術(shù)(na,d等人,nat.biotechnol.,31(2),170-174,2013；yoo,sm等人,nat.protoc.,8(9),1694-1707,2013)，其具有的優(yōu)點(diǎn)是可容易地通過使用質(zhì)粒而無需修飾靶菌株的染色體序列來減少靶基因表達(dá)并容易地以多重同時方式將相同的基因表達(dá)抑制應(yīng)用于多種菌株。另外，該技術(shù)就構(gòu)建、儲存和應(yīng)用而言是快速和簡單的。

srna由hfq結(jié)合序列和用于與靶基因的mrna互補(bǔ)結(jié)合的堿基配對區(qū)(以下稱作bpr)構(gòu)成。為了調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，在常規(guī)技術(shù)中對bpr部分的結(jié)合游離能量進(jìn)行計(jì)算以控制堿基序列長度和突變。這是有利的，因?yàn)閎pr部分能夠以靶基因的堿基序列信息為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(jì)且合成srna能夠通過一般基因重組方法容易地設(shè)計(jì)和構(gòu)建。然而，為了精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)至所需水平，srna的bpr部分需要針對每種靶基因重新設(shè)計(jì)且srna需要以重新設(shè)計(jì)的bpr部分為基礎(chǔ)重新設(shè)計(jì)。另外，使用結(jié)合游離能量的策略具有的限制是難以精確地預(yù)測srna活性的變化。結(jié)合游離能量以srna和mrna的序列為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算。在srna與mrna的實(shí)際結(jié)合中，預(yù)測精確性可由于hfq蛋白有助于srna與mrna的結(jié)合而降低。另外，當(dāng)結(jié)合序列由于srna和mrna的二級結(jié)構(gòu)而發(fā)生結(jié)構(gòu)變化時，不可能預(yù)測表達(dá)抑制活性的程度。為了克服這些問題，應(yīng)開發(fā)能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)至所需水平而無論靶基因類型或bpr序列的通用系統(tǒng)。

因此，本發(fā)明人做出了努力以構(gòu)建滿足上述要求的通用基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)且因此嘗試了使其它元件突變同時固定bpr且因此通過引入具有多種強(qiáng)度活性的啟動子并將突變應(yīng)用于srna支架中的hfq結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建了通用基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。所確認(rèn)的是，靶基因表達(dá)可通過引入多種組成性啟動子以調(diào)節(jié)srna表達(dá)水平來調(diào)節(jié)且當(dāng)引入誘導(dǎo)性啟動子時，所確認(rèn)的是，靶基因表達(dá)可通過將突變引入到srna支架的hfq結(jié)合位點(diǎn)中來精細(xì)調(diào)節(jié)，由此完成本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供使用定制合成srna精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的方法，其能夠精細(xì)調(diào)節(jié)靶基因mrna表達(dá)且同時克服抑制基因表達(dá)的常規(guī)方法的限制。

附圖說明

圖1顯示了包含基于pkk223-3質(zhì)粒(其為用于srna表達(dá)的商購質(zhì)粒)的sgrs支架的srna的重組。

圖2顯示了作為srna的sgrs的部分結(jié)構(gòu)且顯示了誘導(dǎo)突變的潛在靶標(biāo)。在該序列的3’末端的‘uuuuuuuu’序列也為轉(zhuǎn)錄終止子和hfq結(jié)合位點(diǎn)。

圖3顯示了用于表達(dá)基于pacyc184質(zhì)粒(其為用于srna靶基因表達(dá)的商購質(zhì)粒)的dsred2基因的重組。

圖4顯示包含sgrs支架的合成srna有效地抑制dsred2的表達(dá)。

圖5顯示靶向于dsred2的合成srna的抑制能力是由堿基配對區(qū)(bpr)引起的。

圖6顯示抑制靶基因表達(dá)的效果的對數(shù)值與srna表達(dá)水平呈線性比例。

圖7顯示了當(dāng)hfq結(jié)合位點(diǎn)的莖環(huán)中莖的序列變化時srna表達(dá)抑制活性的變化。

圖8顯示了當(dāng)hfq結(jié)合位點(diǎn)的莖環(huán)中莖的長度變化時srna表達(dá)抑制活性的變化。

圖9顯示了當(dāng)hfq結(jié)合位點(diǎn)的莖環(huán)中環(huán)的序列變化時srna表達(dá)抑制活性的變化。

圖10顯示了當(dāng)hfq結(jié)合位點(diǎn)的uauu序列變化時srna表達(dá)抑制活性的變化。

圖11顯示了當(dāng)作為轉(zhuǎn)錄終止子和hfq結(jié)合位點(diǎn)的u尾的長度變化時srna表達(dá)抑制活性的變化。

具體實(shí)施方式

除非另有定義，本說明書使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常理解相同的含義。通常，本說明書使用的命名法和下述實(shí)驗(yàn)方法為本領(lǐng)域已知和常用的。

本發(fā)明的說明書使用的主要術(shù)語的定義等如下所述。

本申請使用的小rna(以下稱作“srna”)是在長度上通常具有200或更少堿基序列的短長度rna，其不被翻譯成蛋白且通過互補(bǔ)結(jié)合有效地抑制特異mrna的翻譯。

本申請使用的術(shù)語“基因”應(yīng)以最廣泛的含義理解且可編碼結(jié)構(gòu)性或調(diào)節(jié)性蛋白。在本申請中，調(diào)節(jié)性蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白或參與dna/rna復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的蛋白。在本發(fā)明中，待作為用于抑制表達(dá)的靶標(biāo)的靶基因可作為染色體外組分存在。

在一個方面，本發(fā)明涉及載體，其包含(a)啟動子；(b)對與靶基因mrna形成互補(bǔ)的堿基對的區(qū)進(jìn)行編碼的核酸；(c)對hfq結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行編碼的由源自sgrs的srna的seqidno:91表示的核酸的野生型或突變srna支架；和(d)轉(zhuǎn)錄終止子。

本發(fā)明的啟動子優(yōu)選為僅當(dāng)誘導(dǎo)劑存在時才發(fā)揮作用的誘導(dǎo)性啟動子、總是發(fā)揮作用的組成性啟動子和源自這些啟動子的啟動子(trc啟動子或tac啟動子)。當(dāng)調(diào)節(jié)這些啟動子的活性時，srna表達(dá)水平發(fā)生變化，由此可調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)程度。在大多數(shù)基因中，srna表達(dá)水平通過引入多種組成性啟動子控制且因此靶基因表達(dá)也可受到調(diào)節(jié)。作為組成性啟動子，可使用由chrisanderson生產(chǎn)的在anderson啟動子集合(http://partsregistry.org/promoters/catalog/anderson)中建議的各種啟動子。

本發(fā)明的突變srna支架控制srna和hfq之間的結(jié)合親和力以精細(xì)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)水平。當(dāng)就微生物的存活而言至關(guān)重要的基因或抑制生長率的基因的表達(dá)被抑制時，需要構(gòu)建其中表達(dá)srna的系統(tǒng)，僅當(dāng)在誘導(dǎo)性啟動子下需要時。然而，當(dāng)引入誘導(dǎo)性啟動子時，表達(dá)水平不容易控制。因此，在本發(fā)明中，靶基因表達(dá)水平優(yōu)選通過hfq結(jié)合位點(diǎn)的誘變來精細(xì)調(diào)節(jié)。

在本發(fā)明中，sgrs的srna支架的一些序列(圖2)由seqidno:91表示并引起突變。srna和hfq之間的結(jié)合親和力如下調(diào)節(jié)：將作為第一莖區(qū)的在seqidno:91的5-8位的ggug序列轉(zhuǎn)換為ggac、ccug和ccuc或?qū)gug4nt轉(zhuǎn)換為6nt和8nt。另外，其特征在于將作為sgrs的srna支架的第一環(huán)區(qū)的在seqidno:91的10-13位的aaaa序列轉(zhuǎn)換為ccgg、cccc、ccuu、gggg、ggcc、gguu、uugg和uuuu或?qū)⒆鳛閔fg結(jié)合位點(diǎn)的在seqidno:91的1-4位的uauu序列轉(zhuǎn)換為gauu、ucuu、uacu、uaau、uauc、uaua、gccc、gcac、gacc和gaac。另外，其特征在于將作為轉(zhuǎn)錄終止子和sgrs的srna支架的hfq結(jié)合位點(diǎn)的在seqidno:91的42-49位的u尾長度轉(zhuǎn)換為4-8。

[seqidno:91]

5’-uauugguguaaaaucacccgccagcagauuauaccugcugguuuuuuuu-3’

本申請使用的術(shù)語“核酸”可指rna、dna、穩(wěn)定化rna或穩(wěn)定化dna。在本發(fā)明中，“編碼”是指編碼srna和與srna互補(bǔ)的核酸序列。

在本發(fā)明中，“載體”是指dna構(gòu)建體，其包含與適當(dāng)?shù)哪軌蛟谶m當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)dna的控制序列可操作地連接的dna序列。載體可為質(zhì)粒、噬菌體顆?；騼H為有效的基因組插入體。當(dāng)載體在適當(dāng)?shù)乃拗髦修D(zhuǎn)化時，載體可復(fù)制和發(fā)揮作用而無論宿主基因組或在一些情況下可與基因組本身合并。質(zhì)粒是目前最常用的載體形式，由此本說明書的“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時可互換使用。本發(fā)明優(yōu)選使用質(zhì)粒載體?？捎糜谠撃康牡牡湫唾|(zhì)粒載體具有的結(jié)構(gòu)包含(a)用于有效復(fù)制進(jìn)而在每個宿主細(xì)胞中包含數(shù)個至數(shù)百個質(zhì)粒載體的復(fù)制區(qū)、(b)用于對用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇的抗生素抗性基因和(c)其中能夠插入外源dna片段的限制性酶裂解位點(diǎn)。即使不存在適當(dāng)?shù)南拗菩悦噶呀馕稽c(diǎn)，載體和外源dna之間的連結(jié)也可如下容易地實(shí)現(xiàn)：根據(jù)一般方法使用合成寡核苷酸接頭或連接子。連結(jié)后，需要將載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中。轉(zhuǎn)化可容易地通過氯化鈣法或電穿孔實(shí)現(xiàn)(neumann等人,emboj.,1:841,1982)。作為根據(jù)本發(fā)明用于srna表達(dá)的載體，可使用本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體。

核酸的堿基序列當(dāng)其與另一個核酸序列以功能關(guān)系排列時被可操作地連接。例如，啟動子或增強(qiáng)子直接影響序列的轉(zhuǎn)錄且置于適當(dāng)?shù)奈恢没蚺c適當(dāng)?shù)奈恢眠B接進(jìn)而在編碼序列中是可操作的；且核糖體結(jié)合位點(diǎn)影響序列的轉(zhuǎn)錄并與編碼序列連接進(jìn)而在編碼序列中是可操作的。編碼前序列或分泌前導(dǎo)序列的dna編碼參與多肽分泌的前蛋白且與靶基因直接連接。通常，術(shù)語“可操作地連接”意為dna序列是物理上連接的。另外，就分泌前導(dǎo)序列而言，其意為在前導(dǎo)框中接觸和存在。然而，增強(qiáng)子不需要具有接觸。這些序列之間的連接通過在方便的限制性酶位點(diǎn)進(jìn)行連結(jié)(連接)來實(shí)施。當(dāng)所述位點(diǎn)不存在時，根據(jù)常規(guī)方法使用合成寡核苷酸接頭或連接子。

在另一個方面，本發(fā)明涉及用上述載體轉(zhuǎn)化的重組微生物。

本申請使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”意為dna作為染色體外在因子是可復(fù)制的或通過將dna引入到宿主中來完成染色體整合而是可復(fù)制的。

應(yīng)理解的是，各種載體在表達(dá)本發(fā)明的dna序列中不等同地發(fā)揮作用。類似地，各種宿主細(xì)胞不等同地作用于相同的表達(dá)系統(tǒng)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)剡x擇各種載體、表達(dá)控制序列和宿主而不偏離本發(fā)明的范圍且無需承受過度的實(shí)驗(yàn)負(fù)擔(dān)。例如，在選擇載體時需要考慮宿主，這是因?yàn)檩d體需要在宿主中復(fù)制。還需要考慮載體的復(fù)制數(shù)、控制復(fù)制數(shù)的能力和由載體編碼的其它蛋白例如抗生素標(biāo)志物的表達(dá)。

在另一個方面，本發(fā)明涉及通過將載體引入到原核生物中或在原核生物中表達(dá)載體對靶基因mrna表達(dá)水平進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)的方法。

在另一個方面，本發(fā)明涉及對用于產(chǎn)生靶產(chǎn)物的靶基因進(jìn)行篩選的方法，所述篩選方法包括：

(a)根據(jù)上述方法對存在于用于產(chǎn)生靶產(chǎn)物的靶菌株中且參與靶產(chǎn)物的生物合成途徑的基因中的任何一種或多種基因的表達(dá)水平進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)；和

(b)當(dāng)靶產(chǎn)物的產(chǎn)率通過精細(xì)調(diào)節(jié)表達(dá)水平而改善時，選擇其中表達(dá)得以調(diào)節(jié)的基因作為用于產(chǎn)生靶產(chǎn)物的靶基因。

在另一個方面，本發(fā)明涉及對靶產(chǎn)物產(chǎn)生菌株進(jìn)行改善的方法，所述方法包括：

(a)根據(jù)上述方法對存在于用于產(chǎn)生靶產(chǎn)物的靶菌株中且參與靶產(chǎn)物的生物合成途徑的基因中的任何一種或多種基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)；

(b)當(dāng)靶產(chǎn)物的產(chǎn)率通過精細(xì)調(diào)節(jié)表達(dá)而改善時，篩選其中表達(dá)得以調(diào)節(jié)的基因作為用于產(chǎn)生靶產(chǎn)物的靶基因；和

(c)引入表達(dá)程度的所篩選的基因以產(chǎn)生重組菌株。

實(shí)施例

在下文中將參考以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于示例本發(fā)明且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1：合成srna性能的確認(rèn)

1-1：合成srna的構(gòu)建和所使用的srna表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

為了確保srna表達(dá)的方便，構(gòu)建了如圖1所示的質(zhì)粒。對于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，圖1的質(zhì)粒中的srna或啟動子通過定點(diǎn)誘變修飾并使用。

本實(shí)施例和下述實(shí)施例使用的限制性酶購自newenglandbiolabs(u.s.a.)和enzynomics(korea)且pcr聚合酶購自solgent(korea)。引物購自macrogen(korea)且其它酶購自enzynomics(korea)。其它事項(xiàng)分別標(biāo)識。

使用seqidno:1和2的引物對pbluescriptiiks+(stratagene)的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行pcr并插入到由pharmacia生產(chǎn)的pkk223-3質(zhì)粒的hindiii/naei位點(diǎn)中。多克隆位點(diǎn)的pcr產(chǎn)物用pvuii和naei消化且質(zhì)粒pkk223-3用hindiii和naei消化。然后質(zhì)粒pkk223-3ks如下構(gòu)建：使用klenow聚合酶形成鈍端并將兩個dna片段接合。將pr啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子t1/te插入到以上構(gòu)建的質(zhì)粒中用于srna支架及其表達(dá)，由此構(gòu)建用于srna表達(dá)的質(zhì)粒。pr啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子t1/te和srna支架的序列如下克?。涸谙惹把芯克褂玫膔lowcat-prmicc*ter中使用seqidno:3和4的引物進(jìn)行pcr(na,d等人,natbiotechnol.,31(2),170-174,2013)。pr啟動子-mimc結(jié)構(gòu)-t1/te轉(zhuǎn)錄終止子的pcr產(chǎn)物用bamhi和noti消化且pkk223-3ks也用bamhi/noti消化并連結(jié)這兩個dna片段。本申請使用的pr啟動子的序列是以bba_r0051登記在registryofstandardbiologicalparts數(shù)據(jù)庫(http://parts.igem.org/)中的序列且t1/te啟動子是以bba_b0015登記在上述數(shù)據(jù)庫中的序列。在以堿基配對區(qū)表示的bpr中，24聚體核苷酸序列由dsred2熒光蛋白的起始密碼子添加。將如上產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pkk223-3ksprmdsred2。bpr通過反向pcr使用seqidno:5和6的引物插入。sgrs序列的支架的序列如圖2所示且也通過反向pcr使用seqidno:7和8的引物產(chǎn)生。將如上產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pkk223-3ksprsdsred2。具有srgs序列的質(zhì)粒的圖譜如圖1所示且大腸桿菌dh5α菌株用于質(zhì)粒構(gòu)建。

<所使用的引物序列>

[seqidno.1]

5’-ggccaattcagctggtaccgggccccccctcg-3’

[seqidno.2]

5’-ggccaattgccggcgagctccaccgcggtgg-3’

[seqidno.3]

5’-ggccttaagcggccgctaacaccgtgcgtgttgac-3’

[seqidno.4]

5’-ccggaattggatcctataaacgcagaaaggccc-3’

[seqidno.5]

5’-ctcgccatatatttgtctttctgttgggccattgcattgc-3’

[seqidno.6]

5’-cagtgagaacgtcatgcaaccattatcaccgccagagg-3’

[seqidno.7]

5’-gccagcagattatacctgctggttttttttctcgagccaggcatcaaataaaacg-3’

[seqidno.8]

5’-gggtgattttacaccaatagacaaatatatggcgagcagtgagaacgtcatgcaaccattatcaccgccagagg-3’

1-2：用于研究合成srna性能的靶基因質(zhì)粒的構(gòu)建

選擇熒光蛋白dsred2作為用于容易地確認(rèn)srna性能的靶基因且構(gòu)建了如圖3所示的報(bào)告質(zhì)粒用于表達(dá)dsred2基因。使用seqidno:1和2的引物對pbluescriptiiks+(stratagene)的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行pcr并插入到由pharmacia生產(chǎn)的pacyc184(newenglandbiolabs,u.s.a.)質(zhì)粒的xbai/naei位點(diǎn)中。多克隆位點(diǎn)的pcr產(chǎn)物用pvuii和naei消化且質(zhì)粒pacyc184用xbai和naei消化。然后質(zhì)粒pacyc184ks如下構(gòu)建：使用klenow聚合酶形成鈍端并連結(jié)兩個dna片段。構(gòu)建了具有熒光蛋白作為srna的靶基因的質(zhì)粒。將乳糖啟動子、熒光蛋白dsred2基因和作為轉(zhuǎn)錄終止子的t1/te序列插入到多克隆位點(diǎn)的apai/sali位點(diǎn)中。本申請使用的乳糖啟動子、dsred2基因和t1/te轉(zhuǎn)錄終止子如下構(gòu)建：在先前研究所使用的rlowcat-plac-dsred2中使用seqidno:9和10進(jìn)行pcr(na,d等人,natbiotechnol.,31(2),170-174,2013)。乳糖啟動子通過使用pbluescriptsk+(stratagene)作為模板進(jìn)行pcr來構(gòu)建且dsred2基因通過使用pdsred2-n1(clontech)作為模板進(jìn)行pcr來構(gòu)建。t1/te轉(zhuǎn)錄終止子是登記在上述registryofstandardbiologicalparts數(shù)據(jù)庫(http://parts.igem.org/)中的bba_r0015序列。大腸桿菌dh5α用于質(zhì)粒構(gòu)建。

<所使用的引物序列>

[seqidno.9]

5’-ggccttaagggcccgtggataaccgtattaccgc-3’

[seqidno.10]

5’-ccggaattgtcgactataaacgcagaaaggccc-3’

1-3：合成srna性能的研究

使用以上構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行用于研究通過srna對靶基因的表達(dá)抑制性能的實(shí)驗(yàn)。將實(shí)施例1-2構(gòu)建的報(bào)告質(zhì)粒和實(shí)施例1-1構(gòu)建的具有sgrs支架且具有包含dsred2作為靶蛋白的srna的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)化到dh5α中。然后使用包含氨芐西林(ap)和氯霉素(cm)抗生素的lb板對具有兩種質(zhì)粒的集落進(jìn)行選擇，然后接種在包含ap和cm的lb培養(yǎng)基上。然后將菌株培養(yǎng)至靜止期并測量是否表達(dá)熒光。如圖4所示，與對照組相比，具有sgrs支架的抗dsred2合成srna顯示出99％的表達(dá)抑制效率。兩種菌株都具有pacyc184ksplacdsred2且對照組和sgrs菌株分別具有pkk223-3ks和pkk223-3kssdsred2。使用用于熒光測量的對照組即具有pacyc184ks和pkk223-3ks的菌株。

1-4：合成srna特異性的研究

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)通過srna對靶基因的表達(dá)抑制是否通過bpr特異性地實(shí)現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)使用具有以下srna的質(zhì)粒(pkk223-3kssdsred2)，所述srna具有sgrs支架并包含由24個核苷酸構(gòu)成的bpr。使用pkk223-3kssdsred2作為模板和seqidno:11和12的引物通過反向pcr構(gòu)建無bpr的質(zhì)粒，將其命名為pkk223-3ksso。在以下數(shù)據(jù)中將其用于經(jīng)樣品標(biāo)記的非靶向srna。另外，以與實(shí)施例1-3相同的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5所示。與對照組相比，無bpr的srna對熒光蛋白顯示出2％的表達(dá)抑制效率且具有由24個核苷酸構(gòu)成的bpr的srna對熒光蛋白顯示出98％的表達(dá)抑制效率。這表明特異性基因通過bpr而非通過合成srna支架來抑制。

<所使用的引物序列>

[seqidno.11]

5’-tattggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

[seqidno.12]

5’-gcaaccattatcaccgccagagg-3’

實(shí)施例2：通過引入各種啟動子調(diào)節(jié)srna表達(dá)及其作用

用于精細(xì)調(diào)節(jié)靶基因抑制的實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行：使用顯示出各種基因表達(dá)強(qiáng)度的啟動子來調(diào)節(jié)srna表達(dá)水平。使用實(shí)施例1的質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)方法并通過使用反向pcr對srna的啟動子進(jìn)行克隆并使用seqidno.13-46的引物對anderson啟動子集合的啟動子進(jìn)行克隆。sgrs用作srna支架且啟動子為j23100、j23101、j23102、j23103、j23104、j23105、j23106、j23107、j23109、j23111、j23112、j23113、j23114、j23115、j23116、j23117和j23118。結(jié)果如圖6所示且能夠認(rèn)識的是，啟動子的強(qiáng)度與蛋白抑制效率的對數(shù)值成比例。

<用于克隆啟動子的引物序列>

j23100：

[seqidno.13]

5’-gactgagctagccgtcaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

[seqidno.14]

5’-ctaggtacagtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

j23101：

[seqidno.15]

5’-ctaggtattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.16]

5’-gactgagctagctgtaaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23102：

[seqidno.17]

5’-ctaggtactgtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.18]

5’-gactgagctagctgtcaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23103：

[seqidno.19]

5’-ctagggattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.20]

5’-gactgagctagctatcaggcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23104：

[seqidno.21]

5’-ctaggtattgtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.22]

5’-gactgagctagctgtcaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23105：

[seqidno.23]

5’-gactgagctagccgtaaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

[seqidno.24]

5’-ctaggtactatgctagcgatgacgttctcactgctcgc-3’

j23106：

[seqidno.25]

5’-ctaggtatagtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.26]

5’-gactgagctagccgtaaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23107：

[seqidno.27]

5’-ctaggtattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.28]

5’-ggctgagctagccgtaaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23109：

[seqidno.29]

5’-gactgagctagctgtaaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

[seqidno.30]

5’-ctagggactgtgctagcgatgacgttctcactgctcgc-3’

j23111：

[seqidno.31]

5’-ctaggtatagtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.32]

5’-gactgagctagccgtcaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23112：

[seqidno.33]

5’-ctagggattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.34]

5’-gactgagctagctatcaggcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23113：

[seqidno.35]

5’-ctagggattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.36]

5’-gactgagctagccatcaggcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23114：

[seqidno.37]

5’-gactgagctagccataaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

[seqidno.38]

5’-ctaggtacaatgctagcgatgacgttctcactgctcgc-3’

j23115：

[seqidno.39]

5’-cttggtacaatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.40]

5’-ggctgagctagctataaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23116：

[seqidno.41]

5’-ctagggactatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.42]

5’-gactgagctagctgtcaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23117：

[seqidno.43]

5’-ctagggattgtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.44]

5’-gactgagctagctgtcaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

j23118：

[seqidno.45]

5’-ctaggtattgtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

[seqidno.46]

5’-gactgagctagccgtcaagcggccgccaccgcggtggagc-3’

實(shí)施例3：通過srna支架突變對靶基因抑制進(jìn)行微小調(diào)節(jié)

用于精細(xì)調(diào)節(jié)靶基因抑制的實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行：在srna支架上進(jìn)行誘變以改變其活性。使用實(shí)施例1的質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)方法且srna的啟動子為j23105，其在先前實(shí)驗(yàn)中顯示出74％的抑制率。僅在圖8的實(shí)驗(yàn)中使用j23108。用j23108啟動子表達(dá)srna的質(zhì)粒通過反向pcr使用seqidno:51和52構(gòu)建。然后通過反向pcr使用下列序列的引物使支架突變。對照組為無srna支架的pkk223-3ks和無bpr的pkk223-3ksso。mrnasgrs支架的莖環(huán)中莖的序列突變(圖7)、莖長度的變化(圖8)、環(huán)的序列(圖9)、uauu序列的突變(圖10)和u尾的長度(圖11)都可減弱或增強(qiáng)srna活性。u尾還是轉(zhuǎn)錄終止子和hfq結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)信這些突變的組合可進(jìn)一步減弱或增強(qiáng)srna的抑制活性。

<在圖7所示的突變中使用的引物序列>

一般使用的引物：

[seqidno.47]

5’-aatcacccgccagcagattatacctgctgg-3’

ggac：

[seqidno.48]

5’-ttagtccaataatggcgagcagtgagaac-3’

ccug：

[seqidno.49]

5’-ttacaggaataatggcgagcagtgagaac-3’

ccuc：

[seqidno.50]

5’-ttagtggaataatggcgagcagtgagaac-3’

<在圖8所示的突變中使用的引物序列>

j23108構(gòu)建引物：

[seqidno.51]

5’-gactgagctagctgtcaggcggccgccaccgcggtggagc-3’

[seqidno.52]

5’-ctaggtataatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc-3’

6nt莖：

[seqidno.53]

5’-ttacccaccaataatggcgagcagtgagaac-3’

[seqidno.54]

5’-aatcccacccgccagcagattatacctgctgg-3’

8nt莖：

[seqidno.55]

5’-ttacccccaccaataatggcgagcagtgagaac-3’

[seqidno.56]

5’-aatcccccacccgccagcagattatacctgctgg-3’

<在圖9所示的突變中使用的引物序列>

ccgg：

[seqidno.57]

5’-ggacaccaataatggcgagc-3’

[seqidno.58]

5’-ggtcacccgccagcagattatac-3’

cccc：

[seqidno.59]

5’-ggacaccaataatggcgagc-3’

[seqidno.60]

5’-cctcacccgccagcagattatac-3’

ccuu：

[seqidno.61]

5’-ggacaccaataatggcgagc-3’

[seqidno.62]

5’-tttcacccgccagcagattatac-3’

gggg：

[seqidno.63]

5’-ccacaccaataatggcgagc-3’

[seqidno.64]

5’-ggtcacccgccagcagattatac-3’

ggcc：

[seqidno.65]

5’-ccacaccaataatggcgagc-3’

[seqidno.66]

5’-cctcacccgccagcagattatac-3’

gguu：

[seqidno.67]

5’-ccacaccaataatggcgagc-3’

[seqidno.68]

5’-tttcacccgccagcagattatac-3’

uugg：

[seqidno.69]

5’-aaacaccaataatggcgagc-3’

[seqidno.70]

5’-ggtcacccgccagcagattatac-3’

uucc：

[seqidno.71]

5’-aaacaccaataatggcgagc-3’

[seqidno.72]

5’-cctcacccgccagcagattatac-3’

uuuu：

[seqidno.73]

5’-aaacaccaataatggcgagc-3’

[seqidno.74]

5’-tttcacccgccagcagattatac-3’

<在圖10所示的突變中使用的引物序列>

一般使用的引物：

[seqidno.75]

5’-gacaaatatatggcgagcag-3’

gauu：

[seqidno.76]

5’-gattggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

ucuu：

[seqidno.77]

5’-gtcttggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

uacu：

[seqidno.78]

5’-tactggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

uaau：

[seqidno.79]

5’-taatggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

uauc：

[seqidno.80]

5’-tatcggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

uaua：

[seqidno.81]

5’-tataggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

gccc：

[seqidno.82]

5’-gcccggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

gcac：

[seqidno.83]

5’-gcacggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

gacc：

[seqidno.84]

5’-gaccggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

gaac：

[seqidno.85]

5’-gaccggtgtaaaatcacccgccagcag-3’

<在圖11所示的突變中使用的引物序列>

一般使用的引物：

[seqidno.86]

5’-ctcgagccaggc-3’

u7：

[seqidno.87]

5’-aaaaaaaccagcaggtataatctgctggcg-3’

u6：

[seqidno.88]

5’-aaaaaaccagcaggtataatctgctggcg-3’

u5：

[seqidno.89]

5’-aaaaaccagcaggtataatctgctggcg-3’

u4：

[seqidno.90]

5’-aaaaccagcaggtataatctgctggcg-3’

工業(yè)應(yīng)用性

根據(jù)本發(fā)明使用合成調(diào)節(jié)性srna精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的方法能夠通過調(diào)節(jié)srna表達(dá)水平或srna和hfq之間的結(jié)合親和力精細(xì)調(diào)節(jié)對靶基因的表達(dá)進(jìn)行抑制的程度且由此可同時、容易和快速地將多種靶基因組合通過用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的合成調(diào)節(jié)性srna應(yīng)用于多種菌株而無需基因缺失且因此非常適于測量每種菌株的代謝能力并選擇最佳菌株。所述方法具有的優(yōu)點(diǎn)是容易并快速地選擇抑制基因表達(dá)的靶基因并表達(dá)所選基因至所需程度，其在產(chǎn)生用于有效產(chǎn)生多種代謝物的重組菌株并建立有效的產(chǎn)生方法中是非常有用的且所述方法因此是非常有用的。

本發(fā)明的具體實(shí)施方案如上所詳細(xì)描述。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，該具體描述僅為描述性和示例性實(shí)施方案且不應(yīng)被理解為是對本發(fā)明范圍的限制。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由所附權(quán)利要求書及其等同形式所定義。

序列表

<110>韓國科學(xué)技術(shù)院

<120>使用合成調(diào)節(jié)性srna精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法

<130>pf-b1818-cn

<140>pct/kr2014/005120

<141>2014-06-11

<160>91

<170>patentinversion3.2

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p1

<400>1

ggccaattcagctggtaccgggccccccctcg32

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p2

<400>2

ggccaattgccggcgagctccaccgcggtgg31

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p3

<400>3

ggccttaagcggccgctaacaccgtgcgtgttgac35

<210>4

<211>33

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p4

<400>4

ccggaattggatcctataaacgcagaaaggccc33

<210>5

<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p5

<400>5

ctcgccatatatttgtctttctgttgggccattgcattgc40

<210>6

<211>38

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p6

<400>6

cagtgagaacgtcatgcaaccattatcaccgccagagg38

<210>7

<211>55

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p7

<400>7

gccagcagattatacctgctggttttttttctcgagccaggcatcaaataaaacg55

<210>8

<211>74

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p8

<400>8

gggtgattttacaccaatagacaaatatatggcgagcagtgagaacgtcatgcaaccatt60

atcaccgccagagg74

<210>9

<211>34

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p9

<400>9

ggccttaagggcccgtggataaccgtattaccgc34

<210>10

<211>33

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p10

<400>10

ccggaattgtcgactataaacgcagaaaggccc33

<210>11

<211>27

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p11

<400>11

tattggtgtaaaatcacccgccagcag27

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>p12

<400>12

gcaaccattatcaccgccagagg23

<210>13

<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23100-f

<400>13

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<210>14

<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23100-r

<400>14

ctaggtacagtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

<210>15

<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23101-f

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ctaggtattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

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<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23101-r

<400>16

gactgagctagctgtaaagcggccgccaccgcggtggagc40

<210>17

<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23102-f

<400>17

ctaggtactgtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

<210>18

<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23102-r

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gactgagctagctgtcaagcggccgccaccgcggtggagc40

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<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23103-f

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ctagggattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

<210>20

<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23103-r

<400>20

gactgagctagctatcaggcggccgccaccgcggtggagc40

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<212>dna

<213>人工

<220>

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<400>21

ctaggtattgtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

<210>22

<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23104-r

<400>22

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<210>23

<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

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<400>23

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<210>24

<211>38

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23105-r

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ctaggtactatgctagcgatgacgttctcactgctcgc38

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<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

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<400>25

ctaggtatagtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

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<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23106-r

<400>26

gactgagctagccgtaaagcggccgccaccgcggtggagc40

<210>27

<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

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<400>27

ctaggtattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

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<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23107-r

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ggctgagctagccgtaaagcggccgccaccgcggtggagc40

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<212>dna

<213>人工

<220>

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<400>29

gactgagctagctgtaaagcggccgccaccgcggtggagc40

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<211>38

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23109-r

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ctagggactgtgctagcgatgacgttctcactgctcgc38

<210>31

<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23111-f

<400>31

ctaggtatagtgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

<210>32

<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23111-r

<400>32

gactgagctagccgtcaagcggccgccaccgcggtggagc40

<210>33

<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23112-f

<400>33

ctagggattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

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<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23112-r

<400>34

gactgagctagctatcaggcggccgccaccgcggtggagc40

<210>35

<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23113-f

<400>35

ctagggattatgctagcgatgacgttctcactgctcgcc39

<210>36

<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>j23113-r

<400>36

gactgagctagccatcaggcggccgccaccgcggtggagc40

<210>37

<211>40

<212>dna

<213>人工

<220>

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