稀有密碼子改造的人znf580基因及該基因原核表達(dá)的蛋白及多克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種稀有密碼子改造的人ZNF580基因及該基因原核表達(dá)的蛋白及多克隆抗體，稀有密碼子改造的人ZNF580基因，是SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明改造了人ZNF580基因中的稀有密碼子，得到稀有密碼子改造的人ZNF580基因，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明改造的基因經(jīng)原核表達(dá)，可以產(chǎn)生大量的ZNF580蛋白，因此解決了現(xiàn)有技術(shù)ZNF580基因在原核中表達(dá)不出來(lái)的難題；成功地表達(dá)并純化了人ZNF580蛋白；并以ZNF580蛋白作為抗原成功制備了多克隆抗體。
【專利說明】稀有密碼子改造的人ZNF580基因及該基因原核表達(dá)的蛋白及多克隆抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種改造的基因及其表達(dá)和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，是缺血性心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。AS斑塊的主要特征是病灶中細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外脂質(zhì)聚集、單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞形成、主動(dòng)脈平滑肌增生以及結(jié)締組織成分聚集。近些年來(lái)，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，AS所致的心腦血管疾病發(fā)病率在我國(guó)有上升趨勢(shì)。AS是一種環(huán)境因素與遺傳因素所誘發(fā)的多基因病，目前還缺少十分有效的治療措施。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)心腦血管疾病患者和動(dòng)物模型的大量研究，已經(jīng)克隆出100多個(gè)AS相關(guān)基因，例如 apoA1、apoB、apoC1、apoC I1、apoC II1、LPL、LCAT、CEPT、ABBP-1、Ath-1、Ath_2、Ath-6等等，并利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除動(dòng)物證實(shí)它們的生理功能。然而，AS作為一種復(fù)雜的多基因病，牽涉到一個(gè)龐大的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，隨著人類及各種模式生物基因組序列測(cè)序的完成，未來(lái)一個(gè)重要的目標(biāo)是闡明人體約3.5萬(wàn)個(gè)基因的功能。為了有效防治AS，有必要深入研究與AS相關(guān)基因的功能。血漿低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein, LDL)水平持續(xù)升高與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率呈正相關(guān)，血管內(nèi)皮細(xì)胞是AS形成及發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)。張文成等人以致動(dòng)脈粥樣硬化因素LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304，采用差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)進(jìn)行分析，以差異表達(dá)的新ESTs為探針，篩選人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù),得到一個(gè)全長(zhǎng)為1726bp的新基因cDNA全長(zhǎng)(Genbank注冊(cè)號(hào):AF184939)，該基因由人類基因命名委員會(huì)定名為ZNF580，ZNF580基因用SEQ ID N0.3所示。ZNF580基因CDNA748-1266位堿基序列構(gòu)成一個(gè)完整的開放閱讀框架，該cDNA開放閱讀框全長(zhǎng)為519bp，編碼172個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量約為18.7564kDa。經(jīng)分子生物學(xué)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能基 序分析:其氨基端5-88位氨基酸序列為脯氨酸富含域，羧基端94-172位氨基酸序列中含有三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，三個(gè)鋅指符合C2H2型鋅指蛋白基序CX2CX3FX5LX2HX3H(其中X代表保守性差的氨基酸)。多組織Northern雜交證實(shí)ZNF580基因在人多種組織中均有表達(dá)，其中在心肌、腎臟、胰腺組織中的表達(dá)量最高，大腦表達(dá)次之，在胎盤、肝臟、骨骼肌、肺組織中表達(dá)量較低。LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞使ZNF580基因表達(dá)明顯下調(diào)。ZNF580基因定位于人19號(hào)染色體19ql3.42。將ZNF580編碼區(qū)克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-Cl上，轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293、胃癌細(xì)胞系MGC803進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，融合有綠色熒光蛋白EGFP的目的蛋白定位于細(xì)胞核。前期研究工作表明:ZNF580基因編碼一種與AS相關(guān)的具有調(diào)控作用的C2H2型鋅指核蛋白轉(zhuǎn)錄因子。檢索基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)ZNF580的相關(guān)信息顯示，ZNF580受多條信號(hào)通路的調(diào)控，并通過調(diào)節(jié)靶基因的開關(guān)或轉(zhuǎn)錄水平參與細(xì)胞增殖、分化與凋亡等過程。為了深入研究ZNF580蛋白在基因表達(dá)調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，有必要利用基因工程技術(shù)表達(dá)并純化ZNF580蛋白，制備多克隆抗體，從而為研究ZNF580基因的功能奠定基礎(chǔ)。[0003]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，完全按照人ZNF580基因開放閱讀框序列進(jìn)行基因工程操作，人ZNF580蛋白在原核中表達(dá)不出來(lái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的人ZNF580基因不能進(jìn)行原核表達(dá)的不足，提供一種能在原核中表達(dá)的稀有密碼子改造的人ZNF580基因。
[0005]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用稀有密碼子改造的人ZNF580基因進(jìn)行原核表達(dá)產(chǎn)生的ZNF580蛋白。
[0006]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用ZNF580蛋白制備的多克隆抗體。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0008]稀有密碼子改造的人ZNF580基因，是SEQ ID N0.1所示。
[0009]用SEQ ID N0.1所示基因進(jìn)行原核表達(dá)產(chǎn)生的ZNF580蛋白，所述ZNF580蛋白氨基酸序列由SEQ ID N0.2所示，分子量約為18.7564kDa，等電點(diǎn)為10.13。
[0010]用ZNF580蛋白制備的多克隆抗體。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0012]本發(fā)明改造了人ZNF580基因中的稀有密碼子，得到稀有密碼子改造的人ZNF580基因，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明 改造的基因經(jīng)原核表達(dá)，可以產(chǎn)生大量的ZNF580蛋白，因此解決了現(xiàn)有技術(shù)ZNF580基因在原核中表達(dá)不出來(lái)的難題；成功地表達(dá)并純化了人ZNF580蛋白；并以ZNF580蛋白作為抗原成功制備了多克隆抗體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為ZNF580融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳(1:陰性對(duì)照:非IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；2:陽(yáng)性結(jié)果:IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；3 =MARKER:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn))。
[0014]圖2為不同誘導(dǎo)時(shí)間ZNF580融合蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳。(1:1.5h誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；2:2.5h誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；3:3.5h誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；4 =MARKER:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn))
[0015]圖3為親和層析純化ZNF580融合蛋白SDS-PAGE電泳。(1:MARKER:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；2:對(duì)沉淀進(jìn)行親和層析純化；3:對(duì)上清進(jìn)行親和層析純化；4:凝膠擴(kuò)散法純化ZNF580融合蛋白)
[0016]圖4為腸激酶作用后純化的ZNF580蛋白SDS-PAGE電泳。I =MARKER:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；2:純化的ZNF580融合蛋白；3:腸激酶作用后凝膠擴(kuò)散法純化的ZNF580目的蛋白)
[0017]圖5為多克隆抗體Western blot分析。(ZNF580為目的蛋白；GAPDH為內(nèi)參照蛋白)
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明作任何限制。
[0019]實(shí)施例1
[0020]以人ZNF580cDNA為依據(jù)，根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的偏好性，并在確保表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸序列不變的情況下，進(jìn)行了密碼子改造，獲得了稀有密碼子改造的人ZNF580基因，是SEQ ID N0.1所示。
[0021]實(shí)施例2
[0022]一、材料與方法
[0023]1.1 材料
[0024]PCR試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒，大腸桿菌BL21 (DE3)，T4DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。高純度質(zhì)粒小提試劑盒及腸激酶購(gòu)自TIANGEN BIOTECH, His.band蛋白純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Novagen公司。
[0025]1.2 方法
[0026]1.2.1構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒
[0027]根據(jù)所應(yīng)用表達(dá)質(zhì)粒pET30a的特性，設(shè)計(jì)相應(yīng)的腸激酶序列及限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行全序列合成并連接到質(zhì)粒pET30a中，命名為pET30a-ZNF580o成功地構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a_ZNF580。
[0028]1.2.2表達(dá)目的蛋白
[0029]1.2.2.1大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)的制備
[0030]取5ml大腸 桿菌BL21于5ml離心管中，冰浴lOmin。在4°C于4000g離心IOmin,棄盡上清。加入0.1M的冰冷CaCl2水溶液0.5ml重懸菌體。冰浴20min，在4°C以4000g離心lOmin，棄盡上清。加入0.1M的冰冷CaCl2水溶液0.2ml重懸菌體。于4°C放置16h備用。
[0031]1.2.2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21
[0032]取10 μ I重組質(zhì)粒pET30a-ZNF580加入200 μ I大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)中，輕輕混勻，冰浴30min，42°C熱休克90s，再冰浴90s，加入37°C預(yù)熱的不含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基800 μ 1，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)lh，取200 μ I培養(yǎng)液均勻涂在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，涼干后37°C倒置培養(yǎng)16h，結(jié)果出現(xiàn)抗性菌落。
[0033]1.2.2.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定
[0034]將長(zhǎng)出的菌落分別接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中。在37°C 140rpm振蕩過夜。在作好標(biāo)記的每個(gè)試管中取5ml菌液提質(zhì)粒(按照高純度質(zhì)粒小提試劑盒操作進(jìn)行)。
[0035]用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)如下:在滅菌的0.5mlEppendorf管中加重組質(zhì)粒DNA2 μ g，IOX酶切緩沖液2 μ 1，限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I各I μ 1，最后加水至總體積為20 μ 1，在37°C保溫6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶切片段與預(yù)期的片段長(zhǎng)度大小一致，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。
[0036]1.2.2.4IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)
[0037]1.2.2.4.1從含有pET30a空質(zhì)粒的陰性單菌落的平板上和步驟1.2.2.2獲得的固體培養(yǎng)基上分別挑取含有PET30a空質(zhì)粒的陰性單菌落和含重組質(zhì)粒pET30a-ZNF580的陽(yáng)性單菌落，，分別接種于6ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
[0038]1.2.2.4.2分別將400 μ I含有重組質(zhì)粒pET30a_ZNF580的菌液和含有pET30a空質(zhì)粒的菌液接種于4ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)至0D600為0.96，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為ImM，繼續(xù)于30°C 200rpm振蕩3h，每隔30min收集含有pET30a-ZNF580的菌液0.5ml，觀察隨時(shí)間變化的表達(dá)情況，離心收集沉淀。
[0039]1.2.2.5SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物
[0040]取2.5ml的步驟L 2.2.4.1獲得的含重組質(zhì)粒pET30a_ZNF580的菌液，接種于250ml的含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)至0D600為0.96，加入IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)于30°C 200rpm振蕩3h，1000Og離心IOmin收集菌體，加入5ml結(jié)合緩沖液，超聲破碎菌體(300W，每次IOs,間歇20s，共20次)，14000g離心20min。取上清和沉淀做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物存在于上清中。預(yù)期表達(dá)的蛋白分子量約為24.3kDa,經(jīng)電泳可見24.3kDa處有明顯的新生區(qū)帶，表明成功表達(dá)了ZNF580融合蛋白(如圖1)。于30。。200rpm振蕩3.5h，分別在1.5h、2.5h和3.5h收集含有pET30a-ZNF580的菌液0.5ml，觀察隨時(shí)間變化的表達(dá)情況，結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)2.5h到3.5h，表達(dá)產(chǎn)物的量達(dá)到高峰(如圖2)
[0041]L 2.3分離純化重組蛋白
[0042]1.2.3.1采用His.band蛋白純化試劑盒純化重組蛋白
[0043]首先將上清用0.45 μ m的濾膜過濾，隨后按下述方法制備層析柱，并進(jìn)行純化:
[0044]①樹脂的準(zhǔn)備與平衡
[0045]進(jìn)行柱層析純化之前需要準(zhǔn)備:5倍體積I X離子化緩沖液，13倍體積I X結(jié)合緩沖液，6倍體積的IX漂洗緩沖液以及6倍體積的IX洗脫緩沖液。應(yīng)用Novagen聚丙烯空色譜柱(貨號(hào)69673-3)，空柱首先加幾毫升滅菌的去離子水，用一只手指(戴手套)輕推柱的上部，浸濕濾芯部分，使液體能正常流動(dòng)。
[0046]②將HiS-Bind樹脂輕柔顛倒徹底重懸樹脂。用一個(gè)闊口吸頭將2.5ml樹脂懸液加入一個(gè)準(zhǔn)備好的空色譜柱中，待樹脂在重力作用下自然沉降。
`[0047]③當(dāng)樹脂沉降、保存液的液面降至樹脂表面時(shí)，按以下順序清洗、離子化和平衡色譜柱；
[0048]A: 3倍體積滅菌去離子水
[0049]B: 5倍體積I X離子化緩沖液
[0050]C: 3倍體積I X結(jié)合緩沖液
[0051]④待結(jié)合緩沖液下降至層析介質(zhì)表面，小心加入步驟1.2.2.5獲得的上清。
[0052]⑤10倍床體積I X結(jié)合緩沖液洗
[0053]⑥6倍體積I X漂洗緩沖液洗
[0054]⑦I倍體積I X洗脫緩沖液洗脫結(jié)合蛋白。
[0055]洗脫液分段收集，Iml收集一管。首先采用PAGE和SDS-PAGE進(jìn)行電泳，觀察蛋白分離情況，結(jié)果表明蛋白被純化，然后對(duì)每管蛋白液進(jìn)行定量測(cè)定，得出每管的蛋白(融合蛋白)濃度值，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，從凝膠中切下所需目的條帶，可見ZNF580融合蛋白被純化(如圖3)。
[0056]1.2.3.2制備純化的ZNF580蛋白
[0057]取融合蛋白1.5mg/ml加入IOX緩沖液10 μ 1，加入重組腸激酶3U，于23°C作用10h，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后，將凝膠條帶冷凍后研碎，放入制備好的磷酸鹽緩沖液100ml中，密封靜置48h，4000rpm離心后，取上清冷凍，經(jīng)真空干燥重新溶于緩沖液中，利用BCA法進(jìn)行蛋白測(cè)定，結(jié)果蛋白濃度為1.2046mg/ml。蛋白純化后做SDS-PAGE，可見ZNF580蛋白被純化(如圖4)，純化的蛋白分子量與預(yù)期的18.7564kDa相一致。
[0058]實(shí)施例3
[0059]一、制備多克隆抗體方法
[0060]1.1抗原準(zhǔn)備
[0061]將實(shí)施例2獲得的純化的ZNF580蛋白，用pH=7.4的0.01M PBS將其稀釋到0.5mg/ml ο抗原乳化米用雙注射器互推法。
[0062]1.2免疫程序
[0063]取4只新西蘭兔，其中2只作為對(duì)照組，對(duì)照組用滅菌的三蒸水(使用量與實(shí)驗(yàn)組的體積相同)，按下述實(shí)驗(yàn)組相同的免疫程序進(jìn)行免疫。 [0064]I)取Iml純化的ZNF580蛋白(0.5mg/ml)，加入等體積弗氏完全佐劑乳化后，新西
蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射；
[0065]2)經(jīng)一個(gè)月第二次免疫，取Iml純化的ZNF580蛋白(0.5mg/ml )，加入等體積弗氏不完全佐劑乳化后，新西蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射；
[0066]3)第二次免疫后的第10天進(jìn)行第三次免疫，取Iml純化的ZNF580蛋白(0.5mg/ml)，加入等體積弗氏不完全佐劑乳化后，新西蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射；
[0067]4)第三次免疫后的第10天進(jìn)行第四次免疫，取Iml純化的ZNF580蛋白(0.5mg/ml)，加入等體積弗氏不完全佐劑乳化后，新西蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射；
[0068]5)第四次免疫后I個(gè)月進(jìn)行沖擊免疫，取2ml純化的ZNF580蛋白(0.5mg/ml)，新西蘭兔腹腔注射；
[0069]6)沖擊免疫后的第3天,兔耳靜脈米血液2ml,室溫凝固后,分尚血清,用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定多抗滴度。
[0070]7)沖擊免疫后的第4天，新西蘭兔頸動(dòng)脈放血，收集血液，4°C放置過夜，待血塊收縮后分離血清，分裝保存。
[0071]1.3抗ZNF580多抗效價(jià)測(cè)定
[0072]多抗用ELSIA法測(cè)定效價(jià)
[0073]I)包被酶標(biāo)板:用包被液稀釋純化的ZNF580蛋白至0.025 μ g/ml, 100 μ I/孔，
4°C過夜。
[0074]2)封閉:次日用PBST洗滌液洗滌2次，每次2min，之后用10%小牛血清封閉液封閉酶標(biāo)板，37°C水浴I h，PBST洗滌液洗滌。
[0075]3)加樣:加入稀釋過的多抗100 μ I/孔(稀釋倍數(shù)見表1，多抗為本實(shí)施例步驟1.2中的7)獲得的血清)，37°C水浴2h，PBST洗滌液洗滌。
[0076]4)加二抗:加入1:4000的山羊抗兔IgG-HRP，37°C水浴45min，PBST洗滌液洗滌。
[0077]5)底物:分別加入顯色液A和顯色液B各50 μ 1，37°C水浴15min。
[0078]6)終止:加入終止液100 μ 1，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。
[0079]二、結(jié)果
[0080]多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定
[0081]純化后的抗ZNF580蛋白的多抗用0.025 μ g/ml ZNF580蛋白包被的酶標(biāo)板測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)，用不同稀釋倍數(shù)的抗ZNF580蛋白的多抗作為一抗，山羊抗兔HRP/IgG為二抗得結(jié)果如下，抗體效價(jià)在1/16000。[0082]表1多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定
【權(quán)利要求】
1.稀有密碼子改造的人ZNF580基因，其特征是SEQID N0.1所示。
2.用權(quán)利要求1的SEQID N0.1所示基因進(jìn)行原核表達(dá)產(chǎn)生的ZNF580蛋白，所述ZNF580蛋白氨基酸序列由SEQ ID N0.2所示。
3.用ZNF580蛋 白制備的多克隆抗體。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103740728SQ201310755745
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】張文成, 李海生, 牟心紅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院