優(yōu)先權聲明本申請要求2014年12月16日提交的題為“parentalrnaisuppressionofhunchbackgenetocontrolcoleopteranpests”的美國臨時專利申請系列號62/092,772、以及2015年6月2日提交的題為“parentalrnaisuppressionofhunchbackgenetocontrolhemipteranpests”美國臨時專利申請系列號62/170,079的申請日的利益，在此將二者全體并入本文。本發(fā)明一般性地涉及由鞘翅目害蟲引起的植物損害的遺傳控制。在特定的實施方案中，本發(fā)明涉及目標編碼和非編碼多核苷酸的鑒定、及其重組dna技術在鞘翅目害蟲細胞中轉錄后阻遏或抑制目標編碼多核苷酸和非編碼多核苷酸表達從而提供植保作用的用途。背景西方玉米根蟲(wcr)(diabroticavirgiferavirgiferaleconte，玉米根螢葉甲)是北美的一種破壞性最大的玉米根蟲物種，在美國中西部玉米種植區(qū)受到特別關注。北方玉米根蟲(ncr)(巴氏根螢葉甲)是與wcr共棲大致相同范圍的近緣物種。有幾種葉甲屬的其他相關亞種是美洲的嚴重害蟲：墨西哥玉米根蟲(mcr)[墨西哥玉米根螢葉甲(d.virgiferazeaekrysanandsmith)]；南方玉米根蟲(scr)(十一星根螢葉甲)；黃瓜條根螢葉甲(d.balteataleconte)；d.undecimpunctatatenella；南美葉甲(d.speciosagermar)、和d.u.undecimpunctatamannerheim。美國農(nóng)業(yè)部已估計玉米根蟲每年造成10億美元收入損失，包括8億美元產(chǎn)量損失和2億美元處理成本。wcr和ncr兩者都以卵的形式在夏季期間潛伏在土壤中。這些昆蟲在整個冬季都停留在卵階段。卵是橢圓的、白色、且長度小于1mm。幼蟲在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵化的精確時間由于溫度差異和位置而在各年間有所變化。新孵出的幼蟲是白色的蠕蟲，長度小于3.18mm。一旦孵出，幼蟲便開始以玉米根為食。玉米根蟲經(jīng)歷三個幼蟲齡。在進食幾周后，幼蟲蛻皮，進入若蟲階段。它們在土壤中化蛹，然后它們在7月和8月中以成蟲從土壤出現(xiàn)。成體根蟲長度約6.35mm。玉米根蟲幼蟲在玉米和幾種其他禾本科物種上完成發(fā)育。在黃色狗尾草上飼養(yǎng)的幼蟲較晚出現(xiàn)，并且作為成蟲比玉米上飼養(yǎng)的幼蟲具有更小的頭殼尺寸。ellsbury等人，(2005)environ.entomol.34:627-34。wcr成蟲以玉米穗絲、花粉、和暴露的穗尖上的籽粒為食。當優(yōu)選的穗絲和花粉變得可得到時，成蟲會快速向其移動。ncr成蟲也以玉米植物的生殖組織為食。wcr雌蟲通常交配一次。bransonetal.(1977)ann.entom.soc.america70(4):506-8。玉米中的大部分根蟲損傷由幼蟲進食引起。新孵出的根蟲最初以細的玉米根毛為食，并鉆入根尖中。隨著幼蟲長得更大，它們以初生根為食并鉆入其中。在有大量玉米根蟲時，幼蟲嚙食往往導致根部被一直修剪到玉米桿基部。嚴重的根損傷干擾根將水和養(yǎng)分轉運到植物中的能力，降低植物生長，并導致籽粒產(chǎn)生減少，由此經(jīng)常急劇降低總產(chǎn)量。嚴重的根損傷還經(jīng)常導致玉米植物的倒伏，其使收獲變得更難，并進一步降低產(chǎn)量。此外，成蟲以玉米生殖組織為食可以導致穗尖的穗絲修剪。如果這種“穗絲剪切”在花粉脫落期間足夠嚴重，則傳粉可能受到破壞。可以通過作物輪作、化學殺蟲劑、生物殺蟲劑(例如，孢子形成革蘭氏陽性細菌蘇云金芽孢桿菌)、表達bt毒素的轉基因植物、或這些手段的組合來嘗試控制玉米根蟲。作物輪作的缺陷是限制了農(nóng)田的用途。此外，一些根蟲物種可以在玉米之外的作物田間產(chǎn)卵，或者長期的滯育(diapause)可導致卵孵化經(jīng)歷多年，因此會降低用玉米和其他作物實施的作物輪作的效率。化學殺蟲劑是最為人們所倚重的實現(xiàn)玉米根蟲控制的手段。然而，使用化學殺蟲劑并不是完美的玉米根蟲控制策略；如果把化學殺蟲劑的成本與使用殺蟲劑后仍可能發(fā)生的根蟲害所致的產(chǎn)量損失的成本相加，則美國每年由于玉米根蟲可能損失超過10億美元。大的幼蟲群體、大雨、和不適當?shù)臍⑾x劑應用均可導致玉米根蟲控制不充分。此外，殺蟲劑的連續(xù)使用可能選擇殺蟲劑抗性根蟲品系，并且由于它們對非靶物種有毒性，有嚴重的影響環(huán)境之虞。rna干擾(rnai)是一種利用內源細胞途徑的方法，由此對足夠大小的整個或任何部分靶基因特異性的干擾rna(irna)分子(例如，雙鏈rna(dsrna)分子)導致由其編碼的mrna的降解。在最近幾年，在許多物種和實驗系統(tǒng)，例如線蟲秀麗隱桿線蟲、植物、昆蟲胚胎、和組織培養(yǎng)物中的細胞中，已經(jīng)使用rnai進行基因“敲低”。參見，例如fire等人，(1998)nature391:806-11；martinez等人，(2002)cell110:563-74；mcmanus和sharp(2002)naturerev.genetics3:737-47。rnai通過包括切丁酶(dicer)蛋白質復合物的內源途徑完成mrna的降解。切丁酶將長的dsrna分子切割成約20個核苷酸的短片段，稱作小干擾rna(sirna)。sirna解旋成兩個單鏈rna：乘客鏈(passengerstrand)和引導鏈(guidestrand)。乘客鏈被降解，引導鏈則被整合到rna誘導的沉默復合物(risc)中。微核糖核酸(mirna)在結構上是非常近似的分子，從前體分子切割而來，前體分子包含連接雜交的乘客鏈和引導鏈的多核苷酸“環(huán)”，微核糖核酸可以類似地并入risc中。當引導鏈與互補的mrna分子特異性結合并誘導risc復合物的催化成分argonaute被切割時，發(fā)生轉錄后基因沉默。已知該過程遍布在一些真核生物，例如植物、線蟲和一些昆蟲的體內，盡管最初的sirna和/或mirna的濃度有限。只有與sirna和/或mirna互補的轉錄本才會被切割和降解，因此mrna表達的敲低是序列特異性的。在植物中，存在切丁酶基因的幾種官能團。rnai的基因沉默效應持續(xù)數(shù)天，在實驗條件下可導致目標轉錄物的豐度下降90％以上，導致相應的蛋白質水平的降低。在昆蟲中，至少有兩種切丁酶基因，其中切丁酶1促進argonaute1的mirna指導性降解。leeetal.(2004)cell117(1):69-81。切丁酶2促進argonaute2的sirna引導的降解。美國專利7,612,194和美國專利公開文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545披露了自玉米根螢葉甲若蟲分離的9112種表達序列標簽(est)序列的文庫。在美國專利7,612,194和美國專利公開號2007/0050860中提出將與其中披露的玉米根螢葉甲液泡型h+-atp酶(v-atp酶)的幾個特定部分序列之一互補的核酸分子與啟動子可操作連接，以在植物細胞中表達反義rna。美國專利公開文本no.2010/0192265提出將啟動子與核酸分子可操作連接以在植物細胞中表達反義rna，所述核酸分子與具有未知且未公開的功能的玉米根螢葉甲基因的特定部分序列互補(該部分序列據(jù)稱與秀麗隱桿線蟲中的c56c10.3基因產(chǎn)物58％相同)。美國專利公開文本no.2011/0154545提出將啟動子與核酸分子可操作連接以在植物細胞中表達反義rna，所述核酸分子與玉米根螢葉甲外被體(coatomer)beta亞單位基因的兩個特定部分序列互補。此外，美國專利7,943,819公開了自玉米根螢葉甲幼蟲、若蟲、和切開的中腸分離的906種表達序列標簽(est)序列的文庫，并且提出了將啟動子與核酸分子可操作連接以在植物細胞中表達雙鏈rna，所述核酸分子與玉米根螢葉帶電的多泡體蛋白4b基因的特定部分序列互補。除了v-atp酶的幾個特定部分序列和未知功能的基因的特定部分序列之外，在美國專利7,612,194和美國專利公開文本2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545中沒有進一步提出使用其中列出的超過9000個序列中的任何特定序列進行rna干擾。此外，美國專利7,612,194、以及美國專利公開文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545都沒有教示提供的超過9000個序列中哪些其他序列在用作dsrna或sirna時在玉米根蟲物種中會是致命的、甚至沒有教示其有任何其他方面的用處。除了帶電多泡體蛋白4b基因的特定部分序列之外，美國專利7,943,819沒有提出使用其文中的超過900個序列的任何特定序列進行rna干擾。此外，美國專利7,943,819沒有教示其提供的超過900個序列中哪些其他序列在用作dsrna或sirna時在玉米根蟲物種中會是致命的、甚至沒有教示其有任何其他方面的用處。美國專利申請公開文本u.s.2013/040173和pct申請公開文本wo2013/169923描述了源自玉米根螢葉甲snf7基因的序列在玉米中進行rna干擾的用途。(還公開于bolognesi等人，(2012)plosone7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534)。與玉米根蟲dna互補的絕大多數(shù)序列(如上述)用作dsrna或sirna時不提供對玉米根蟲物種的植保作用。例如，baum等人(2007,naturebiotechnology25:1322-1326)描述了rnai對幾個wcr基因靶的抑制作用。這些作者報告，在超過520ng/cm2的極高irna(例如，dsrna)濃度下，他們測試的26個靶基因中有8個不能提供實驗上顯著的鞘翅目害蟲死亡率。美國專利7,612,194和美國專利申請公開2007/0050860的作者們首次報道了在玉米植株中靶向西方玉米根蟲的植物體內(inplanta)rnai。baumetal.(2007)nat.biotechnol.25(11):1322-6。這些作者們描述了一種高通量體內餌食rnai系統(tǒng)，用來篩選用于開發(fā)轉基因rnai玉米的潛在靶基因。在290種靶物的初始基因池中，只有14種基因展現(xiàn)了幼蟲控制潛力。最有效的雙鏈rna(dsrna)中之一靶向了編碼囊泡性atp酶亞單位a(v-atpase)的基因，導致相應的內源mrna的迅速阻遏，并以低濃度的dsrna引發(fā)了特異性的rnai應答。由此，這些作者首次記錄了植物體內rnai作為害蟲管理工具的潛力，同時證明，有效的靶物是無法先驗地準確鑒定的，即使從較小的一組候選基因鑒定亦然。rnai用于昆蟲控制的另一個潛在應用涉及親代rnai(prnai)。最先描述的prnai是在秀麗隱桿線蟲中，通過將dsrna注入體腔(或通過攝取施用dsrna)鑒定，導致后代胚胎中的基因無活性，從而鑒定了prnai。fireetal.(1998)同上；timmonsandfire(1998)nature395(6705):854。在鞘翅目模式生物赤擬谷盜(triboliumcastaneum)中描述了類似的過程，其中對雌性蛹注射了控制胚胎發(fā)育過程中分節(jié)的三個獨特基因的相應dsrna，導致后代胚胎中的合子基因的敲低。bucheretal.(2002)curr.biol.12(3):r85-6。該研究中幾乎所有的后代幼蟲在注射后一周均顯示了基因特異性表型。盡管功能基因組學研究中dsrna的注射在各種昆蟲中已經(jīng)取得成功，但要使得rnai成為害蟲管理的有效工具，需要從腸道環(huán)境中通過口服暴露于dsrna來攝取dsrna，隨后下調必需基因。auerandfrederick(2009)trendsbiotechnol.27(11):644-51。親代rnai已經(jīng)被用于描述許多昆蟲種類中的胚胎基因的功能，包括跳蟲(springtail)，orchesellacincta(konopovaandakam(2014)evodevo5(1):2)；褐飛虱(nilaparvatalugens)；蕪菁葉蜂(athaliarosae)(yoshiyamaetal.(2013)j.insectphysiol.59(4):400-7)；德國小蠊(blattellagermanica)(piulachsetal.(2010)insectbiochem.mol.biol.40:468-75)；和豌豆蚜(acyrthosiphonpisum)(maoetal.(2013)archinsectbiochemphysiol84(4):209-21)。在所有這些情況下，prnai反應通過將dsrna注射到親代雌性的血腔中來實現(xiàn)。公開本文中公開了用于控制鞘翅目害蟲的核酸分子(例如，靶基因、dna、dsrna、sirna、shrna、mirna、和hprna)及其使用方法，所述鞘翅目害蟲包括，例如，鞘翅目害蟲，諸如玉米根螢葉甲(d.virgiferaleconte)(西方玉米根蟲，“wcr”)；巴氏根螢葉甲(d.barberismithandlawrence,北方玉米根蟲，“ncr”)；十一星根螢葉甲(d.u.howardibarber；南方玉米根蟲，“scr”)；墨西哥玉米根螢葉甲(d.v.zeaekrysanandsmith,墨西哥玉米根蟲，“mcr”)；黃瓜條根螢葉甲(d.balteataleconte)；d.u.tenella；南美葉甲(d.speciosagermar)；和d.u.undecimpunctatamannerheim。在具體的實例中，公開了示例性核酸分子，其與鞘翅目害蟲中的一個或多個天然核酸序列的至少一部分可以同源。在一些實施方案中，通過降低現(xiàn)有世代的產(chǎn)生下一代害蟲的能力來控制鞘翅目害蟲。在某些實例中，將核酸分子遞送給鞘翅目害蟲并不會導致對害蟲的顯著死亡，而是減少由其產(chǎn)生的可存活后代的數(shù)量。在這些和進一步的實例中，天然核酸可以是靶基因，其產(chǎn)物可以，例如但不限于：涉及代謝過程；涉及生殖過程；和/或涉及胚胎和/或幼蟲發(fā)育。在一些實例中，借助于包含與靶基因同源的多核苷酸的核酸分子進行靶基因的表達轉錄后抑制，可導致鞘翅目害蟲的存活力、生長和/或生殖的降低。在具體的實例中，選擇一種hunchback基因作為轉錄后沉默的靶基因。在具體實例中，有用于轉錄后抑制的靶基因是本文稱為葉甲屬(diabrotica)hunchback的新基因(seqidno:1)。因此本文中公開了包含：seqidno:1、seqidno:1的互補物、和/或前述任一者的片段(例如seqidno:3和67)的分離的核酸分子。還公開了包含編碼與靶基因產(chǎn)物內的氨基酸序列(例如hunchback基因的產(chǎn)物)至少約85％相同的多肽的多核苷酸的核酸分子。例如，核酸分子可以包含編碼與seqidno:2(葉甲屬hunchback)和/或葉甲屬hunchback的產(chǎn)物內的氨基酸序列至少85％相同的多肽的多核苷酸。進一步公開了包含編碼這樣的多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸是編碼與靶基因產(chǎn)物內的氨基酸序列至少85％相同的多肽的多核苷酸的反向互補物。還公開了用于產(chǎn)生irna(例如，dsrna、sirna、shrna、mirna、和hprna)分子的cdna多核苷酸，所述irna與鞘翅目害蟲靶基因(例如hunchback基因)的全部或部分互補。在特定的實施方案中，dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna可以在體外產(chǎn)生，或由遺傳修飾的生物(如植物或細菌)在體內產(chǎn)生。在特定的實例中，公開了可用于產(chǎn)生與自葉甲屬hunchback(seqidno:1)轉錄的mrna的全部或部分互補的irna分子。進一步公開了用于抑制鞘翅目害蟲中必需基因的表達的手段、以及用于保護植物不受害于鞘翅目害蟲的手段。用于抑制鞘翅目害蟲中必需基因表達的手段是由選自下組的多核苷酸構成的單鏈或雙鏈rna分子：seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72、以及它們的互補物。用于抑制鞘翅目害蟲中的必需基因表達的手段的功能等同物包括與自包含seqidno:1的wcr基因轉錄的mrna的全部或部分基本上同源的單鏈或雙鏈rna分子。保護植物不受害于鞘翅目害蟲的手段是這樣的dna分子，其包含與啟動子可操作連接的、編碼用于抑制鞘翅目害蟲中的必需基因的表達的手段的多核苷酸，其中所述dna分子能夠整合到玉米植物的基因組中。公開了控制鞘翅目害蟲群體的方法，所述方法包括向鞘翅目害蟲提供irna(例如，dsrna、sirna、shrna、mirna、和hprna)分子，所述irna分子在被所述害蟲攝取之后發(fā)揮作用而抑制該害蟲體內的生物功能，其中所述irna分子包含選自以下的多核苷酸的全部或部分(例如至少15個連續(xù)核苷酸)：seqidno:1；seqidno:1的互補物；seqidno:3；seqidno:3的互補物；seqidno:67；seqidno:67的互補物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1、seqidno:3、和/或seqidno:67的全部或部分的天然編碼多核苷酸；葉甲屬生物的包含seqidno:1、seqidno:3、和/或seqidno:67的全部或部分的天然編碼多核苷酸的互補物；葉甲屬生物轉錄為包含seqidno:1、seqidno:3、和/或seqidno:6全部或部分的天然rna分子的天然非編碼多核苷酸；以及葉甲屬生物轉錄為包含seqidno:1、seqidno:3、和/或seqidno:6全部或部分的天然rna分子的天然非編碼多核苷酸的互補物。在具體實例中，公開了用于控制鞘翅目害蟲的群體的方法，包括對鞘翅目害蟲提供irna(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)分子，所述irna分子一旦被該害蟲攝取則發(fā)揮作用以抑制該害蟲體內的生物學功能，其中該irna分子包含選自下組的多核苷酸：seqidno:70的全部或部分；seqidno:70的全部或部分的互補物；seqidno:71；seqidno:71的互補物；seqidno:73；以及seqidno:73的互補物；與包含seqidno:1、3、和/或67的葉甲屬生物(例如wcr)的天然編碼多核苷酸雜交的多核苷酸；以及與包含seqidno:1、3、和/或67的葉甲屬生物(例如wcr)的天然編碼多核苷酸雜交的多核苷酸的互補物。本文中還公開了方法，其中可將dsrna、mirna、sirna、shrna、和/或hprna在基于餌食的測定中(diet-basedassay)提供給鞘翅目害蟲，或提供在表達dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna的遺傳修飾的植物細胞中。在這些和另外的實例中，dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna可被鞘翅目害蟲攝入。然后，本發(fā)明的dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna的攝入可在該害蟲中導致rnai，進而可導致對于該鞘翅目害蟲的代謝過程、生殖過程、和/或幼蟲發(fā)育必需的基因的沉默。因此，公開了方法，其中給鞘翅目害蟲提供的多核苷酸，所述核酸分子包含可用于對鞘翅目害蟲的親代控制的示例性核酸序列。在特定的實例中，通過使用本發(fā)明的核酸分子控制的鞘翅目害蟲可以是wcr、ncr或scr。在一些實例中，將核酸分子遞送給鞘翅目害蟲并不導致害蟲的顯著死亡，但是可減少由其產(chǎn)生的可存活的后代的數(shù)量。在一些實例中，將核酸分子遞送到鞘翅目害蟲可導致害蟲的顯著死亡，并且還可減少由其產(chǎn)生的可存活的后代的數(shù)量。參考下文結合附圖進行的對若干實施方案的詳細說明，前述的特征以及其他特征將會更加自明。附圖簡述圖1包括用于使用用單一一對引物從單個轉錄模板生成dsrna(圖1a)、以及從兩個轉錄模板生成dsrna(圖1b)的策略的描述。圖2包括對黑腹果蠅，赤擬谷盜和玉米根螢葉甲hunchback蛋白序列的結構域組織的描述。黑腹果蠅、赤擬谷盜和玉米根螢葉甲的hunchback蛋白含有六個c2h2型鋅指，使用smart數(shù)據(jù)庫注釋。圖3包括顯示特定dsrna對wcr產(chǎn)卵和生存力的影響的數(shù)據(jù)的匯總。描繪了每個wcr雌性成蟲產(chǎn)卵的卵數(shù)(圖3a)和孵出的卵的百分比(圖3b)。數(shù)據(jù)是平均值加/減sem。具有相同字母的條棒沒有顯著差異(p>0.05，n＝6)。圖4包括在不同實驗條件下解剖wcr卵以檢查胚胎發(fā)育的代表性照片。用gfpdsrna處理的雌性產(chǎn)的卵(圖4a)顯示正常發(fā)育。用hunchbackdsrna處理的雌性產(chǎn)生的卵(圖4a-4b)顯示不完全胚胎發(fā)育和畸形幼蟲。圖5包括：數(shù)據(jù)匯總，顯示收集自在經(jīng)處理的人工餌食中暴露于dsrna的wcr雌性的卵中hunchback的相對表達；相對于gfp和水對照(圖5a)。還顯示了在經(jīng)處理的人工餌食中暴露于dsrna的雌性成蟲中的hunchback的相對表達，相對于gfp和水對照(圖5b)，在經(jīng)處理的人工餌食中暴露于dsrna的幼蟲中的hunchback的相對表達，相對于gfp和水對照(圖5c)，以及在經(jīng)處理的人工餌食中暴露于dsrna的雄性成蟲中的hunchback的相對表達，相對于gfp和水對照(圖5d)。相同字母的條棒沒有顯著差異(p>0.05；n＝3個生物學重復，每個重復10個卵或幼蟲，以及每個樣品2個技術重復)。圖6包括模型數(shù)據(jù)的匯總，其顯示了prnai效應對從“避難所綴塊”(即，在轉基因作物中未表達殺蟲irna或重組蛋白質的綴塊)羽化的雌性wcr成蟲的影響的相對幅度，當避難所植物表達殺蟲蛋白和親代活性irna時，對殺蟲蛋白(r)和rnai(y)的抗性的等位基因頻率增加速率的影響。圖7包括模型數(shù)據(jù)的匯總，其顯示了prnai效應對從“避難所綴塊”(即，在轉基因作物茬中未表達殺蟲irna或重組蛋白質的綴塊，所述轉基因植物包含對玉米根蟲幼蟲有活性的干擾dsrna以及對玉米根蟲有活性的殺蟲蛋白的組合)出現(xiàn)的雌性wcr成蟲的影響的相對幅度，當非避難所植物所述表達殺蟲蛋白以及對幼蟲活性的irna和對親代活性的irna分子二者時，對殺蟲蛋白(r)和rnai(y)的抗性的等位基因頻率增加速率的影響。圖8a示出了顯示每個雌蟲回收的卵數(shù)量的數(shù)據(jù)的匯總，8b分別顯示了在交配前暴露于0.67μg/μl的hunchback或gfp6次、交配后立即暴露6次、以及在交配后六天暴露6次之后，孵化的幼蟲的占總數(shù)的百分比的結果。比較用dunnett檢驗進行，*表示p<0.1的顯著性，**表示p<0.05的顯著性，***表示p<0.001的顯著性。圖9示出了顯示在交配前暴露于0.67μg/μl的hunchback或gfp6次、交配后立即暴露6次、以及交配后6天暴露6次之后，測量的hunchback相對表達的數(shù)據(jù)的總結。比較用dunnett檢驗進行，**表示p<0.05的顯著性，***表示p<0.001的顯著性。圖10.在玉米根螢葉甲中使用hunchbackdsrna時，暴露持續(xù)時間對prnai應答的影響。用經(jīng)dsrna處理的餌食喂養(yǎng)雌蟲；t表示雌蟲接受dsrna(0.67μg/μl)的次數(shù)，餌食每隔一天提供，持續(xù)12天。10a.產(chǎn)卵：從dsrna喂養(yǎng)的雌蟲收集的卵，在最后一次喂食暴露后收集的卵。10b.孵化百分比：以10a產(chǎn)生的卵的數(shù)目為基礎，孵化的卵數(shù)。10c.對于暴露持續(xù)時間的相對hunchback轉錄物表達。比較用dunnett檢驗進行，*表示p<0.05的顯著性。**表示p<0.001的顯著性。圖11顯示了玉米根螢葉甲雌性中濃度反應的相對hunchback轉錄物。比較用dunnett檢驗進行，**表示p<0.05的顯著性，***表示p<0.001的顯著性。序列表使用如37c.f.r.§1.822規(guī)定的核苷酸堿基的標準字母縮寫，示出了所附序列表中標明的核酸序列。所列出的核酸和氨基酸序列定義了具有以所記載的方式排列的核苷酸和氨基酸單體的分子(即分別為多核苷酸和多肽)。每個列出的核酸和氨基酸序列也定義了包含以所記載的方式排列的核苷酸和氨基酸單體的多核苷酸或多肽的類屬(genus)。鑒于遺傳密碼的冗余，可以理解的是，某個包含編碼序列的核苷酸序列同樣可還描述一個多核苷酸類屬，其中的多核苷酸和由參考序列組成的多核苷酸編碼相同的多肽。還應當理解，某個氨基酸序列可描述編碼該多肽的多核苷酸orf的類屬。對于每個核酸序列僅顯示了一條鏈，僅顯示每個核酸序列的一條鏈，任何對所展示的鏈的提述應理解為包括對互補鏈。由于一級核酸序列的互補序列和反向互補序列必然被該一級序列所公開，所以對核酸序列的任何提述也包括核酸序列的互補序列和反向互補序列，但另有明確說明或者從該序列出現(xiàn)的上下文可以明確看出并非如此的除外。此外，如本領域所知，rna鏈的核苷酸序列決定于轉錄該rna的dna的序列(除了胸腺嘧啶(t)被尿嘧啶(u)核堿基替換之外)，對于某個rna序列而言，任何對編碼它的dna序列的提述也包括了該序列。在所附序列表中：seqidno:1顯示一個重疊群，其包含來自一個示例性的葉甲屬hunchbackdna：gttagatagtggtggtcacatgacattgttatcagtgattttaatacgtgtttttgaggaatgaaaataatagttggattatttctaatacagactttgattcttaccgtgaaatgagaggaggtgtttctgacgatatgacttcaacttgcgttcaaggaggaattagaccaattggacgatatcaaccaaacatgcttatggaaccatcgtctcctcaatctgcctggcagtttcacccagccatgccgaaacgagaacccgtcgatcatgatggcagaaatgactccggcttagcatctggaggtgaatttatttcatcttcaccaggaagtgacaatagtgaacacttcagcgcttcctattcatctccaaccagttgccatacagtaatttctactaatacttattatcccaccaatctaagaagaccttcacaggcgcagacgagtattccaacgcacatgatgtacaccggcgatcacaaccccttaactcccccgaattcggaacctatgatttcgcccaaaagcgtgttatcaagaaacaacgaaggtgaacatcaaactactctgacgccttgtgcgtctcctgaggatgcttctgttgatgctacagacagcgttaattgcgacggtgctttaaaaaaattacaagcgacttttgaaaaaaatgcttttagtgaaggttctggggatgacgataccaaatctgatggagaggcagaagaatacgacgaacaaggactaagagttccaaaagttaactctcatggaaaaattaaaactttcaagtgtaagcaatgtgattttgtggccattactaaactagtcttctgggaacataccaagttacatattaaagctgacaaactccttaaatgccccaagtgtccttttgtcaccgaatataagcaccatttagaatatcaccttagaaatcattatggttcaaaaccatttaaatgtaaccagtgtagttactcttgtgtaaacaaatcaatgcttaattcacatttaaaatctcactctaatatttaccaataccgctgttctgactgcagttatgccacaaaatattgtcattcgctgaaattgcatcttagaaaatactcgcacaaacctgctatggtactaaacccagatggaacaccaaatccgttgcccataatcgatgtttatggtacaaggagaggaccaaagatgaagtcagaacaaaaatcatctgaggaaatgtctccgaaacccgaacaagttctaccattcccatttaaccagtttctaccccaaatgcagttaccattcccaggatttccattatttggaggttttccaggtggcattccaaatcctttgttattgcaaaacttggaaaaactagcccgagaaaggcgtgaatccatgaactcttcagaacgtttttctcccgcacaatcagaacaaatggataccgatgcaggcgttcttgatctcagtaaaccagatgactcttcccagacaaaccgacgaaaagattcagcttacaaactttcaactggtgataattcttcagatgaagaagacgatgaggcaactacaacaatgttcggtaatgttgaagttgttgaaaataaagaactagaagatacttcatcggggaaacagacaccaactagtgctaaaaaggatgactactcgtgccaatactgtcagataaatttcggggaccccgttttgtatactatgcatatgggttaccacggatacaagaatccatttatttgcaacatgtgcggtgaggaatgtaatgataaagtgtctttcttcttgcacattgcacgaaatcctcattcttaaaaatatcaataagactgaattcaaggttagcatttttatatattatattcacactgaaacttttttaatattcaatatttggttgcgtaacatttacgcatatctatactttatttcacgseqidno:2顯示由示例性的葉甲屬hunchbackdna編碼的葉甲屬hunchback多肽的氨基酸序列：mrggvsddmtstcvqggirpigryqpnmlmepsspqsawqfhpampkrepvdhdgrndsglasggefissspgsdnsehfsasyssptschtvistntyyptnlrrpsqaqtsipthmmytgdhnpltppnsepmispksvlsrnnegehqttltpcaspedasvdatdsvncdgalkklqatfeknafsegsgdddtksdgeaeeydeqglrvpkvnshgkiktfkckqcdfvaitklvfwehtklhikadkllkcpkcpfvteykhhleyhlrnhygskpfkcnqcsyscvnksmlnshlkshsniyqyrcsdcsyatkychslklhlrkyshkpamvlnpdgtpnplpiidvygtrrgpkmkseqksseemspkpeqvlpfpfnqflpqmqlpfpgfplfggfpggipnplllqnleklarerresmnsserfspaqseqmdtdagvldlskpddssqtnrrkdsayklstgdnssdeeddeatttmfgnvevvenkeledtssgkqtptsakkddyscqycqinfgdpvlytmhmgyhgyknpficnmcgeecndkvsfflhiarnphsseqidno:3顯示示例性的葉甲屬hunchbackdna，在本文中一些地方稱為hunchbackreg1，其在某些實施例中用于產(chǎn)生dsrna：aagtgtaagcaatgtgattttgtggccattactaaactagtcttctgggaacataccaagttacatattaaagctgacaaactccttaaatgccccaagtgtccttttgtcaccgaatataagcaccatttagaatatcaccttagaaatcattatggttcaaaaccatttaaatgtaaccagtgtagttactcttgtgtaaacaaatcaatgcttaattcacatttaaaatctcactctaatatttaccaataccgctgttctgactgcagttatgccacaaaatattgtcattcgctgaaattgcatcttagaaaatactcgcacaaacctgctatggtactaaacccagatggaacaccaaatccgttgcccataatcgatgtttatggtacaaggagaggseqidno:4顯示t7噬菌體啟動子的核苷酸序列。seqidno:5-8顯示用于擴增葉甲屬hunchback基因或gfp基因的基因區(qū)的引物(包括所有引物都有的t7啟動子taatacgactcactataggg)。seqidno:9顯示gfp基因。seqidno:10顯示示例性的yfp基因。seqidno:11顯示膜聯(lián)蛋白區(qū)域1的dna序列。seqidno:12顯示膜聯(lián)蛋白區(qū)域2的dna序列。seqidno:13顯示β血影蛋白2區(qū)域1的dna序列。seqidno:14顯示β血影蛋白2區(qū)域2的dna序列。seqidno:15顯示mtrp-l4區(qū)域1的dna序列。seqidno:16顯示mtrp-l4區(qū)域2的dna序列。seqidno:17-44顯示用于擴增膜聯(lián)蛋白、β血影蛋白2、mtrp-l4、以及yfp的基因區(qū)用于dsrna合成的引物。seqidno:45顯示包含st-ls1內含子的示例性dna。seqidno:46顯示編碼葉甲屬hunchbackv1發(fā)夾形成rna的示例性dna；其含有有義多核苷酸、包含內含子(加有下劃線)的環(huán)多核苷酸、以及反義多核苷酸(粗體)：caataccgctgttctgactgcagttatgccacaaaatattgtcattcgctgaaattgcatcttagaaaatactcgcacaaacctgctatggtactaaacccagatggaacaccaaatccgttgcccataatcgatgtttatggtacaaggagaggagactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttaseqidno:47顯示t20vn引物寡核苷酸的核苷酸序列。seqidno:48-52顯示用于dsrna轉錄物表達分析的引物和探針。seqidno:53顯示了用于二元載體骨架檢測的specr編碼區(qū)的一部分的核苷酸序列。seqidno:54顯示用于基因組拷貝數(shù)分析的aad1編碼區(qū)的核苷酸序列。seqidno:55-66顯示用于基因拷貝數(shù)確定和二元載體骨架檢測的dna寡核苷酸的核苷酸序列。seqidno:67顯示了在一些實例中用于產(chǎn)生dsrna的示例性葉甲屬hunchback(v1)dna：caataccgctgttctgactgcagttatgccacaaaatattgtcattcgctgaaattgcatcttagaaaatactcgcacaaacctgctatggtactaaacccagatggaacaccaaatccgttgcccataatcgatgtttatggtacaaggagaggaseqidno:68和69顯示了在一些實例中用于產(chǎn)生dsrna的hunchbackv1序列的pcr擴增的引物。seqidno:70-73顯示了從包含示例性的hunchback多核苷酸及其片段的核酸轉錄的示例性rna。用于實施發(fā)明的模式i.若干實施方案的概覽我們開發(fā)了rna干擾(rnai)作為昆蟲害蟲管理的工具，使用表達dsrna的轉基因植物的最有可能的靶標害蟲物種之一：西方玉米根蟲。到目前為止，大多數(shù)被建議用作根蟲幼蟲rnai靶標的基因沒有達到其目的，而已鑒定的有用靶標涉及到在幼蟲期致死的靶標。在這里，我們描述了在西方玉米根蟲中rnai介導的hunchback(hb)的敲低，據(jù)顯示，例如，當通過提供給成年雌性hunchbackdsrna而遞送irna分子時，hunchback的敲低可破壞胚胎發(fā)育。當hunchbackdsrna通過口服施用給雌性成蟲時，雌性成蟲與hunchbackdsrna的接觸不影響成蟲的壽命。然而，從暴露于hunchbackdsrna的雌性收集的卵幾乎完全沒有孵化。在本文的實施方案中，通過喂養(yǎng)成年昆蟲遞送hunchbackdsrna的能力賦予對昆蟲(例如鞘翅目)害蟲管理非常有用的prnai效應。此外，影響幼蟲和成蟲根蟲的多個目標序列的潛力可能會增加開發(fā)涉及rnai技術的可持續(xù)的昆蟲害蟲管理途徑的機會。本文中公開了用于遺傳控制鞘翅目害蟲侵染的方法和組合物。還提供了用于鑒定對于鞘翅目害蟲的生命周期必需的一個或多個基因(例如對正常的生殖能力和/或胚胎和/或幼蟲發(fā)育而言必需的基因)，作為靶基因用于rnai介導的鞘翅目害蟲群體控制的方法。可設計編碼rna分子的dna質粒載體來抑制生長、存活、發(fā)育、和/或生殖所必需的靶基因。在一些實施方案中，所述rna分子可能能夠形成dsrna分子。在一些實施方案中，提供了通過與昆蟲害蟲中靶基因的編碼或非編碼序列互補的核酸分子來轉錄后阻抑靶基因表達或抑制靶基因的方法。在這些和另外的實施方案中，鞘翅目害蟲可以攝取一種或多種從與靶基因的編碼或非編碼序列互補的核酸分子的全部或部分轉錄的dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna分子，由此提供植物保護效果。一些實施方案涉及使用與靶基因的編碼和/或非編碼序列互補的dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna)對靶基因產(chǎn)物的表達進行序列特異性抑制，以實現(xiàn)對鞘翅目害蟲的至少部分控制。公開了一組分離純化的核酸分子，其包含，例如，如seqidno:1列出的多核苷酸及其片段。在一些實施方案中，可以從這些多核苷酸、其片段、或包含這些多核苷酸中一種或多種的基因表達穩(wěn)定化的dsrna分子，用于靶基因的轉錄后沉默或抑制。在某些實施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:1；3；和67的全部或部分。其他實施方案涉及在其基因組中具有編碼至少一種irna(例如，dsrna)分子的至少一種重組dna的重組宿主細胞(例如，植物細胞)。在特定的實施方案中，dsrna分子可以在被鞘翅目害蟲攝取時產(chǎn)生，使該害蟲或該害蟲的后代中的靶基因發(fā)生轉錄后沉默或抑制其表達。重組dna可以包含，例如：seqidno:1、3和67中任一者；seqidno:1、3和67中任一者的片段；由包含seqidno:1、3和67中一者的基因的部分序列組成的多核苷酸；和/或其互補物。一些實施方案涉及重組宿主細胞，所述細胞在其基因組中具有重組dna，所述重組dna具有編碼至少一種irna(例如，dsrna)分子，所述irna分子包含seqidno:70的全部或部分(例如，選自seqidno:70-73的至少一個多核苷酸)。當被鞘翅目害蟲攝入時，irna分子可以在該害蟲或該害蟲的后代中沉默或抑制靶hunchback基因(例如包含選自seqidno:1、3、67的多核苷酸的全部或部分的dna)的表達，從而導致該害蟲的生殖的停止，和/或該害蟲的后代中生長、發(fā)育和/或進食停止。在其他實施方案中，在其基因組中具有編碼至少一種能夠形成dsrna分子的rna分子的至少一種重組dna的重組宿主細胞可以是轉化的植物細胞。一些實施方案涉及包含這樣的轉化的植物細胞的轉基因植物。除了這樣的轉基因植物之外，還提供了任何轉基因植物世代的后代植物、轉基因種子、和轉基因植物產(chǎn)品，它們均包含重組dna。在特定的實施方案中，可以在轉基因植物細胞中表達能夠形成dsrna分子的rna分子。因此，在這些和其他實施方案中，可以從轉基因植物細胞分離dsrna分子。在特定的實施方案中，轉基因植物是選自下組的植物，包括：玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、棉花、和禾本科(poaceae)的植物。一些實施方案涉及用于調控鞘翅目害蟲細胞中靶基因表達的方法。在這些和其他實施方案中，可以提供核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸。在特定的實施方案中，編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸可與啟動子可操作連接，并且還可與轉錄終止序列可操作連接。在特定的實施方案中，用于調控鞘翅目害蟲細胞中靶基因表達的方法可包括：(a)用包含編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸的載體轉化植物細胞；(b)在足以容許形成包含多個轉化的植物細胞的植物細胞培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)所述轉化的植物細胞；(c)選擇已將載體整合到其基因組中的轉化的植物細胞；和(d)確定選擇的轉化的植物細胞包含由載體的所述多核苷酸序列編碼的、能夠形成dsrna分子的rna分子?？梢詮幕蚪M中整合有載體、且包含由載體的所述多核苷酸編碼的dsrna分子的植物細胞再生植物。還公開了在其基因組中整合有載體的轉基因植物，所述載體具有編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸，其中轉基因植物包含由所述載體的所述多核苷酸編碼的dsrna分子。在特定的實施方案中，植物中能夠形成dsrna分子的rna分子的表達足以調控接觸了所述轉化的植物或植物細胞(例如通過以轉化的植物、植物的一部分(例如，根)或植物細胞為食)的鞘翅目害蟲細胞中、或者接觸了經(jīng)轉化的植物或植物細胞的鞘翅目害蟲的后代(例如通過親代傳播)的細胞中靶基因的表達，使得害蟲的生殖被抑制。本文中公開的轉基因植物可以展現(xiàn)出對鞘翅目害蟲侵染的耐受性和/或保護作用。特定的轉基因植物可以展現(xiàn)出對一種或多種選自下組的鞘翅目害蟲的保護作用和/或增強的保護作用：wcr、ncr、scr、mcr、玉米根螢葉甲、d.u.tenella、南美葉甲、和d.u.undecimpunctatamannerheim。本文中還公開了用于將控制劑(如irna分子等)投送給鞘翅目害蟲的方法。這樣的控制劑可以直接或間接地阻礙鞘翅目害蟲群體進食、生長或以其他方式致害宿主的能力。在一些實施方案中，提供了這樣的方法，包括將穩(wěn)定化的dsrna分子遞送至鞘翅目害蟲以抑制該害蟲或其后代中的至少一種靶基因，從而導致親代rnai并減少或消除害蟲宿主中的植物損害。在一些實施方案中，抑制鞘翅目害蟲中靶基因表達的方法可以導致害蟲中生殖的停止、和/或害蟲的后代中生長、發(fā)育、和/或進食的停止。在一些實施方案中，該方法可以顯著減少侵染中后續(xù)的害蟲世代的大小，而不直接導致與irna分子接觸的害蟲的死亡。在一些實施方案中，該方法可以顯著減少侵染中后續(xù)的害蟲世代的大小，同時也導致接觸irna分子的害蟲的死亡。在一些實施方案中，提供了包含irna(例如，dsrna)分子的組合物(例如，局部用組合物)，供用于植物、動物、和/或植物或動物的環(huán)境以消除或降低鞘翅目害蟲的侵染。在一些實施方案中，提供了包含原核生物的組合物，所述原核生物包含編碼irna分子的dna；例如，轉化的細菌細胞。在具體實例中，這種轉化的細菌細胞可以用作常規(guī)的農(nóng)藥制劑。在特定的實施方案中，組合物可以是要喂給鞘翅目害蟲的營養(yǎng)組合物或資源，或食物來源。一些實施方案包括使害蟲可得到所述營養(yǎng)組合物或食物來源。包含irna分子的組合物的攝入可導致所述分子被鞘翅目害蟲的一個或多個細胞攝取，進而可導致害蟲或其后代的細胞中至少一種靶基因表達的抑制。通過在害蟲的宿主中提供一種或多種包含irna分子的組合物，可以在任何存在鞘翅目害蟲的宿主組織或環(huán)境之中或之上限制或消除該害蟲侵染對植物或植物細胞的攝入或損傷。本文中公開的組合物和方法可與針對其他用于控制鞘翅目害蟲所示損害的方法和組合物聯(lián)用。例如，本文中所描述的用于針對鞘翅目害蟲保護植物的irna分子可以在這樣的方法中使用，所述方法包括另外使用一種或多種針對鞘翅目害蟲有效的化學劑、針對這樣的害蟲有效的生物殺蟲劑、作物輪作、展現(xiàn)出與rnai介導的方法和rnai組合物的特征不同的特征(例如，在植物中重組產(chǎn)生對于鞘翅目害蟲有害的蛋白質(例如，bt毒素))的重組遺傳技術、和/或重組表達非親代irna分子(例如可導致攝取該irna分子的鞘翅目害蟲中生長、發(fā)育和/或進食停止的致命性irna分子)。ii.縮寫dsrna雙鏈核糖核酸gi生長抑制gfp綠色熒光蛋白ncbi美國國家生物技術信息中心gdna基因組脫氧核糖核酸irna抑制性核糖核酸orf開放閱讀框rnai核糖核酸干擾mirna微小核糖核酸sirna小抑制性核糖核酸hprna發(fā)夾核糖核酸shrna短發(fā)夾核糖核酸prnai親代rna干擾utr非翻譯區(qū)wcr西方玉米根蟲(玉米根螢葉甲)ncr北方玉米根蟲(巴氏根螢葉甲)mcr墨西哥玉米根蟲(墨西哥玉米根螢葉甲)pcr聚合酶鏈式反應qpcr定量聚合酶鏈式反應riscrna誘導的沉默復合物rh相對濕度scr南方玉米根蟲(十一星根螢葉甲)sem均值標準誤snrna小細胞核核糖核酸yfp綠色熒光蛋白iii.術語在以下描述和表中，使用了許多術語。為了提供對說明書和權利要求書的清楚且一致的理解，包括要賦予此類術語的范圍，提供了以下定義：鞘翅目害蟲：如本文中使用的，術語“鞘翅目害蟲”指以農(nóng)業(yè)作物和作物產(chǎn)品，包括玉米和其它真正的禾本科為食的、屬于鞘翅目(coleoptera)的害蟲昆蟲，包括屬于葉甲屬的害蟲。在具體的例子中，鞘翅目害蟲選自下列清單，包括：玉米根螢葉甲(wcr)；巴氏根螢葉甲(ncr)；十一星根螢葉甲(scr)；墨西哥玉米根螢葉甲(mcr)；黃瓜條根螢葉甲；d.u.tenella；和d.u.undecimpunctatamannerheim。(與生物)接觸：如本文中使用的，與生物(例如，鞘翅目害蟲)“接觸”或被生物“攝取”等術語，就核酸分子而言，包括核酸分子內化到生物中，例如但不限于：生物攝取分子(例如，通過進食)；使生物與包含核酸分子的組合物接觸；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物。重疊群：如本文中使用的，術語“重疊群”指從一組來源于單一遺傳來源的重疊dna區(qū)段重建的dna序列。玉米植物：如本文中使用的，術語“玉米植物”指物種玉蜀黍(玉米)的植物。術語“玉米植物”和“玉蜀黍”在本文中可互換使用。表達：如本文中使用的，編碼多核苷酸(例如，基因或轉基因)的“表達”是指這樣的過程，通過該過程，核酸轉錄單元(包括，例如gdna或cdna)的編碼信息被轉化為細胞的操作部分、非操作部分、或結構部分(常常包括蛋白質的合成)。基因表達可能受到外部信號的影響，例如細胞、組織、或生物暴露于增加或降低基因表達的物質?；虮磉_也可以在從dna到rna再到蛋白質的途徑中的任何位置受到調節(jié)。例如，通過控制對轉錄、翻譯、rna運輸和加工、中間分子比如mrna的降解的作用，或通過在特異性蛋白分子已經(jīng)產(chǎn)生之后的活化、失活、區(qū)室化、或降解，或它們的組合，由此發(fā)生基因表達的調節(jié)。通過本領域已知的任何方法，包括但不限于，northern印跡、rt-pcr、western印跡，或體外、原位或體內蛋白活性測定，可以在rna水平或蛋白質水平測量基因表達。遺傳物質：如本文中使用的，術語“遺傳物質”包括所有基因和核酸分子，諸如dna和rna。抑制：如本文中使用的，術語“抑制”在用于描述對編碼多核苷酸(例如基因)的影響時是指從編碼多核苷酸轉錄的mrna和/或編碼多核苷酸的肽、多肽、或蛋白質產(chǎn)物的細胞水平的可測量的降低。在一些實例中，抑制編碼多核苷酸的表達可以使得表達大致消失?！疤禺愋砸种啤笔侵冈趯崿F(xiàn)特異性抑制的細胞中對靶編碼多核苷酸的抑制不對其他編碼多核苷酸(例如，基因)的表達產(chǎn)生影響。分離的：“分離的”生物學組分(諸如核酸、肽或蛋白質)是已經(jīng)從該組分所天然存在的生物細胞中的其他生物學組分(即，其他染色體和染色體外的dna和rna、和蛋白質)實質性分開、分開產(chǎn)生、或純化出來，同時實現(xiàn)組分中的化學或功能變化(例如，核酸可以通過斷開將核酸連接到染色體中的其余dna的化學鍵而從染色體分離)。已經(jīng)“分離的”核酸分子和蛋白質包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白質。該術語還包括通過在宿主細胞內重組表達制備的核酸分子和蛋白質，以及化學合成的核酸分子、蛋白質和肽。核酸分子：如本文中使用的，術語“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物形式，可包括rna、cdna、gdna的有義和反義鏈，以及上述情形的合成形式和混合聚合物。核苷酸或核堿基可以是指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或這兩種類型核苷酸的任一者的修飾形式。如本文中使用的“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義詞。除非另外指明，核酸分子通常在長度上具有至少10個堿基。根據(jù)慣例，核酸分子的核苷酸序列從分子的5’至3’端閱讀。核酸分子的“互補物”(即互補序列)是指具有可以與該核酸分子的核堿基形成堿基對(即，a-t/u，和g-c)的核堿基的多核苷酸。一些實施方案包括包含轉錄為rna分子的模板dna的核酸，所述rna分子是mrna分子的互補序列。在這些實施方案中，轉錄為mrna分子的核酸的互補物以5'至3'方向存在，使得rna聚合酶(其以5'至3'方向轉錄dna)將從互補物轉錄出可以與mrna分子雜交的核酸。因此，除非另有明確說明或者從上下文中可以清楚地看出另有所指，術語“互補物”是指具有可以與特定核苷酸序列的核堿基形成堿基對的從5'至3'的核堿基的多核苷酸。類似地，除非另有明確說明或者從上下文中可以清楚地看出另有所指，核酸的“反向互補物”是指相反取向的互補物。前述內容在以下圖示中示出：atgatgatg多核苷酸t(yī)actactac該多核苷酸的“互補物”catcatcat該多核苷酸的“反向互補物”本發(fā)明的一些實施方案可包括形成發(fā)夾rna的rnai分子。在這些rnai分子中，rna干擾的靶核酸的互補物和反向互補物可以出現(xiàn)在同一分子中，使得單鏈rna分子在包含互補和反向互補的多核苷酸的區(qū)域上可以“回折”并與自身雜交。“核酸分子”包括所有多核苷酸，例如：dna的單鏈和雙鏈形式；rna的單鏈形式；和rna的雙鏈形式(dsrna)。術語“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作為個別單鏈或在雙鏈體中的核酸有義和反義鏈兩者。術語“核糖核酸”(rna)包括irna(抑制性rna)、dsrna(雙鏈rna)、sirna(小干擾rna)、shrna(小發(fā)夾rna)、mrna(信使rna)、mirna(微小rna)、hprna(發(fā)夾rna)、trna(轉運rna)(無論是裝載還是卸下相應的酰化氨基酸)、和crna(互補rna)。術語“脫氧核糖核酸”(dna)包括cdna、gdna、和dna-rna雜交體。術語“多核苷酸”、“核酸”、及其“片段”，如本領域技術人員將理解的，是包括gdna、核糖體rna、轉運rna、信使rna、操縱子、和較小的工程化多核苷酸的術語，其編碼或可適用于編碼肽、多肽、或蛋白質。寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通過切割較長核酸區(qū)段、或通過使單獨的核苷酸前體聚合而形成。自動合成儀能夠合成長度多達幾百個堿基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可與互補的核酸結合，因此它們可用作檢測dna或rna的探針。由dna(寡脫氧核糖核苷酸)組成的寡核苷酸可以用于pcr，pcr是一種用于擴增dna的技術。在pcr中，寡核苷酸一般被稱為“引物”，其允許dna聚合酶延伸寡核苷酸并復制互補鏈。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修飾核苷酸，它們通過天然存在和/或非天然存在的核苷酸連接而連接在一起。本領域技術人員易于理解，核酸分子可被化學修飾或生物化學修飾，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸堿基。這些修飾包括，例如，標記物、甲基化、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾(例如，如不帶電連接(unchargedlinkage)的修飾：例如甲基膦酸鹽、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；帶電連接(chargedlinkage)的修飾：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；懸垂部分的修飾：例如肽類；嵌入劑修飾：例如吖啶、補骨脂素等；螯合劑修飾；烷化劑(alkylator)修飾；和修飾的連接：例如α異頭核酸等)。術語“核酸分子”還包括任何拓撲結構，包括單鏈的、雙鏈的、部分雙鏈體的、三鏈體的、發(fā)夾形的(hairpinned)、圓形的、掛鎖形的結構。如本文中使用的，就dna而言，術語“編碼多核苷酸”、“結構多核苷酸”、或“結構核酸分子”是指這樣的多核苷酸，當被置于適當?shù)恼{節(jié)元件控制下時，其通過轉錄和mrna最終翻譯成多肽。就rna而言，術語“編碼多核苷酸”指翻譯成肽、多肽或蛋白質的多核苷酸。編碼多核苷酸的邊界由5’端的翻譯起始密碼子和3’端的翻譯終止密碼子所界定。編碼多核苷酸包括但不限于：gdna；cdna；est；和重組多核苷酸。如本文所用的，“轉錄的非編碼多核苷酸”是指mrna分子的區(qū)段，例如不被翻譯成肽、多肽或蛋白質的5'utr、3'utr和內含子片段。此外，“轉錄的非編碼多核苷酸”是指轉錄成在細胞中起作用的rna的核酸，例如結構rna(例如，核糖體rna(rrna)，其實例有5srrna、5.8srrna、16srrna、18srrna、23srrna和28srrna等)；轉運rna(trna)；和snrna諸如u4，u5，u6等。轉錄的非編碼多核苷酸還包括例如但不限于小rna(srna)，該術語通常用于描述小細菌非編碼rna；小核仁rna(snorna)；微rna；小干擾rna(sirna)；piwi相互作用rna(pirna)；和長非編碼rna。此外，“轉錄的非編碼多核苷酸”是指可以在核酸中作為基因內“接頭”本身存在并且被轉錄成rna分子的多核苷酸。致死性rna干擾：如本文所用的，術語“致死性rna干擾”是指可導致受試者個體死亡或存活力降低的rna干擾，所述受試者個體被遞送了例如dsrna，mirna，sirna，shrna和/或hprna。親代rna干擾：如本文所用，術語“親代rna干擾”(prnai)是指可以在受試者(例如，鞘翅目害蟲)的后代中觀察到的rna干擾表型，所述受試者個體被遞送了例如dsrna、mirna、sirna、shrna和/或hprna。在一些實施方案中，prnai包括將dsrna遞送至鞘翅目昆蟲，其中該害蟲產(chǎn)生可存活后代的能力由此被降低。啟動prnai的核酸可以增加，也可以不增加被遞送了該核酸的群體中的死亡發(fā)生率。在某些實例中，啟動prnai的核酸不增加被遞送了該核酸的群體中的死亡發(fā)生率。例如，某個鞘翅目害蟲群體可以被飼以一種或多種啟動prnai的核酸，其中這些害蟲存活并交配，但其產(chǎn)生的卵比未被飼以所述核酸的相同物種的害蟲所產(chǎn)的卵相比，孵化出可存活的后代的能力較低。在prnai的一種機制中，遞送到雌性的親代rnai能夠敲除雌性后代胚胎中的合子基因表達。bucheretal.(2002)curr.biol.12(3):r85-6?；蚪M：如本文中所使用的，術語“基因組”是指存在于細胞核內的染色體dna，并且也指存在于細胞的亞細胞組成部分內的細胞器dna。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以將dna分子導入植物細胞中，使得dna分子整合到植物細胞的基因組中。在這些和另外的實施方案中，dna分子可以整合到植物細胞的核dna中，或整合到植物細胞的葉綠體或線粒體的dna中。術語“基因組”在其應用于細菌時，指細菌細胞內的染色體和質粒兩者。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以將dna分子導入細菌中，使得dna分子整合到細菌的基因組中。在這些和另外的實施方案中，dna分子可以整合于染色體，或者作為穩(wěn)定的質粒定位或位于穩(wěn)定的質粒中。序列同一性：如本文中使用的術語“序列同一性”或“同一性”，在兩個多核苷酸或多肽的情況下，是指在指定比較窗口上以最大對應性比對時，這兩個分子的序列中相同的殘基。如本文中使用的，術語“序列同一性百分比”可以是指通過在比較窗口上比較分子的兩個最優(yōu)比對序列(例如，核酸序列或多肽序列)確定的值，其中為了實現(xiàn)這兩個序列的最優(yōu)比對，該比較窗口中的序列部分相比于參考序列(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。通過確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核苷酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)目而產(chǎn)生匹配位置數(shù)，用該匹配位置數(shù)除以比較窗口中位置的總數(shù)，將結果乘以100而產(chǎn)生序列同一性的百分比，從而計算出該百分比。每個位置與參考序列相比均相同的序列被認為是與參考序列是100％相同的，反之亦然。用于比較的序列比對方法是本領域技術人員熟知的。各種程序和比對算法例如描述于smith和waterman(1981)adv.appl.math.2:482；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444；higgins和sharp(1988)gene73:237-44；higgins和sharp(1989)cabios5:151-153；corpet等人，(1988)nucleicacidsres.16:10881-90；huang等人，(1992)comp.appl.biosci.8:155-65；pearson等人，(1994)methodsmol.biol.24:307-31；tatiana等人(1999)femsmicrobiol.lett.174:247-50。序列比對方法和同源性計算的詳細考慮事項可見于例如，altschul等人，(1990)j.mol.biol.215:403-10。美國國家生物技術信息中心(ncbi)基本局部比對搜索工具(blasttm；altschul等人(1990))可在幾個來源訪問，包括美國國家生物技術信息中心(bethesda,md)、以及在互聯(lián)網(wǎng)上，其與幾種序列分析程序結合使用。怎樣使用該程序確定序列同一性的描述可在互聯(lián)網(wǎng)上blasttm的“幫助”部分獲得。為了比較核酸序列，可以采用利用默認參數(shù)的默認blosum62矩陣集的blasttm(blastn)程序的“blast2序列”函數(shù)。在用這種方法評估時，與參考多核苷酸的序列具有較大序列相似性的核酸將顯示出同一性百分比的增加?？商禺愋噪s交/特異性互補：如本文中使用的，術語“可特異性雜交”和“特異性互補”是表明互補性的足夠程度的術語，該互補性足以使得在核酸分子與靶核酸分子之間發(fā)生穩(wěn)定且特異的結合。在兩個核酸分子之間的雜交兩種涉及核酸分子的核堿基之間的反平行比對的形成。然后，兩個分子能夠與相反鏈上的相應堿基形成氫鍵以形成雙鏈體分子，如果該雙鏈體分子足夠穩(wěn)定，則可使用本領域中熟知的方法檢出。多核苷酸與其可特異性雜交的靶核酸不一定是100％互補的。然而，對于特異性雜交而言必須存在的序列互補性的量依賴所使用的雜交條件而變化。導致特定嚴格程度的雜交條件會根據(jù)選擇的雜交方法的性質和雜交的核酸的組成和長度而變化。通常，雜交的溫度和雜交緩沖液的離子強度(尤其是na+和/或mg++濃度)將決定雜交嚴格性，雖然洗滌次數(shù)也會影響嚴格性。關于獲得特定嚴格性程度所需要的雜交條件的計算是本領域普通技術人員已知的，并且論述于例如sambrook等人(編輯)molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,vol.1-3,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,1989,chapters9and11；以及hames和higgins(編輯)nucleicacidhybridization,irlpress,oxford,1985。關于核酸雜交的進一步詳細說明和指導例如可見于tijssen,"overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,"inlaboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobes,parti,chapter2,elsevier,ny,1993；以及ausubel等人編輯，currentprotocolsinmolecularbiology,chapter2,greenepublishingandwiley-interscience,ny,1995。如本文中使用的，“嚴格條件”涵蓋僅在雜交分子的序列與靶核酸分子內的同源多核苷酸之間存在的錯配小于20％時才發(fā)生雜交的條件?！皣栏駰l件”包括另外的特定嚴格性水平。因此，如本文中使用的，“中等嚴格性”條件為具有超過20％的以上序列錯配的分子將不會雜交的條件；“高嚴格性”條件為具有超過10％的錯配的序列將不會雜交的條件；并且“極高嚴格性”條件為具有超過5％的錯配的序列將不會雜交的條件。以下是代表性的非限制性雜交條件：高嚴格性條件(檢測出共享至少90％序列同一性的多核苷酸)：在5xssc緩沖液中在65℃雜交16小時；在2xssc緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次15分鐘；并且在0.5xssc緩沖液中在65℃洗滌兩次，每次20分鐘。中等嚴格性條件(檢測出共享至少80％序列同一性的多核苷酸)：在5x到6xssc緩沖液中在65--70℃雜交16-20小時；在2xssc緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次5-20分鐘；并且在1xssc緩沖液中在55-70℃洗滌兩次，每次30分鐘。非嚴格對照條件(共享至少50％序列同一性的多核苷酸會雜交)：在6xssc緩沖液中在室溫到55℃雜交16-20小時；在2x到3xssc緩沖液中在室溫到55℃洗滌至少兩次，每次20-30分鐘。如本文中使用的，術語“基本上同源”或“實質同源性”就核酸而言是指具有這樣的連續(xù)核堿基的多核苷酸，所述連續(xù)核堿基在嚴格條件下與參考核酸雜交。例如，與seqidno:1、3、46和67中任一個的參考核酸序列基本上同源的序列的核酸是在嚴格條件(例如，上文列出的中等嚴格性條件)下與seqidno:1、3、46和67中任一個的參考核酸雜交的那些核酸。基本上同源的多核苷酸可以具有至少80％序列同一性。例如，基本上同源的多核苷酸可以具有約80％到100％序列同一性，諸如約79％；80％；約81％；約82％；約83％；約84％；約85％；約86％；約87％；約88％；約89％；約90％；約91％；約92％；約93％；約94％；約95％；約96％；約97％；約98％；約98.5％；約99％；約99.5％；和約100％。實質性同源性的特性與特異性雜交緊密相關。例如，當存在足夠的互補程度時，核酸分子可特異性地雜交，以便避免核酸在特異性結合是期望的情況下(例如，在嚴格雜交條件下)與非靶多核苷酸的非特異性結合。如本文中使用的，術語“直系同源物”是指兩種或更多種物種中已經(jīng)從共同的祖先核酸進化并且可以在所述兩種或更多種物種中保留相同功能的基因。如本文中使用的，當一個多核苷酸以5’至3’方向閱讀的每個核苷酸與另一多核苷酸以3’至5’方向閱讀時的每個核苷酸序列互補時，兩個核酸分子被認為展現(xiàn)出“完全互補性”。與參考多核苷酸互補的多核苷酸將展現(xiàn)出與參考多核苷酸的反向互補物相同的序列。這些術語和描述是本領域中定義明確的，并且是本領域普通技術人員容易理解的。可操作(地)連接：當?shù)谝欢嗪塑账崤c第二多核苷酸處于功能性關系中時，則第一多核苷酸與第二多核苷酸是可操作連接的。當以重組方式產(chǎn)生時，可操作連接的多核苷酸通常是連續(xù)的，并且在需要將兩個蛋白質編碼區(qū)連接在一起的場合，二者在同一個閱讀框內(例如，在翻譯融合的orf中)。然而，可操作連接的核酸不一定是連續(xù)的。在有關調節(jié)性遺傳元件和編碼多核苷酸的語境下使用時，術語“可操作連接”意味著該調節(jié)元件影響該連接的編碼序列的表達?！罢{節(jié)元件”或“控制元件”是指影響轉錄的周期和水平/量、rna加工或穩(wěn)定性、或相關編碼多核苷酸的翻譯的多核苷酸。調節(jié)元件可以包括啟動子；翻譯前導；內含子；增強子；莖環(huán)結構；阻抑物結合多核苷酸；具有終止序列的多核苷酸；具有多腺苷酸化識別序列的多核苷酸等。特定的調節(jié)元件可位于與其可操作連接的編碼多核苷酸的上游和/或下游。并且，與編碼多核苷酸可操作連接的特定調節(jié)序列可位于雙鏈核酸分子的相關互補鏈上。啟動子：如本文中使用的，術語“啟動子”是指可以在轉錄起始上游的、且可能涉及rna聚合酶與其他蛋白質的識別和結合而啟動轉錄的dna區(qū)域。啟動子可與用于在細胞中表達的編碼多核苷酸可操作連接，或者啟動子可與編碼信號序列的多核苷酸可操作連接，所述多核苷酸可與用于在細胞中表達的編碼多核苷酸可操作連接?！爸参飭幼印笨梢允悄軌騿又参锛毎D錄的啟動子。在發(fā)育控制下的啟動子的實例包括優(yōu)先啟動某些組織中的轉錄的啟動子，所述組織例如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞、或厚壁組織。這樣的啟動子稱為“組織優(yōu)先”啟動子。僅啟動某些組織中的轉錄的啟動子被稱為“組織特異性”啟動子?！凹毎愋吞禺愋浴眴幼又饕寗右粋€或多個器官中某些細胞類型(例如，根或葉中的維管細胞)中的表達?！罢T導型”啟動子可以是可以在環(huán)境控制之下的啟動子?？赏ㄟ^誘導型啟動子啟動轉錄的環(huán)境條件的實例包括厭氧條件和光的存在。組織特異性啟動子、組織優(yōu)先啟動子、細胞類型特異性啟動子、和誘導型啟動子構成“非組成型”啟動子類別?！敖M成型”啟動子是可在大多數(shù)環(huán)境條件下或在大多數(shù)組織或細胞類型中有活性的啟動子。在本發(fā)明的一些實施方案中可以使用任何誘導型啟動子。參見ward等人，(1993)plantmol.biol.22:361-366。利用誘導型啟動子，轉錄速率響應于誘導劑而增加。誘導型啟動子的實例包括但不限于：來自響應于銅的acei系統(tǒng)的啟動子；響應于苯磺酰胺除草劑安全劑的來自玉米的in2基因啟動子；來自tn10的tet阻抑物；和來自類固醇激素基因的誘導型啟動子，其轉錄活性可通過糖皮質激素誘導(schena等人，(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:0421)。示例性的組成型啟動子包括，但不限于：來自植物病毒的啟動子，例如來自花椰菜花葉病毒(camv)的35s啟動子；來自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pemu；mas；玉米h3組蛋白啟動子；和als啟動子，歐洲油菜als3結構基因5'的xba1/ncoi片段(或與所述xba1/ncoi片段相似的多核苷酸)(國際pct公布號美國專利wo96/30530)。另外，在本發(fā)明的一些實施方案中可以利用任何組織特異性或組織優(yōu)先啟動子。用包含與組織特異性啟動子可操作連接的編碼多核苷酸的核酸分子轉化的植物可唯一地或優(yōu)先地在特異性組織中產(chǎn)生所述編碼多核苷酸的產(chǎn)物。示例性的組織特異性或組織優(yōu)先啟動子包括但不限于：種子特異性啟動子，如來自菜豆蛋白基因的啟動子；葉特異性和光誘導型啟動子，如來自cab或rubisco的啟動子；花藥特異性啟動子，如來自lat52的啟動子；花粉特異性啟動子，如來自zm13的啟動子；以及小孢子優(yōu)先啟動子，如來自apg的啟動子。大豆植物：如本文中使用的，術語“大豆植物”是指屬于大豆屬物種(glycinesp.)的植物，例如大豆(glycinemax)。轉化：如本文中使用的，術語“轉化”或“轉導”是指將一個或多個核酸分子轉移到細胞中。當核酸分子通過核酸分子并入細胞基因組中、或通過附加型復制而由該細胞穩(wěn)定復制時，細胞被轉導到該細胞中的核酸分子“轉化”。如本文中使用的，術語“轉化”涵蓋可將核酸分子導入這種細胞中的所有技術。實例包括但不限于：用病毒載體轉染；用質粒載體轉化；電穿孔(fromm等人，(1986)nature319:791-3)；脂質體轉染(felgner等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84:7413-7)；顯微注射(mueller等人，(1978)cell15:579-85)；土壤桿菌介導的轉移(fraley等人，(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803-7)；直接dna攝取；和微粒轟擊(klein等人，(1987)nature327:70)。轉基因：外源核酸。在一些實例中，轉基因可以是編碼rna的dna，所述rna能夠形成dsrna分子的一條或兩條鏈，包含與存在于鞘翅目害蟲中的核酸分子互補的多核苷酸。在另外的實例中，轉基因可以是反義多核苷酸，其中反義多核苷酸的表達抑制靶核酸的表達，從而產(chǎn)生親代rnai表型。在又另外的實例中，轉基因可以為基因(例如除草劑耐性基因、編碼工業(yè)或藥學上有用的化合物的基因、或編碼期望的農(nóng)業(yè)性狀的基因)。在這些和其他實例中，轉基因可以含有與轉基因的編碼多核苷酸可操作連接的調節(jié)元件(例如，啟動子)。載體：引入到細胞中，例如產(chǎn)生轉化的細胞的核酸分子。載體可以包含允許其在宿主細胞中復制的遺傳元件，諸如復制起點。載體的實例包括但不限于：質粒；粘粒；噬菌體；和攜帶外源dna或rna進入細胞中的病毒。載體還可包括一種或多種基因、包括產(chǎn)生反義分子的基因、和/或選擇標志物基因和本領域已知的其他遺傳元件。載體可以轉導、轉化或感染細胞，由此引起細胞表達核酸分子和/或由該載體編碼的蛋白質。任選地，載體包括輔助核酸分子實現(xiàn)進入細胞中的物質(例如脂質體、蛋白質包衣等)。產(chǎn)量：相對于在相同生長位置在相同時間且在相同條件下生長的檢驗品種的產(chǎn)量，約100％或更大的穩(wěn)定化產(chǎn)量。在特定的實施方案中，“提高的產(chǎn)量”或“提高產(chǎn)量”意指相對于在含有相當大密度的對該作物有害的鞘翅目害蟲(本申請的組合物和方法以所述害蟲為目標)的相同生長位置在相同時間且在相同條件下生長的檢驗品種的產(chǎn)量，具有105％或更大的穩(wěn)定化產(chǎn)量的栽培種。除非特別指明或暗示，如本文中使用的術語“一個”、“一種”和“該”表示“至少一個/種”。除非另外特別地解釋，本文中使用的全部技術術語和科學術語具有與屬于本公開的領域之內的普通技術人員通常所理解的相同的含義。可以在以下出版物中找到分子生物學中常見術語的定義：例如，lewin’sgenesx,jones&bartlettpublishers,2009(isbn100763766321)；krebs等人(編輯)，theencyclopediaofmolecularbiology,blackwellscienceltd.,1994(isbn0-632-02182-9)；和meyersr.a.(編輯)，molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,vchpublishers,inc.,1995(isbn1-56081-569-8)。除非另有說明，所有百分比均以重量計，所有溶劑混合物比例以體積計。所有溫度以攝氏度計。iv.包含鞘翅目害蟲多核苷酸的核酸分子a.概述本文中描述了可用于控制鞘翅目害蟲的核酸分子。描述的核酸分子包括靶多核苷酸(例如，天然基因、和非編碼多核苷酸)、dsrna、sirna、shrna、hprna、和mirna。例如，在一些實施方案中描述了dsrna、mirna、sirna、shrna和/或hprna分子，其可與鞘翅目害蟲中的一種或多種天然核酸的全部或部分特異性地互補。在這些和另外的實施方案中，天然核酸可以是一種或多種靶基因，其產(chǎn)物可以例如但不限于：涉及生殖過程或涉及幼蟲發(fā)育。本文中描述的核酸分子在導入包含至少一種與該核酸分子特異性互補的天然核酸的細胞中時(例如通過親代傳播)，可以在細胞中啟動rnai，隨后降低或消除該天然核酸的表達。在一些實例中，借助于與靶基因特異性互補的核酸分子降低或消除靶基因表達，可導致鞘翅目害蟲的生殖停止，和/或該害蟲的后代中生長、發(fā)育和/或進食停止。這些方法可能顯著地減少侵襲中后續(xù)害蟲世代的大小，例如不導致接觸該irna分子的害蟲的死亡。在一些實施方案中，可以選擇鞘翅目害蟲中的至少一種靶基因，其中靶基因包含hunchback多核苷酸。在具體的實例中，選自鞘翅目害蟲中的靶基因，其中該靶基因包含選自seqidno:1、3和67的多核苷酸。西方玉米根蟲hunchback代表1955bp和573個氨基酸(hunchback蛋白)的序列。在該序列內，預測位置226-248、255-277、283-305、311-335、520-542和548-572處有六個c2h2型鋅指結構域，與其作為鋅指轉錄因子的功能一致。參見例如tautzetal.(1987)nature327:383-9。當使用blastp算法在ncbi數(shù)據(jù)庫中進行搜索時，最相似的序列來自赤擬谷盜，它僅顯示53％的序列同一性。在一些實施方案中，靶基因可以是包含這樣的多核苷酸的核酸分子，該多核苷酸能夠在計算機上逆翻譯成包含連續(xù)氨基酸序列的多肽：所述連續(xù)氨基酸序列與hunchback多核苷酸的蛋白質產(chǎn)物的氨基酸序列至少約85％相同(例如，至少84％、85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、或100％相同)。靶基因可以是鞘翅目害蟲中的任何核酸，對該序列的轉錄后抑制會對該害蟲的產(chǎn)生可存活的后代的能力造成有害影響，從而，例如，給植物提供針對該害蟲的保護效益。在具體的實例中，靶基因是這樣的核酸分子，其包含能夠在計算機上反向翻譯為多肽的多核苷酸，所述多肽包含與作為seqidno:2的計算機翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列至少約85％相同、約90％相同、約95％相同、約96％相同、約97％相同、約98％相同、約99％相同、約100％相同、或100％相同的連續(xù)氨基酸序列。依照一些實施方案提供了dna，其表達生成包含這樣的多核苷酸的rna分子，該多核苷酸與由鞘翅目害蟲中的編碼多核苷酸編碼的天然rna分子的全部或部分特異性地互補。在一些實施方案中，在鞘翅目害蟲攝入表達的rna分子后，可以獲得該害蟲細胞中，或該害蟲的后代的細胞中編碼多核苷酸的下調。在特定的實施方案中，鞘翅目害蟲細胞中編碼多核苷酸的下調導致該害蟲的生殖和/或增殖的減少或停止，和/或該害蟲的后代中生長、發(fā)育和/或進食的減少或停止。在一些實施方案中，靶多核苷酸包括轉錄的非編碼性rna，諸如5’utr；3’utr；剪接前導；內含子；末端內含子(outron)(例如，隨后在反式剪接中修飾的5'utrrna)；donatron(例如，提供反式剪接的供體序列需要的非編碼rna)；和鞘翅目害蟲靶基因的其他非編碼轉錄rna。這樣的多核苷酸可以衍生自單順反子和多順反子基因兩者。因此，本文中結合一些實施方案還描述了包含至少一種多核苷酸的irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna和hprna)，所述多核苷酸與鞘翅目害蟲中的靶核酸的全部或部分特異性地互補。在一些實施方案中，irna分子可以包含與多個靶核酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個靶核酸的全部或部分互補的多核苷酸。在特定的實施方案中，irna分子可以在體外產(chǎn)生，或通過遺傳修飾的生物(如植物或細菌)在體內產(chǎn)生。還公開了cdna，其可以用于產(chǎn)生與鞘翅目害蟲中的靶核酸的全部或部分特異性地互補的dsrna分子、sirna分子、mirna分子、shrna分子、和/或hprna分子。進一步描述了在實現(xiàn)特定宿主靶標的穩(wěn)定轉化中使用的重組dna構建體。轉化的宿主靶標可以從重組dna構建體表達有效水平的dsrna、sirna、mirna分子、shrna分子、和/或hprna分子。因此，還描述了植物轉化載體，其包含與在植物細胞中功能性的異源啟動子可操作連接的至少一個多核苷酸，其中多核苷酸的表達生成包含與鞘翅目害蟲中的靶核酸的全部或部分特異性地互補的連續(xù)核堿基串的rna分子。在特定實例中，可用于控制鞘翅目害蟲的核酸分子可以包括：從葉甲屬分離的包含hunchback多核苷酸(例如seqidno:1、3和67中任一者)的天然核酸的全部或部分；dna，其在表達時生成這樣的rna分子：所述rna分子包含與由hunchback編碼的天然rna分子的全部或部分特異性地互補的多核苷酸；irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna和hprna)，所述irna分子包含與hunchback編碼的rna分子的全部或部分特異性地互補的至少一個多核苷酸；可用于產(chǎn)生dsrna分子、sirna分子、mirna、shrna和/或hprna分子的cdna，所述分子與hunchback編碼的rna分子的全部或部分特異性地互補；以及用于在實現(xiàn)特定宿主靶標的穩(wěn)定轉化中使用的重組dna構建體，其中轉化的宿主靶標包含一種或多種前述的核酸分子。b.核酸分子本發(fā)明提供了，除其他事項外，抑制鞘翅目害蟲的細胞、組織、或器官中的靶基因表達的irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna和hprna)分子；和能夠在細胞或微生物中表達為irna分子以抑制鞘翅目害蟲的細胞、組織、或器官中的靶基因表達的dna分子。本發(fā)明的一些實施方案提供了分離的核酸分子，其包含至少一個(例如，一個、兩個、三個、或更多個)選自下組的多核苷酸：seqidno:1；seqidno:1的互補物；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸(例如至少19個連續(xù)核苷酸)的片段(例如seqidno:3和seqidno:67)；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，和葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物。在特定實施方案中，所述分離的多核苷酸與鞘翅目害蟲接觸或被所述鞘翅目害蟲攝取抑制該害蟲的生長、發(fā)育、生殖、和/或進食。在一些實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子可以包含選自以下的至少一種(例如，一種，兩種，三種或更多種)多核苷酸：seqidno:70；seqidno:70的互補物；seqidno:71；seqidno:71的互補物；seqidno:72；seqidno:72的互補物；seqidno:73；seqidno:73的互補物；seqidno:70，71和73中任一個的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:70，71和73中任一個的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；在葉甲屬生物中從包含seqidno:1的基因轉錄的天然多核糖核苷酸；在葉甲屬生物中從包含seqidno:1的基因轉錄的天然多核糖核苷酸的互補物；在葉甲屬生物中從包含seqidno:1的基因轉錄的天然多核糖核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；以及在葉甲屬生物中從包含seqidno:1的基因轉錄的天然多核糖核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物。在具體實施方案中，分離的多核苷酸與鞘翅目害蟲的接觸或攝取抑制害蟲的生長，發(fā)育，生殖和/或進食。在其他實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包含至少一個(例如，一個、兩個、三個、或更多個)dna，其能夠在細胞或微生物中表達為irna分子以抑制鞘翅目害蟲的細胞、組織、或器官中的靶基因表達。這樣的dna可以與在包含該dna分子的細胞中具備功能的啟動子可操作連接，以啟動或增強編碼的能夠形成dsrna分子的rna的轉錄。在一個實施方案中，所述至少一個(例如，一個、兩個、三個、或更多個)dna可衍生自seqidno:1的多核苷酸。seqidno:1的衍生物包括seqidno:1的片段。在一些實施方案中，這樣的片段可包含例如seqidno:1的至少約15個連續(xù)核苷酸，或其互補物。因此，這樣的片段可包括，例如seqidno:1的15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200或更多個連續(xù)核苷酸，或其互補物。因此，這樣的片段可包含，例如，seqidno:1的至少19個連續(xù)核苷酸(例如，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續(xù)核苷酸)，或其互補物。一些實施方案包括將部分或完全穩(wěn)定化的dsrna分子導入鞘翅目害蟲中以抑制鞘翅目害蟲的細胞、組織或器官中靶基因的表達。當表達為irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)并被鞘翅目害蟲攝取時，包含seqidno:1、3和67的一個或多個片段的多核苷酸可以引起下列一項或多項：鞘翅目害蟲的死亡、發(fā)育停止、生長抑制、性別比變化、產(chǎn)卵量(broodsize)減少、感染停止、和/或進食停止。在具體實例中，包含seqidno:1、3和67中任一者的一個或多個片段(例如，包括約15至約300個核苷酸的多核苷酸)及其互補序列的多核苷酸導致害蟲的現(xiàn)有世代產(chǎn)生下一代害蟲的能力降低。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的dsrna分子包含與來自包含seqidno:1、3、46和/或67的靶基因的轉錄物互補的多核苷酸，和/或與seqidno:1、3、46和/或67的片段互補的多核苷酸，所述靶基因在鞘翅目害蟲中的抑制導致對于該害蟲或該害蟲的后代的生長、發(fā)育、或其他生物學功能必需的蛋白質或多核苷酸物質的減少或消除。選擇的核苷酸序列可以與下列各項展現(xiàn)出約80％到約100％序列同一性：seqidno:1、3、46和/或67；seqidno:1、3、46和/或67的連續(xù)片段；或前述任一者的互補物。例如，選定的多核苷酸可以與下列任一項展現(xiàn)出79％、80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約98.5％、約99％、約99.5％、或約100％的序列同一性：seqidno:1、3、46和/或67；seqidno:1、3、46和/或67的連續(xù)片段；和前述任一者的互補物。在一些實施方案中，能夠在細胞或微生物中表達為irna分子以抑制靶基因表達的dna分子可以包含與存在于一個或多個靶鞘翅目害蟲物種(例如鞘翅目或半翅目害蟲物種)中的天然多核苷酸的全部或部分特異性地互補的單個多核苷酸，或者dna分子可以是從多個這樣的特異性互補多核苷酸構建而成的嵌合體。在其他實施方案中，核酸分子可以包含以“接頭”分開的第一和第二多核苷酸。接頭可以是任何包含促進第一和第二多核苷酸之間的二級結構形成(在期望的情況下)的核苷酸序列的區(qū)域。在一個實施方案中，接頭是mrna的有義或反義編碼多核苷酸的一部分?；蛘撸宇^可以包含能夠與核酸分子可操作連接的核苷酸或其同源物的任何組合。在一些實例中，接頭可以包含內含子(例如作為st-ls1內含子)。例如，在一些實施方案中，dna分子可以包含編碼一種或多種不同rna分子的多核苷酸，其中每種不同rna分子分別包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第一和第二多核苷酸彼此互補。第一和第二多核苷酸在rna分子內可以通過間隔物連接。接頭可以構成第一多核苷酸或第二多核苷酸的一部分。包含第一和第二多核苷酸的rna分子的表達可以通過第一和第二多核苷酸的特異性分子內堿基配對而導致本發(fā)明的dsrna分子的形成。第一多核苷酸或第二多核苷酸可以與對于鞘翅目害蟲而言天然的多核苷酸(例如，靶基因、或轉錄的非編碼多核苷酸)、其衍生物、或其互補多核苷酸基本上相同。dsrna核酸分子包含聚合核糖核苷酸的雙鏈，并且可以包含對磷酸-糖主鏈或核苷的修飾?？梢赃m宜調整rna結構的修飾以使得特異性抑制能夠發(fā)生。在一個實施方案中，可以通過普遍存在的酶促過程來修飾dsrna分子，以便能夠生成sirna分子。此酶促過程可以利用體外或體內的rna酶iii酶，如真核生物中的切丁酶。參見elbashir等人，(2001)nature411:494-8；以及hamilton和baulcombe(1999)science286(5441):950-2。切丁酶或功能等效的rna酶iii酶將較大的dsrna鏈和/或hprna分子切割成較小的寡核苷酸(例如，sirna)，每個所述寡核苷酸長度為約19-25個核苷酸。由這些酶生成的sirna分子具有2到3個核苷酸3’突出物、和5’磷酸和3’羥基末端。由rna酶iii酶生成的sirna分子在細胞中解旋，并分成單鏈rna。然后，sirna分子與從靶基因轉錄的rna特異性地雜交，并且這兩種rna分子隨后通過固有的細胞rna降解機制而被降解。這個過程可以導致由靶生物中的靶基因編碼的rna的有效降解或消除。結果導致靶向基因的轉錄后沉默。在一些實施方案中，通過內源rna酶iii酶從異源核酸分子產(chǎn)生的sirna分子可以有效介導鞘翅目害蟲中靶基因的下調。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包括至少一種可被轉錄成單鏈rna分子的非天然存在的多核苷酸，所述單鏈rna分子能夠在體內通過分子間雜交形成dsrna分子。這樣的dsrna常常進行自組裝，并且可以在鞘翅目害蟲的營養(yǎng)來源中提供，以實現(xiàn)靶基因的轉錄后抑制。在這些和另外的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包含兩種不同的非天然存在的核苷酸序列，其中每種序列與鞘翅目害蟲中的不同靶基因特異性地互補。當向鞘翅目害蟲以dsrna分子的形式提供這樣的核酸分子時，dsrna分子抑制害蟲中至少兩種不同靶基因的表達。c.獲得核酸分子可以使用鞘翅目害蟲中的多種多核苷酸作為靶標來設計本發(fā)明的核酸分子，如irna和編碼irna的dna分子。然而，天然多核苷酸的選擇并非是直截了當?shù)倪^程。鞘翅目害蟲的天然多核苷酸中僅有少數(shù)會是有效的靶標。例如，特定的天然多核苷酸是否可以被本發(fā)明的核酸分子有效下調，抑或特定的天然多核苷酸的下調是否會對鞘翅目害蟲的生長、存活力、增殖、和/或生殖具有有害影響，都是無法肯定地預測的。絕大多數(shù)的鞘翅目害蟲天然多核苷酸，如自這些害蟲分離的est(例如，如美國專利7,612,194中所列出的鞘翅目害蟲多核苷酸)，對害蟲的生長、存活力、增殖、和/或生殖沒有有害影響。同樣無法預測的是，在可以對害蟲具有有害影響的天然多核苷酸中哪些能夠在重組技術中使用，從而在宿主植物中表達與這樣的天然多核苷酸互補的核酸分子，并且在進食后對害蟲造成有害影響，同時不對宿主植物引起損害。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子(例如，要在鞘翅目害蟲的宿主植物中提供的dsrna分子)被選擇為靶向這樣的cdna，其編碼對于鞘翅目害蟲生殖和/或發(fā)育必需的蛋白質或蛋白質部分(如涉及代謝或分解代謝生物化學途徑、細胞分裂、生殖、能量代謝、胚胎發(fā)育、幼蟲發(fā)育、轉錄調控等的多肽)。如本文中描述的，靶生物攝入含有一種或多種dsrna——所述dsrna的至少一個區(qū)段與靶害蟲生物細胞中產(chǎn)生的rna的至少一個基本上相同的區(qū)段特異地互補——的組合物，可以導致交配、產(chǎn)卵、或產(chǎn)生可存活后代的失敗或能力降低?？梢允褂脧那食崮亢οx衍生的多核苷酸(dna或rna)來構建對該害蟲侵染有抗性的植物細胞。例如，可以轉化鞘翅目害蟲的宿主植物(例如，玉米)，使其含有從鞘翅目害蟲衍生的如本文中提供的多核苷酸中的一種或多種。轉化到宿主中的多核苷酸可以編碼一種或多種rna，其在轉化的宿主內的細胞或生物學流體中形成dsrna結構，這樣，如果/當害蟲與轉基因宿主形成營養(yǎng)關系時，就有dsrna可用。這可以導致害蟲細胞中一種或多種基因表達的阻抑，最終導致生殖和/或發(fā)育的抑制。在備選的實施方案中，靶向實質參與鞘翅目害蟲的生長、發(fā)育和生殖的基因。本發(fā)明中使用的其他靶基因可以包括例如那些在鞘翅目害蟲的存活力、運動、遷移、生長、發(fā)育、感染性、和進食位置的建立中發(fā)揮重要作用的靶基因。因此，靶基因可以是管家基因或轉錄因子。另外，本發(fā)明中使用的天然鞘翅目害蟲多核苷酸也可以從植物、病毒、細菌或昆蟲基因的同源物(例如，直系同源物)衍生，所述同源物的功能對于本領域技術人員是已知的，且其多核苷酸與害蟲的基因組中的靶基因可特異性地雜交。通過雜交鑒定已知核苷酸序列的基因同源物的方法是本領域技術人員已知的。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于獲得包含用于產(chǎn)生irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子的多核苷酸的核酸分子的方法。一種這樣的實施方案包括：(a)對一種或多種靶基因分析其在鞘翅目害蟲中在dsrna介導的基因阻抑后的表達、功能和表型；(b)用探針探查cdna或gdna文庫，所述探針包含來自靶向的鞘翅目害蟲的多核苷酸的全部或部分或其同源物，所述靶向的鞘翅目害蟲在dsrna介導的阻抑分析中展現(xiàn)出改變的(例如，降低的)生殖或發(fā)育表型；(c)鑒定與探針特異性雜交的dna克隆；(d)分離步驟(b)中鑒定的dna克??；(e)對包含步驟(d)中分離的克隆的cdna或gdna片段測序，其中測序的核酸分子包含rna的全部或大部分或其同源物；和(f)化學合成基因的全部或大部分、mirna、sirna、hprna、mrna、shrna、或dsrna。在另外的實施方案中，用于獲得包含用于產(chǎn)生大部分的irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子的多核苷酸的核酸片段的方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其與來自靶向的鞘翅目害蟲的天然多核苷酸的一部分特異性地互補；和(b)使用步驟(a)的第一和第二寡核苷酸引物擴增克隆載體中存在的cdna或gdna插入物，其中擴增的核酸分子包含mirna、sirna、mrna、hprna、shrna或dsrna分子的大部分。本發(fā)明的核酸可以通過多種途徑分離、擴增、或產(chǎn)生。例如，可以通過pcr擴增從gdna或cdna文庫衍生的靶多核苷酸(例如，靶基因或靶轉錄的非編碼多核苷酸)、或其部分而獲得irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子。可以從靶生物提取dna或rna，并且可以使用本領域普通技術人員已知的方法從其制備核酸文庫?？墒褂米园猩锷傻膅dna或cdna文庫進行靶基因的pcr擴增和測序。可以使用確認的pcr產(chǎn)物作為體外轉錄的模板以在最低限度的啟動子的情況下生成有義和反義rna。或者，可以使用標準化學，如亞磷酰胺化學，通過許多技術(參見，例如ozaki等人，(1992)nucleicacidsresearch,20:5205-5214；和agrawal等人，(1990)nucleicacidsresearch,18:5419-5423)，包括使用自動化dna合成儀(例如，p.e.biosystems,inc.(fostercity,calif.)392或394型dna/rna合成儀)的任一者來合成核酸分子。參見，例如，beaucage等人，(1992)tetrahedron,48:2223-2311；美國專利4,980,460、4,725,677、4,415,732、4,458,066、和4,973,679。也可以采用備選化學，其生成非天然主鏈基團，如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。本發(fā)明的rna、dsrna、mirna、sirna、shrna、或hprna分子可以由本領域技術人員可以通過手動或自動反應以化學或酶促方式產(chǎn)生，或者在包含含有編碼rna、dsrna、mirna、sirna、shrna、或hprna分子的多核苷酸的核酸分子的細胞中體內產(chǎn)生。還可以通過部分或完全有機合成產(chǎn)生rna，可以通過體外酶促或有機合成引入任何經(jīng)修飾的核糖核苷酸?？梢酝ㄟ^細胞rna聚合酶或噬菌體rna聚合酶(例如，t3rna聚合酶、t7rna聚合酶、和sp6rna聚合酶)合成rna分子?？捎糜诳寺『捅磉_多核苷酸的表達構建體是本領域中已知的。參見，例如，國際pct公布號wo97/32016；及美國專利5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214、和5,804,693。可以在導入細胞中之前純化化學合成或通過體外酶促合成合成的rna分子。例如，可以通過用溶劑或樹脂提取、沉淀、電泳、色譜法、或其組合從混合物純化rna分子?；蛘?，可以在不純化或最小程度純化的情況下使用化學合成或通過體外酶促合成而合成的rna分子，例如，以避免由于樣品加工所致的損失。可以將rna分子干燥貯存或溶解在水溶液中。溶液可以含有緩沖劑或鹽以促進dsrna分子雙鏈體鏈的退火和/或穩(wěn)定化。在實施方案中，可以通過單一自身互補的rna鏈或者從兩條互補rna鏈形成dsrna分子。dsrna分子可以在體內或在體外合成。細胞的內源rna聚合酶可以在體內介導一條或兩條rna鏈的轉錄，或者可以使用克隆的rna聚合酶在體內或在體外介導轉錄。通過宿主器官、組織、或細胞類型中的特異性轉錄(例如，通過使用組織特異性啟動子進行)；刺激宿主中的環(huán)境條件(例如，通過使用響應于感染、脅迫、溫度、和/或化學誘導物的誘導型啟動子)；和/或在宿主的某個發(fā)育階段或年齡人工造成轉錄(例如，通過使用發(fā)育階段特異性啟動子)，在鞘翅目害蟲中靶基因的轉錄后抑制可以是宿主靶向性的。形成dsrna分子的rna鏈(不論是體外還是體內轉錄的)可以也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可以能夠也可以不能被細胞翻譯機制翻譯成多肽。d.重組載體和宿主細胞轉化在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了用于導入細胞(例如，細菌細胞、酵母細胞、或植物細胞)中的dna分子，其中dna分子包含這樣的多核苷酸，該多核苷酸在表達為rna并被鞘翅目害蟲攝取后，可實現(xiàn)對害蟲的細胞、組織或器官中靶基因的阻抑。因此，一些實施方案提供了重組核酸分子，其包含能夠在植物細胞中表達為irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子以抑制鞘翅目害蟲中靶基因表達的多核苷酸。為了啟動或增強表達，這樣的重組核酸分子可以包含一種或多種調節(jié)元件，所述調節(jié)元件可以與能夠表達為irna的多核苷酸可操作連接。在植物中表達基因阻抑分子的方法是已知的，并且可以用于表達本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，國際pct公開號wo06/073727；和美國專利公開號2006/0200878a1)。在具體的實施方案中，本發(fā)明的重組dna分子可以包含編碼可形成dsrna分子的rna的多核苷酸。這樣的重組dna分子可以編碼可形成dsrna分子的rna，其被攝取后能夠抑制鞘翅目害蟲細胞中內源靶基因的表達。在許多實施方案中，轉錄的rna可以形成dsrna分子，所述dsrna分子可以以穩(wěn)定化形式提供；例如，以發(fā)夾和莖和環(huán)結構的形式提供。在某些實施方案中，dsrna分子的一條鏈可以通過從與rna基本上同源的多核苷酸轉錄而形成，所述rna由選自下組的多核苷酸編碼：seqidno:1、3、46和67；seqidno:1、3、46和/或67的互補物；seqidno:1、3、46和/或67的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1、3、46和/或67的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1、3和/或67的天然編碼多核苷酸；葉甲屬生物的包含seqidno:1、3和/或67的天然編碼多核苷酸的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:1、3和/或67的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；及葉甲屬生物的包含seqidno:1、3和/或67的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物。在特定的實施方案中，編碼可形成dsrna分子的重組dna分子可包含編碼區(qū)，其中至少兩個多核苷酸如此排列，使得相對于至少一個啟動子，一個多核苷酸處于有義取向，另一多核苷酸處于反義取向，其中該有義多核苷酸和該反義多核苷酸通過接頭連接或聯(lián)接，所述接頭具有，例如，約5個(～5)至約一千個(～1000)核苷酸。接頭可以在有義和反義多核苷酸之間形成環(huán)。有義多核苷酸或反義多核苷酸可以與由靶基因(例如，包含seqidno:1的hunchback基因)或其片段編碼的rna基本上同源。然而，在一些實施方案中，重組dna分子可以編碼可以形成沒有接頭的dsrna分子的rna。在實施方案中，有義編碼多核苷酸和反義編碼多核苷酸可以是不同的長度。通過在本發(fā)明的重組核酸分子中創(chuàng)建適當?shù)谋磉_盒，可以容易地將鑒定為對鞘翅目害蟲具有有害影響或者針對該害蟲的植物保護效果的多核苷酸摻入表達的dsrna分子中。例如，可以通過如下步驟將這樣的多核苷酸表達為具有莖和環(huán)結構的發(fā)夾：采用對應于由靶基因多核苷酸(例如，包含seqidno:1的hunchback基因，或其片段)編碼的rna的第一區(qū)段；將此多核苷酸與第二區(qū)段接頭區(qū)連接，所述第二區(qū)段接頭區(qū)與第一區(qū)段不是同源或互補的；并將這與第三區(qū)段連接，其中第三區(qū)段的至少一部分與第一區(qū)段基本上互補。這樣的構建體通過第一區(qū)段與第三區(qū)段的分子內堿基配對而形成莖和環(huán)結構，其中環(huán)結構形式包含第二區(qū)段。參見，例如，美國專利公開文本2002/0048814和2003/0018993；以及國際pct公開文本wo94/01550和wo98/05770?？梢岳缫噪p鏈結構諸如莖環(huán)結構(例如，發(fā)夾)形式生成dsrna分子，由此通過共表達靶基因的片段(例如在另外的植物表達盒上的靶基因的片段)增強靶向天然鞘翅目害蟲序列的sirna的產(chǎn)生，這可導致sirna產(chǎn)生增強，或者降低甲基化以防止dsrna發(fā)夾啟動子的轉錄基因沉默。本發(fā)明的實施方案包括將本發(fā)明的重組核酸分子導入植物中(即，轉化)以實現(xiàn)一種或多種irna分子的鞘翅目害蟲保護水平的表達。重組dna分子可以例如是載體，如線性或閉合環(huán)狀質粒。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質粒，或者共同含有要導入宿主基因組中的總dna的兩個或更多個載體或質粒。另外，載體可以是表達載體?？梢岳鐚⒈景l(fā)明的核酸適當?shù)夭迦胼d體中，在一種或多種宿主中發(fā)揮功能以驅動連接的編碼多核苷酸或其他dna元件表達的合適啟動子控制下。許多載體可用于此目的，適當載體的選擇主要將取決于要插入載體中的核酸的大小和要用載體轉化的特定宿主細胞。每種載體含有不同的組分，根據(jù)其功能(例如，dna擴增或dna表達)及與其相容的特定宿主細胞而定。為了對轉基因植物賦予對鞘翅目害蟲的保護，例如可以在重組植物的組織或流體內將重組dna轉錄成irna分子(例如，形成dsrna分子的rna分子)。irna分子可包含與可引起宿主植物物種損害的鞘翅目害蟲內的相應轉錄多核苷酸基本上同源且可特異性雜交的多核苷酸。例如，鞘翅目害蟲可以通過攝取包含irna分子的轉基因宿主植物的細胞或流體而接觸在轉基因宿主植物細胞中轉錄的irna分子。因此，靶基因的表達在侵染轉基因宿主植物的鞘翅目害蟲內受到irna分子阻抑。在一些實施方案中，對靶鞘翅目害蟲中靶基因表達的阻抑可以導致植物對害蟲攻擊有抗性。為了使irna分子能夠被投送給與已經(jīng)用本發(fā)明的重組核酸分子轉化的植物細胞存在營養(yǎng)關系的鞘翅目害蟲，需要在植物細胞中表達(即，轉錄)irna分子。因此，重組核酸分子可以包含與一種或多種調節(jié)元件(諸如在宿主細胞中發(fā)揮功能的異源啟動子元件)可操作連接的本發(fā)明的多核苷酸，所述宿主細胞諸如其中要擴增核酸分子的細菌細胞，或其中要表達核酸分子的植物細胞。適合于用于本發(fā)明的核酸分子的啟動子包括誘導型、病毒的、合成的、或組成型的那些啟動子，它們都是本領域中熟知的。描述這樣的啟動子的非限制性實例包括美國專利6,437,217(玉米rs81啟動子)；5,641,876(水稻肌動蛋白啟動子)；6,426,446(玉米rs324啟動子)；6,429,362(玉米pr-1啟動子)；6,232,526(玉米a3啟動子)；6,177,611(組成型玉米啟動子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196(camv35s啟動子)；6,433,252(玉米l3油質蛋白啟動子)；6,429,357(水稻肌動蛋白2啟動子和稻肌動蛋白2內含子)；6,294,714(光誘導型啟動子)；6,140,078(鹽誘導型啟動子)；6,252,138(病原體誘導型啟動子)；6,175,060(磷缺乏誘導型啟動子)；6,388,170(雙向啟動子)；6,635,806(γ薏苡辛(coixin)啟動子)；及美國專利公開號2009/757,089(玉米葉綠體醛縮酶啟動子)。其他啟動子包括膽脂堿合酶(nos)啟動子(ebert等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84(16):5745-9)和章魚堿合酶(ocs)啟動子(兩者都在根癌土壤桿菌的腫瘤誘導質粒上攜帶)；花椰菜花葉病毒組(caulimovirus)啟動子，如花椰菜花葉病毒(camv)19s啟動子(lawton等人，(1987)plantmol.biol.9:315-24)；camv35s啟動子(odell等人，(1985)nature313:810-2；玄參花葉病毒35s啟動子(walker等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84(19):6624-8)；蔗糖合酶啟動子(yang和russell(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:4144-8)；r基因復合物啟動子(chandler等人，(1989)plantcell1:1175-83)；葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子；camv35s(美國專利5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196)；fmv35s(美國專利6,051,753和5,378,619)；pclsv啟動子(美國專利5,850,019)；scp1啟動子(美國專利6,677,503)；和agrtu.nos啟動子(genbanktm登錄號v00087；depicker等人，(1982)j.mol.appl.genet.1:561-573；bevan等人，(1983)nature304:184-7)。在特定的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含組織特異性啟動子，如根特異性啟動子。根特異性啟動子驅動專門或優(yōu)先在根組織中表達可操作連接的編碼多核苷酸。根特異性啟動子的實例是本領域中已知的。參見，例如，美國專利5,110,732；5,459,252和5,837,848；opperman等人，(1994)science263:221-3；和hirel等人，(1992)plantmol.biol.20:207-18。在一些實施方案中，可以在兩個根特異性啟動子之間克隆依照本發(fā)明的用于鞘翅目害蟲控制的多核苷酸或片段，所述根特異性啟動子相對于所述多核苷酸或片段以相反的轉錄方向排布，在轉基因植物細胞中可操作，并且在轉基因植物細胞中表達以在轉基因植物細胞中產(chǎn)生rna分子，rna分子隨后可形成dsrna分子，如上文所述。鞘翅目害蟲可以攝取植物組織中表達的irna分子，從而實現(xiàn)對靶基因表達的阻抑。其他可任選地與感興趣的核酸分子可操作連接的調節(jié)元件包括5'utr，5'utr作為位于啟動子元件和編碼多核苷酸之間的翻譯前導元件發(fā)揮功能。翻譯前導元件存在于完全加工的mrna中，并且其可以影響初級轉錄物的加工和/或rna的穩(wěn)定性。翻譯前導元件的例子包括玉米和矮牽牛熱休克蛋白前導物(美國專利no.5,362,865)、植物病毒外殼蛋白前導序列、植物rubisco前導序列等。參見，例如，turner和foster(1995)molecularbiotech.3(3):225-36。5'utr的非限制性實例包括gmhsp(美國專利no.5,659,122)；phdnak(美國專利5,362,865)；atant1；tev(carrington和freed(1990)j.virol.64:1590-7)；和agrtunos(genbanktm登錄號v00087；和bevan等人，(1983)nature304:184-7)。其他任選地與感興趣的核酸分子可操作連接的調節(jié)元件還包括3'非翻譯元件、3'轉錄終止區(qū)、或多腺苷酸化區(qū)。這些是位于多核苷酸下游的遺傳元件，并且包括提供多腺苷酸化信號的多核苷酸、和/或能夠影響轉錄或mrna加工的其他調節(jié)信號。多腺苷酸化信號在植物中發(fā)揮功能，導致多腺苷酸化的核苷酸被添加至mrna前體的3'端。多腺苷酸化元件可以源自多種植物基因或t-dna基因。3'轉錄終止區(qū)的一個非限制性實例是膽脂堿合酶3'區(qū)(nos3'；fraley等人，(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803-7)。在ingelbrecht等人，(1989)plantcell1:671-80中提供了使用不同3'非翻譯區(qū)的實例。多腺苷酸化信號的非限制性實例包括來自豌豆rbcs2基因的信號(ps.rbcs2-e9；coruzzi等人，(1984)emboj.3:1671-9)和agrtu.nos(登錄號e01312)。一些實施方案可以包括植物轉化載體，該植物轉化載體包含分離純化的dna分子，該dna分子包含與本發(fā)明的一種或多種多核苷酸可操作連接的至少一種上文描述的調節(jié)元件。在表達時，一種或多種多核苷酸生成一種或多種包含多核苷酸的rna分子，所述多核苷酸與鞘翅目害蟲中的天然rna分子的全部或部分特異性地互補。因此，多核苷酸可以包含編碼靶向的鞘翅目害蟲rna轉錄物內存在的多核糖核苷酸的全部或部分的區(qū)段，并且可以包含被靶向的害蟲轉錄物的全部或部分的反向重復。植物轉化載體可以含有與超過一種靶多核苷酸特異性互補的多核苷酸，由此容許產(chǎn)生超過一種dsrna以抑制靶鞘翅目害蟲的一個或多個群體或物種的細胞中兩種或更多種基因的表達。可以將與不同基因中存在的多核苷酸特異性互補的多核苷酸區(qū)段組合成單一復合核酸分子，以便在轉基因植物中表達。這樣的區(qū)段可以是連續(xù)的或者由接頭分開。在其他實施方案中，可以通過在同一質粒中依次插入另外的多核苷酸來修飾已經(jīng)含有本發(fā)明的至少一個多核苷酸的本發(fā)明質粒，其中所述另外的多核苷酸與原有的至少一個多核苷酸可操作連接于相同的調節(jié)元件。在一些實施方案中，核酸分子可以設計為抑制多種靶基因。在一些實施方案中，要抑制的多種基因可以獲自相同的鞘翅目害蟲物種，這樣做可以增強核酸分子的有效性。在其他實施方案中，基因可以來自不同的昆蟲(例如鞘翅目)害蟲，這樣可以拓寬藥劑有效的害蟲的范圍。當靶向多種基因以實現(xiàn)阻抑、或表達和阻抑的組合時，可以工程化多順反子dna元件。本發(fā)明的重組核酸分子或載體可以包含賦予轉化的細胞，諸如植物細胞可選擇表型的選擇標志物。也可以使用選擇標志物來選擇包含本發(fā)明的重組核酸分子的植物或植物細胞。標志物可以編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遺傳霉素(g418)、博來霉素、潮霉素，等等)、或除草劑耐性(例如，草甘膦等)。選擇標志物的實例包括但不限于編碼卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、g418等選擇的neo基因；編碼雙丙氨磷抗性的bar基因；編碼草甘膦耐性的突變體epsp合酶基因；賦予對溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；賦予咪唑啉酮或磺酰脲耐性的突變體乙酰乳酸合酶基因(als)；和甲氨蝶呤抗性dhfr基因?？捎枚喾N選擇標志物，其賦予對氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦絲菌素、嘌呤霉素、大觀霉素、利福平、鏈霉素和四環(huán)素等的抗性。這樣的選擇標志物的實例展示于，例如美國專利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047。本發(fā)明的重組核酸分子或載體還可以包含可篩選標志物?？梢允褂每珊Y選標志物來監(jiān)測表達。示例性篩選標志物包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uida基因(gus)，其編碼已知的多種生色底物的酶(jefferson等人，(1987)plantmol.biol.rep.5:387-405)；r基因座基因，其編碼調節(jié)植物組織中花色素苷色素(紅色)產(chǎn)生的產(chǎn)物(dellaporta等人，(1988)"molecularcloningofthemaizer-njallelebytransposontaggingwithac."收錄于18thstadlergeneticssymposium,p.gustafson和r.appels編輯，(newyork:plenum),pp.263-82)；β-內酰胺酶基因(sutcliffe等人，(1978)proc.natl.acad.sci.usa75:3737-41)；編碼已知多種生色底物的酶(例如，padac，一種生色頭孢菌素)的基因；螢光素酶基因(ow等人，(1986)science234:856-9)；xyle基因,其編碼能轉化生色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶(zukowski等人，(1983)gene46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(ikatu等人，(1990)bio/technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其編碼能夠將酪氨酸氧化為dopa和多巴醌(dopaquinone)(其繼而縮合成黑色素)的酶(katz等人，(1983)j.gen.microbiol.129:2703-14))；和α-半乳糖苷酶。在一些實施方案中，在用于創(chuàng)建轉基因植物和在植物中表達異源核酸的方法中，可以使用如上文所描述的重組核酸分子來制備表現(xiàn)出對鞘翅目害蟲的易感性降低的轉基因植物。例如，可以通過將編碼irna分子的核酸分子插入植物轉化載體中，并將這些導入植物中來制備植物轉化載體。用于宿主細胞轉化的適合方法包括任何能將dna導入細胞中的方法，如通過原生質體轉化(參見，例如，美國專利5,508,184)，通過干燥/抑制介導的dna攝取(參見，例如，potrykus等人.(1985)mol.gen.genet.199:183-8)，通過電穿孔(參見，例如，美國專利5,384,253)，通過用碳化硅纖維攪拌(參見，例如，美國專利5,302,523和5,464,765)，通過土壤桿菌介導的轉化(參見，例如，美國專利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；和6,384,301)，以及通過加速dna包被的顆粒(參見，例如，美國專利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、和6,403,865)，等。特別可用于轉化玉米的技術描述于例如美國專利7,060,876和5,591,616；以及國際pct公布wo95/06722中。通過應用諸如此類的這些技術，幾乎任何物種的細胞都可被穩(wěn)定轉化。在一些實施方案中，轉化dna被整合到宿主細胞的基因組中。在多細胞物種的情況下，轉基因細胞可再生為轉基因生物?？梢允褂萌魏芜@些技術來產(chǎn)生轉基因植物，例如在轉基因植物的基因組中包含編碼一種或多種irna分子的一種或多種核酸。用于將表達載體導入植物中的廣泛使用的方法是基于土壤桿菌的天然轉化系統(tǒng)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是將植物細胞遺傳轉化的植物致病性土壤細菌。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的ti和ri質粒分別攜帶負責植物遺傳轉化的基因。ti(誘導腫瘤)-質粒含有被稱為t-dna的大片段，其被轉移到轉化的植物中。ti質粒的另一個片段，vir區(qū)，負責t-dna的轉移。t-dna區(qū)的邊界為末端重復序列。在修飾的二元載體中，腫瘤誘導基因已缺失，vir區(qū)的功能用于轉移以t-dna邊界元件為界的外來dna。t區(qū)還可含有用于轉基因細胞和植物有效恢復的選擇標志物、以及插入用于轉移諸如編碼核酸的dsrna之類多核苷酸的多克隆位點。因此，在一些實施方案中，植物轉化載體來源于根癌土壤桿菌的ti質粒(參見，例如，美國專利4,536,475、4,693,977、4,886,937、和5,501,967；以及歐洲專利no.ep0122791)或發(fā)根土壤桿菌的ri質粒。其他的植物轉化載體包括，例如但不限于，由herrera-estrella等人，(1983)nature303:209-13；bevan等人，(1983)nature304:184-7；klee等人，(1985)bio/technol.3:637-42；以及在歐洲專利no.ep0120516中所描述的那些載體，以及從任何前述文獻來源的那些載體?？梢孕揎椞烊坏嘏c植物相互作用的其他細菌，如中華根瘤菌屬、根瘤菌屬、和中慢生根瘤菌屬，以介導到許多各種各樣的植物中的基因轉移。通過獲取卸甲ti質粒和適合的二元載體，可以使這些植物相關的共生細菌能夠勝任基因轉移。在提供外源dna到受體細胞的遞送之后，通常鑒定出轉化的細胞用于進一步培養(yǎng)和植物再生。為了提高鑒定轉化細胞的能力，人們可能期望采用如前提出的選擇或篩選標志物基因，與用來再生轉化體的轉化載體一道使用。在采用選擇標志物的情況下，通過使細胞暴露于選擇劑或藥劑，鑒定出在潛在轉化的細胞群中的轉化細胞。在采用篩選標志物的情況下，可針對期望的標志物基因性狀來篩選細胞。暴露于選擇劑后存活的細胞、或者在篩選測定中已被評分為陽性的細胞，可以在支持植物再生的介質中進行培養(yǎng)。在一些實施方案中，可通過包含其他物質，如生長調節(jié)劑來改良任何適合的植物組織培養(yǎng)基(例如，ms和n6培養(yǎng)基)?？蓪⒔M織維持在具有生長調節(jié)劑的基本培養(yǎng)基上，直到可得到足夠的組織用于啟動植物再生工作時為止，或者在重復多輪的手動選擇之后，直到組織形態(tài)適合于再生時為止(例如，至少2周)，然后轉移到有助于芽形成的介質中。定期轉移培養(yǎng)物，直到已經(jīng)出現(xiàn)充分的芽形成時為止。一旦形成芽，將它們轉移到有助于根形成的介質中。一旦形成足夠的根，可將植物轉移到土壤中，以便進一步生長和成熟。為了證實再生植物中感興趣核酸分子(例如，編碼一種或多種irna分子的dna，所述irna分子抑制鞘翅目害蟲中的靶基因表達)的存在，可以進行多種測定法。這樣的測定法例如包括：分子生物學測定，如southern和northern印跡、pcr、和核酸測序；生物化學測定，如檢測蛋白質產(chǎn)物的存在，例如通過免疫學手段(elisa和/或western印跡)或借助于酶功能；植物部分測定，如葉或根測定；和再生的全植物的表型分析?？衫缤ㄟ^使用對感興趣核酸分子特異的寡核苷酸引物進行pcr擴增來分析整合事件。pcr基因分型應當理解為包括但不限于，來源于分離的宿主植物愈傷組織的gdna的聚合酶鏈反應(pcr)擴增，所述愈傷組織預期含有整合到基因組中的感興趣核酸分子，然后進行標準克隆和pcr擴增產(chǎn)物的序列分析。pcr基因分型方法已被很好地描述(例如rios,g等人，(2002)plantj.32:243-53)，并可應用于來源于任何植物物種(例如，玉米)或組織類型(包括細胞培養(yǎng)物)的gdna。采用依賴于土壤桿菌的轉化方法形成的轉基因植物一般含有插入一個染色體中的單個重組dna。該單個重組dna的多核苷酸被稱為“轉基因事件”或“整合事件”。這樣的轉基因植物對于插入的外源多核苷酸而言是雜合的。在一些實施方案中，通過含有單個外源基因的獨立分離的轉基因植物與自身(例如t0植物)有性交配(自交)以產(chǎn)生tl種子，可獲得相對于轉基因為純合的轉基因植物。所產(chǎn)生的tl種子的四分之一相對于所述轉基因是純合的。萌發(fā)tl種子產(chǎn)生的植物可用于測試雜合性，所述測試一般使用snp測定或熱擴增測定，使得允許在雜合子和純合子之間進行區(qū)分(即，接合型測定)。在特定的實施方案中，在植物細胞中產(chǎn)生具有鞘翅目害蟲保護效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9種或10種或更多種不同irna分子?？梢詮囊氩煌D化事件中的多種核酸、或從引入單一轉化事件中的單一核酸表達irna分子(例如，dsrna分子)。在一些實施方案中，在單一啟動子的控制下表達多個irna分子。在其他實施方案中，在多個啟動子的控制下表達多個irna分子?？梢员磉_包含多個多核苷酸的單一irna分子，所述多核苷酸各自與在相同鞘翅目害蟲物種的不同群體中或在不同的鞘翅目害蟲物種中的一個或多個鞘翅目害蟲內的不同基因座(例如由seqidno:1、3和67定義的基因座)同源。除了用重組核酸分子直接轉化植物之外，可通過使具有至少一個轉基因事件的第一植物與缺乏這種事件的第二植物雜交來制造轉基因植物。例如，可將包含編碼irna分子的多核苷酸的重組核酸分子導入易于轉化的第一植物品系中而產(chǎn)生轉基因植物，其中轉基因植物可與第二植物品系雜交而使編碼irna分子的多核苷酸滲入到第二植物品系中。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的商業(yè)產(chǎn)品。具體的實施方案包括自含有本發(fā)明一種或多種多核苷酸的重組植物或種子產(chǎn)生的商業(yè)產(chǎn)品。包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的商業(yè)產(chǎn)品意在包括，但不限于：植物的粕、油類、碾碎的或完整的籽?；蚍N子，或包含含有本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的重組植物或種子的任何粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物產(chǎn)品。在一種或多種商品或商業(yè)產(chǎn)品中的檢出本發(fā)明的一種或多種多核苷酸，事實上證明該商品或商業(yè)產(chǎn)品是由為了利用dsrna介導的基因阻遏方法來控制害蟲的目的而設計為表達本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的轉基因植物生產(chǎn)的。在一些方面，包括由自轉化的植物細胞衍生的轉基因植物產(chǎn)生的種子和商業(yè)產(chǎn)品，其中種子或商業(yè)產(chǎn)品包含可檢出量的本發(fā)明的核酸。在一些實施方案中，例如，可以通過獲得轉基因植物并從它們制備食物或飼料來生產(chǎn)這樣的商業(yè)產(chǎn)品。包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的商業(yè)產(chǎn)品包括例如但不限于：植物的粕、油類、碾碎的或完整的籽?；蚍N子，和包含含有本發(fā)明的一種或多種核酸的重組植物或種子的任何粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物產(chǎn)品。在一種或多種商品或商業(yè)產(chǎn)品中的檢出本發(fā)明的一種或多種核酸，事實上證明該商品或商業(yè)產(chǎn)品是由為了控制鞘翅目害蟲的目的，設計為表達本發(fā)明的一種或多種irna分子的轉基因植物生產(chǎn)的。在其他實施方案中，包含本發(fā)明的核酸分子的轉基因植物或種子也可在其基因組中包含至少一個其他的轉基因事件，包括但不限于：自其轉錄靶向鞘翅目害蟲中與由seqidno:1、3和67定義的基因座不同的基因座的irna分子的轉基因事件；自其轉錄靶向與鞘翅目害蟲不同的生物(例如，植物寄生性線蟲)中的基因的irna分子的轉基因事件；編碼殺蟲蛋白(例如，蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白)的基因；除草劑耐性基因(例如提供對草甘膦耐性的基因)；以及促成轉基因植物中的期望表型的基因，所述期望表型例如產(chǎn)量增加、脂肪酸代謝改變、或細胞質雄性不育的恢復。在特定的實施方案中，可以在植物中將編碼本發(fā)明irna分子的多核苷酸與其他昆蟲控制和疾病性狀組合以實現(xiàn)增強的植物疾病和昆蟲損害的期望性狀。例如，由于對所述性狀的抗性的概率在田間將發(fā)生降低，組合采用獨特作用模式的昆蟲控制性狀可以對受保護的轉基因植物提供優(yōu)越的持久性，該持久性優(yōu)于含有單一控制性狀的植物。v.鞘翅目害蟲中的靶基因阻抑a.概述在本發(fā)明的一些實施方案中，可以對鞘翅目害蟲提供至少一種可用于控制鞘翅目害蟲的核酸分子，其中所述核酸分子在害蟲中導致rnai介導的基因沉默。在特定的實施方案中，可以對鞘翅目害蟲提供irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)。在一些實施方案中，可以通過使核酸分子與害蟲接觸來對鞘翅目害蟲提供可用于控制鞘翅目害蟲的核酸分子。在這些和另外的實施方案中，可以在鞘翅目害蟲的進食基質，例如營養(yǎng)組合物中提供可用于控制鞘翅目害蟲的核酸分子。在這些和另外的實施方案中，可以通過攝取被鞘翅目害蟲攝取的包含核酸分子的植物材料來提供可用于控制鞘翅目害蟲的核酸分子。在某些實施方案中，核酸分子通過表達導入植物材料中的重組核酸而存在于植物材料中，所述導入例如通過用包含重組核酸的載體轉化植物細胞，并從轉化的植物細胞再生植物材料或全植物來進行。b.rna介導的靶基因阻抑在具體實施方案中，本發(fā)明提供了irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)，可以設計此類分子使之靶向鞘翅目害蟲(例如wcr或ncr)的轉錄組中的必需天然多核苷酸(例如，必需基因)，例如設計有至少一條鏈包含與靶多核苷酸特異性互補的多核苷酸的irna分子。如此設計的irna分子的序列可以與靶多核苷酸相同，或者可以含有不會阻止irna分子與其靶多核苷酸之間的特異性雜交的錯配。本發(fā)明的irna分子可以在用于鞘翅目害蟲中基因阻抑的方法中使用，由此降低由害蟲對植物(例如，包含irna分子的受保護的轉化植物)引起的損害水平或發(fā)生率。如本文中使用的，術語“基因阻抑”是指用于降低由于基因轉錄成mrna及隨后mrna翻譯而產(chǎn)生的蛋白質水平，包括降低基因或編碼多核苷酸的蛋白質表達，包括任何公知的轉錄后抑制表達和轉錄阻抑表達的方法。通過從靶向阻抑的基因轉錄的mrna的全部或部分與用于阻抑的相應irna分子之間的特異性同源性而介導轉錄后抑制。另外，轉錄后抑制是指通過核糖體結合的細胞中可用的mrna量的實質性且可測量的降低。在其中rnai分子是dsrna分子的特定實施方案中，切丁酶這種酶可以將dsrna分子切割成短sirna分子(大約20個核苷酸長)。借助于切丁酶對dsrna分子的活性而生成的雙鏈sirna分子可以分成兩個單鏈sirna：“乘客鏈”和“引導鏈”。乘客鏈可以被降解，而引導鏈可以摻入risc中。通過引導鏈與mrna分子的特異性互補多核苷酸的特異性雜交，隨后通過酶argonaute(risc復合物的催化組分)切割而發(fā)生轉錄后抑制。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以使用任何形式的irna分子。本領域技術人員會理解的是，在制備過程中及在對細胞提供irna分子的步驟過程中，dsrna分子一般比單鏈rna分子更穩(wěn)定，并且一般在細胞中也是更穩(wěn)定的。因此，例如，雖然在一些實施方案中sirna和mirna分子可能是同等有效的，但是dsrna分子可以由于其穩(wěn)定性而被選用。在特定的實施方案中，提供了包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸可以在體外表達以產(chǎn)生irna分子，所述irna分子與由鞘翅目害蟲基因組內的多核苷酸編碼的核酸分子基本上同源。在某些實施方案中，體外轉錄的irna分子可以是包含莖環(huán)結構的穩(wěn)定化的dsrna分子。在鞘翅目害蟲接觸體外轉錄的irna分子后，可以發(fā)生對該鞘翅目害蟲中靶基因(例如，必需基因)的轉錄后抑制。在本發(fā)明的一些實施方案中，在用于對鞘翅目害蟲中靶基因的轉錄后抑制的方法中利用自包含多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸(例如至少19個連續(xù)核苷酸)的核酸分子的irna表達，其中所述多核苷酸選自下組：seqidno:1；seqidno:1的互補物；seqidno:3；seqidno:3的互補物；seqidno:67；seqidno:67的互補物；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；seqidno:3的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:3的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；seqidno:67的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:67的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:3的天然編碼多核苷酸；葉甲屬生物的包含seqidno:3的天然編碼多核苷酸的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:67的天然編碼多核苷酸；葉甲屬生物的包含seqidno:67的天然編碼多核苷酸的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)多核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)多核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:3的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)多核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:3的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)多核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:67的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)多核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:67的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)多核苷酸的片段的互補物。在某些實施方案中，可以使用與前述任一項至少約80％相同(例如，79％，約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、和100％)的核酸分子的表達。本發(fā)明的一些實施方案的重要特征在于，rnai轉錄后抑制系統(tǒng)能夠容忍靶基因中預期由于遺傳突變、株系多態(tài)性、或進化趨異而可能發(fā)生的序列變異。導入的核酸分子可以不必與靶基因的初級轉錄產(chǎn)物或完全加工的mrna絕對同源，只要導入的核酸分子與靶基因的初級轉錄產(chǎn)物或完全加工的mrna可特異性雜交即可。而且，相對于靶基因的初級轉錄產(chǎn)物或完全加工的mrna，導入的核酸分子可以不必是全長的。使用本文的irna技術抑制靶基因是序列特異性的；即，靶向與irna分子基本上同源的多核苷酸進行遺傳抑制。在一些實施方案中，可以使用包含具有與靶基因的一部分相同的核苷酸序列的多核苷酸的rna分子進行抑制。在這些和另外的實施方案中，可以使用包含相對于靶多核苷酸具有一個或多個插入、缺失和/或點突變的多核苷酸的rna分子。在特定的實施方案中，irna分子和靶基因的一部分可以共享例如至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、至少約100％、和100％的序列同一性?；蛘?，dsrna分子的雙鏈體區(qū)可以與靶基因轉錄物的一部分可特異性地雜交。在可特異性雜交的分子中，展現(xiàn)出較大同源性的小于全長的多核苷酸可補償較長的、同源性較低的多核苷酸。dsrna分子的雙鏈體區(qū)中與靶基因轉錄物的一部分相同的多核苷酸的長度可以是至少約15、25、50、100、200、300、400、500個、或至少約1000個堿基。在一些實施方案中，可以使用大于20個到100個核苷酸的多核苷酸；例如，可以使用100-200或300-500個核苷酸的多核苷酸。在特定的實施方案中，可以使用大于約200個到300個核苷酸的多核苷酸。在特定的實施方案中，根據(jù)靶基因的大小，可以使用大于約500個到1000個核苷酸的多核苷酸。在某些實施方案中，可以將鞘翅目害蟲中靶基因的表達在害蟲細胞內抑制至少10％；至少33％；至少50％；或至少80％，使得發(fā)生顯著抑制。顯著抑制是指高于閾值的抑制，所述抑制導致可檢出的表型(例如，生長、生殖、進食、發(fā)育等的停止)，或與所抑制的靶基因對應的rna和/或基因產(chǎn)物的可檢出降低。雖然在本發(fā)明的某些實施方案中，在害蟲的基本上所有細胞中均發(fā)生抑制，但在其他實施方案中，僅在表達靶基因的細胞的一個子集中發(fā)生抑制。在一些實施方案中，細胞中的轉錄阻抑由細胞中展現(xiàn)出與啟動子dna或其互補物的實質性序列同一性的dsrna分子的存在所介導，從而產(chǎn)生所謂的“啟動子反式阻抑”。基因阻抑可以在可以攝取或接觸此類dsrna分子的鞘翅目害蟲中針對靶基因發(fā)揮效果，例如通過害蟲攝取或接觸含有dsrna分子的植物材料。在啟動子反式阻抑中使用的dsrna分子可以特異性地設計為抑制或阻抑鞘翅目害蟲細胞中一種或多種同源或互補多核苷酸的表達。美國專利5,107,065；5,759,829；5,283,184；和5,231,020中公開了通過反義或有義取向的rna進行轉錄后基因阻抑以調節(jié)植物細胞中的基因表達。c.對鞘翅目害蟲提供的irna分子的表達可以許多體外或體內形式的任一種進行表達用于在鞘翅目害蟲中rnai介導的基因抑制的irna分子。然后，可以對鞘翅目害蟲提供irna分子，例如通過使irna分子與害蟲接觸，或通過引起害蟲攝取或以別的方式內在化irna分子。本發(fā)明的一些實施方案包括鞘翅目害蟲的經(jīng)轉化的宿主植物、經(jīng)轉化的植物細胞、和經(jīng)轉化的植物的后代。經(jīng)轉化的植物細胞和經(jīng)轉化的植物可以工程化改造為，例如，在異源啟動子控制下表達一種或多種irna分子，以提供害蟲保護效果。因此，當在鞘翅目害蟲在進食期間食用轉基因植物或植物細胞時，害蟲可以攝取轉基因植物或細胞中表達的irna分子。也可以將本發(fā)明的多核苷酸導入廣泛而多樣的原核和真核微生物宿主中以產(chǎn)生irna分子。術語“微生物”包括原核和真核物種，如細菌和真菌?；虮磉_的調變可以包括對此類表達的部分或完全阻抑。在另一個實施方案中，用于阻抑鞘翅目害蟲中基因表達的方法包括在害蟲宿主的組織中提供基因阻抑量的至少一種如本文中所描述的多核苷酸在轉錄后形成的dsrna分子，其至少一個區(qū)段與害蟲細胞內的mrna互補。鞘翅目害蟲所攝取的依照本發(fā)明的dsrna分子，包括其修飾的形式，如mirna、sirna、shrna、或hprna分子，可以與自hunchbackdna分子(例如包含選自seqidno:1、3和67的多核苷酸的hunchbackdna分子)轉錄的rna分子至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或約100％相同。因此，提供了用于提供本發(fā)明的dsrna分子的分離的且基本上純化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的多核苷酸和重組dna構建體，其在導入鞘翅目害蟲時阻抑或抑制其中的內源編碼多核苷酸或靶編碼多核苷酸的表達。特定的實施方案提供了用于遞送irna分子以轉錄后抑制鞘翅目植物害蟲中的一種或多種靶基因并控制該植物害蟲群體的遞送系統(tǒng)。在一些實施方案中，所述遞送系統(tǒng)涉及包括對宿主轉基因植物細胞或包含在宿主細胞中轉錄的rna分子的宿主細胞內容物的攝取。在這些和另外的實施方案中，創(chuàng)建轉基因植物細胞或轉基因植物，其含有可提供本發(fā)明的穩(wěn)定化dsrna分子的重組dna構建體。包含編碼特定irna分子的核酸的轉基因植物細胞和轉基因植物可以如下產(chǎn)生：采用重組dna技術(這些基礎技術是本領域中熟知的)構建包含編碼本發(fā)明的irna分子(例如，穩(wěn)定化的dsrna分子)的多核苷酸的植物轉化載體；以此轉化植物細胞或植物；并以此生成含有轉錄的irna分子的轉基因植物細胞或轉基因植物。為了對轉基因植物賦予針對鞘翅目害蟲的保護，可以例如將重組dna分子轉錄成irna分子，如dsrna分子、sirna分子、shrna分子、mirna分子、或hprna分子。在一些實施方案中，從重組dna分子轉錄的rna分子可以在重組植物的組織或流體內形成dsrna分子。這樣的dsrna分子可以包含在多核苷酸的一部分中，所述多核苷酸與可侵染宿主植物的類型的鞘翅目害蟲內的dna轉錄的相應多核苷酸相同。鞘翅目害蟲內靶基因的表達被所述dsrna分子所阻抑，并且該害蟲中靶基因表達的阻抑導致該轉基因植物對該害蟲有抗性。已經(jīng)顯示dsrna分子的調控作用可適用于害蟲中表達的多種基因，包括例如負責細胞分裂、染色體重塑、以及細胞代謝或細胞轉化的內源基因，包括管家基因；轉錄因子；蛻皮相關基因；和編碼涉及細胞代謝或正常生長和發(fā)育的多肽的其他基因。為了從體內轉基因或表達構建體轉錄，可以在一些實施方案中使用調節(jié)區(qū)(例如，啟動子、增強子、沉默子、和多聚腺苷酸化信號)以轉錄一條或多條rna鏈。因此，在一些實施方案中，如上文提出的，在產(chǎn)生irna分子中使用的多核苷酸可以與在植物宿主細胞中有功能的一種或多種啟動子元件可操作連接。啟動子可以是通常駐留于宿主基因組中的內源啟動子。在可操作連接的啟動子元件控制下的本發(fā)明的多核苷酸可以進一步被其他有利地影響其轉錄和/或所得轉錄物的穩(wěn)定性的元件所側翼。這樣的元件可以位于可操作連接啟動子的上游、表達構建體3'端的下游、并且可以同時存在于啟動子的上游和表達構建體3'端的下游。在實施方案中，靶基因(例如，hunchback基因)的抑制導致親代rnai表型；在與irna分子接觸的受試者(例如，鞘翅目害蟲)的后代中可觀察到的表型。在一些實施方案中，prnai表型包括害蟲產(chǎn)生可存活的后代的能力被降低。在prnai的具體實例中，啟動prnai的核酸不增加被遞送該核酸的群體(例如，在包括幼蟲的總群體中的成蟲群體)中死亡的發(fā)生率。在prnai的其它實例中，啟動prnai的核酸也增加被遞送該核酸的群體中的死亡的發(fā)生率。在一些實施方案中，令鞘翅目害蟲群體與irna分子接觸，從而導致prnai，其中害蟲存活并交配，但是所產(chǎn)生的卵孵化出可存活后代的能力小于未被提供該核酸的相同物種的害蟲產(chǎn)生的卵。在某些例子中，這樣的害蟲不產(chǎn)卵，或者其產(chǎn)卵少于未與該irna分子接觸的相同物種的害蟲中可觀察到的產(chǎn)卵。在一些實例中，由這樣的害蟲產(chǎn)卵不能孵化，或者孵化的速率顯著低于未與該irna分子接觸的相同物種的害蟲中可觀察到的速率。在一些實例中，從這樣的害蟲產(chǎn)的卵孵化的幼蟲的存活力低于從未與該irna分子接觸的相同物種的害蟲中可觀察到的存活力。產(chǎn)生可保護其免受昆蟲攝食的物質的轉基因作物易于遭到目標昆蟲種群的適應，從而難以持久受益于昆蟲保護物質。傳統(tǒng)上，通過下述手段實現(xiàn)對轉基因作物的蟲害適應的延遲：(1)種植“避難所”(不包含殺蟲物質的作物，因此允許對殺蟲物質敏感的昆蟲的存活)，和/或(2)將殺蟲物質與針對目標害蟲的多種作用方式相結合，使得對一種作用模式有抗性的個體被另一種作用模式殺死。在一些實例中，irna分子(例如，從宿主植物中的轉基因表達的)提供新的作用模式，以供與蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白技術昆蟲和/或致死rnai技術組合成為昆蟲抗性管理基因金字塔(insectresistancemanagementgenepyramids)，以減輕昆蟲群體對這兩種控制技術中任一者發(fā)生抗性。親代rnai在某些實施方案中可以導致一種類型的害蟲控制，此類型不同于通過致死性rnai獲得的控制，并且可以與致死性rnai組合以產(chǎn)生協(xié)同性的害蟲控制。因此，在具體實施方案中，用于在鞘翅目植物害蟲中的一個或多個靶基因的轉錄后抑制的irna分子可以與其他irna分子組合以提供冗余的rnai靶向和協(xié)同的rnai效應。導致卵死亡或卵活力喪失的親代rnai(prnai)有可能為利用rnai和其他機制進行昆蟲保護的轉基因作物帶來更多的耐久性益處。prnai可防止暴露的昆蟲產(chǎn)生后代，因此可防止它們將其攜帶的任何賦予對殺蟲物質的抗性的等位基因傳遞到下一代。prnai當與一種或多種可提供對相同害蟲種群的保護的其他殺蟲物質組合時，對于延長受保護的轉基因作物的耐久性特別有用。此類另外的殺蟲物質在一些實施方案中可以包括例如：dsrna；對幼蟲有活性的dsrna；殺蟲蛋白(如來自蘇云金芽孢桿菌或其他生物的那些)；和其他殺蟲物質。這種益處的產(chǎn)生是因為，在轉基因作物中對殺蟲物質具有抗性的昆蟲在群體中出現(xiàn)的比例高于避難所作物中。如果當prnai存在時，傳遞給下一代的抗性等位基因與易感等位基因的比例比prnai不存在時低，則抗性的演化將會延遲。例如，prnai可能不會減少對表達irna分子的植物造成損害的第一害蟲世代中的個體數(shù)量。然而，這樣的害蟲維持后續(xù)世代侵染的能力可能會降低。相反，致死性rnai可能會殺死已經(jīng)正在侵染植物的害蟲。當prnai與致死性rnai組合時，與親代irna分子接觸的害蟲可以來自系統(tǒng)外部的未與irna接觸的害蟲繁育，然而，這種交配的后代可能無法存活或存活力低，因此可能無法侵染植物。同時，與致死性irna分子接觸的害蟲也可能直接受到影響。這兩種效應的結合可能是協(xié)同性的；即prnai和致死性rnai的組合效應可以大于prnai和致死性rnai的獨立效應之和。prnai可例如通過如下方式與致死性rnai組合：提供表達致死性irna分子和親代irna分子的植物；通過在同一位置提供表達致死性irna分子的第一植物和表達親代irna分子的第二植物；和/或通過使雌性和/或雄性害蟲與prnai分子接觸，隨后將接觸過的害蟲釋放到植物環(huán)境中，使得它們可以與植物害蟲非生產(chǎn)性地交配。一些實施方案提供了用于降低由以植物為食的鞘翅目害蟲引起的對宿主植物(例如，玉米植物)的損害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表達本發(fā)明的至少一種核酸分子的轉化植物細胞，其中所述核酸分子在被害蟲攝取后發(fā)揮功能以抑制該害蟲內靶多核苷酸的表達，該表達抑制除了導致該害蟲死亡和/或生長降低之外，還例如導致該害蟲生殖降低，由此降低由該害蟲引起的對宿主植物的損害。在一些實施方案中，核酸分子包含dsrna分子。在這些和另外的實施方案中，核酸分子包含dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超過一種與鞘翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸。在一些實施方案中，核酸分子由一種多核苷酸組成，所述多核苷酸與鞘翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交。在其他實施方案中，提供了用于提高玉米作物產(chǎn)量的方法，其中所述方法包括將本發(fā)明的至少一種核酸分子導入玉米植物中；并栽培玉米植物以容許表達包含核酸的irna分子，其中包含所述核酸的irna分子的表達可抑制鞘翅目害蟲損害和/或生長，由此降低或消除由于鞘翅目害蟲侵染所致的產(chǎn)量損失。在一些實施方案中，irna分子是dsrna分子。在這些和另外的實施方案中，核酸分子包含dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超過一種與鞘翅目害蟲細胞中表達的核酸分子特異性可雜交的多核苷酸。在一些實施方案中，所述核酸分子由與鞘翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸組成。在一些實施方案中，提供了用于提高植物作物產(chǎn)量的方法，其中所述方法包括將至少一種本發(fā)明的核酸分子引入雌性鞘翅目害蟲(例如通過注射、通過攝取、噴霧和通過自dna表達)；并將該雌性害蟲釋放到作物中，其中包括該雌性害蟲的配對(matingpair)無法產(chǎn)生可存活的后代或產(chǎn)生可存活后代的能力降低，從而減少或消除由于鞘翅目害蟲侵襲引起的產(chǎn)量損失。在具體實施方案中，這種方法提供對所述害蟲的后續(xù)世代的控制。在類似的實施方案中，該方法包括將本發(fā)明的核酸分子引入雄性鞘翅目昆蟲，并將該雄性害蟲釋放到作物中(例如，其中prnai雄性害蟲比未處理的對照產(chǎn)生的精子少)。例如，鑒于wcr雌性通常只交配一次，可以用這些prnai雌性和/或雄性進行競爭，以在求偶時對天然wcr昆蟲形成壓倒性優(yōu)勢。在一些實施方案中，核酸分子是表達產(chǎn)生irna分子的dna分子。在一些實施方案中，核酸分子是dsrna分子。在這些和進一步的實施方案中，核酸分子包含dsrna分子，每個dsrna分子包含多于一個與在鞘翅目有害生物細胞中表達的核酸分子可特異性雜交的的多核苷酸。在一些實施方案中，核酸分子由與鞘翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性雜交的一個多核苷酸組成。在一些實施方案中，提供了用于調變鞘翅目害蟲中靶基因表達的方法，所述方法包括：用包含編碼本發(fā)明的至少一種irna分子的多核苷酸的載體轉化植物細胞，其中所述多核苷酸與啟動子和轉錄終止元件可操作連接；在足以容許形成包含多個轉化植物細胞的植物細胞培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉化的植物細胞；選擇已經(jīng)將核酸分子整合到其基因組中的轉化植物細胞；對轉化植物細胞篩選由整合的核酸分子編碼的irna分子的表達；選擇表達irna分子的轉基因植物細胞；并且用選擇的轉基因植物細胞喂養(yǎng)鞘翅目害蟲。也可以從表達由整合的核酸分子編碼的irna分子的轉化植物細胞再生植物。在一些實施方案中，irna分子是dsrna分子。在這些和另外的實施方案中，核酸分子包含dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超過一種與鞘翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸。在一些實例中，核酸分子由與鞘翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸組成。可以將本發(fā)明的irna分子作為來自摻入植物細胞基因組中的重組基因的表達產(chǎn)物、或者摻入應用于種植前種子的包衣或種子處理中而摻入植物物種(例如，玉米)的種子之內。包含重組基因的植物細胞被視為轉基因事件。本發(fā)明的實施方案中還包括用于將irna分子投送給鞘翅目害蟲的遞送系統(tǒng)。例如，可以將本發(fā)明的irna分子直接導入害蟲的細胞中。用于導入的方法可以包括將irna直接混合到鞘翅目害蟲的餌食中(例如通過與該害蟲的宿主的植物組織混合)，以及對宿主植物組織應用包含本發(fā)明的irna分子的組合物。例如，可將irna分子噴霧到植物表面上?；蛘?，可以通過微生物表達irna分子，并且可以將微生物施加到植物表面上，或通過物理手段諸如注射導入根或莖中。如上文論述的，也可以對轉基因植物進行遺傳工程改造，使其以足以殺死已知侵染植物的鞘翅目害蟲的量表達至少一種irna分子。通過化學或酶促合成產(chǎn)生的irna分子也可以以符合常見農(nóng)業(yè)實踐的方式配制，并且作為噴霧產(chǎn)品使用以控制鞘翅目害蟲所致的植物損害。配制劑可以包含有效的葉覆蓋需要的適當輔料(例如粘著劑(sticker)和濕潤劑)，以及保護irna分子(例如，dsrna分子)免于uv損傷的uv保護劑。這樣的添加劑通常在生物殺蟲劑產(chǎn)業(yè)中使用，并且是本領域技術人員熟知的。這樣的應用可以與其他噴霧殺蟲劑應用(基于生物學的或其他方面)組合以增強針對害蟲的植物保護。本文中所討論的所有參考文獻，包括本文引用的出版物，專利和專利申請，均通過引用并入本文，只要與本公開的明確細節(jié)不沖突，如同單獨地和具體地明示將每篇參考文獻通過引用并入本文一樣。本文所討論的參考文獻僅為其在本申請的申請日之前的公開內容而提供。本文中任何內容不應被解釋為承認發(fā)明人無權憑借在先發(fā)明而先于這些公開。提供以下實施例以展示某些具體特征和/或方面。這些實施例不應被理解為將本公開限于本文中描述的具體特征或方面。實施例實施例1：材料和方法用于葉甲屬幼蟲進食測定的樣品制備和生物測定使用rnai試劑盒(lifetechnologies)或t7體外轉錄試劑盒合成并純化了若干dsrna分子(包括對應于hunchback的那些)。將純化的dsrna分子準備在te緩沖液中，并且所有生物測定均包含由該緩沖液組成的對照處理，用作wcr的死亡率或生長抑制的背景檢查。使用nanodroptm8000分光光度計(thermoscientific，wilmington，de)測量生物測定緩沖液中dsrna分子的濃度。在使用飼喂人工昆蟲餌食的新生昆蟲幼蟲的生物測定中測試樣品的昆蟲活性。wcr卵獲自cropcharacteristics，inc(farmington，mn)。生物測定在特別為昆蟲生物測定設計的128孔塑料托盤(c-dinternational，pitman，nj)中進行。每個孔含有約1.0ml設計用于鞘翅目昆蟲生長的餌食。通過移液管將60μl等份的dsrna樣品遞送到每個孔的1.5cm2餌食表面(40μl/cm2)。dsrna樣品濃度作為孔中每平方厘米(ng/cm2)表面積的dsrna量來計算。將處理的托盤保持在通風櫥中，直到餌食表面上的液體蒸發(fā)或吸收到餌食中。在破殼后的幾個小時內，用濕潤的駱駝毛刷拾取幼蟲個體，并且將其放置在處理的餌食(每孔一個或兩個幼蟲)上。然后用透明塑料粘合片密封128孔塑料托盤上帶蟲的孔，并通氣以允許氣體交換。將生物測定盤在受控環(huán)境條件(28℃，～40％相對濕度，16:8(光照:黑暗))下保持9天，而后記錄暴露于每個樣品的昆蟲總數(shù)、死亡的昆蟲數(shù)、和存活昆蟲的重量。計算每個處理的百分比死亡率、平均生存重量、以及生長抑制。生長受阻(stunting)定義為平均生存重量的減少。生長抑制(gi)計算如下:gi＝[1-(twit/tnit)/(twibc/tnibc)]，其中twit是處理中活昆蟲的總重量；tnit是處理中的昆蟲總數(shù)；twibc是背景檢查中的活昆蟲的總重量(緩沖液對照)；和tnibc是背景檢查中的昆蟲總數(shù)(緩沖液對照)。gi50規(guī)定為gi值為50％時餌食中樣品的濃度。lc50(50％致死濃度)作為50％的測試昆蟲被殺死時的樣品濃度記錄。統(tǒng)計學分析使用jmptm軟件(sas,cary,nc)進行。實施例2：來自葉甲屬的候選靶基因的鑒定選擇來自wcr(玉米根螢葉甲)的多個發(fā)育期的昆蟲進行匯集的轉錄組分析，以提供通過rnai轉基因植物保護技術控制的候選靶基因序列。在一個范例中，從約0.9gm的完整第一齡wcr幼蟲(孵化后4到5天；保持在16℃)分離總rna，并使用下述基于苯酚/tri的方法(molecularresearchcenter,cincinnati,oh)進行純化。將幼蟲于室溫在具有10mltri的15ml勻漿器中均質化，直到獲得均勻的懸浮液時為止。在室溫溫育5分鐘后，將勻漿分配到1.5ml微量離心管中(每管1ml)，添加200μl氯仿，并將混合物強力振搖15秒。在室溫提取10分鐘之后，通過在4℃以12,000xg離心分離各個相。將上層相(包含約0.6ml)小心轉移到另一個無菌的1.5ml管中，并添加等體積的室溫異丙醇。在室溫溫育5到10分鐘之后，將混合物在12,000xg(4℃或25℃)離心8分鐘。將上清液小心取出并棄去，并將rna離心沉淀通過用75％乙醇渦旋振蕩洗滌兩次，在每次洗滌后通過在7,500xg(4℃或25℃)離心5分鐘回收。小心去除乙醇，讓離心沉淀風干3至5分鐘，然后溶解在無核酸酶的無菌水中。通過在260nm和280nm測量吸光度(a)測定rna濃度。從約0.9gm幼蟲的典型提取產(chǎn)生超過1mg的總rna，其中a260/a280比為1.9。如此提取的rna在80℃貯存，直到進一步處理。通過使等份跑1％瓊脂糖凝膠確定rna質量。在經(jīng)高溫滅菌的容器中，使用經(jīng)depc(焦碳酸二乙酯)處理的水稀釋的高溫滅菌的10xtae緩沖液(tris乙酸鹽edta；1x濃度為0.04mtris乙酸鹽，1mmedta(乙二胺四乙酸鈉鹽，ph8.0)制成瓊脂糖凝膠溶液。使用1xtae作為運行緩沖液。在使用前，用rnaseawaytm(invitrogeninc.,carlsbad,ca)清潔電泳槽和造孔梳。將2μlrna樣品與8μlte緩沖液(10mmtrishclph7.0；1mmedta)和10μlrna樣品緩沖液(目錄號70606；emd4bioscience,gibbstown,nj)混合。將樣品于70℃加熱3分鐘，冷卻至室溫，每孔上樣5μl(含有1μg到2μgrna)。將市售的rna分子量標記物在分離的孔中同時運行以進行分子大小比較。在60伏特下跑膠2小時。由服務提供商(eurofinsmwgoperon,huntsville,al)利用隨機引發(fā)從幼蟲總rna制備標準化的cdna文庫。在eurofinsmwgoperon通過gsflx454titaniumtm系列化學以1/2板的規(guī)模對標準化的幼蟲cdna文庫進行測序，其產(chǎn)生具有平均讀段長度348bp的超過600,000個讀段。將350,000個讀段裝配成超過50,000個重疊群。使用公眾可訪問的程序f0rmatdb(可在ncbi訪問)將未裝配的讀段和重疊群兩者都轉換成可blast的數(shù)據(jù)庫。類似地從其他wcr發(fā)育期收獲的材料制備了總rna和標準化的cdna文庫。合并代表各個發(fā)育期的cdna文庫成員，構建了用于靶基因篩選的匯集的轉錄組文庫。利用關于其他昆蟲如果蠅屬(drosophila)和擬谷盜屬(tribolium)中的致死性效應的信息選擇了用于rnai靶向的候選基因。例如，選擇了間隙基因hunchback，一種在早期胚胎發(fā)育中建立前-后極性所必需的轉錄因子，選擇的基礎是hunchback功能在果蠅屬和擬谷盜屬中的保守(brizuelaetal.(1994)genetics137(3):803-13；schroder(2003)nature422(6932):621-5；marques-souzaetal.(2008)development135(5):881-8)。使用候選蛋白質編碼多核苷酸針對含有未裝配的葉甲屬序列讀段或已裝配的重疊群的可blast數(shù)據(jù)庫進行tblastn搜索。對于與葉甲屬序列的顯著命中(定義為：對于重疊群同源性，好于e-20；對于未裝配的序列讀段同源性，好于e-10)，使用blastx針對ncbi非冗余數(shù)據(jù)庫加以確認。此blastx搜索的結果確認，在tblastn搜索中鑒定的葉甲屬同源物候選基因序列確實包含葉甲屬基因，或者是在葉甲屬序列中可用的對非葉甲屬候選基因序列的最佳命中。在大多數(shù)情況下，被注釋為編碼蛋白質的擬谷盜屬候選基因呈現(xiàn)出明確的與葉甲屬轉錄物組序列中的一種或多種序列的序列同源性。在少數(shù)情況下可明顯看出，某些基于與非葉甲屬候選基因的同源性選擇的葉甲屬重疊群或未裝配的序列讀段有重疊，而且重疊群的裝配未能連接起這些重疊。在這些情況下，使用sequenchertmv4.9(genecodescorporation,annarbor,mi)將序列裝配成更長的重疊群。玉米根螢葉甲的其他轉錄組測序先前已經(jīng)有描述。eyunetal.(2014)plosone9(4):e94052。在另一個示例中，使用illuminatm配對末端和454titanium測序技術，從由卵制備的cdna(15,162,017個經(jīng)過濾的illuminatm末端配對讀段)、由新生蟲制備的cdna(721,697,288個經(jīng)過濾的illuminatm末端配對讀段)和由三齡幼蟲的中腸制備的cdna(44,852,488個illuminatm末端配對讀段和415,742個roche454讀段，兩者都經(jīng)過過濾)測序了總共約700吉堿基(gigabases)。使用trinity(grabherretal.(2011)nat.biotechnol.29(7):644-52)對三個樣品中的每一個，以及對匯集的數(shù)據(jù)集進行了從頭轉錄組裝配。匯集組合產(chǎn)生了163,871個重疊群，平均長度為914bp。使用果蠅屬或擬谷盜屬的hunchback的氨基酸序列作為查詢序列，用tblastn以10-5的截止e值搜索根蟲轉錄組和基因組數(shù)據(jù)庫(未發(fā)表)。將推導的氨基酸序列用clustalxtm比對并用genedoctm軟件編輯。鑒定了一個可能導致鞘翅目害蟲死亡，或wcr中的生長、發(fā)育或生殖抑制的候選靶基因，其包括轉錄物seqidno:1，以及子序列seqidno:3和seqidno:67。這些序列編碼一種hunchback蛋白或其子區(qū)域，對應于一種c2h2型鋅指蛋白家族轉錄因子，該c2h2型鋅指蛋白家族轉錄因子又被定義為間隙基因(gapgene)，該基因的丟失導致軀體模式(bodyplan)中產(chǎn)生間隙。在wcrhunchback序列中，使用smart數(shù)據(jù)庫(可在萬維網(wǎng)上interproscan訪問)在這種具有573個氨基酸的蛋白質的第226-248、255-277、283-305、311-335、520-542、和548-572位處預測了6個c2h2型鋅指結構域，這與其作為鋅指轉錄因子的作用一致。圖2。seqidno:1的多核苷酸是新的。該序列未提供在公共數(shù)據(jù)庫中，并且沒有在wo/2011/025860；美國專利申請?zhí)?0070124836；美國專利申請?zhí)?0090306189；美國專利申請?zhí)杣s20070050860；美國專利申請no.20100192265；或美國專利7,612,194中公開。在genbank中檢索未找到顯著的同源性核苷酸序列。葉甲屬hunchback氨基酸序列(seqidno:2)的最接近的同源物是一種赤擬谷盜蛋白，其genbank登錄號為np_001038093.1(66％相似，在同源性區(qū)域上53％相同)。利用葉甲屬候選hunchback基因的全長序列或部分克隆產(chǎn)生pcr擴增子用于dsrna合成。還從一個包含黃色熒光蛋白(yfp)編碼區(qū)(seqidno:10；shaginetal.(2004)mol.biol.evol.21:841-850)的dna克隆中擴增了dsrna。實施例3：來自葉甲屬的靶基因的擴增設計引物來通過pcr擴增每個靶基因的編碼區(qū)部分。參見表1。在適當?shù)那闆r下，將t7噬菌體啟動子元件(taatacgactcactataggg；seqidno:4)引入擴增的有義或反義鏈的5'端。參見表1。從wcr提取總dna，并使用相反向的引物，使用第一鏈cdna作為模板進行pcr反應，引物的位置可擴增天然靶基因序列的全部或部分。表1.用于擴增示例性hunchback和yfp靶基因的編碼區(qū)部分的引物和引物對實施例4：rnai構建體通過pcr制備模板和dsrna合成。用于為hunchbackdsrna產(chǎn)生提供特定模板的策略如圖1a和圖1b所示。分別通過使用引物對1和引物對2(表1)和(作為pcr模板的)由總rna制備的第一鏈cdna，通過pcr制備了準備用于hunchbackreg1或hunchbackv1dsrna合成的模板dna。對于hunchbackreg1和hunchbackv1的選定的靶基因區(qū)域，進行了兩個分別的pcr擴增。圖1。第一個pcr擴增在擴增出的有義鏈的5'末端引入t7啟動子序列。第二個反應將t7啟動子序列納入反義鏈的5'末端。然后將目標基因的每個區(qū)域的兩個pcr擴增片段以大約相等的量混合，并將該混合物用作dsrna產(chǎn)生的轉錄模板。圖1。用特異性引物擴增的hunchbackreg1dsrna模板序列如seqidno:3所公開。用特定引物擴增的hunchbackv1dsrna模板序列如seqidno:67所公開。對于yfp陰性對照，進行單次pcr擴增。圖1b。pcr擴增在擴增出的有義鏈和反義鏈的5'端引入t7啟動子序列。然后將目標基因的每個區(qū)域的兩個pcr擴增片段以大約相等的量混合，并將該混合物用作dsrna產(chǎn)生的轉錄模板。圖1b。使用引物對3(表1)和yfp編碼區(qū)的dna克隆作為模板產(chǎn)生陰性對照yfp編碼區(qū)的dsrna(seqidno:10)。使用引物對4(表1)從pizt/v5-his表達載體(invitrogen)擴增了gfp陰性對照。使用megascript高產(chǎn)轉錄試劑盒(appliedbiosystemsinc.，fostercity，ca)，將為hunchback和gfp而擴增的pcr產(chǎn)物用作體外合成dsrna的模板。使用rneasymini試劑盒(qiagen，valencia，ca)或rnai試劑盒，大體上按制造商的說明書規(guī)定純化合成的dsrna。使用nanodroptm8000分光光度計(thermoscientific，wilmington，de)或等效手段定量dsrna制備物，并通過凝膠電泳分析以確定純度。實施例5：在葉甲屬幼蟲中篩選候選靶基因重復的生物測定表明，在基于餌食的測定中，在實施例2中鑒定的來源于hunchbackreg1靶基因序列的合成dsrna制備物的攝取導致了西方玉米根蟲幼蟲的死亡和生長抑制。表2。表2.暴露于單劑量dsrna9天后的wcr幼蟲的基于餌食的進食生物測定結果。方差分析發(fā)現(xiàn)平均％死亡率(mort.)和平均％增長抑制(gi)有一些顯著差異。使用tukey-kramer檢驗，各平均值是分離的。*sem-均值標準誤。括號中的字母指示統(tǒng)計學水平。不連接相同字母的水平是顯著差異的(p<0.05)。**te-trishcl(1mm)加edta(1mm)緩沖液，ph7.2。***yfp-黃色熒光蛋白以前曾經(jīng)有人提出，葉甲屬某些物種的某些基因可用于rnai介導的昆蟲控制。參見美國專利公開號2007/0124836，其中公開了906個序列，和美國專利7,614,924，其中公開了9,112個序列。然而，許多被建議用于rnai介導的昆蟲控制的基因被確定在控制葉甲屬方面是無效的。還確定了，與其他被建議可用于rnai介導的昆蟲控制的基因相比，hunchbackreg1提供了對葉甲屬的驚人和意想不到的控制。例如，美國專利7,614,924中提出了膜聯(lián)蛋白、β血影蛋白2和mtrp-l4，以在rnai介導的昆蟲控制中有效。seqidno:11是膜聯(lián)蛋白區(qū)域1的dna序列，seqidno:12是膜聯(lián)蛋白區(qū)域2的dna序列。seqidno:13是β血影蛋白2區(qū)域1的dna序列，seqidno:14是β血影蛋白2區(qū)域2的dna序列，seqidno:15是mtrp-l4區(qū)域1的dna序列，seqidno:16是mtrp-l4區(qū)域2的dna序列。通過實施例4(圖1)的雙引物對方法，將上述每個序列用于產(chǎn)生dsrna，并且將這些dsrna分別通過上述基于餌食的生物測定法加以測試。yfp序列(seqidno:10)也用于產(chǎn)生dsrna作為陰性對照。表3列出了用于產(chǎn)生膜聯(lián)蛋白、β血影蛋白2、mtrp-l4和yfpdsrna分子的引物序列。表4顯示了暴露于這些dsrna分子9天后wcr幼蟲基于餌食的進食生物測定的結果。重復的生物測定表明攝入這些dsrna導致西方玉米根蟲幼蟲的死亡或生長抑制高于te緩沖液、yfpdsrna或水等對照樣品所見。表3.用于擴增基因的編碼區(qū)的部分的引物和引物對表4.西方玉米根蟲幼蟲獲得的餌食進食測定的結果實施例6：用于葉甲屬成蟲進食測定的樣品制備和生物測定法通過將對應于hunchback目標基因序列區(qū)段的dsrna加入到妊娠成年雌性中，進行西方玉米根蟲的親本rna干擾(rnai)。成蟲根蟲(羽化后<48小時)獲自cropcharacteristics，inc.(farmington，mn)。成蟲飼養(yǎng)在23±1℃，相對濕度>75％，所有生物測定的光:暗周期為8小時：16小時。昆蟲飼養(yǎng)餌食借鑒自bransonandjackson(1988),j.kansasentomol.soc.61:353-55。向包含2.9％瓊脂和5.6ml甘油的雙蒸水的溶液中加入干成分(48gm/100ml)。此外，每100ml餌食中加入0.5ml含有47％丙酸和6％磷酸溶液的混合物以抑制微生物生長。將瓊脂溶于沸水中，加入干成分、甘油和丙酸/磷酸溶液，充分混合，倒至約2mm的深度。用1號軟木鑿子從餌食中切下固化的餌食小栓(直徑約4mm，高2mm；25.12mm3)。6個雄性和雌性成蟲(24至48小時齡)用未經(jīng)處理的人工餌食維持，并在帶排氣蓋的16孔盤(5.1cm長×3.8cm寬×2.9高)中令它們交配4天。在第五天，將雄性從容器中取出，并將雌性飼養(yǎng)在用3μlhunchbackreg1(seqidno:3)基因特異性dsrna(2μg/餌食小栓；約79.6ng/mm3)處理的人工餌食表面小栓上。對照處理由暴露于用相同濃度的gfpdsrna(seqidno:9)或相同體積水處理的餌食的妊娠雌性組成。如上所述使用在其5'末端具有t7啟動子序列(seqidno:7和8)的相反引物產(chǎn)生gfpdsrna。在整個實驗中每隔一天提供用dsrna處理的新鮮人工餌食。在第11天，將雌性轉移到產(chǎn)卵籠(7.5cm×5.5cm×5.5cm)(showman箱，althorproducts，wilton，ct)中，籠中有60目篩子過篩的高壓滅菌的粉質粘土壤土(jackson(1986)rearingandhandlingofdiabroticavirgiferaanddiabroticaundecimpunctatahowardi.收錄于l.krysanandt.a.miller,eds.methodsforthestudyofpestdiabrotica.springer-verlag,newyork，第25-47頁)。允許雌性產(chǎn)卵4天，卵在產(chǎn)卵箱內土壤中27℃孵化10天，然后通過用60目篩網(wǎng)清洗產(chǎn)卵土壤將卵從土壤中取出。用甲醛(500μl甲醛在5ml雙蒸水中)和甲基-(丁基氨基甲酰)-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(0.025g在50ml雙蒸水中)的溶液處理卵以防止真菌生長。從產(chǎn)卵箱中取出的雌性和每次處理的卵的子樣品(subsamples)在液氮中快速冷凍，用于后續(xù)通過定量rt-pcr進行表達分析(見實施例7)。用dino-litepro數(shù)字顯微鏡(torrance，ca)拍攝各皿，并使用imagej軟件的細胞計數(shù)器功能計數(shù)總卵數(shù)(schneider等(2012)nat.methods9：671-5)。將收獲的卵保持在培養(yǎng)皿中28℃的濕濾紙上，并監(jiān)測15天以確定卵活力。分別在不同的日子運行六個重復，每個包含三到六個雌性。每天記錄每次處理的幼蟲孵化次數(shù)，直至不再觀察到孵化。wcr雌性成蟲攝取hunchbackreg1dsrna分子證明對卵活力有驚人的、劇烈的、可重復的影響。暴露于hunchbackdsrna的經(jīng)交配的雌性所產(chǎn)的卵數(shù)與暴露于未處理的餌食或用gfpdsrna處理的餌食的雌性產(chǎn)的卵數(shù)大致相等(圖3a；表5)。然而，從暴露于hunchbackdsrna的雌性中收集的卵是無存活力的(圖3b；表5)。暴露于hunchbackdsrna的雌性成蟲有<3％的卵孵化。圖3a和3b以圖形方式總結了表5關于dsrna處理對卵產(chǎn)量和卵活力的影響的數(shù)據(jù)。表5.在攝入經(jīng)處理的人工餌食11天后，hunchbackdsrna對wcr產(chǎn)卵和卵活力的影響。使用成對比較，各平均值是分離的。*sem-均值標準誤。括號中的字母指定統(tǒng)計學水平。連接有不相同字母的水平是差異顯著的(p<0.05)。解剖來自每個處理的未孵化的卵，以檢查胚胎發(fā)育并估計親代rnai(prnai)的表型應答。用gfpdsrna處理的wcr雌性產(chǎn)的卵顯示正常發(fā)育。圖4a。相比之下，用hunchbackreg1dsrna處理的雌性產(chǎn)的卵在卵內顯示出一些胚胎發(fā)育，但是當被解剖時，其被明顯縮短，并且似乎缺少許多腹節(jié)和胸節(jié)，盡管應答在個體幼蟲之間有差異。圖4b。因此，本發(fā)明的一個意想不到且令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，攝入的hunchbackdsrna對幼蟲具有致死或生長抑制作用。令人驚訝和意想不到的是，妊娠wcr雌性成蟲攝取hunchbackdsrna顯著地影響了卵生產(chǎn)和卵活力，而對雌性成蟲本身沒有可覺察的劇烈影響。上述結果清楚地記錄了西方玉米根蟲幼蟲和成蟲中rnai的全身性性質，以及實現(xiàn)親代效應的潛力，在該親代效應中，在暴露于dsrna的雌性的卵中，與胚胎發(fā)育相關的基因被敲低。重要的是，這是西方玉米根蟲中攝入dsrna的prnai應答的首例報道?；谠谙?這里發(fā)生著dsrna的暴露和攝取)以外的組織中的觀察到敲低現(xiàn)象，來指示全身性應答。由于一般而言昆蟲——具體說是根蟲——缺乏與植物和線蟲中的全身性反應相關的rna依賴性rna聚合酶，我們的結果證實dsrna可以被腸組織吸收并轉運到其他組織(例如，發(fā)育中的卵巢管)。人們能夠敲除涉及胚胎發(fā)育的基因的表達，使得卵不孵化，這為實現(xiàn)和改善西方玉米根蟲的控制提供了獨特的機會。因為成蟲容易取食地上生殖組織(如玉米絲和玉米纓)，根蟲成蟲可以通過dsrna的轉基因表達暴露于irna控制劑，以通過防止卵孵化而在下一代獲得根保護。通過在玉米植物中通過dsrna的轉基因表達或通過與表面施加的irna的接觸來遞送dsrna，為直接靶向幼蟲并提高害蟲管理策略的總體耐久性的其他轉基因方法提供了重要的堆疊伙伴。實施例7：實時pcr分析使用rneasyminikit(qiagen，valencia，ca)，根據(jù)制造商的建議，從成年雌性、雄性、被處理的雌性孵化的幼蟲和卵的全體分離總rna。在轉錄反應開始之前，使用quantitech逆轉錄試劑盒(qiagen，valencia，ca)用dna酶處理總rna，以去除任何gdna?？俽na(500ng)用于合成第一鏈cdna作為實時定量pcr(qpcr)模板。通過分光光度法在260nm定量rna，并通過瓊脂糖凝膠電泳評估純度。用于qpcr分析的引物使用beacon設計軟件(premierbiosoftinternational，paloalto，ca)設計。使用5倍連續(xù)稀釋度(1：1/5：1/25：1/125：1/625)一式三份地評價引物對的效率。對于本研究中使用的所有qpcr引物對，擴增效率均高于96.1％。本研究中使用的所有引物組合顯示cdna模板量與pcr產(chǎn)物量之間呈線性相關。所有相關系數(shù)均大于0.99。用7500fastsystemsdsv2.0.6軟件(appliedbiosystems)確定斜率、相關系數(shù)和效能。使用三個生物復制，每個具有兩個技術重復，用于qpcr分析。使用sybrgreen試劑盒(appliedbiosystemsinc.，fostercity，ca)和7500fastsystem實時pcr檢測系統(tǒng)(appliedbiosystemsinc.，fostercity，ca)進行qpcr。qpcr循環(huán)參數(shù)包括40個循環(huán)，每個循環(huán)由95℃3秒、58℃30秒組成，如制造商的方案(appliedbiosystemsinc.，fostercity，ca)所述。在每個pcr反應結束時，產(chǎn)生熔融曲線以確認單峰，并排除引物二聚體和非特異性產(chǎn)物形成的可能性。使用比較2-δδct方法計算轉錄物的相對定量，并將其對β-肌動蛋白歸一化為。圖5(a-d)以圖形方式總結了表6的數(shù)據(jù)，其顯示了與水對照相比，卵、雌性成蟲、幼蟲和雄性成蟲中的hunchback和gfp的相對轉錄水平的數(shù)據(jù)。成蟲(雄性和雌性)和卵的轉錄水平有驚人的下降。從被處理過的雌性孵出的幼蟲的轉錄物沒有減少。表6.相對于gfp和水對照，在處理的人工餌食中暴露于dsrna的卵、雌性成蟲、雄性成蟲、和幼蟲中hunchback的相對表達。利用成對比較，各平均值是分離的。*sem-均值標準誤。括號中的字母指定統(tǒng)計學水平。不連接相同字母的水平差異顯著(p<0.05)；n＝3次生物重復，每次重復10個卵或幼蟲或成蟲個體，2次技術重復/樣品)。實施例8：植物轉化載體的構建使用化學合成片段的組合(dna2.0，menlopark，ca)和標準分子克隆方法組裝入門載體，入門載體包含用于dsrna發(fā)夾形成的靶基因構建體，其包含hunchback(seqidno:1)、hunchbackreg1(seqidno:3)、和/或hunchbackv1(seqidno:67)的區(qū)段。通過在彼此相反取向的兩個拷貝的靶基因片段(在單個轉錄單位內)布置兩個片段，兩個區(qū)段由接頭序列(例如st-ls1內含子，seqidno:45；vancanneyt等人(1990)mol.gen.genet.220：245-250))分隔，幫助rna初級轉錄物的分子內發(fā)夾形成。因此，初級mrna轉錄物包含兩個hunchback基因區(qū)段序列，二者彼此是對方的大反向重復，由接頭序列分開。一個拷貝的啟動子(例如玉米泛素1，美國專利5,510,474；來自花椰菜花葉病毒(camv)的35s；來自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pemu；mas；玉米h3組蛋白啟動子；als啟動子；菜豆蛋白基因啟動子；cab；rubisco；lat52；zm13和/或apg)用于驅動初級mrna發(fā)夾轉錄物的產(chǎn)生，并利用包含3'非翻譯區(qū)的片段，例如但不限于玉米過氧化物酶5基因(zmper53'utrv2；美國專利6,699,984)，atubi10，atef1或stpinii，來終止發(fā)夾rna表達基因的轉錄。入門載體包括hunchbackv1發(fā)夾rna構建體(seqidno:46)，其包含hunchback(seqidno:1)的區(qū)段、hunchbackreg1(seqidno:3)和hunchbackv1(seqidno:67)。將如上所述的入門載體與典型的二元目的載體一起進行標準重組反應，產(chǎn)生hunchback發(fā)夾rna表達轉化載體，以供用于土壤桿菌介導的玉米胚轉化。陰性對照二元載體包含表達yfp發(fā)夾dsrna的基因，它是用典型的二元目的載體和入門載體通過標準的重組反應構建的。入門載體包含在玉米泛素1啟動子(如上)的表達控制下的yfp發(fā)夾序列和包含來自玉米過氧化物酶5基因的3'非翻譯區(qū)的片段(如上所述)。二元目的載體包含在植物可操作的啟動子(例如，甘蔗桿菌病毒(scbv)啟動子(schenk等人(1999)plantmol.biol.39:1221-30)或zmubi1(美國專利5,510,474))調控下的除草劑耐受性基因(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶；(aad-1v3，美國專利7,838,733和wright等人(2010)proc.natl.acad.sci.usa107：20240-5))。5'utr和來自這些啟動子的內含子位于啟動子區(qū)段的3'端和aad-1編碼區(qū)的起始密碼子之間。包含來自玉米脂肪酶基因(zmlip3'utr；美國專利7,179,902)的3'非翻譯區(qū)的片段用于終止aad-1mrna的轉錄。另一個陰性對照二元載體，其包含表達yfp蛋白的基因，是通過與典型的二元目的載體和入門載體的標準重組反應構建的。所述二元目的載體包含在玉米泛素1啟動子(如上)的表達調節(jié)下的除草劑耐受性基因(芳氧基亞乙酰雙加氧酶；aad-1v3)(如上所述)和包含來自玉米脂肪酶基因的3'非翻譯區(qū)的片段(zmlip3'utr；如上)。入門載體包含玉米泛素1啟動子(如上)的表達控制下的yfp編碼區(qū)和包含來自玉米過氧化物酶5基因的3'非翻譯區(qū)的片段(如上所述)。seqidno:46顯示了一種hunchbackv1發(fā)夾形成序列。實施例9：包含殺蟲dsrna的轉基因玉米組織土壤桿菌介導的轉化.在土壤桿菌介導的轉化之后，制成了通過表達穩(wěn)定地整合到植物基因組中的嵌合基因而產(chǎn)生一種或多種殺蟲dsrna分子(例如，至少一種dsrna分子，其包含靶向包含hunchback(seqidno:1),hunchbackreg1(seqidno:3)及hunchbackv1(seqidno:67)的區(qū)段的基因)的轉基因玉米細胞、組織、和植物。采用超二元或二元轉化載體的玉米轉化方法是本領域中已知的，正如例如美國專利號8,304,604中(在此通過提述并入其全部內容)所描述。通過轉化的組織在含吡氟氯禾靈的培養(yǎng)基上生長的能力選擇它們，并視情況適宜篩選其dsrna產(chǎn)生?？梢詫⒁徊糠诌@樣的轉化的組織培養(yǎng)物提供給新生玉米根蟲幼蟲以進行生物測定，基本上如實施例1中所描述。土壤桿菌培養(yǎng)啟動.將包含上述(實施例4)二元轉化載體pdab109819或pdab114245的土壤桿菌菌株dat13192細胞(wo2012/016222a2)的甘油儲劃線接種在含有適當抗生素的ab基本培養(yǎng)基平板(watson等人，(1975)j.bacteriol.123:255-264)上，并在20℃培養(yǎng)3天。然后將培養(yǎng)物劃線接種在含有相同抗生素的yep平板(g/l:酵母提取物10；蛋白胨10；nacl,5)上，并在20℃溫育1天。土壤桿菌培養(yǎng).在實驗當天，以適合于實驗中的構建體數(shù)目的體積制備接種培養(yǎng)基和乙酰丁香酮的儲液，并將其移液到無菌的一次性250ml燒瓶中。接種培養(yǎng)基(frame等人，(2011)genetictransformationusingmaizeimmaturezygoticembryos.收錄于plantembryoculturemethodsandprotocols:methodsinmolecularbiology.t.a.thorpeande.c.yeung,(eds),springerscienceandbusinessmedia,llc.pp327-341)含有：2.2gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素(frame等人，(2011))；68.4gm/l蔗糖；36gm/l葡萄糖；115mg/l脯氨酸；和100mg/l肌醇；ph為5.4)。將乙酰丁香酮以200μm的終濃度(從100％二甲亞砜中的1m儲液)添加到含有接種培養(yǎng)基的燒瓶中，并充分混合溶液。對于每種構建體，來自yep平板的1或2個滿接種環(huán)的土壤桿菌懸浮在一次性50ml無菌離心管內15ml的接種培養(yǎng)基/乙酰丁香酮儲液中，在分光光度計中在550nm(od550)處測量溶液的光密度。然后使用另外的接種培養(yǎng)基/乙酰丁香酮混合物將懸液稀釋到0.3到0.4的od550。然后將土壤桿菌懸液的管水平放置在設置為在室溫下約75rpm的平臺搖床上，并在進行胚切開的同時振搖1到4小時。玉米棒消毒和胚分離.未成熟玉米胚從玉米近交系b104(hallauer等人，(1997)cropscience37:1405-1406)植物獲得，所述植物在溫室中培養(yǎng)，并進行自花授粉或近親授粉以產(chǎn)生玉米棒。在授粉后大約10到12天收獲玉米棒。在實驗當天，將玉米棒脫殼，并通過浸沒在20％市售漂白劑(ultragermicidalbleach，6.15％次氯酸鈉；加兩滴吐溫tm20)的溶液中并振搖20到30分鐘進行表面消毒，隨后在層流罩內在無菌去離子水中沖洗三次。從每個玉米棒無菌切下未成熟合子胚(1.8到2.2mm長)并隨機分配到微量離心管中，每根微量離心管含有2.0ml的液體接種培養(yǎng)基中的適當土壤桿菌細胞的懸液，其中含200μm乙酰丁香酮，并添加了2μl的10％s233表面活性劑(evonikindustries；essen,germany)。對于一套給定的實驗，每次轉化均使用來自匯集的玉米棒的胚。土壤桿菌共培養(yǎng).在分離之后，將胚在搖動平臺上放置5分鐘。然后將管的內容物傾倒到共培養(yǎng)基的平板上，所述培養(yǎng)基含有4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；30gm/l蔗糖；700mg/ll-脯氨酸；在koh中的3.3mg/l的麥草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/l肌醇(myo-inositol)；100mg/l酪蛋白酶水解物；15mg/lagno3；200μm溶于dmso中的乙酰丁香酮；和3gm/lgelzantm，ph為5.8。用無菌一次性移液管移除液態(tài)土壤桿菌懸液。然后借助于顯微鏡，使用無菌鑷子使胚定向為盾片面向朝上。蓋上平板，用3mtmmicroporetm醫(yī)用膠帶密封，并放置在具有大約60μmolm-2s-1的光合有效輻射(par)的連續(xù)光照的25℃培養(yǎng)箱中。愈傷組織選擇和轉基因事件的再生.在共培養(yǎng)期之后，將胚轉移到靜息培養(yǎng)基上，靜息培養(yǎng)基的組成為：4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；30gm/l蔗糖；700mg/ll-脯氨酸；溶于koh中的3.3mg/l的麥草畏；100mg/l肌醇；100mg/l酪蛋白酶水解物；15mg/lagno3；0.5g/lmes(2-(n-嗎啉代)乙磺酸一水合物；phytotechnologieslabr.；lenexa,ks)；250mg/l羧芐青霉素；和2.3gm/lgelzantm；ph為5.8。將不超過36個胚移到每個平板上。將平板放置在透明的塑料盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育7到10天。然后將愈傷的胚轉移(<18個/板)到選擇培養(yǎng)基i上，所述培養(yǎng)基由具有100nm吡氟氯禾靈酸(r-haloxyfopacid)(0.0362mg/l；用于選擇包含aad-1基因的愈傷組織)的靜息培養(yǎng)基(上文)構成。將平板返回到透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育7天。然后將愈傷的胚轉移(<12個/板)到選擇培養(yǎng)基ii上，所述培養(yǎng)基由具有500nm吡氟氯禾靈酸(0.181mg/l)的靜息培養(yǎng)基組成。將平板返回到透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育14天。這一選擇步驟允許轉基因愈傷組織進一步增殖和分化。將增殖中的胚性愈傷組織轉移到(<9個/板)預再生培養(yǎng)基上。預再生培養(yǎng)基含有4.33g/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；45gm/l蔗糖；350mg/ll-脯氨酸；100mg/l肌醇；50mg/l酪蛋白酶水解物；1.0mg/lagno3；0.25gm/lmes；溶于naoh中的0.5mg/l萘乙酸；溶于乙醇中的2.5mg/l脫落酸；1mg/l6-芐氨基嘌呤；250mg/l羧芐青霉素；2.5gm/lgelzantm；和0.181mg/l吡氟氯禾靈酸；ph為5.8。將平板保存在透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育7天。然后將再生中的愈傷組織轉移到(<6個/板)phytatraystm(sigma-aldrich)中的再生培養(yǎng)基上，在28℃以每天16小時光照/8小時黑暗(以大約160μmolm-2s-1par)溫育14天，直到發(fā)出芽和根為止。再生培養(yǎng)基含有4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；60gm/l蔗糖；100mg/l肌醇；125mg/l羧芐青霉素；3gm/lgellantm膠；和0.181mg/l吡氟氯禾靈酸；ph為5.8。然后分離具有主根的小芽，并不經(jīng)選擇直接轉移到伸長培養(yǎng)基上。伸長培養(yǎng)基含有4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；30gm/l蔗糖；和3.5gm/lgelritetm:ph為5.8。通過它們在含有吡氟氯禾靈的培養(yǎng)基上生長的能力而選擇出轉化植物芽，將所述芽從phytatraystm移栽到填充有生長培養(yǎng)基(promixbx；premiertechhorticulture)的小盆中，小盆用杯子或humi-domes(arcoplastics)覆蓋，然后在convirontm生長室中煉苗(27℃晝/24℃夜，16小時光周期，50-70％rh，200μmolm-2s-1par)。在一些情況下，分析推定的轉基因小植物的轉基因相對拷貝數(shù)，這使用設計用于檢測整合到玉米基因組中的aad1除草劑耐受基因的引物通過定量實時pcr測定來完成。此外，利用rnaqpcr測定來檢測在推定的轉化體表達的dsrna中接頭序列的存在。然后將選定的轉化小植物移動到溫室中，以便進一步生長和測試。轉移t0植物和在溫室中定植以進行生物測定和產(chǎn)生種子.當植物達到v3-v4期時，將其移栽到iecustomblend(profile/metromix160)土壤混合物中，在溫室中(光曝露類型：光或同化作用；高光限值：1200par；16-小時晝長；27℃晝/24℃夜)培植至開花。將要用于昆蟲生物測定的植物從小盆移栽到tinustm350-4(spencer-lemaireindustries,acheson,alberta,canada)(每每事件一個植物)。在移栽到約四天后，將植物用于生物測定。通過對t0轉基因植物的穗絲授粉，其中花粉從非轉基因良種近交系b104或其他適當?shù)幕ǚ酃w采集而來，并種植所得的種子而獲得t1代植物。在可能時進行互交。實施例10：成體葉甲屬植物進食生物測定將表達用于親代rnai靶標和gfp對照的dsrna的轉基因玉米葉(v3-4)凍干，并用研缽和杵研磨成細粉，并過600μm篩，以便在將其摻入人工餌食之前達到均勻的粒度。人工餌食與之前用于親代rnai實驗的餌食是相同的，只是水量加倍(20mlddh2o，0.40g瓊脂，6.0g餌食預混物，700μl甘油，27.5μl霉菌抑制劑)。在固化之前，以40mg/ml餌食的速率將凍干的玉米葉組織摻入餌食中，并充分混合。然后將餌食倒在塑料培養(yǎng)皿的表面上至約4mm的深度并使其固化。從餌食中切下餌食小栓，并用與前面描述的親代rnai實驗相同的方法利用這些小栓暴露西方玉米根蟲成蟲。令prnait0或t1事件在溫室中生長，直到植物產(chǎn)生穗軸、穗和絲。每株植物上總共釋放25只新羽化的根蟲成蟲，并給整株植物加罩，以防止成蟲逃逸。釋放兩周后，從每株植物中回收雌性成蟲，并維持在實驗室內以收集卵。根據(jù)親代rnai靶標和預期表型，記錄每個雌蟲的卵數(shù)、卵孵化率和幼蟲死亡率等參數(shù)，并與對照植物進行比較。實施例11：轉基因玉米的葉甲屬幼蟲進食生物測定昆蟲生物測定.通過生物測定方法來證實在植物細胞中產(chǎn)生的本主題發(fā)明的dsrna的生物活性。人們能夠例如通過在受控的飼喂環(huán)境下給靶昆蟲喂食來源于產(chǎn)生殺蟲dsrna的植物的各種植物組織或組織片來證實效力?；蛘?，從來源于產(chǎn)生殺蟲dsrna的植物的各種植物組織制備提取物，并將提取的核酸分配在用于如以前在本文中描述的生物測定的人工餌食上面。將這樣的飼喂測定的結果與類似方式進行的采用來自不產(chǎn)生殺蟲dsrna的宿主植物的適當對照組織、或其他對照樣品的生物測定進行比較。關于轉基因玉米事件的昆蟲生物測定.選擇從經(jīng)洗滌的卵孵化的兩條西方玉米根蟲幼蟲(1到3日齡)并將其置于生物測定托盤的每個孔中。然后將這些孔用“拉-揭”(pulln’peel)護蓋(bio-cv-16,bio-serv)覆蓋，并置于具有18小時/6小時光照/黑暗周期的28℃培養(yǎng)箱中。在初始侵染9日之后，評估幼蟲死亡率，其按照死亡昆蟲占的每次處理中昆蟲總數(shù)的百分比來計算。將昆蟲樣品在-20℃冷凍兩天，然后匯集來自每個處理的昆蟲幼蟲并稱重。生長抑制百分比按照實驗處理的平均重量除以兩個對照孔處理的平均重量的均值來計算。數(shù)據(jù)表示為(陰性對照的)生長抑制百分比。將超過對照平均重量的平均重量歸一化為零。溫室中的昆蟲生物測定.從cropcharacteristics(farmington,mn)收到帶有西方玉米根蟲(wcr，玉米根螢葉甲)卵的土壤。在28℃溫育wcr卵10到11天。洗掉卵上的土壤，將卵置于0.15％瓊脂溶液中，濃度調節(jié)至每0.25ml等份大約75個到100個卵。將一份卵懸浮液加入培養(yǎng)皿中以設置孵化平板，用于監(jiān)測孵化速率。用150到200個wcr卵侵染中生長的玉米植物周圍的土壤。允許昆蟲攝食2周，在這段時間之后，對每個植物給出“根評級”。利用一個節(jié)損傷量表進行分級，大體上如oleson等人，(2005,j.econ.entomol.98:1-8)所述。將通過了這個生物測定的植物移栽到18.9升的盆中供產(chǎn)生種子。用殺蟲劑處理移植物以防止進一步根蟲損害和昆蟲釋放到溫室中。將植物人工授粉以產(chǎn)生種子。保存由這些植物產(chǎn)生的種子以評估植物的t1和后續(xù)世代。溫室生物測定包括兩種陰性對照植物。轉基因陰性對照植物通過用包含設計為產(chǎn)生黃色熒光蛋白(yfp)的基因或yfp發(fā)夾dsrna的載體轉化而生成(參見實施例4)。非轉化的陰性對照植物從品系b104的種子培植而來。在兩個不同的日期進行生物測定，其中每一組植物材料中均包括陰性對照。實施例12：轉基因玉米組織的分子分析對來自葉和根的樣品進行玉米組織的分子分析(例如rnaqpcr)，所述樣品在評估根進食損傷的同一天從溫室生長的植物收集。用于per53'utr的rnaqpcr測定的結果用于驗證發(fā)夾轉基因的表達。(預期在非轉化的玉米植物中會檢測到低水平的per53'utr，因為內源性per5基因通常在玉米組織中表達)。針對重復序列之間的插入序列(其對于形成dsrna發(fā)夾分子是不可缺的)的rnaqpcr測定結果用于驗證發(fā)夾轉錄物的存在。測量轉基因rna相對于內源玉米基因的rna水平的表達水平。通過dnaqpcr分析檢測gdna中aad1編碼區(qū)的一部分，用來估計轉基因插入拷貝數(shù)。用于這些分析的樣品是從在環(huán)境室中生長的植物中收集的。將結果與設計用于檢測單拷貝天然基因的一部分的測定的dnaqpcr結果進行比較，并且將簡單事件(具有一個或兩個拷貝的轉基因)推進用于在溫室中進一步研究。另外，設計用于檢測一部分壯觀霉素抗性基因(specr，位于t-dna外的二元載體質粒上)的qpcr測定法，用于確定轉基因植物是否含有外來整合的質粒骨架序列。發(fā)夾rna轉錄物表達水平：per53'utrqpcr.通過實時定量pcr(qpcr)分析愈傷組織細胞事件或轉基因植物的per53'utr序列，以確定全長發(fā)夾轉錄物與內部玉米基因(例如，genbank登錄號bt069734)的轉錄水平相比的相對表達水平，所述內部玉米基因編碼tip41樣蛋白(即genbank登錄號at4g34270的玉米同系物；具有74％同一性的tblastx得分)。使用rnaeasytm96試劑盒(qiagen，valencia，ca)分離rna。洗脫后，根據(jù)試劑盒的建議方案對總rna進行dnasei處理。然后在nanodrop8000分光光度計(thermoscientific)上定量rna，并將濃度歸一化至25ng/μl。使用highcapacitycdnasynthesiskit(invitrogen)，基本上根據(jù)制造商推薦的方案，在具有5μl變性rna的10μl反應體積中制備第一鏈cdna。該方案稍微修改為包括加入10μl的100μmt20vn寡核苷酸(idt)(tttttttttttttttttttnn，其中v為a，c或g，n為a，c，g或t；seqidno:47)到1ml隨機引物儲液預混物管中，以制備混合有隨機引物和寡聚dt的工作儲液。cdna合成后，樣品用無核酸酶水1:3稀釋，保存在-20℃直至測定。在10μl反應體積中，在lightcyclertm480(rochediagnostics，indianapolis，in)上各別進行per53'utr和tip41樣轉錄物的實時pcr測定。對于per53'utr測定，使用引物p5u76s(f)(seqidno:48)和p5u76a(r)(seqidno:49)和rocheuniversalprobetm(upl76；目錄號4889960001；用fam標記)。對于tip41樣參考基因測定，使用用hex(六氯熒光素)標記的引物tipmxf(seqidno:50)和tipmxr(seqidno:51)和探針hxtip(seqidno:52)。所有測定包括無模板的陰性對照(僅預混物)。對于標準曲線，來源板中還包括一個空白(來源孔中的水)，以檢查樣品交叉污染。引物和探針序列列于表7中。表8中公開了檢測各種轉錄物的反應組分配方，pcr反應條件總結在表9中。在465nm激發(fā)fam(6-羧基熒光素亞磷酰胺)的熒光部分，在510nm測量熒光；hex(六氯熒光素)熒光部分的相應值為533nm和580nm。表7.用于轉基因玉米轉錄水平分子分析的寡核苷酸序列。*tip41樣蛋白**nav序列無法從供應商獲得表8.用于轉錄物檢測的pcr反應配方表9.rnaqpcr的熱循環(huán)儀條件使用lightcyclertm軟件v1.5，通過使用二階導數(shù)最大算法進行相對量化來分析數(shù)據(jù)，以根據(jù)供應商的建議計算cq值。對于表達分析，使用δδct方法(即2-(cq靶-cq參比))計算表達值，其依賴于兩個目標之間的cq值的差異的比較，基于下述假設選擇基礎值為2：對于優(yōu)化的pcr反應，每個周期產(chǎn)物加倍。發(fā)夾轉錄物大小和完整性：northern印跡測定。在某些情況下，通過使用northern印跡(rna印跡)分析來確定轉基因植物表達hunchback發(fā)夾dsrna的轉基因發(fā)夾rna的分子大小，可獲得對轉基因植物的更多分子表征。所有材料和設備在使用前用rnasezap(ambion/invitrogen)進行處理。將組織樣品(100mg至500mg)收集在2mlsafelockeppendorf管中，利用kleckotm組織粉碎機(garciamanufacturing，visalia，ca)，在1mltrizol(invitrogen)中用三個鎢珠破碎5分鐘，然后在室溫(rt)下溫育10分鐘。任選地，將樣品在4℃以11,000rpm離心10分鐘，并將上清液轉移到新的2mlsafelockeppendorf管中。將200μl氯仿加入到勻漿中，通過顛倒混合2至5分鐘，在室溫下溫育10分鐘，并在4℃下以12,000xg離心15分鐘。將頂層轉移到無菌的1.5mleppendorf管中，加入600μl的100％異丙醇，然后在室溫下溫育10分鐘至2小時，然后在4℃至25℃下以12,000xg離心10分鐘。棄去上清液，將rna沉淀用1ml70％乙醇洗滌兩次，各次洗滌之間在4℃至25℃以7,500×g離心10分鐘。棄去乙醇，將沉淀短暫空氣干燥3至5分鐘，然后重新懸浮于50μl無核酸酶的水中。使用(thermo-fisher)定量總rna，樣品標準化至5μg/10μl。然后將10μl乙二醛(ambion/invitrogen)加入到每個樣品中。將5至14ng的digrna標準預混物(rocheappliedscience，indianapolis，in)分配并加入到等體積的乙二醛中。將樣品和標記rna在50℃變性45分鐘并儲存在冰上，直到加載到northernmax10x乙二醛運行緩沖液(ambion/invitrogen)中的1.25％seakemgold瓊脂糖(lonza，allendale，nj)凝膠上。rna通過65伏特/30ma的電泳分離2小時15分鐘。電泳后，將凝膠在2×ssc中漂洗5分鐘，并在geldoc工作站(biorad，hercules，ca)上成像，然后將rna在室溫下過夜被動地轉移到尼龍膜(millipore)，使用10xssc作為轉移緩沖液(20xssc由3m氯化鈉和300mm檸檬酸三鈉組成，ph7.0)。轉移后，將膜在2×ssc中漂洗5分鐘，將rna與膜(agilent/stratagene)uv交聯(lián)，并將膜在室溫下干燥最多2天。將膜在ultrahyb緩沖液(ambion/invitrogen)中預雜交1至2小時。探針由通過rocheappliedsciencedig程序用地高辛標記的含有感興趣序列(例如，視情況，seqidno:46的反義序列部分)的pcr擴增產(chǎn)物組成。在雜交管中的推薦的緩沖液中在60℃的溫度下雜交過夜。雜交后，將印跡進行dig洗滌，包裹，暴露于膠片1至30分鐘，然后通過dig試劑盒供應商推薦的方法顯影該膠片。轉基因拷貝數(shù)確定.在96孔收集板(qiagen)中收集大約相當于2個葉沖孔塊的玉米葉片。使用kleckotm組織粉碎機(garciamanufacturing，visalia，ca)在含有一個不銹鋼珠的biosprint96ap1裂解緩沖液(由biosprint96plantkit；qiagen提供)中進行組織破壞。在組織浸漬后，使用biosprint96plantkit和biosprint96提取機器人以高通量模式分離gdna。在設置qpcr反應之前，將gdna稀釋為2:3dna:水。qpcr分析.水解探針測定法轉基因檢測通過使用480系統(tǒng)的實時pcr來進行。使用探針設計軟件2.0來設計在水解探針測定中要用來檢測接頭序列(例如st-ls1；seqidno:45)或檢測specr基因的一部分(即，攜帶于二元載體質粒的壯觀霉素抗性基因；seqidno:53；表10中的spc1寡核苷酸)的寡核苷酸。此外，使用primerexpress軟件(appliedbiosystems)設計用于檢測aad-1除草劑耐受基因的區(qū)段(seqidno:54；表10中的gaad1寡核苷酸)的水解探針測定中使用的寡核苷酸。表10顯示了引物和探針的序列。測定中加入用于內源性玉米染色體基因(轉化酶；genbank登錄號：u16123；本文稱為ivr1)的試劑，其用作內部參考序列以確保每個測定中存在gdna。為了擴增，在含有0.4μm每種引物和0.2μm每種探針的10μl體積多重反應中，以1x最終濃度制備480探針master預混物(rocheappliedscience)(表11)。如表12所示進行兩步擴增反應。fam-和hex-標記的探針的熒光團活化和發(fā)射如上所述；cy5綴合物在650nm處最大激發(fā)，并且在670nm處最大地發(fā)熒光。使用擬合點算法(software版本1.5)和相對quant模塊(基于δδct方法)從實時pcr數(shù)據(jù)確定cp得分(熒光信號跨越背景閾值的點)。數(shù)據(jù)如前所述(上文；rnaqpcr)處理。表10.用于基因拷貝數(shù)確定和二元載體質粒骨架檢測的引物和探針(帶熒光綴合物)的序列。cy5＝花青-5表11.用于基因拷貝數(shù)分析和質粒骨架檢測的反應組分組分量(μl)儲液終濃度2x緩沖液5.02x1x合適的正向引物0.410μm0.4合適的反向引物0.410μm0.4合適的探針0.45μm0.2ivr1-正向引物0.410μm0.4ivr1-反向引物0.410μm0.4ivr1-探針0.45μm0.2h2o0.6na*nagdna2.0nd**nd總量10.0*na＝不適用**nd＝未測定表12.用于qpcr的熱循環(huán)儀條件實施例13：包含鞘翅目害蟲序列的轉基因玉米如實施例8中所述生成10個到20個轉基因t0玉米植物。獲得另外的10--20個表達針對rnai構建體的發(fā)夾dsrna的t1玉米獨立品系用于玉米根蟲攻擊。發(fā)夾dsrna可自seqidno:1、seqidno:3和seqidno:67所示的序列衍生。更多的發(fā)夾dsrna衍生自例如鞘翅目害蟲序列，例如像caf1-180(美國專利申請公開號2012/0174258)、vatpasec(美國專利申請公開號2012/0174259)、rho1(美國專利申請公開號2012/0174260)、vatpaseh(美國專利申請公開號2012/0198586)、ppi-87b(美國專利申請公開號2013/0091600)、rpa70(美國專利申請公開號2013/0091601)、rps6(美國專利申請公開號2013/0097730)，brahma(ussn),和kruppel(ussn)。這些通過rt-pcr或其他分子分析方法得以證實。來自選定的獨立t1系的總rna制備物任選地用于qpcr，其中引物被設計為在每個rnai構建體中的發(fā)夾表達盒的接頭中結合。另外，用于rnai構建體中每個靶基因的特異性引物任選地用于擴增在植物內sirna產(chǎn)生所需要的預加工mrna，并用于確認所述預加工mrna的產(chǎn)生。對于每個靶基因的期望條帶的擴增可確認每個轉基因玉米植物中發(fā)夾rna的表達。隨后任選地利用rna印跡雜交在獨立轉基因系中確認靶基因的dsrna發(fā)夾加工成sirna。而且，與靶基因具有80％以上序列同一性、具有錯配序列的rnai分子對玉米根蟲的影響類似于與靶基因具有100％序列同一性的rnai分子。錯配序列與天然序列的配對在同一個rnai構建體中形成發(fā)夾dsrna，由此產(chǎn)生出能夠影響攝食中的鞘翅目害蟲的生長、發(fā)育和生存力的植物加工的sirna。對應于靶基因的dsrna、sirna、或mirna的植物體內遞送以及被鞘翅目害蟲進食后的攝取，導致鞘翅目害蟲中的靶基因由于rna介導的基因沉默而下調。當靶基因在發(fā)育的一個或多個階段發(fā)揮重要作用的時候，鞘翅目害蟲的生長、發(fā)育和生殖受到影響，而且在wcr、ncr、scr、mcr、黃瓜條根螢葉甲、d.u.tenella、南美葉甲、和d.u.undecimpunctatamannerheim的至少一者的情況下，會導致鞘翅目害蟲無法成功侵染、進食、發(fā)育、和/或生殖，或導致其死亡。然后通過靶基因的選擇和rnai的成功應用來控制鞘翅目害蟲。轉基因rnai品系和非轉化玉米的表型比較.選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsrna的靶鞘翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因bn序列都沒有相似性。因此不期望靶向這些鞘翅目害蟲基因或序列的構建體的(全身性)rnai的產(chǎn)生或活化對轉基因植物會有任何有害影響。然而，將轉基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉化植物、以及用沒有發(fā)夾表達基因的“空”載體轉化的那些轉基因系進行比較。比較了植物根、芽、葉和生殖特征。轉基因植物和非轉化植物在根長和生長模式上沒有可觀察到的差異。植物地上部特征，諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時間、花大小和外觀之類，是相似的?？偟膩碚f，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時，在轉基因系和沒有表達靶irna分子的那些株系之間沒有可觀察的形態(tài)差異。實施例14：包含鞘翅目害蟲序列和另外的rnai構建體的轉基因玉米轉基因玉米植物在其基因組中包含異源編碼多核苷酸，所述異源編碼多核苷酸被轉錄成靶向鞘翅目害蟲之外的生物的irna分子，對這樣的轉基因植物通過土壤桿菌或whiskerstm方法(參見petolino和arnold(2009)methodsmol.biol.526:59-67)進行二次轉化，以產(chǎn)生一種或多種殺蟲dsrna分子(例如，至少一種dsrna分子，包括靶向包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:67的基因的dsrna分子)?；旧先鐚嵤├?中所述制備植物轉化質粒載體，經(jīng)由土壤桿菌或whiskerstm-介導的轉化方法遞送到獲自轉基因hiii或b104玉米植物的玉米懸浮細胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因組中包含異源編碼多核苷酸，所述異源編碼多核苷酸被轉錄成靶向鞘翅目害蟲之外的生物的irna分子。實施例15：包含rnai構建體和另外的鞘翅目害蟲控制序列的轉基因玉米轉基因玉米植物在其基因組中包含被轉錄成靶向鞘翅目害蟲生物的irna分子的異源編碼多核苷酸(例如，至少一種dsrna分子，包括靶向包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:67的基因的dsrna分子)，對于這樣的轉基因玉米植物，通過土壤桿菌或whiskerstm方法(參見petolino和arnold(2009)methodsmol.biol.526:59-67)進行二次轉化以產(chǎn)生一種或多種殺蟲蛋白分子，例如，cry1b、cry1i、cry2a、cry3、cry7a、cry8、cry9d、cry14、cry18、cry22、cry23、cry34、cry35、cry36、cry37、cry43、cry55、cyt1a和cyt2c殺蟲蛋白。基本上如實施例7中所述制備植物轉化質粒載體，經(jīng)由土壤桿菌或whiskerstm-介導的轉化方法遞送到獲自轉基因b104玉米植物的玉米懸浮細胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因組中包含被轉錄成靶向鞘翅目害蟲生物的irna分子的異源編碼多核苷酸。獲得產(chǎn)生用于控制鞘翅目害蟲的irna分子和殺蟲蛋白的雙重轉化植物。實施例16：prnai介導的昆蟲保護可導致卵死亡或卵存活力喪失的親代rnai為使用rnai和其他昆蟲保護機制的轉基因作物帶來更多的耐久性益處。使用基本的雙綴塊模型(two-patchmodel)來演示這一用處。一個綴塊含有表達殺蟲成分的轉基因作物，另一個綴塊含有不表達殺蟲成分的避難所作物。將卵根據(jù)其相對比例“產(chǎn)”在兩個模型的綴塊中。在這個例子中，轉基因綴塊占景觀的95％，避難所綴塊占5％。轉基因作物表達對玉米根蟲幼蟲有活性的殺蟲蛋白質。玉米根蟲對殺蟲蛋白質的抗性被模擬為單基因，具有兩個可能的等位基因：一個等位基因(s)賦予敏感性，另一個等位基因(r)賦予抗性。殺蟲蛋白質根據(jù)模型推導可導致以其為食的純合易感(ss)玉米根蟲幼蟲的死亡率達到97％。假定對抗性等位基因(rr)為純合的玉米根蟲幼蟲沒有死亡。假定對殺蟲蛋白質的抗性是不完全隱性的，因而功能優(yōu)勢(functionaldominance)為0.3(以該轉基因作物為食的、對該蛋白質的抗性為雜合子(rs)的幼蟲的死亡率為67.9％)。轉基因作物還表達了親代活性dsrna，這些dsrna通過rna干擾作用(prnai)可導致暴露于轉基因作物的成年雌性玉米根蟲的卵無存活力。玉米根蟲對prnai的抗性也被認為是單基因性的，具有兩個可能的等位基因：一個(x)賦予成年雌性對rnai的易感性，另一個(y)賦予成年雌性對rnai的抗性。假設有高水平的dsrnas暴露，prnai根據(jù)模型推導可導致純合易感(xx)雌性產(chǎn)生的99.9％的卵無存活力。該模型假定prnai對由純合抗性(yy)雌性產(chǎn)生的卵的存活力沒有影響。假定對dsrna的抗性是隱性的，由此功能優(yōu)勢是0.01(對于dsrna的抗性為雜合子(xy)的雌性產(chǎn)生的卵98.9％是無存活力的)。在該模型中，在兩個綴塊中存活下來的成蟲之間都有根據(jù)其相對比例的隨機交配以及隨機產(chǎn)卵。可存活的后代的基因型頻率遵循兩基因座遺傳系統(tǒng)的孟德爾遺傳學。prnai的作用需要成年雌性以表達親代活性dsrna的植物組織為食。從避難所作物羽化的成年雌性與從轉基因作物羽化的成年雌性相比，卵發(fā)育所受的干擾可能較低；預計玉米根蟲經(jīng)過幼蟲發(fā)育后在某個綴塊中羽化，它們就會在那個綴塊中更廣泛地進食。因此，就從避難所綴塊羽化的雌性玉米根蟲成蟲而言，作用于其上的prnai效應的相對幅度是變化的，其中prnai效應的比例為0(prnai對從避難所綴塊羽化的成年雌性沒有影響)至1(prnai對從避難所綴塊羽化的成年雌性的影響與從轉基因綴塊羽化的成年雌性的影響相同)不等。當prnai效應(還)通過以表達親代活性dsrna的植物組織喂養(yǎng)成年雄性來實現(xiàn)時，可以容易地調整該模型來演示這種情形。計算各個世代中的兩種抗性等位基因的頻率。兩個抗性等位基因(r和y)的初始頻率假定為0.005。結果以每個抗性等位基因的頻率達到0.05所需的昆蟲世代數(shù)表示。為了檢查由prnai引起的抗性延遲，將包含prnai的模擬與不包括prnai的模擬進行比較，但是其他所有方面都相同。圖6。還修改了該模型以包括對玉米根蟲幼蟲有活性的干擾dsrna與轉基因作物中玉米根蟲活性殺蟲蛋白質的組合。其中，給幼蟲rnai賦予導致純合rnai敏感玉米根蟲幼蟲(基因型xx)97％的幼蟲死亡率的效力，而對純合rnai抗性(yy)的玉米根蟲幼蟲沒有效力。對rnai抗性(xy)為雜合的玉米根蟲幼蟲死亡率為67.9％。假設同一抗性機制適用于玉米根蟲中的幼蟲活性rnai和prnai二者。如前所述，對從避難所綴塊羽化的成年雌性的prnai效應相對于對從轉基因綴塊羽化的成年雌性的prnai效應從0到1變化。如前所述，為了檢查由prnai引起的抗性延遲，將包括prnai的模擬與不包括prnai的模擬進行比較，但是所有其他方面(包括幼蟲rnai)相同。圖7。與從轉基因綴塊出現(xiàn)的成蟲的效應量值相比，當從避難所綴塊出現(xiàn)的雌性玉米根蟲成蟲的卵存活力的prnai效應量值降低時，觀察到prnai的明顯的抗性管理益處。與僅產(chǎn)生殺蟲蛋白質的轉基因作物相比，除了殺蟲蛋白質之外還產(chǎn)生親代活性dsrna的轉基因作物更耐久。類似地，與僅產(chǎn)生殺蟲蛋白質和幼蟲活性dsrna的轉基因作物相比，除了殺蟲蛋白質和幼蟲活性dsrna之外還產(chǎn)生親代活性dsrna的轉基因作物更耐久。在后一種情況下，耐久性益處適用于殺蟲蛋白質和殺蟲干擾dsrna。實施例17：親代rnai對wcr雄性的影響將新羽化的未交配過的wcr雄性(cropcharacteristic；farmington，mn)暴露于以prnaidsrna(hunchback)處理過的人工餌食歷時7天，期間連續(xù)喂食dsrna。然后將存活的雄性與未交配過的雌性配對，并允許它們交配4天。將雌性分離到產(chǎn)卵室中，用未經(jīng)處理的餌食維持，以基于卵的活力確定交配是否成功。此外，在產(chǎn)卵10天后解剖雌性以確定精子細胞的存在。包括gfpdsrna和水的對照。每個處理進行三個重復，每個重復10個雄性和10個雌性。各個重復在3個不同日期用新羽化的成蟲完成。每次處理的每次處理含有10個雄性/處理/重復，并放置在托盤的一個孔中。每個孔包括用水或dsrna(gfp(seqidno:9)或hunchback(seqidno:3))處理的12個餌食小栓。每個餌食小栓在3μl水中用2μgdsrna處理。將托盤轉移到溫度為23±1℃、相對濕度>80％，l：d16:8的生長室中。在第3、5、7天，將雄性轉移到新托盤中，新托盤的每個孔中加有12個經(jīng)處理的餌食小栓。在第7天，如實施例7所述，將每個處理的每個復制的三只雄性快速冷凍用于qpcr分析。在第8天，將十只雌性和十只處理的雄性一起放在一個容器中以允許交配。每個容器包括22個未經(jīng)處理的餌食小栓。在第10天，將昆蟲轉移到具有22個未處理的餌食小栓的新托盤中，在第12天將雄性移出并使用熒光染色技術測量精子活力。每隔一天將雌性轉移到一個放有12個未經(jīng)處理的餌食小栓的新托盤，直到第22天。在第16天，將雌性轉移到含有高壓消毒土壤的卵籠中以供產(chǎn)卵。在第22天，將所有的雌性從土壤籠中取出并冷凍以檢查精子的存在。將土壤籠轉移到溫度為27±1℃、相對濕度>80％，24小時黑暗的新生長室。在第28天，使用#60篩洗滌土壤以從每個籠子中收集卵。用甲醛(500μl甲醛在5ml雙蒸水中)和甲基-(丁基氨基甲酰基)-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(0.025g在50ml雙蒸水中)的溶液處理卵以防止真菌污染，并置于放有濾紙的培養(yǎng)皿中。對每個培養(yǎng)皿拍攝照片，以供使用imagej軟件的細胞計數(shù)器功能(schneider等人(2012)nat.methods9:671-5)進行卵計數(shù)。將帶卵的培養(yǎng)皿轉移到溫度為27±1℃，相對濕度>80％，黑暗24小時的小生長室。從第29-42天，每天監(jiān)測幼蟲的孵化。精子活力.將未交配過的西部玉米根蟲雄性暴露于用親代rnai基因hunchback的dsrna處理過的人工餌食7天。每隔一天提供經(jīng)處理的餌食。，每次重復每次處理使用四只雄性來檢測精子活力，精子活力的檢測使用熒光技術，以便區(qū)分活精子和死精子，如collins和donoghue(1999)所述。livedeadspermviabilitykittm(lifetechnologies，carlsbadca)含有sybr14，一種膜透性核酸染色劑，以及碘化丙啶，后者可染色死細胞。將wcr雄性在冰上麻醉，剖出睪丸和精囊，置于10μl緩沖液(hepes10mm，nacl150mm，bsa10％，ph7.4)中，并用高壓消毒的牙簽粉碎。立即用livedeadspermviabilitykittm評估精子活力。加入1μlsybr14(0.1mm，在dmso中)，在室溫下溫育10分鐘，然后加入1μl碘化丙啶(2.4mm)，并在室溫下再次溫育10分鐘。將10μl精子染色的溶液轉移到玻璃微玻片中并用蓋玻片覆蓋。使用配備nikona1共聚焦和nis-elements軟件的nikontmeclipse90i顯微鏡對樣品進行評估。以10x可視化樣品，以488激發(fā)，對于活精子(sybr14)500-550nm帶通，對死精子(碘化丙錠)663-738nm帶通同時進行。每個樣品記錄五個視野的數(shù)字圖像。使用imagej軟件的細胞計數(shù)器功能評估活(綠)和死(紅)精子的數(shù)量。schneider等人(2012)nat.methods9：671-5。喂食hunchbackdsrna7天的雄性產(chǎn)生的總精子和死精子均少于僅攝取gfpdsrna或水的雄性。表20。各處理之間活精子的平均數(shù)沒有顯著差異。與已經(jīng)同攝入了dsrna處理的雄性交配的雌性相比，每個雌性的卵數(shù)或卵孵化率沒有統(tǒng)計學差異。表21。對于暴露于hunchbackdsrna4次的雄性，轉錄物表達沒有統(tǒng)計學差異。表20.hunchbackdsrna對wcr成年雄性精子生產(chǎn)和攝入7天后對經(jīng)處理的人工餌食的活力的影響。使用dunnett檢驗，各平均值是分離的。sem-均值標準誤*表明p值≤0.1的顯著性.**表明p值≤0.05的顯著性.表21.僅雄性攝入dsrna處理過的人工餌食7日后hunchbackrna對wcr卵產(chǎn)生和卵存活力的影響sem-均值標準誤.對未交配過的雄性，除了將dsrna的暴露增加至總共6次以外，如上所述進行處理。在第3、5、7、9和11天，將雄性轉移到每個孔中有12個經(jīng)處理的餌食小栓的新托盤。然后將存活的雄性與未交配過的雌性配對，并允許其交配4天。將雌性分離到產(chǎn)卵室中，并用未經(jīng)處理的餌食維持，以基于卵活力確定交配是否成功。表22.僅由雄性攝入dsrna處理的人工餌食hunchbackdsrna對攝入7天后的wcr卵產(chǎn)量和卵活力的影響。使用dunnett檢驗，各平均值是分離的。sem-均值標準誤.雄性中的相對表達如實施例7中所述確定。表23.暴露于經(jīng)處理的人工餌食中的hunchbackdsrna6次的成年雄性中hunchback相對于gfp和水對照的相對表達。雄性成蟲中轉錄物的水平有降低。使用dunnett檢驗，各平均值是分離的。sem-均值標準誤.*表示p<0.05的顯著性.實施例18：有效濃度將交配后的雌性暴露于4種暴露條件的hunchbackdsrna以確定有效濃度。從cropcharacteristics(farmington，mn)收到新羽化的(<48小時)的成年雄性和雌性。處理包括每個餌食小栓的2、0.2、0.02、和0.002μg的hunchback(seqidno:3)dsrna。2μg的gfp和水作為對照。將10只雄性和10只雌性放在一個含有20粒未經(jīng)處理的人工餌食的孔中。將托盤轉移到生長室，并保持在23±1℃，相對濕度>80％和16:8l:d光周期。在第5天將雄性從實驗中移除。每隔一天提供新鮮處理的餌食至第13天。在第14天，將雌性轉移到含有高壓滅菌土壤的卵籠中，并提供新的經(jīng)處理的人工餌食(每籠11個小栓)。將卵籠放回生長室。在第16天，如上所述提供新的經(jīng)處理的餌食。將所有雌性在第18天從土壤籠中取出，并迅速冷凍用于qpcr。將土壤籠轉移到新生長室，其中溫度為27±1℃，相對濕度>80％，24小時黑暗。在第24天，使用#60篩子洗滌土壤以從每個籠子中收集卵。用甲醛(500μl甲醛在5ml雙蒸水中)和甲基-(丁基氨基甲酰)-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(0.025g在50ml雙蒸水中)的溶液處理卵以防止真菌污染，并置于含濾紙的小培養(yǎng)皿中。對每個培養(yǎng)皿拍攝照片，用于使用imagej軟件的細胞計數(shù)器功能(schneider等人(2012)nat.methods9：671-5)進行卵計數(shù)。將帶卵的培養(yǎng)皿轉移到溫度為27±1℃，相對濕度>80％，黑暗24小時的小生長室。每天監(jiān)測幼蟲孵化歷時15天。每天計數(shù)幼蟲并將它們從培養(yǎng)皿中取出。在2和0.2μg/餌食小栓處理中，卵孵化率顯著降低(表24)，但是在測試的任何劑量和對照之間，每個雌性產(chǎn)卵數(shù)量沒有差異。表24.hunchbackdsrna濃度對攝入經(jīng)處理的人造餌食后wcr產(chǎn)卵和卵存活力的影響。各平均值使用dunnett檢驗是分離的。*sem-均值標準誤。括號中的字母表明統(tǒng)計學水平。不連接相同字母的水平是顯著不同(p<0.05)。用濃度為2、0.2和0.02處理的玉米根螢葉甲雌性的相對的hunchback表達顯著低于對照(水和gfp)(圖11)。比較用dunnett檢驗進行。實施例19：暴露時間以3個不同時間開始將雌性暴露于2μghunchbackdsrna6次，以確定產(chǎn)生親代rnai效應所必需的暴露時間。雌性在交配前暴露于dsrna6次，交配后立即暴露6次，以及在交配后6天暴露。對于每個暴露時間，完成三個重復，每個重復10只雌性和10只雄性。從cropcharacteristics(farmington，mn)收到wcr成蟲。交配前的dsrna喂食.將10只雌性放在一個孔中，其中有11粒經(jīng)處理的人工餌食(每粒2μgdsrna)。將托盤轉移到溫度為23±1℃、相對濕度>80％、和16:8l:d光周期的生長室。每隔一天將雌性轉移到含有新鮮的經(jīng)處理餌食的托盤中，歷時10天。在第12天，將雌性與10只雄性配對，并提供22個未經(jīng)處理的餌食的小栓。4天后，移出雄性。每隔一天提供新鮮的未經(jīng)處理的餌食，歷時8天。在第22天，將雌性轉移到含有11個未經(jīng)處理的人工餌食小栓的高壓滅菌土壤的卵籠中。將卵籠放回生長室，并在第24天更換餌食。第26天，從土壤籠中取出雌性，并快速冷凍用于qpcr。將土壤籠轉移到溫度為27±1℃，相對濕度>80％，24小時黑暗的生長室中。4天后，使用#60篩洗滌土壤，以從每個籠子中收集卵。用甲醛(500μl甲醛在5ml雙蒸水中)和甲基-(丁基氨基甲?；?-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(0.025g在50ml雙蒸水中)的溶液處理卵，以防止真菌污染，并將卵置于放有濾紙的小培養(yǎng)皿中。對每個培養(yǎng)皿拍照，以便使用imagej軟件的細胞計數(shù)器功能進行卵計數(shù)。將帶卵的培養(yǎng)皿轉移到溫度27±1℃，相對濕度>80％，24小時黑暗的小生長室。每天監(jiān)測幼蟲孵出情況，歷時15天。每天計數(shù)幼蟲并從培養(yǎng)皿中取出幼蟲。圖8a示出了顯示每只雌性回收的卵數(shù)量的數(shù)據(jù)的匯總，圖8b分別顯示了在交配前暴露于0.67μg/μl的hunchback或gfp6次，交配后立即暴露6次、以及交配6天后暴露6次后，孵出的總幼蟲百分比的結果。比較用dunnett檢驗進行，*表示p<0.1的顯著性，**表示p<0.05的顯著性，***表示p<0.001的顯著性。圖9示出了顯示在交配前6次暴露于0.67μg/μl的hunchback或gfp，交配后立即暴露6次，以及交配6日后暴露6次后測量的相對hunchback表達的數(shù)據(jù)的總結。用dunnett檢驗進行的比較**表示p<0.05的顯著性，***表示p<0.001的顯著性。在交配后立即喂食dsrna.使用類似于上述方法的方法，除了在研究開始時，將10只雄性和10只雌性與22粒未處理的人工餌食顆粒放在一個孔中。將托盤如上所述轉移到生長室。在第3天提供新鮮的未處理的餌食，并且在第5天取出雄性。然后將雌性轉移到經(jīng)處理的人工餌食并保持在生長室中。每隔一天提供新鮮處理的餌食歷時6天。在第12天，將雌性轉移到含有11個經(jīng)處理的人工餌食小栓的高壓滅菌土壤的卵籠中。將卵籠放回生長室，并在第14天提供新鮮處理的餌食。在第16天，將所有雌性從土壤籠中取出并快速冷凍用于qpcr。在6天后如上所述進行土壤籠和卵洗滌。拍攝每只培養(yǎng)皿的照片用于卵計數(shù)。每天監(jiān)測幼蟲孵出，歷時15天。每只雌性的卵的結果如圖8a所示。圖8b示出了孵化的總幼蟲百分比的結果。在接受6次dsrna后測量雌性的相對hunchback表達，如圖9所示。交配后的dsrna喂養(yǎng).遵循與交配后立即進行dsrna喂養(yǎng)的方法類似的方法，不同之處是昆蟲每隔一天接受未經(jīng)處理的人工餌食直到第11天，在第11天將雌性轉為經(jīng)處理的餌食。在第12天，將雌性轉移到含有11個經(jīng)處理的人工餌食小栓的高壓滅菌土壤的卵籠中。將卵籠放回生長室。從12-20天開始每隔一天提供新鮮的經(jīng)處理的餌食。在第22天，將所有雌性從土壤籠中取出，并迅速冷凍用于qpcr。如上所述，在6天后進行土壤籠和卵的清洗。拍攝每只培養(yǎng)皿的照片用于卵計數(shù)。每天監(jiān)測幼蟲孵出，歷時15天。每天從培養(yǎng)皿中計數(shù)并取出幼蟲。每只雌性的卵的結果如圖8a所示，孵化的總幼蟲百分比的結果示于圖8b。測量相對hunchback表達，如圖9所示。在整個研究中，對于所有處理，每隔一天記錄雌性死亡率。實施例20：暴露持續(xù)時間使用未經(jīng)處理的餌食令未交配過的雄性和雌性配對4天，之后令交配過的雌性暴露于2μg的hunchbackdsrna。為了評估暴露持續(xù)時間的影響，使昆蟲暴露于hunchback或gfpdsrna1，2，4或6次(在圖10和10b中顯示為t1，t2，t4或t6)。每次處理完成了四個重復，每個重復10只雌性和10只雄性。成年雌性和雌性從cropcharacteristics(farmington，mn)收到。將10只雌性和10只雄性與20粒未經(jīng)處理的人工餌食放在一個孔中。將托盤保持在溫度為23±1℃，相對濕度>80％和16:8l:d光周期的生長室中。在第3天提供新的未處理的人工餌食。在第5天移除雄性，并將雌性轉移到每個孔含有11個餌食小栓的新盤中，并進行相應的處理。在第7天，將雌性轉移到具有新的處理的人工餌食的托盤中，并記錄死亡率。將來自第1次(t1)暴露的雌性轉移到未經(jīng)處理的餌食。在第10天和第12天，雌性被轉移到具有新的經(jīng)處理的人工餌食的新托盤，記錄死亡率。將來自t1和t2的雌性轉移到未經(jīng)處理的餌食。在第14天，將雌性轉移到含有高壓滅菌土壤的卵籠中，并提供新的經(jīng)處理的人工餌食。對來自t1，t2和t4的雌性提供未經(jīng)處理的餌食。在第16天，除去舊的餌食，加入新的經(jīng)處理餌食。對來自t1，t2和t4的雌性提供未經(jīng)處理的餌食。18天后，將所有雌性從土壤籠中取出，并迅速冷凍用于qpcr。將土壤籠子轉移到生長室，溫度為27±1℃，相對濕度>80％，24小時黑暗。洗滌卵，并根據(jù)暴露的時間指示對每只培養(yǎng)皿拍攝照片。計數(shù)孵出的幼蟲，每天從每個培養(yǎng)皿中取出孵出的幼蟲，歷時15天。每只雌性產(chǎn)卵的百分比的結果如圖10a所示。孵出的總幼蟲百分比的結果如圖10b所示。測量雌性的相對hunchback表達，如圖10c所示。實施例21：卵巢發(fā)育在如暴露時間所示的交配之前和交配后立即暴露于用hunchbackdsrna處理的人工餌食的雌性中，對玉米根螢葉甲卵巢發(fā)育進行評估。雌性暴露于2μg的hunchback或gfpdsrna或水6次。每個處理在最后一次dsrna暴露后一天收集五只雌性，并儲存在70％乙醇中用于隨后的卵巢解剖。所有存活雌性的子宮解剖均在立體顯微鏡下進行。使用olympusszx16顯微鏡，olympussdfplapo2xpfc鏡頭和olympuscellsensdimensions軟件(日本東京)獲取圖像。玉米根螢葉甲解剖顯示，用水、gfp或hunchbackdsrna處理的雌性相互之間卵巢發(fā)育沒有明顯的差異；對于未交配的雌性以及交配后立即被解剖的雌性都是如此。序列表<110>美國陶氏益農(nóng)公司及內布拉斯加大學董事會b·齊格弗里德k·e·納爾瓦k·阿羅拉s·e·沃登c·卡朱里亞e·菲什里維奇n·p·斯托勒m·弗雷r·哈姆a·m·威萊斯阿朗戈<120>parentalrnaisuppressionofhunchbackgenetoconferresistancetocoleopteranpests<130>2971-p12202.4us(74840-us-np)<150>62/092,772<151>2014-12-16<160>73<170>patentinversion3.5<210>1<211>1955<212>dna<213>diabroticavirgifera<400>1gttagatagtggtggtcacatgacattgttatcagtgattttaatacgtgtttttgagga60atgaaaataatagttggattatttctaatacagactttgattcttaccgtgaaatgagag120gaggtgtttctgacgatatgacttcaacttgcgttcaaggaggaattagaccaattggac180gatatcaaccaaacatgcttatggaaccatcgtctcctcaatctgcctggcagtttcacc240cagccatgccgaaacgagaacccgtcgatcatgatggcagaaatgactccggcttagcat300ctggaggtgaatttatttcatcttcaccaggaagtgacaatagtgaacacttcagcgctt360cctattcatctccaaccagttgccatacagtaatttctactaatacttattatcccacca420atctaagaagaccttcacaggcgcagacgagtattccaacgcacatgatgtacaccggcg480atcacaaccccttaactcccccgaattcggaacctatgatttcgcccaaaagcgtgttat540caagaaacaacgaaggtgaacatcaaactactctgacgccttgtgcgtctcctgaggatg600cttctgttgatgctacagacagcgttaattgcgacggtgctttaaaaaaattacaagcga660cttttgaaaaaaatgcttttagtgaaggttctggggatgacgataccaaatctgatggag720aggcagaagaatacgacgaacaaggactaagagttccaaaagttaactctcatggaaaaa780ttaaaactttcaagtgtaagcaatgtgattttgtggccattactaaactagtcttctggg840aacataccaagttacatattaaagctgacaaactccttaaatgccccaagtgtccttttg900tcaccgaatataagcaccatttagaatatcaccttagaaatcattatggttcaaaaccat960ttaaatgtaaccagtgtagttactcttgtgtaaacaaatcaatgcttaattcacatttaa1020aatctcactctaatatttaccaataccgctgttctgactgcagttatgccacaaaatatt1080gtcattcgctgaaattgcatcttagaaaatactcgcacaaacctgctatggtactaaacc1140cagatggaacaccaaatccgttgcccataatcgatgtttatggtacaaggagaggaccaa1200agatgaagtcagaacaaaaatcatctgaggaaatgtctccgaaacccgaacaagttctac1260cattcccatttaaccagtttctaccccaaatgcagttaccattcccaggatttccattat1320ttggaggttttccaggtggcattccaaatcctttgttattgcaaaacttggaaaaactag1380cccgagaaaggcgtgaatccatgaactcttcagaacgtttttctcccgcacaatcagaac1440aaatggataccgatgcaggcgttcttgatctcagtaaaccagatgactcttcccagacaa1500accgacgaaaagattcagcttacaaactttcaactggtgataattcttcagatgaagaag1560acgatgaggcaactacaacaatgttcggtaatgttgaagttgttgaaaataaagaactag1620aagatacttcatcggggaaacagacaccaactagtgctaaaaaggatgactactcgtgcc1680aatactgtcagataaatttcggggaccccgttttgtatactatgcatatgggttaccacg1740gatacaagaatccatttatttgcaacatgtgcggtgaggaatgtaatgataaagtgtctt1800tcttcttgcacattgcacgaaatcctcattcttaaaaatatcaataagactgaattcaag1860gttagcatttttatatattatattcacactgaaacttttttaatattcaatatttggttg1920cgtaacatttacgcatatctatactttatttcacg1955<210>2<211>573<212>prt<213>diabroticavirgifera<400>2metargglyglyvalseraspaspmetthrserthrcysvalglngly151015glyileargproileglyargtyrglnproasnmetleumetglupro202530serserproglnseralatrpglnphehisproalametprolysarg354045gluprovalasphisaspglyargasnaspserglyleualasergly505560glyglupheileserserserproglyseraspasnsergluhisphe65707580seralasertyrserserprothrsercyshisthrvalileserthr859095asnthrtyrtyrprothrasnleuargargproserglnalaglnthr100105110serileprothrhismetmettyrthrglyasphisasnproleuthr115120125proproasnsergluprometileserprolysservalleuserarg130135140asnasngluglygluhisglnthrthrleuthrprocysalaserpro145150155160gluaspalaservalaspalathraspservalasncysaspglyala165170175leulyslysleuglnalathrpheglulysasnalapheserglugly180185190serglyaspaspaspthrlysseraspglyglualagluglutyrasp195200205gluglnglyleuargvalprolysvalasnserhisglylysilelys210215220thrphelyscyslysglncysaspphevalalailethrlysleuval225230235240phetrpgluhisthrlysleuhisilelysalaasplysleuleulys245250255cysprolyscysprophevalthrglutyrlyshishisleuglutyr260265270hisleuargasnhistyrglyserlysprophelyscysasnglncys275280285sertyrsercysvalasnlyssermetleuasnserhisleulysser290295300hisserasniletyrglntyrargcysseraspcyssertyralathr305310315320lystyrcyshisserleulysleuhisleuarglystyrserhislys325330335proalametvalleuasnproaspglythrproasnproleuproile340345350ileaspvaltyrglythrargargglyprolysmetlysserglugln355360365lyssersergluglumetserprolysprogluglnvalleuprophe370375380propheasnglnpheleuproglnmetglnleupropheproglyphe385390395400proleupheglyglypheproglyglyileproasnproleuleuleu405410415glnasnleuglulysleualaarggluargargglusermetasnser420425430sergluargpheserproalaglnsergluglnmetaspthraspala435440445glyvalleuaspleuserlysproaspaspserserglnthrasnarg450455460arglysaspseralatyrlysleuserthrglyaspasnserserasp465470475480glugluaspaspglualathrthrthrmetp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