專利名稱：一個(gè)能誘導(dǎo)植物抗病性的大豆疫霉基因PsIR1的應(yīng)用的制作方法
一個(gè)能誘導(dǎo)植物抗病性的大豆疫霉基因PsIRI的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一個(gè)能誘導(dǎo)植物抗病性的大豆疫霉基因PsIRl 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著世界人口的急劇增長(zhǎng)，可耕地面積的減少，世界糧食問題變得日趨嚴(yán)重，在有限的土地資源上耕作出更多的糧食，是解決人類生存的頭等大事。育種學(xué)家們不僅要提高作物的產(chǎn)量，還要減少作物的損失，其中植物病害一直是阻礙優(yōu)良品種增產(chǎn)的最大瓶頸，因此，培育高產(chǎn)抗病的作物品質(zhì)是近年來育種學(xué)家們追求的方向。常規(guī)的育種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力， 而隨著生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程的方法來培育的品種，不僅能縮短育種時(shí)間，而且可以讓多個(gè)優(yōu)良的性狀集中到一個(gè)品種上，是目前育種領(lǐng)域的應(yīng)用熱點(diǎn)。植物抗病基因工程是指采用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將外緣的基因?qū)胧荏w植株，從而獲得抗病的轉(zhuǎn)基因植物的方法。一般用于導(dǎo)入受體植物的外緣基因包括植物的抗病基因(即R基因)，病原菌無毒基因和抗病基因共轉(zhuǎn)形成的“雙組分系統(tǒng)”，植物的防衛(wèi)反應(yīng)基因以及一些生物的抗菌蛋白基因。通過將這些基因構(gòu)建到合適的載體上，構(gòu)成適于轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒，用不同的轉(zhuǎn)化方法向具有優(yōu)良品質(zhì)的受體植物中導(dǎo)入重組質(zhì)粒，利用合適的抗性篩選并鑒定出轉(zhuǎn)基因植株，通過抗病性鑒定，從而獲得高抗優(yōu)質(zhì)的品種。生物體內(nèi)基因眾多，例如人類基因組預(yù)測(cè)有3萬個(gè)基因以上，大豆疫霉接近2萬個(gè)基因，大多數(shù)基因的功能未知，而生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳、變異乃至生理平衡，無不與基因的表達(dá)和調(diào)控密切相關(guān)，因此，克隆并研究基因的功能對(duì)于基因工程來說是研究基礎(chǔ)。
本專利所涉及到的基因是一類由病原菌分泌，在侵染過程中可進(jìn)入植物細(xì)胞并引起植物生理生化活性改變的蛋白。已經(jīng)在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)大量的這種效應(yīng)蛋白，而近年來隨著基因組的測(cè)序，卵菌中也發(fā)現(xiàn)大量的效應(yīng)蛋白，除了大家廣為熟悉的RXLR效應(yīng)蛋白外，還有一類具有保守FLAK序列元件的CRN效應(yīng)蛋白。迄今為止，將CRN蛋白導(dǎo)入受體植物并能提高植物抗性未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
為了克服常規(guī)育種費(fèi)時(shí)費(fèi)力、不能具有持久廣譜抗性的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一個(gè)大豆疫霉效應(yīng)因子I3SlRl做為育種的候選材料，該蛋白可以誘導(dǎo)植物PRl基因的高度表達(dá)，引起煙草的抗病性。該基因?qū)橹参锟共』蚬こ烫峁┚哂袘?yīng)用潛力的功能基因，進(jìn)一步可為生產(chǎn)上提供一種具有持久抗病潛力的育種材料。
本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種大豆疫霉PsIRl基因在構(gòu)建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，該大豆疫霉I3SlRl基因序列為GenBank :HQ231784. 1。
其中，所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
含有大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的重組表達(dá)載體在構(gòu)建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
其中，所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。所述的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為PVX載體。
一種大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)在構(gòu)建具有煙草疫霉抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
含有大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的重組表達(dá)載體在構(gòu)建具有煙草疫霉抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。所述的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為PVX載體。
有益效果
本發(fā)明與現(xiàn)有的育種材料相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在
1.可大大的增強(qiáng)植物抗性。卵菌是具有巨大破壞力的病原菌，自然條件下抗源材料較少。煙草疫霉侵染速度非常快，在發(fā)明中，提前在煙草上表達(dá)I3S^l (GenBank HQ231784. 1)后接種煙草疫霉，可讓煙草疫霉的侵染速度減緩25%以上。
2. PsIRl (GenBank :HQ231784. 1)能夠誘導(dǎo)PRl和PR2基因高表達(dá)，可為生產(chǎn)上提供具有持久抗性的育種材料。PRl和PR2基因是水楊酸通路的基因，而水楊酸的增加可提高植物的廣譜抗性，因此，雖然PsIRl是大豆疫霉的基因，但是在植物上瞬時(shí)表達(dá)后，能引起 PRl基因的高表達(dá)，這表明PsIRl可誘導(dǎo)水楊酸的積累，因而可增強(qiáng)煙草的抗病性。


圖IPsIRl可抑制煙草疫霉的侵染
A.葉片左邊及右邊均表達(dá)GFP后接種煙草疫霉菌的病斑酒精脫色后表型B.葉片左邊表達(dá)GFP，右邊表達(dá)I^sIRl后接種煙草疫霉菌的病斑酒精脫色后表型C.圖A和圖B中葉片右邊與左邊病斑直徑比值。*代表在的水平上差異顯著。
圖2PsIRl可引起水楊酸通路防衛(wèi)反應(yīng)基因PRl和PR2的高表達(dá)
A. PsIRl和GFP分別在煙草上表達(dá)5天后，檢測(cè)SA通路PRl基因相對(duì)于0天的表達(dá)量，設(shè)定Od的表達(dá)量為10，比值取IoglO ；
B. PsIRl和GFP分別在煙草上表達(dá)5天后，檢測(cè)SA通路PR2基因相對(duì)于0天的表達(dá)量，設(shè)定Od的表達(dá)量為10，比值取IoglO具體實(shí)施方式
實(shí)施例IPsIRl可抑制煙草疫霉的侵染
1.載體構(gòu)建
根據(jù) Liu, et al, Two host cytoplasmic effectors are required for pathogenesis of Phytophthora sojae by suppression ο f host defenses. Plant physiology, 2011,155,1 :490-501 文章中構(gòu)建方法獲得 PVX:PsIRl 和 PVX:GFP 質(zhì)粒。
2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)
將PVX:PsIRl和PVX:GFP質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌(Biovector) 菌株中，將農(nóng)桿菌的陽性轉(zhuǎn)化子于3ml添加kanamycin (50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)液中，220rpm,培養(yǎng)48h，4000rpm離心％iin，收集菌體，用IOmM MgCl2重懸，重復(fù)三次后，用IOmM MgCl2定容至0D600 = 0. 4-0. 6。取生長(zhǎng)6_8周的煙草，從上數(shù)第三至第六片完全展開的真葉被用于滲透接種農(nóng)桿菌。用針頭在煙草下表皮造成一小傷口，用ImL無針頭的注射器將 30-50 μ 1農(nóng)桿菌懸液滲透到本氏煙葉片中。
3.煙草疫霉接種和病斑長(zhǎng)度測(cè)量
農(nóng)桿菌表達(dá)5天后取下注射的煙草葉片，放在培養(yǎng)皿里面濾紙保濕，然后用培養(yǎng) 3-5天煙草疫霉菌絲塊接種處理過的煙草葉片，隨時(shí)觀察和記錄煙草葉片的表型變化，2天后，用酒精脫色后測(cè)量病斑直徑。與對(duì)照相比GFP相比，PsIRl可以顯著限制煙草疫霉的侵染，至少可使煙草疫霉的侵染速度減緩25%以上(圖1)。
實(shí)施例2PsIRl引起水楊酸通路防衛(wèi)反應(yīng)基因的高表達(dá)
將實(shí)施例1中獲得的PVX:PSIR1和PVX:GFP按照實(shí)施例1的方法在煙草上瞬時(shí)表達(dá)，分別在表達(dá)Od和5d時(shí)取樣，按照Total RNA Purification System試劑盒(Invitrogen)提供的ftOtocal進(jìn)行。熒光定量PCR操作按照ABI 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA)軟件和指南進(jìn)行。PCR 反應(yīng)液使用 Real time PCR 試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM, TaKaRa, DaLian, China)來進(jìn)行反應(yīng)。以瞬時(shí)表達(dá)煙草葉片所提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA為模板進(jìn)行相對(duì)定量PCR擴(kuò)增。 M 50ng 的 cDNA 禾口 0. 2 μ M 弓| 物，0. 4ul ROX Reference Dye 及 IOul SYBR Premix Ex TaqTM混合于20 μ 1的PCR反應(yīng)體系中。PCR程序?yàn)?5°C 30秒預(yù)變性，40個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)(95°C 5秒，65°C 31秒)，引物的特異性通過融解曲線和電泳來判斷。本研究中所用到的引物見表1。
與Od未處理的煙草葉片相比，PsIRl可顯著提高SA通路基因ra2b和PRb-Ib基因的表達(dá)，分別引起ra2b和PRb-Ib的表達(dá)量提高約10000和20000倍，而GFP對(duì)照僅提高分別為1000倍和100多倍(圖2)。由此可見，PsIRl可以顯著引起SA通路防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)。
表1本研究中所用到的熒光定量引物
權(quán)利要求
1.一種大豆疫霉I3SlRl基因GenBank :HQ231784. 1在構(gòu)建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)大豆疫霉I3sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
3.含有大豆疫霉I^sIRl基因GenBank:HQ231784. 1的重組表達(dá)載體在構(gòu)建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)大豆疫霉I^sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為PVX載體。
6.一種大豆疫霉I3SlRl基因GenBank :HQ231784. 1在構(gòu)建具有煙草疫霉抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)大豆疫霉I^sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
8.含有大豆疫霉I^sIRl基因GenBank:HQ231784. 1的重組表達(dá)載體在構(gòu)建具有煙草疫霉抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)大豆疫霉I^sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為PVX載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一個(gè)能誘導(dǎo)植物抗病性的大豆疫霉基因PsIR1的應(yīng)用。一種大豆疫霉PsIR1基因(GenBankHQ231784.1)在構(gòu)建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明將大豆疫霉基因PsIR1插入PVX表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)在煙草上對(duì)PsIR1的功能進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PsIR1可顯著提高煙草對(duì)疫霉的抗性，并且PsIR1可誘導(dǎo)水楊酸通路防衛(wèi)反應(yīng)基因PR1和PR2的高表達(dá)。因此，可認(rèn)為PsIR1可引起了水楊酸的積累，而水楊酸的增加可提高植物的廣譜抗性，可見PsIR1可增強(qiáng)煙草的抗病性。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102533852SQ20121004345
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者劉廷利, 劉沛菡, 劉莉, 竇道龍, 茹艷艷 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)