專利名稱：一種h1r高表達的重組hek293細胞的構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于重組細胞技術領域，涉及一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法。
背景技術：
G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs),又稱為七次a螺旋跨膜蛋白受體(seven a -helices transmembrane segment receptors, 7TM receptors),是體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)超家族。在結構上面它包括七個跨膜區(qū)段，它們與配體結合G蛋白分子開關后，通過與受體偶聯(lián)的G蛋白的介導，使第二信使物質(zhì)增多或減少，轉而改變膜上的離子通道，引起膜電位發(fā)生變化。其作用比離子通道型受體緩慢，這類受體與G蛋白之間的偶聯(lián)關系也頗為復雜；一種受體可以和多種G蛋白偶聯(lián)，激活多種效應系統(tǒng)；也可同時和幾種受體偶聯(lián)或幾種G蛋白與一種效應系統(tǒng)聯(lián)系而使來自不同受體的信息集中于同一效應系統(tǒng)。組胺是一種小分子胺類物質(zhì)。它是由組氨酸脫羧酶作用于L-組氨酸而合成，組氨酸脫羧酶在整個機體細胞內(nèi)均有表達，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元、胃黏膜壁細胞、肥大細胞及嗜堿粒細胞。組胺通過組胺受體(Histamine receptor,HlR)調(diào)節(jié)機體功能,包括睡眠與覺醒周期，能量及內(nèi)分泌穩(wěn)定，識別及記憶，抗驚厥作用。組胺受體屬G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族成員，與其他單胺GPCR具有共同的保守序列。但序列同源性很低，在與組胺的親和力上存在很大差異，通過偶聯(lián)激活特異的G蛋白進行信號轉導。HlR在多種細胞中表達，包括內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞，調(diào)節(jié)血管舒張和支氣管收縮。研究表明，組胺在過敏性炎癥中起關鍵性作用，長期以來人們認為組胺釋放引起的炎性反應是由HlR介導的。HlR通過改變細胞內(nèi)鈣離子的濃度而將細胞外信號傳遞給第二信使傳導系統(tǒng)并升高環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)濃度而影響細胞生理功能。過敏是指由免疫機制誘導的高敏反應。過敏是體液(抗體)或者是細胞免疫機制介導的。在大多數(shù)情況下，可產(chǎn)生過敏反應的抗體屬于IgE類，這些個體可以歸類于患有 IgE-介導的過敏反應。然而，并非所有的“特異反應性”(atopy)個體都會發(fā)生與IgE相關的“過敏反應”。在非-IgE-介導的過敏反應中，抗體也可以屬于IgG—類。HlR拮抗劑也稱為抗組胺藥，可用于因組胺釋放所致的蕁麻疹、變應性鼻炎，以及對過敏所致的瘙癢、水腫都有很好的抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法，采用以 HlR為靶標，篩選HlR阻斷劑，為發(fā)現(xiàn)HlR阻斷劑建立細胞模型。為了達到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法，HlR高表達的重組HEK293細胞是以HEK293細胞為宿主細胞，轉染宿主細胞的外源性表達載體的是包含HlR全長基因的表達載體。所述的HlR全長基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。所述的包含HlR全長基因的表達載體是pEGFP-Nl，該表達載體是通過HindIII， Xho I酶切位點將Hl全長基因克隆入真核表達載體pEGFP-Nl。所述的表達載體pEGFP-Nl帶有GFP綠色熒光，應用于HlR高表達細胞的篩選。所述的HlR高表達的HEK293-H1R重組細胞應用于抗過敏藥物的篩選。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果I、本發(fā)明構建了組胺受體Hl的真核表達載體pEGFP-Nl，經(jīng)過克隆測序證實序列同NCBI數(shù)據(jù)庫中的人HlR序列一致；經(jīng)過脂質(zhì)體法轉染HEK293細胞，G418抗性篩選獲得能夠穩(wěn)定生長、存活的細胞株，經(jīng)過Western blot,免疫熒光檢測，篩選出穩(wěn)定、高表達HlR 的重組HEK293/H1R細胞株；本發(fā)明構建的包含HlR基因全長的重組HEK293/H1R細胞株能夠穩(wěn)定表達H1R，具有完整的分子結構。2、作為宿主細胞的HEK293細胞為原代人胚腎細胞轉染V型腺病毒(Ad5)DNA的永生化細胞，該細胞本身還有的各種受體表達量相對較低，而重組后的HEK293/H1R細胞表達的HlR的相對表達量較HEK293空載明顯升高，相對于其他細胞表面分子占據(jù)優(yōu)勢表達量， 處于與特異配體結合的優(yōu)勢地位，這樣就大大提高了以HlR為藥物篩選靶標的特異性及靈敏性。3、重組后的HEK293/H1R細胞表達的HlR利用GFP融合蛋白，活體觀察HlR蛋白表達定位，顯示HlR蛋白主要表達于細胞膜上。4、通過Western blot及免疫熒光檢測技術，證明HlR表達量相比HEK293明顯升高，且其在細胞膜上的表達較HEK293細胞表達量明顯提高，體現(xiàn)HlR的分子活性。


圖I是擴增HlR基因及線性化載體電泳檢測圖譜。圖2是pEGFP-Nl/HIR重組載體轉染大腸桿菌DH5后，提取質(zhì)粒菌液PCR鑒定結果。圖3是經(jīng)G418抗性篩選后，通過GFP熒光蛋白，活體觀察的陽性細胞培養(yǎng)圖。圖4-a是Western blot分析陽性細胞HlR表達量；圖4_b是對Western blot結果灰度分析柱狀圖。圖5是免疫熒光分析HlR在pEGFP-Nl/HIR細胞表達定位。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發(fā)明做詳細描述。本發(fā)明在構建HlR全長基因的真核表達載體pEGFP-Nl/HIR的基礎上，轉染HEK293 細胞，獲得穩(wěn)定、高表達HlR的重組HEK293/H1R細胞株，下面是對本發(fā)明實施例的解釋而不是限定。本實施例以pEGFP-Nl為基礎載體，具體選擇HindIII和XhoI酶切位點作為連接外源基因的多克隆位點。
一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法，包括以下步驟I) HlR基因克隆選擇包含HlR基因全長cDNA序列pBluescriptR/Hl質(zhì)粒作為模板進行克隆，采用 Primer Premier5. 0軟件設計相應的特異性引物,并在兩端分別加入Hindlll/Xhol酶切位點HlR-HindIII :5’ -GATAAGCTTGGAGCGAATATGCAGAATTCT-3，HlR~XhoI :5’ -GTACTCGAGATG AGCCTCCCCAATTCCTCC-3’ ；采用Takara公司LA Taq進行擴增PCR反應體系為上游引物4 ii L、下游引物 4u LUOXM buffer 5u L.dNTP :8 y UDNA 1 u L、BSA :2 y UTaq 酶0. L、補加 ddH20 至 50 u L ;首次95°C變性5min,再經(jīng)過30個循環(huán)作用(95°C變性45s，60。。復性40s, 72°C延伸 2min)，最后72°C延伸lOmin，得到大量目的片段，對產(chǎn)物采用商品化PCR純化試劑盒將擴增產(chǎn)物純化，HlcDNA擴增結果檢測如圖I所示，M為marker，結果表明擴增獲得預期的基因；2)重組表達載體構建利用Hindlll/Xhol雙酶切真核表達載體pEGFP_Nl和Hl基因純化產(chǎn)物酶切體系為=HindIII 1 u L, Xho I 1. 5u L, DNA/質(zhì)粒2u LUOXM buffer L、補加 ddH20 至 20 u L ;37°C反應4h，對pEGFP-Nl載體酶切產(chǎn)物采用商品化PCR產(chǎn)物純化試劑盒將擴增產(chǎn)物純化，pEGFP-Nl載體酶切產(chǎn)物電泳結果如圖I所示，M為Marker ；將線性化載體同酶切后的Hl擴增片段4°C條件下，T4DNA Iigase作用下過夜連接，反應體系為:酶切后的線性PEGFP-N13. 7iiL、酶切后的Hl片段5yL、T4DNAligase
0.3 u LUOXbuffer I y L，得到重組 pEGFP-Nl/Hl 表達載體；按照《分子克隆實驗指南》制備大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，將IOiiL重組 pEGFP-Nl/Hl質(zhì)粒加入200 u L感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42°C熱激90s，加入IOmL無卡拉霉素抗性LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖lh，3000rpm離心3min，將菌體沉淀吹打均勻，加入30mL 含有卡拉霉素抗性(lOOmg/mL) LB固體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆在含有卡拉霉素抗性(100mg/mL)LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，采用商品化試劑盒提取獲得高純度質(zhì)粒，菌液PCR初步鑒定陽性克隆(結果如圖2所示)，并送金斯瑞生物科技公司進行測序，驗證序列堿基，DNAstar Seqman進行序列拼接，得到的測序結果如SEQ. ID. NO. I所示,測序結果與基因庫(NCBI)中比對，序列一致性為100%，含有正確序列即為pEGFP-Nl/Hl重組表達載體；3)高表達Hl重組HEK293細胞構建①使用Invitrogen公司脂質(zhì)體轉染試劑LipofectAMINE 2000進行轉染常規(guī)培養(yǎng)HEK293細胞，在6孔板中接種3 X IO5個細胞/孔，加入2mL完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱中 37°C培養(yǎng)過夜，待細胞長至50 80%時進行轉染；在無菌離心管中配制如下溶液溶液A :將5 ii g待轉染的超純DNA稀釋到200 U L無血清培養(yǎng)基中；溶液B :將8 ii L LipofectAMINE 2000稀釋到200 U L無血清培養(yǎng)基中；混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15 45min ;用2mL無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞，加入0. SmL無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中37°C孵育6h ;用完全培養(yǎng)基替換轉染液，繼續(xù)培養(yǎng)；HEK293細胞的篩選濃度為800 u g/ mL ;轉染72小時后按I : 10的比例將轉染細胞在6孔板中傳代，換為含G418的選擇培養(yǎng)基；在6孔板內(nèi)可見單個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)14天左右，可見單個細胞分裂增殖形成單個抗性集落，如圖3所示；②有限稀釋法抗性集落細胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋(10_2 10_1(1)，將每一稀釋度的細胞滴加到96孔板中培養(yǎng)，15天左右細胞長滿整個孔，胰酶消化，傳代至大瓶培養(yǎng)，反復凍存、培養(yǎng)細胞兩次； 4)高表達HlR重組HEK293細胞鑒定①Western blot :4 °C 條件下，將轉染 HI、轉染 pEGFP-Nl 的 HEK293 細胞，按
I.5 X IO6個細胞加入200 ii L細胞裂解液(加入蛋白酶抑制劑PMSF)的比例裂解細胞，加入 50 u L loading buffer,沸水浴lOmin，提取細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳，用PVDF膜完成全濕電轉印，后用含5% (m/v)脫脂奶粉的TBST室溫封閉轉移后的PVDF膜，經(jīng)TBST洗滌， 加5% (m/v)BSA的TBST稀釋的特異性一抗與靶蛋白4°C過夜孵育，TBST洗滌3次后，再加 5% (m/v)BSA的TBST稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，用ECL化學發(fā)光檢測蛋白表達， 檢測HEK293/H1R細胞Hl蛋白表達。經(jīng)檢測，如圖4_a所示，H1-1、H1-3、H1-4、H1-7、H1_8、 H1-9為篩選的轉染了 HEK293/H1R的細胞克隆，pcDNA為轉染空載的重組HEK293細胞，克隆Hl-4、Hl-7、Hl-8、H1-9的HlR表達量較克隆HEK293_pcDNA的表達量均有提高，而以克隆H1-8的HlR表達量最高。對Western blot的灰度分析結果表明，陽性克隆表達量均有升高，且H1-8較陰性細胞HEK293的HlR的表達高2. 58倍；如圖4_b所示；②免疫熒光分析HlR表達定位取對數(shù)生長期的HEK293空載細胞和pEGFP_Nl/ HlR細胞，0.25% (m/v)胰蛋白酶消化，按I X IO5個細胞/孔左右接種于放有多聚賴氨酸預處理的無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24h細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌爬有細胞的蓋玻片三次；4% (m/v)多聚甲醛(pH 7.4PBS溶解)lmL固定細胞15min，后棄去；PBS 輕柔洗漆細胞2次,加入ImL含I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的 PBST孵育細胞Ih ;用含I % (m/v) BSA的PBST以I : 100稀釋兔抗人HlR多克隆抗體，加到蓋玻片上，室溫孵育211; 85輕輕洗滌三次，每次5111111;用含1%(111八)854的？851'以1 : 200 稀釋FITC標記山羊抗兔IgG 二抗，滴加到爬片上，室溫避光孵育Ih ;于暗處，PBS洗滌三次， 每次5min;在載玻片上滴加90% (m/v)甘油封片，注意不要產(chǎn)生氣泡。用熒光顯微鏡觀察并拍照，結果如圖5所示，圖5-a、圖5-d為DAPI分別染HlR和HEK293細胞核，藍色熒光。 圖5-b、圖5-e為cy-3分別染HlR和HEK293細胞膜，紅色熒光。圖5_c、圖5_f別為HlR和 HEK293細胞核和細胞膜熒光疊加后的圖譜。與HEK293空載細胞相比，HlR細胞膜上有HlR 的表達。
權利要求
1.一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法，其特征在于H1R高表達的重組 HEK293細胞是以HEK293細胞為宿主細胞，轉染宿主細胞的外源性表達載體的是包含HlR全長基因的表達載體。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法，其特征在于所述的HlR全長基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示
3.根據(jù)權利要求I所述的一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法，其特征在于所述的包含HlR全長基因的表達載體是pEGFP-Nl，該表達載體是通過Hind III，XhoI酶切位點將HlR全長基因克隆入真核表達載體pEGFP-Nl。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法，其特征在于所述的達載體pEGFP-Nl帶有GFP綠色熒光，應用于HlR高表達細胞的篩選。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法，其特征在于所述的HlR高表達的HEK293-H1R重組細胞應用于抗過敏藥物篩選。
6.根據(jù)權利要求I至5任一權利要求所述的一種HlR高表達的重組HEK293細胞的構建方法，其特征在于包括以下步驟.1)H1R基因克隆選擇包含HlR基因全長cDNA序列pBluescriptR/HIR質(zhì)粒作為模板進行克隆，采用 Primer Premier5. 0軟件設計相應的特異性引物,并在兩端分別加入Hindlll/Xhol酶切位點HlR-HindIII :5’ -GATAAGCTTGGAGCGAATATGCAGAATTCT-3，HlR~XhoI :5’ -GTACTCGAGATG AGCCTCCCCAATTCCTCC-3’ ；采用Takara公司LA Taq進行擴增PCR反應體系為上游引物4 U L、下游引物4 ii L、 IOXM buffer :5ii L、dNTP :8ii L、DNA :1 ii L、BSA :2ii L、Taq 酶0. L、補力口 ddH20 至 50 u L ;首次95°C變性5 min，再經(jīng)過30個循環(huán)作用(95°C變性45s，60°C復性40s，72°C延伸2min)，最后72°C延伸lOmin，得到大量目的片段，對產(chǎn)物采用商品化PCR純化試劑盒將擴增產(chǎn)物純化；.2)重組表達載體構建利用Hindlll/Xhol雙酶切真核表達載體pEGFP-Nl和Hl基因純化產(chǎn)物酶切體系為 HindIII 1 u L.Xho I : I. 5 y L、DNA/質(zhì)粒2u LUOXM buffer 2 y L、補加 ddH20 至 20 y L ; 37°C反應4h，對pEGFP-Nl載體酶切產(chǎn)物采用商品化PCR產(chǎn)物純化試劑盒將擴增產(chǎn)物純化；將線性化載體同酶切后的Hl擴增片段4°C條件下，T4 DNA Iigase作用下過夜連接，反應體系為，酶切后的線性pEGFP-Nl 3. 7iiL、酶切后的Hl片段5iiL、T4 DNA Iigase.0.3 u LUOXbuffer lyL，得到重組 pEGFP-Nl/Hl 表達載體；按照《分子克隆實驗指南》制備大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，將10 ii L重組pEGFP_Nl/ Hl質(zhì)粒加入200 ii L感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42°C熱激90s，加入IOmL無卡拉霉素抗性 LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖lh，3000rpm離心3min，將菌體沉淀吹打均勻，加入30mL含有卡拉霉素抗性(lOOmg/mL) LB固體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆在含有卡拉霉素抗性 (100mg/mL) LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，采用商品化試劑盒獲得高純度質(zhì)粒，菌液PCR初步鑒定陽性克隆，并送金斯瑞生物科技公司進行測序，驗證序列堿基，DNAstar Seqman進行序列拼接，得到的測序結果如SEQ. ID. NO. I所示，測序結果與基因庫(NCBI)中比對，序列一致性為100%，含有正確序列即為pEGFP-Nl/Hl重組表達載體；.3)高表達Hl重組HEK293細胞構建①使用Invitrogen公司脂質(zhì)體轉染試劑LipofectAMINE 2000進行轉染常規(guī)培養(yǎng) HEK293細胞，在6孔板中接種3 X IO5個細胞/孔，加入2mL完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37°C 培養(yǎng)過夜，待細胞長至50 80%時進行轉染；在無菌離心管中配制如下溶液溶液A :將5 ii g待轉染的超純DNA稀釋到200 u L無血清培養(yǎng)基中；溶液B :將8 ii L LipofectAMINE 2000稀釋到200 u L無血清培養(yǎng)基中；混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15 45min ;用2mL無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞，加入0. SmL無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中 37°C孵育6h ;用完全培養(yǎng)基替換轉染液，繼續(xù)培養(yǎng)；HEK293細胞的篩選濃度為800 u g/mL ； 轉染72小時后按I : 10的比例將轉染細胞在6孔板中傳代，換為含G418的選擇培養(yǎng)基；在 6孔板內(nèi)可見單個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)14天左右，可見單個細胞分裂增殖形成單個抗性集落；②有限稀釋法抗性集落細胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋(10_2 10_1(1)，將每一稀釋度的細胞滴加到96孔板中培養(yǎng)，15天左右細胞長滿整個孔，胰酶消化，傳代至大瓶培養(yǎng)， 反復凍存、培養(yǎng)細胞兩次；4)高表達HlR重組HEK293鑒定①Western blot :4°C條件下，將轉染 H1R、轉染 pEGFP-Nl 的 HEK293 細胞，按 I. 5 X IO6 個細胞加入200 ii L細胞裂解液(加入蛋白酶抑制劑PMSF)的比例裂解細胞，加入50 ii L loading buffer，沸水浴lOmin，提取細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳，用PVDF膜完成全濕電轉印，后用含5% (m/v)脫脂奶粉的TBST室溫封閉轉移后的PVDF膜，經(jīng)TBST洗滌，加％ (m/v)BSA的TBST稀釋的特異性一抗與靶蛋白4°C過夜孵育，TBST洗滌3次后，再加5% (m/v) BSA的TBST稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，用ECL化學發(fā)光檢測蛋白表達，檢測 HEK293/H1細胞Hl蛋白表達；經(jīng)檢測，Hl-U Hl-3、Hl-4、Hl-7、Hl-8、H1-9為篩選的轉染了 HEK293/H1R的細胞克隆，pcDNA為轉染空載的重組HEK293細胞，克隆Hl-4、Hl-7、H1-8、 H1-9的HlR表達量較克隆HEK293-pcDNA的表達量均有提高，而以克隆H1-8的HlR表達量最高J^Western blot的灰度分析結果表明，陽性克隆表達量均有升高，且Hl_8較陰性細胞HEK293的HlR的表達高2. 58倍；②免疫熒光分析HlR表達定位取對數(shù)生長期的HEK293空載細胞和pEGFP-Nl/HIR細胞，0.25% (m/v)胰蛋白酶消化，按IX IO5個細胞/孔左右接種于放有多聚賴氨酸預處理的無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24h細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌爬有細胞的蓋玻片三次；4% (m/v)多聚甲醛(pH 7.4 PBS溶解)ImL固定細胞15min后棄去；PBS輕柔洗漆細胞2次,加入ImL含I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的PBST 孵育細胞Ih ;用含I % (m/v) BSA的PBST以I : 100稀釋兔抗人Hl多克隆抗體，加到蓋玻片上，室溫孵育211; 85輕輕洗滌三次，每次5111111;用含1%(111八)854的？851'以1 : 200稀釋FITC標記山羊抗兔IgG 二抗，滴加到爬片上，室溫避光孵育Ih ;于暗處，PBS洗滌三次，每次5min ;在載玻片上滴加90% (m/v)甘油封片，注意不要產(chǎn)生氣泡。
全文摘要
一種H1R高表達的重組HEK293細胞的構建方法，利用真核表達載體pEGFP-N1構建全長H1R基因真核表達載體pEGFP-N1-H1R，進而以其轉染HEK293細胞，利用G418篩選得到高表達全長H1R的基因的工程細胞系HEK293-H1R，并證實該細胞系可將全長H1R的表達提高2.58倍，H1R高表達的HEK293-H1R重組細胞應用于抗過敏藥物篩選。
文檔編號C12N15/11GK102604896SQ20121004236
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月23日 優(yōu)先權日2012年2月23日
發(fā)明者張濤, 賀浪沖, 郭瑛, 黃靜 申請人:西安交通大學