一種分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pAO815Hr及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pAO815Hr，其堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示，本發(fā)明中以質(zhì)粒pPIC9和pAO815為模板，采用重疊PCR方法拼接質(zhì)粒pAO815中酶切位點(diǎn)Cla?I起始并包括5′AOX啟動(dòng)子區(qū)在內(nèi)的基因片段與質(zhì)粒pPIC9中信號(hào)肽基因序列起始的包括多克隆位點(diǎn)在內(nèi)的基因片段并于3′端引入酶切位點(diǎn)BamH?I，同時(shí)除去質(zhì)粒pPIC9中信號(hào)肽基因序列上游的BamH?I位點(diǎn)，體外構(gòu)建分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pAO815Hr。本發(fā)明中同時(shí)還提供了木聚糖酶DSB基因單拷貝重組質(zhì)粒pAO815Hr-DSB以及雙拷貝重組質(zhì)粒pAO815Hr-2×DSB。
【專利說明】—種分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr，以及其構(gòu)建方法，特別是體外構(gòu)建分泌型多拷貝工程質(zhì)粒的方法，并能夠認(rèn)為操縱外源基因插入的拷貝數(shù)，有利于外源基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的改造，本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是一類最近發(fā)展十分迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)工具，同時(shí)具備原核生物的生長(zhǎng)快，易于操作等特點(diǎn)和真核生物的翻譯后修飾的功能，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近10年來得到廣泛應(yīng)用的表達(dá)外源基因最成功的系統(tǒng)之一，使用最為廣泛，有許多蛋白質(zhì)和多肽在該系統(tǒng)中成功表達(dá)并且獲得較高的表達(dá)量。
[0003]畢赤酵母酵母表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)兩種，其中分泌性表達(dá)的質(zhì)粒具有表達(dá)量較高、糖基化完全、高級(jí)結(jié)構(gòu)形成正確、后續(xù)分離純化程序比較簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，因而使用更普遍。影響工程菌表達(dá)量的因素有很多，外源性因素如培養(yǎng)基成份、酸堿度和培養(yǎng)溫度、通氣量等，內(nèi)源性的影響因素主要是目的基因特性和數(shù)量，雖然研究表明，基因的數(shù)量與表達(dá)量之間沒有必然的聯(lián)系，很少數(shù)的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)增加基因的數(shù)量表達(dá)量反而降低，但更多試驗(yàn)證實(shí)，相當(dāng)數(shù)量的目的基因可以提高表達(dá)量。
[0004]質(zhì)粒pPIC9和pA0815是Invitrogen公司開發(fā)的應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的整合型質(zhì)粒，各有其特點(diǎn)，適合不同的外源基因表達(dá)策略。質(zhì)粒PA0815適合體外構(gòu)建多拷貝，但質(zhì)粒上不含編碼分泌信號(hào)肽 的基因序列，屬于胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒，克隆位點(diǎn)僅有一個(gè)限制性酶EcoR I位點(diǎn)，對(duì)一些要求特殊的外源基因或特異克隆表達(dá)策略，會(huì)造成不便。質(zhì)粒PPIC9攜帶分泌信號(hào)肽的基因序列，卻不能于體外構(gòu)建目的基因的多拷貝。
[0005]為了提聞目的蛋白的表達(dá)量和避免質(zhì)粒pA0815胞內(nèi)表達(dá)、克隆位點(diǎn)單一的不足，利用質(zhì)粒PPIC9分泌型質(zhì)粒具有a -factor信號(hào)肽基因序列和多克隆位點(diǎn)的特點(diǎn)，可采用基因工程技術(shù)于體外對(duì)兩者進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)外源蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明解決了【背景技術(shù)】中的不足，提供了一種分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr，其堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本發(fā)明提供的分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr，用于在畢赤酵母中分泌表達(dá)外源基因。
[0008]本發(fā)明還提供了一種采用該重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建多拷貝外源基因重組質(zhì)粒時(shí)的篩選驗(yàn)證方法。
[0009]本發(fā)明中所提供的分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr的制備方法如下:(I)、根據(jù)pPIC9分泌型表達(dá)質(zhì)粒和pA0815組成型多拷貝表達(dá)質(zhì)粒的核酸序列，設(shè)計(jì)合成引物，所合成的引物如下:[0010]引物名稱引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr，其特征在于:其堿基序列如SEQ IDN0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)、根據(jù)PPIC9分泌型表達(dá)質(zhì)粒和pA0815組成型多拷貝表達(dá)質(zhì)粒的核酸序列，設(shè)計(jì)合成引物，所合成的引物如下: 引物名稱引物序列
Cla 1-F5/ -GCATCGATAAGCTGACTCATGTTGG-3'
BER5' -GGAATCTTGGAATAGCCATCTCGTTTCGAATAATTAGTTG-3'
BEF5' -CAACTAATTATTCGAAACGAGATGGCTATTCCAAGATTCC-3'
BamH 1-R5/ -CGGGATCCGCACAAACGAACGTCTCACTTAATC-3; (2)、以質(zhì)粒pA0815為模板，使用引物Cla1-F與BER，采用PCR反應(yīng)合成分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr核心區(qū)的上游基因片段，上游基因片段為質(zhì)粒pA0815中酶切位點(diǎn)Cla I起始并包括5' AOX啟動(dòng)子區(qū)在內(nèi)的基因片段(1027bp); (3)、以質(zhì)粒pPIC9為模板，使用引物BEF與BamH1-R,采用PCR反應(yīng)合成分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr核心區(qū)的下游基因片段，下游基因片段為質(zhì)粒pPIC9中信號(hào)肽基因序列起始的包括多克隆位點(diǎn) 在內(nèi)的基因片段(722bp)，并于3'端引入酶切位點(diǎn)BamH I，同時(shí)除去質(zhì)粒PPIC9中信號(hào)肽基因序列上游的BamH I位點(diǎn)； (4)、以步驟(2)和步驟(3)中合成的上游基因片段和上游基因片段為模板，使用引物Cla 1-F與BamH 1-R,采用PCR反應(yīng)合成分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr核心區(qū)(1719bp)，該核心區(qū)基因序列Y端和:V端分別具有Cla I和BamH I酶切位點(diǎn)，且具有5' AOX啟動(dòng)子區(qū)，信號(hào)肽基因序列和多克隆位點(diǎn)區(qū)，并除去了信號(hào)肽基因序列5'端的BamH I位點(diǎn)； (5)、將質(zhì)粒pA0815與分泌型多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr核心區(qū)分別經(jīng)ClaI與BamH I雙酶切后，純化回收目的產(chǎn)物并連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Escherichiacoli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選出攜帶質(zhì)粒pA0815Hr的陽性克隆菌株，并將其命名為pA0815Hr-DH5α 。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中PCR反應(yīng)程序?yàn)?950C 5min ;循環(huán) 30 次:95°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin30sec ；72°C IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)中PCR反應(yīng)程序?yàn)?950C 5min ;循環(huán) 30 次:95°C 30sec,62°C 30sec,72°C Imin ；72°C IOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)中PCR反應(yīng)程序?yàn)?950C 5min ;循環(huán) 10 次:95°C 30sec,60°C 30sec (每個(gè)循環(huán)下降 0.5°C),72C2min ;循環(huán) 30次:95°C 30sec,55°C 30sec,72°C 2min ；72°C IOmin0
6.一種木聚糖酶DSB基因單拷貝重組質(zhì)粒pA0815Hr-DSB，其特征在于:該重組質(zhì)粒采用如下方法構(gòu)建:將權(quán)利要求1中所述質(zhì)粒pA0815Hr與木聚糖酶DSB基因分別經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切后，回收目標(biāo)產(chǎn)物并連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選攜帶木聚糖酶DSB基因的陽性克隆菌株并將其命名為pA0815Hr-DSB-DH5 α。
7.一種木聚糖酶DSB基因雙拷貝重組質(zhì)粒pA0815Hr-2XDSB，其特征在于:該重組質(zhì)粒采用如下方法構(gòu)建:將權(quán)利要求6中的質(zhì)粒pA0815Hr-DSB逐步經(jīng)Bgl II和BamH I酶切并回收最終目標(biāo)產(chǎn)物，將最終目標(biāo)產(chǎn)物與質(zhì)粒pA0815Hr-DSB經(jīng)BamH I酶切后的回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取重組菌株中的質(zhì)粒，采用Cal I和Bam H I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，從中篩選出攜帶兩個(gè)聚糖酶DSB基因且基因順序一致的陽性克隆菌株并將其命名為pA0815Hr-2XDSB-DH5 α。
8.一種產(chǎn)木聚糖酶DSB的重組畢赤酵母菌株DSB-GS115，其特征在于:該重組菌株采用以下方法制備:將權(quán)利要求6所述的木聚糖酶DSB基因單拷貝重組質(zhì)粒pA0815Hr-DSB采用限制性內(nèi)切酶Bgl II線性化后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，采用酶活力檢測(cè)方法，篩選出高效表達(dá)木聚糖酶DSB基因的畢赤酵母基因工程菌株DSB-GSl 15。
9.權(quán)利要求1所述的分泌型多 拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒pA0815Hr，在畢赤酵母中分泌表達(dá)外源基因的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103789334SQ201410029534
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】熊海容, 王亞偉, 陳豐, 張巍 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)