專利名稱：一種細菌質(zhì)粒dna提取的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說是一種細菌質(zhì)粒DNA的提取方法。質(zhì)粒是存在于細菌染色體外的能獨立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的環(huán)狀雙鏈DNA 分子，質(zhì)粒腿A是基因工程的常用載體，可以攜帶外源基因進入細菌、動 物細胞或植物體內(nèi)進行擴增與表達。質(zhì)粒DNA提取的效率及質(zhì)量對后續(xù)實 驗(酶切、PCR擴增等)的成功與否有著直接的關(guān)系，因此快速高效地從細 菌細胞中提取和純化質(zhì)粒具有重要的意義。目前從細菌中提取質(zhì)粒DNA常采用的方法有煮沸法、SDS法、堿裂解法等，這些方法通常都是針對帶有人工構(gòu)建質(zhì)粒的大腸桿菌進行提取，耗時 長、質(zhì)量低，而且提取過程中使用酚、氯仿等有毒物質(zhì)，既污染環(huán)境又危 害人體健康。對于很多有機污染物降解細菌來說，污染物降解的特性都是 由細菌的內(nèi)生質(zhì)粒調(diào)控的或者與質(zhì)粒有關(guān)，認(rèn)清降解細菌質(zhì)粒以及位于質(zhì) 粒上的基因與有機污染物降解之間的關(guān)系，將有助于更深刻地了解微生物 對有機污染物降解的內(nèi)在機制和過程，所以尋找一種安全高效、簡便快速 并能應(yīng)用于多種有機污染物降解菌的質(zhì)粒提取方法是進行此項研究的基 礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種安全、高效、適合多種細菌質(zhì)粒DNA提取 的方法。有機污染物降解菌的質(zhì)粒DNA提取的方法。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為-. 提取的方法1) 細菌的培養(yǎng)將挑取的細菌單菌落在細菌常用液體培養(yǎng)基中，25-30x:振搖過夜培養(yǎng)；2) 菌體的收集、裂解當(dāng)為革蘭氏染色陰性菌時，取1.5-2.0mL培養(yǎng) 16-24小時的菌液，并在10000-12000rpm下離心30-60秒，收集菌體；用 l-l. 5mL S丁E溶液洗滌兩次，10000rpra離心30秒；而后在細菌沉淀中加入 100-30GjuL溶液I ,再加入2QQ-6QQjuL溶液I]，冰浴3-5分鐘，得裂解菌 液；當(dāng)為革蘭氏染色陽性菌分別培養(yǎng)時，取3. 0-4.0mL培養(yǎng)10-16小時的 菌液，并在8000-10000r，下離心60-90秒，收集菌體；用2. 0-3. OmL STE 溶液洗滌兩次，lOOOOrpm離心30秒；而后在細菌沉淀中加入100-200 y L 溶液1和50-lOOjaL溶菌酶，37"C水洛30-60分鐘,然后再加入200-600ML溶液II，冰浴3-5分鐘，得裂解菌液；3) 質(zhì)粒DNA的復(fù)性、與染色體DNA分離在步驟2)中得到的裂解菌 液內(nèi)加入150-400 mL溶液m，冰浴15-20分鐘，4 。C下以12000rpm離心10 分鐘，取上清；并在上清液中加與其等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘，4 。C下再以12000rpm離心5分鐘，取其沉淀待用；4) 質(zhì)粒dna的沉淀將步驟3)中的沉淀用100-400 m l無菌重蒸水溶 解，并加入溶解沉淀的無菌水的l/2體積的7. 5mol -L—屮lUc和5mo1 'l—'LiCl, 冰洛3-5分鐘，4。C下以12000rpm離心5分鐘，取上清；并在上清液中加 與其等體積的異丙醇，室溫放置40分鐘，沉淀即為質(zhì)粒DNA;其中溶液I為50mmol/L葡萄糖，25畫1/L Tris Cl ， pH8. 0和 1O隨ol/L EDTA, pH8. 0;溶液ii為0. 2mol/L NaOH和1%SDS;溶液iii為 溶液中含鉀的濃度為3-5mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根，pH4. 8; NH,Ac 和LiCl之間的摩爾比例是1: 1。所述細菌常用液體培養(yǎng)基的成分為葡萄糖1.0g,酵母奢l. 0g， MgS04 7H20 0. 2g, Na2C03 0. lg, CaCh . 2H20 0. Olg, MnS04 . H20 0. 02g, FeS04 - 7H20 0. 005g, NH萬1. Og， KH2P04 0. 4g, Na2HP04 。
6g,加蒸餾水 至1L, pH7. 2-7. 5。上述得到的質(zhì)粒DNA可用乙醇洗滌，空氣中干燥后加50-lOOjaL TE溶 解，-2(TC保存。所述質(zhì)粒DNA的洗滌用乙醇洗滌2-4次，其中乙醇的濃度為60-80%。 STE溶液的成分為10mmol/L Tris "Cl,pH8. 0， 10mmol/L NaCl和lmmol/L EDTA, pH8. 0; TE緩沖液為10mmol/L Tris HC1, pH8. 0和1mmol/L EDTA, pH8. 0;所述溶菌酶(Lysozyme Egg White,濃度為50mg/mL) 本發(fā)明所具有的優(yōu)點1. 操作簡便、安全。本發(fā)明所用儀器簡單，易操作。用NH,Ac代替酚、 氯仿去除蛋白，可以有效降低對人體的危害，并減少對環(huán)境的污染。2. 質(zhì)量高。選擇適宜的條件進行細菌培養(yǎng)以及合適體積的菌液進行質(zhì) 粒DNA提取，可最大限度的提高提取的效率；同時利用LiCl進行處理可以 大量沉淀RNA,并減少RNaseA的消化時間；用等體積異丙醇代替2倍體積 的乙醇來沉淀質(zhì)粒dna,可以獲得更好的沉淀效果，最終獲得的質(zhì)粒dna的 a，/a則均達到了 1.80，完全可以滿足常規(guī)分子生物學(xué)實驗的要求。3. 應(yīng)用范圍廣。在帶有質(zhì)粒的有機污染物降解細菌中，既有革蘭氏染 色陰性細菌也有革蘭氏染色陽性細菌，經(jīng)實驗證明本發(fā)明不僅適用于革蘭 氏染色陰性細菌質(zhì)粒DNA的提取，同樣適用于革蘭氏染色陽性細菌，因此 具有廣泛的適用性。


圖1為DNA的水平瓊脂糖凝膠電泳譜圖；其中的1泳道是lkb DNA marker, 5泳道是入隨/跑c/111 marker,中間三個泳道分別2為戈登氏菌ZCG2， 3為假單胞菌B61, 4為人蒼白桿菌ZHL4。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明。 實施例1將在斜面培養(yǎng)的戈登氏菌ZCG2，挑取其單菌落在細菌常用液體培養(yǎng)基 中25。C振蕩培養(yǎng)12小時后，取3. OmL菌液，9000rpni離心70秒,用2. OmL STE溶液洗滌兩次，10000rpm離心30秒；先加入150 ja L溶液I和50 p L 溶菌酶(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，37。C水浴40分鐘， 然后再加入400 mL溶液I1,冰浴5分鐘；加入300 m L溶液iii,冰浴20分 鐘，4。C, 12000rpm離心IO分鐘；取上清，加等體積異丙醇，室溫放置5 分鐘，4'C， 12000rpm離心5分鐘；用300 m L無菌重蒸水溶解沉淀，加入 150yL的7. 5mol . L—'NH4Ac和5mol . L—'LiCl,冰洛5分鐘，4*C， 12000rpm 離心5分鐘；取上清，并在上清液中加與其等體積的異丙醇，室溫放置40 分鐘，沉淀即為質(zhì)粒DNA;將上述沉淀用70%乙醇洗滌兩次，空氣中干燥后 加70mL TE溶解。其中細菌常用液體培養(yǎng)基的成分為葡萄糖l. Og,酵母膏1.0g, MgS04 7H20 0. 2g, Na2C03 0. lg， CaCl2 2H20 0. Olg, MnS04 . H20 0. 02g, FeS04 7H20 0. 005g, NH萬1. Og, KH2P04 0. 4g, Na風(fēng)0. 6g，加蒸餾水 至1L, pH7.2, 12rC滅菌30tnin;溶液I為50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris ■ CI, pH8. 0和lOmmol/L EDTA, pH8. 0;溶液II為0, 2mol/L NaOH和 1%SDS;溶液III為溶液中含鉀的濃度為5mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根， pH4. 8; NIUc和LiCl之間的摩爾比例是1:1。 STE溶液的成分為1O腿ol/L Tris-Cl， pH8. 0, 10,1/L NaCl和lmmol/L EDTA， pH8. 0; TE緩沖液為 lOmmol/L Tris HC1， p朋.0和lmmol/L EDTA, pH8. 0;其質(zhì)粒DNA的提取 結(jié)果(參見圖1第2泳道)，提取DNA的含量為28. 9pg/mL， A261t/A28 =l. 80。實施例2將在斜面培養(yǎng)的假單胞菌B61,挑取其單菌落在細菌常用液體培養(yǎng)基中 28。C振蕩培養(yǎng)18小時后，取2. OmL菌液，lOOOOrpm離心45秒，用1. 5mL STE 溶液洗滌兩次，lOOOOrpm離心30秒；先加入135 ja L溶液I ,然后再加入 270laL溶液I1 ,冰洛4分鐘；加入200iaL溶液in，冰浴20分鐘，4。C，12000rpm 離心10分鐘；取上清，加等體積異丙醇，室溫放置5分鐘，4°C, 12000rpm 離心5分鐘；用200 nL無菌重蒸水溶解沉淀，加入100 y L的 7. 5mol . L—'歸c和5rao1 . L 'LiCl,冰浴5分鐘，4°C, 12000rpm離心5分 鐘；取上清，加入等體積的異丙醇，室溫放置40分鐘，沉淀即為質(zhì)粒DNA; 將上述沉淀用70%乙醇洗滌兩次，空氣中干燥后加60pLTE溶解。其中細菌常用液體培養(yǎng)基的成分為葡萄糖l.Og，酵母膏l(xiāng).Og, MgS04 7H:0 0. 2g, Na.'CO 0. lg， CaCl2 2H20 0. Olg, MnSO, H.O 0. 02g, FeS04 . 7H;0 0. Q05g，歸O' l.Og, KHPOj 0. 4g， Na2HP04 0. 6g,加蒸f水至1L. pH7. 4， 12rC滅菌30min;溶液I為50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris'Cl， pH8. 0和10mmol/L EDTA, pH8. 0;溶液II為0. 2mol/L NaOH和 1%SDS;溶液III為溶液中含鉀的濃度為4mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根， pH4. 8; NH4Ac和LiCl之間的摩爾比例是1: 1。 STE溶液的成分為lOmmol/L Tris . CI, pH8. 0, 10mmol/L NaCi和1睡1/L EDTA, pH8. 0; 丁E緩沖液為 10mmol/L Tris HCl， pH8. 0和l鵬ol/L EDTA， pH8. 0;其質(zhì)粒DNA的提取 結(jié)果(參見圖1第3泳道)，提取DNA的含量為42. 3 ja g/mL, A2fc。/Aw)=l. 85。 實施例3將在斜面培養(yǎng)的人蒼白桿菌ZHL4,挑取其單菌落在細菌常用液體培養(yǎng) 基中3(TC振蕩培養(yǎng)20小時后，取1. 5mL菌液，11000rpm離心35秒，用1. OmL STE溶液洗滌兩次，10000rpm離心30秒；先加入100 y L溶液I ，然后再 加入200juL溶液II,冰洛3分鐘；加入150 n L溶液III,冰洛15分鐘，4 °C， 12000rpm離心IO分鐘；取上清，加等體積異丙醇，室溫放置5分鐘， 4°C， 12000rpm離心5分鐘；用200 m L無菌重蒸水溶解沉淀，加入lOOyL 1的7. 5mol . L—'WUc和5mol L—'LiCl,冰洛5分鐘，4°C, 12000rpm離心 5分鐘；取上清，加入等體積的異丙醇，室溫放置40分鐘，沉淀即為質(zhì)粒 DNA;將上述沉淀用70%乙醇洗滌兩次，空氣中干燥后加50 )a L TE溶解。其中細菌常用液體培養(yǎng)基的成分為葡萄糖l.Og,酵母膏l(xiāng).Og, MgSO, ■ 7H20 0. 2g, Na2CO; 0. lg， CaCh 2H20 0. Olg, MnS04 H20 0. 02g, FeSO廣7H20 0. 005g， NH4N03 l.Og, KH2P04 0. 4g, Na2HP04 0. 6g,加蒸餾水 至1L， pH7. 3, 12rC滅菌30min;溶液I為50,1/L葡萄糖，25醒ol/L Tris . CI, pH8. 0和10mmol/L EDTA, pH8. 0;溶液II為0. 2mol/L NaOH和 1°/。SDS;溶液III為溶液中含鉀的濃度為3mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根， pH4. 8; NH4Ac和LiCl之間的摩爾比例是1: 1。 STE溶液的成分為lOmmol/L Tris . CI, pH8. 0， 10mmol/L NaCl和l隱ol/L EDTA, pH8. 0; TE緩沖液為 lOmmol/L Tris HCl， pH8. 0和1嶋1/L EDTA, pH8. 0;其質(zhì)粒DM的提取 結(jié)果(參見圖1第4泳道)，提取DNA的含量為35. 3jug/niL, A26。/A28。=l. 82。
權(quán)利要求
1. 一種細菌質(zhì)粒DNA提取的方法，其特征在于1)細菌的培養(yǎng)將挑取的細菌單菌落在細菌常用液體培養(yǎng)基中，25-30℃振搖過夜培養(yǎng)；2)菌體的收集、裂解當(dāng)細菌為革蘭氏染色陰性菌時，取1.5-2.0mL培養(yǎng)16-24小時的菌液，并在10000-12000rpm下離心30-60秒，收集菌體；用1-1.5mL STE溶液洗滌兩次，10000rpm離心30秒；而后在細菌沉淀中加入100-300μL溶液I，再加入200-600μL溶液II，冰浴3-5分鐘，得裂解菌液；當(dāng)為革蘭氏染色陽性菌分別培養(yǎng)時，取3.0-4.0mL培養(yǎng)10-16小時的菌液，并在8000-10000rpm下離心60-90秒，收集菌體；用2.0-3.0mL STE溶液洗滌兩次，10000rpm離心30秒；而后在細菌沉淀中加入100-200μL溶液I和50-100μL溶菌酶，37℃水浴30-60分鐘，然后再加入200-600μL溶液II，冰浴3-5分鐘，得裂解菌液；3)質(zhì)粒DNA的復(fù)性、與染色體DNA分離在步驟2)中得到的裂解菌液內(nèi)加入150-400μL溶液III，冰浴15-20分鐘，4℃下以12000rpm離心10分鐘，取上清；并在上清液中加與其等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘，4℃下再以12000rpm離心5分鐘，取其沉淀待用；4)質(zhì)粒DNA的沉淀將步驟3)中的沉淀用100-400μL無菌重蒸水溶解，并加入溶解沉淀的無菌水的1/2體積的7.5mol·L-1NH4Ac和5mol·L-1LiCl，冰浴3-5分鐘，4℃下以12000rpm離心5分鐘，取上清；并在上清液中加與其等體積的異丙醇，室溫放置40分鐘，沉淀即為質(zhì)粒DNA；其中溶液I為50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl，pH8.0和10mmol/L EDTA，pH8.0；溶液II為0.2mol/L NaOH和1％SDS；溶液III為溶液中含鉀的濃度為3-5mol/L的KAc，和5mol/L乙酸根，pH4.8；NH4Ac和LiCl之間的摩爾比例是1∶1。
2. 按權(quán)利要求1所述的細菌質(zhì)粒DNA提取的方法，其特征在于所述 細菌常用液體培養(yǎng)基的成分為葡萄糖1. 0g，酵母膏1. Og，MgSO, '7H,0 0. 2g, Na2C03 0. lg， CaCl2 2H20 0. 01g, MnS04 ' H20 0. 02g, FeS04 7H20 0. 005g, NH4N0, l.Og, KH2P04 0. 4g, Na2HP04 0. 6g，加蒸餾水至1L, pH7. 2-7. 5。
3. 按權(quán)利要求1所述的細菌質(zhì)粒DNA提取的方法，其特征在于上述 得到的質(zhì)粒DNA可用乙醇洗滌，空氣中干燥后加50-IOOjuLTE溶解，-20°C 保存。
4. 按權(quán)利要求3所述的細菌質(zhì)粒DNA提取的方法，其特征在于所述 質(zhì)粒DNA的洗滌用乙醇洗滌2-4次，其中乙醇的濃度為60-80%。5.按權(quán)利要求1所述的細菌質(zhì)粒DNA提取的方法，其特征在于STE 溶液的成分為10國l/LTris .Cl， pH8. 0, lOmmol/L NaCl和1mmol/L ED丁A， pH8. 0; TE緩沖液為0隱ol/LTris . HC1， pH8. 0和lmmol/L EDTA, pH8. 0。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說是一種細菌質(zhì)粒DNA的提取方法。具體為將微生物菌體在液體培養(yǎng)基中，25-30℃振搖過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)過夜的菌液中加入緩沖溶液，離心收集和洗滌得裂解菌體；質(zhì)粒DNA的分離純化，所得到的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR等多種分子生物學(xué)實驗。本發(fā)明操作簡便、安全、質(zhì)量高、同時適用于革蘭氏染色陰性細菌、革蘭氏染色陽性細菌質(zhì)粒DNA的提取，因此具有廣泛的適用性。
文檔編號C12N15/31GK101235379SQ20071001027
公開日2008年8月6日 申請日期2007年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者宛 劉, 張利紅, 李培軍, 樂 鄭 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所