專(zhuān)利名稱(chēng)：：蛇毒金屬蛋白酶抑制劑BJ46a抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種蛇毒金屬蛋白酶抑制劑BJ46a抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤的發(fā)病率自20世紀(jì)70年代以來(lái)在全球范圍內(nèi)逐年上升，并在我國(guó)死亡病因中高居第二位。我國(guó)目前每年有180萬(wàn)人新患癌癥，150萬(wàn)人死于癌癥。惡性腫瘤不僅給患者本人及其親屬帶來(lái)精神和肉體上的雙重痛苦，也對(duì)我國(guó)有限的衛(wèi)生資源造成巨大的壓力?？刂坪椭委煇盒阅[瘤是我國(guó)政府面臨的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。瘤組織的增殖失控、瘤細(xì)胞的分化異常、瘤細(xì)胞具有侵襲轉(zhuǎn)移的能力是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特性，而侵襲轉(zhuǎn)移又是惡性腫瘤威脅患者健康乃至生命的主要原因。惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的的過(guò)程，大致可分為以下幾個(gè)步驟毛細(xì)血管瘤栓形成、腫瘤細(xì)胞穿透基底膜、腫瘤細(xì)胞到達(dá)繼發(fā)部位、繼發(fā)瘤生長(zhǎng)等。其中腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的屏障結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，涉及該過(guò)程最重要的酶系是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，麗Ps)。麗Ps是一類(lèi)含有鈣和鋅離子的水解蛋白酶，幾乎能降解除多糖以外的全部ECM，目前已發(fā)現(xiàn)二十多種。在正常組織中，畫(huà)Ps的水平較低并且活性受其天然抑制物一金屬蛋白酶組織抑制齊U(tissueinhibitorofmetalloproteinases，TIMPs)的抑制。TIMPs分為兩個(gè)功能區(qū)，其N(xiāo)端功能區(qū)的半胱氨酸殘基與MMPs的鋅離子活性中心結(jié)合，C端功能區(qū)與醒Ps的其他部位結(jié)合，以1:1的比例形成MMP—TIMP復(fù)合體，從而阻斷MMP與底物結(jié)合。在侵襲性惡性腫瘤，MMPs呈高水平表達(dá)，使ECM過(guò)度降解，為腫瘤細(xì)胞穿過(guò)組織基底膜進(jìn)而侵襲、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造前提條件。此外，腿Ps還參與腫瘤血管生成。Yamamoto等研究了30例原發(fā)性肝癌，發(fā)現(xiàn)MMP-2表達(dá)升高與肝門(mén)靜脈浸潤(rùn)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及首次術(shù)后復(fù)發(fā)率相關(guān)，表明肝癌細(xì)胞分泌的醒P-2在降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)腫7瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用；Nomura采用免疫組化、明膠酶譜等多種測(cè)檢手段，發(fā)現(xiàn)MMP-2主要在胃癌的進(jìn)展期表達(dá)，固P-2前體的激活是胃癌細(xì)胞擴(kuò)散的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。另外，在肺癌、結(jié)一直腸癌、乳腺癌等病例均出現(xiàn)不同類(lèi)型的MMPs高表達(dá)。而薩Ps抑制物TIMPs的表達(dá)增加，則使腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱。近年發(fā)展起來(lái)的麗P敲除小鼠提示缺乏MMP-2則血管生成減少，腫瘤演進(jìn)減緩。經(jīng)研究表明應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞的薩P-9和TIMP-1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)麗Ps和TIMPs表達(dá)失衡與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切?？傊怭s涉及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一較成熟的理論。因此，尋找新型、強(qiáng)效的金屬蛋白酶抑制劑成為抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要研究課題之一。BJ46a(46—kDaisoformafrom及j.araraca)是來(lái)自美洲矛頭蝮(Bothropsjararaca)血清的一類(lèi)金屬蛋白酶抑制劑，屬cystatin超家族的胎球蛋白(fetuin)家族。胎球蛋白的研究己持續(xù)半個(gè)多世紀(jì)，至今仍方興未艾。作為半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族cystatin的一個(gè)分支，胎球蛋白具有多種生物學(xué)作用在骨重塑、胎腦發(fā)育中起重要作用，并能維持體外細(xì)胞生長(zhǎng)；在腫瘤細(xì)胞表面，胎球蛋白和麗Ps結(jié)合，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。BJ46a分子量為46kDa，是酸性糖蛋白，擁有一個(gè)雙頭cystatin結(jié)構(gòu)域；在322個(gè)氨基酸之前是含19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，全長(zhǎng)有4個(gè)推定的N—糖基化位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明，BJ46a通過(guò)非共價(jià)復(fù)合物的形成與金屬蛋白酶交互作用，能有效抑制蛇毒金屬蛋白酶(snakevenommetalloproteinases,SVMPs)astrolysinc(I類(lèi)SVMPs)和jararhagin(III類(lèi)SVMPs)蛋白水解活性，抑制率分別為100%和91%。根據(jù)與鋅離子配位的配體數(shù)目、類(lèi)別及分布情況，SVMPs被認(rèn)為是與醒Ps同屬M(fèi)etzincins(鋅依賴(lài)金屬蛋白酶)家族，總體的空間結(jié)構(gòu)非常相似。BJ46a能有效抑制SVMPs蛋白水解活性，作用位點(diǎn)在金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域，它也可能通過(guò)與MMPs結(jié)合，從而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。從包括中國(guó)專(zhuān)利在內(nèi)的有關(guān)資料檢索表明，蛇毒金屬蛋白酶抑制劑BJ46a具有抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用及應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防與治療方面尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是要提供一種具有抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用及應(yīng)用于預(yù)防與治療腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的蛇毒金屬蛋白酶抑制劑BJ46a。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種蛇毒金屬蛋白酶抑制劑BJ46a抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的制備方法及應(yīng)用，其特征是1.BJ46a桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中序列AF294836,設(shè)計(jì)與人工合成相對(duì)應(yīng)的20條互補(bǔ)的寡核苷酸，以及10對(duì)PCR引物，通過(guò)緩慢退火PCR法使之拼接為BJ46a基因，經(jīng)Sacl及XhoI雙酶切后定向克隆到載體pET-42a(+)，PCR擴(kuò)增、酶切及測(cè)序分析；用定點(diǎn)突變法逐一改正錯(cuò)誤位點(diǎn)，獲得含正確目的基因的pET-42a(+)/BJ46a質(zhì)粒;在合成BJ46a基因的基礎(chǔ)上，將其插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacHTC的MCS中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a-Tl，以LB/AP平板篩選、PCR擴(kuò)增和酶切鑒定獲得陽(yáng)性重組子，提取pFastBacHTC-BJ46a重組體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，48h后通過(guò)藍(lán)白篩選，挑取單個(gè)白色菌落劃線，所得菌落均為白斑，從而構(gòu)建桿狀病毒重組轉(zhuǎn)座載體、重組穿梭載體；2.重組BJ46a蛋白在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)、純化利用公知的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白，以Cellfectin脂質(zhì)體與重組子Bacmid-BJ46a混合，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲Pl病毒；Pl病毒再感染昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得更高滴度的P2病毒，進(jìn)而擴(kuò)增P3病毒；將較高滴度的重組桿狀病毒感染Sf9，Westernblot示重組BJ46a蛋白表達(dá)，且最佳表達(dá)時(shí)間為感染后96h;用滴度5X107pfu/ml的重組病毒P3感染Sf9細(xì)胞，MOI值為10pfu/cell，在感染后96h收集細(xì)胞；使用ProBondm純化系統(tǒng)對(duì)大規(guī)模表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行純化，SDS—PAGE電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色及Western-blot分析可見(jiàn)重組融合蛋白清晰條帶；3.重組BJ46a蛋白生物學(xué)活性醒P(collagenase)水解底物gelatin產(chǎn)生熒光物質(zhì)，在激發(fā)波長(zhǎng)EX495nm、發(fā)射波長(zhǎng)EM515nm時(shí)有明顯的光吸收值，而底物gelatin在相應(yīng)波長(zhǎng)處無(wú)光吸收值；基質(zhì)金屬蛋白酶67os^ri:Vi咖collagenase終濃度分別為0.05U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL，室溫，于不同時(shí)間點(diǎn)用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)0D值，結(jié)果表明0.2U/mL、0.4U/mLGostrjV/咖collagenase在較短時(shí)間內(nèi)熒光值上升明顯；使用EnzChekGelatinase/CollagenaseAssayKit檢測(cè)重組BJ46a蛋白抑制應(yīng)Ps活性；通過(guò)檢測(cè)水解產(chǎn)物的生成量達(dá)到檢測(cè)酶活性的目的；以加入抑制劑BJ46a的濃度為橫坐標(biāo)，基質(zhì)金屬蛋白酶殘余活性％為縱坐標(biāo)，繪制重組蛋白BJ46a對(duì)MMPs的抑制活性曲線，表明隨著重組蛋白濃度的增高，MMPs的活性呈下降趨勢(shì)，BJ46a對(duì)應(yīng)Ps抑制活性的IG。值為0.12mg/ml;4.重組BJ46a蛋白體外抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的檢測(cè)應(yīng)用Transwell小室分析B16體外穿越基底膜能力，重組BJ46a蛋白處理組B16細(xì)胞數(shù)為5.93±0.66，低于對(duì)照組的39±2.79，代O.01,抑制率84.8%和空白對(duì)照組41.4士3.37，代0.01;5.應(yīng)用B16細(xì)胞實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型分析腫瘤細(xì)胞體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力不同濃度重組BJ46a蛋白處理組肺部轉(zhuǎn)移瘤數(shù)為1.1±0.83、0.9±0.7，低于對(duì)照組的6.3土3.00，代O.OOl和空白對(duì)照組10.7±5.73，代0.001;6.構(gòu)建pcDNA3.1HisC-BJ46a載體及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞系的篩選用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)將BJ46a克隆到pcDNA3.1HisC質(zhì)粒中，構(gòu)建pcDNA3.IHisC-BJ46a載體；Fugene6法轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，經(jīng)G418篩選抗性細(xì)胞克隆，RT-PCR鑒定其BJ46amRNA表達(dá)；7.B16/pcDNA3.1HisC—BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株體外侵襲能力分析采用Transwell小室侵襲轉(zhuǎn)移模型結(jié)果表明B16/pcDNA3.1HisC—BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株體外侵襲能力明顯降低，其穿膜細(xì)胞數(shù)低于B16/pcDNA3.1HisC空載體組和空白對(duì)照B16細(xì)胞組(代O.Ol)，抑制率為59.2%，其體外增殖、粘附、運(yùn)動(dòng)能力未見(jiàn)明顯改變；8.B16/pcDNA3.1HisC—BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型采用C57BL/6小鼠經(jīng)尾靜脈注射B16/pcDNA3.1HisC—BJ46a細(xì)胞、B16/pcDNA3.1HisC細(xì)胞、B16細(xì)胞建立實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型，注射后20天以頸椎脫臼法處死小鼠，肺轉(zhuǎn)移率均為100%,但B16/pcDNA3.1HisC—BJ46a組其肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)均優(yōu)于對(duì)照組，從而表明BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可抑制B16細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明根據(jù)GenBank中的BJ46a基因序列(AF294836),設(shè)計(jì)與人工合成BJ46a全基因?？寺〉綏U狀病毒表達(dá)載體，在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞生產(chǎn)具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的重組BJ46a蛋白，并通過(guò)體外侵襲模型試驗(yàn)和體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證明其具有抗黑色素瘤細(xì)胞B16侵襲轉(zhuǎn)移功能。因此，本發(fā)明可作為基因工程生產(chǎn)應(yīng)用于預(yù)防與治療腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的蛋白藥物。本發(fā)明構(gòu)建pcDNA3.1HisC-BJ46a真核表達(dá)載體，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a細(xì)胞株，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)再次證明BJ46a具有明顯抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用。因此，本發(fā)明還可作為基因治療應(yīng)用于預(yù)防與治療腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。通過(guò)基因工程合成BJ46a基因，首次從蛋白和基因水平證明BJ46a具有抑制B16細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛能。因此，通過(guò)生物工程技術(shù)，一方面可大量制備重組BJ46a蛋白，作為基因工程蛋白藥物應(yīng)用于預(yù)防與治療腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移；另一方面，構(gòu)建相應(yīng)的BJ46a基因表達(dá)載體或病毒，作為基因治療應(yīng)用于預(yù)防與治療腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。由此可見(jiàn)，BJ46a將在預(yù)防與治療腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面具有巨大的應(yīng)用前景和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。圖1:BJ46a基因擴(kuò)增示意圖。圖2:基質(zhì)金屬蛋白酶水解底物gelatin的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線(橫坐標(biāo)為時(shí)間分鐘；縱坐標(biāo)為吸光度)。圖3:重組BJ46a蛋白抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性分析(橫坐標(biāo)為重組BJ46a蛋白濃度mg/ml，縱坐標(biāo)為基質(zhì)金屬蛋白酶殘余活性％)。圖4:重組BJ46a蛋白預(yù)處理對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響(橫坐標(biāo)中依次為重組BJ46a蛋白組、雜蛋白對(duì)照組、空白對(duì)照組；縱坐標(biāo)為侵襲的細(xì)胞數(shù))。圖5:接種重組BJ46a蛋白預(yù)處理B16細(xì)胞C57BL/6小鼠肺臟轉(zhuǎn)移瘤灶(A為空白對(duì)照組，B為雜蛋白對(duì)照組，C為重組BJ46a蛋白組)。圖6:BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響(A為B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a組，B為B16/pcDNA3.1HisC組，C為未轉(zhuǎn)染B16組蘇木素染色X200)。圖7:接種B16細(xì)胞株C57BL/6小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤組織學(xué)觀察(A為B16組，B為B16/pcDNA3.1HisC組，C為B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a組HE染色X100)。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明BJ46a基因合成根據(jù)GenBank中査找的BJ46a基因序列(AF294836)將其分為20個(gè)片段，并相應(yīng)設(shè)計(jì)10對(duì)引物，合成純化。20個(gè)片段序列分別為<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>13:5'-ACTGCACTGCTCAGGAACTCCATACAGCAGGAGAAGACCATAT-3，14:5'-GTTTTTCCAGGCTAGCATGCGCAATATGGTCTTCTCCTGCTGT-3，15:5，-GCATGCTAGCCTGGAAAAACCTGTCATCCTTCATGTCMGGAG-3，16:5，-ATACTGTCTTTTTCAACGTGCCCCTCCTTGACATGAAGGATGA-3，17:5'-CACGTTGAAMAGACAGTATTAACTTCGTCCATCCACACMTG-3，18:5，-AACTGGGACTTCCGCCAAATGATCATTGTGTGGATGGACGAAG-3,19:5'-ATTTGGCGGAAGTCCCAGTTGATATATCAGATCGTCACACMC-3，20:5'-CTACAGCTCGAAGTGATGTACTGTGTGACGATCTGATAT-3'ACGATGACCATCATCACTGCCATCCTAACCTGAMACAGTTGCTCTGCAGAATCTAAAGATGAACAGTTTGAGTCGGACTGTGCTGAATCAAATGGGAGTGAGCGTGTTCCCCAGAACACAACAATACTGCCCTCTTCATGAGACTCGTGTGAGGTGCTTGTCTTTTGTCAAAAAAGAACTCCCCAMGTTTTCCTGGACAACCTTTCACAGGGGTIO對(duì)引物序列分別為12F:5，-ATGMTTCCCTGGTAGCTC-3'12R:5，-ACCTGTATCTGTCCACTC-3'34F:5，-GAGTGGACAGATACAGG-3'34R:5，-TTAAGGAAGACTGCCACCC-3'56F:5，-TGGGTGGCAGTCTTCCTT-3'56R:5'-ACAGTCCATTTCAACAGC-3，78F:5，-ATGCTGTTGAAATGGACTG-3'78R:5，—GACMTTTCGCCGCACGTTTTC—3，91OF:5'-AAACGTGCGGCGAAATTG-3，910R:5'-TAAACGTGGTCGGAAAG-3'1112F:5，-AAACTTTCCGACCACGTT-3'1112R:5，-GAGTTCCTGAGCAGTGCAG-3'1314F:5，-ACTGCACTGCTCAGGAACTC-3'1314R:5，-GTTTTTCCAGGCTAGCATGCG-3，1516F:5，-GCATGCTAGCCTGGAAAAAC-3，1516R:5，-ATACTGTCTTCAACGTG-3'1718F:5，-CACGTTGAAAAAGACAG-3，1718R:5，-AACTGGGACTTCCGCCAAATG-3，1920F:5，-ATTTGGCGGAAGTCCCAGTTG-3，1920R:5，—CTACAGCTCGAAGTGATGTAC—3，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果20個(gè)片段經(jīng)緩慢退火PCR兩兩拼接后分別獲得12、34、56、78、910、1112、1314、1516、1718、1920約120bp的IO個(gè)DNA片段；12、34、910、1112、1314、1516、1718、1920進(jìn)一步拼接為14、912、1316、1720約220bp的4個(gè)片段;14、56拼接為16，78、912拼接為712，即約320bp的2個(gè)片段；16、712拼接為約620bp的112，1316、1720拼接為約420bp的1320;112、1320拼接為約1020bp的120，即完整BJ46a基因。這些片段的大小與預(yù)期結(jié)果一致。BJ46a基因合成示意圖見(jiàn)圖1。實(shí)施例2:通過(guò)GeneTailor位點(diǎn)特異性突變系統(tǒng)校正錯(cuò)誤堿基BJ46a合成后序列測(cè)定表明與蛇類(lèi)BJ46a基因序列基本一致，但6個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)錯(cuò)誤。根據(jù)測(cè)序結(jié)果用定點(diǎn)突變的方法逐一改正錯(cuò)誤位點(diǎn)。每個(gè)位點(diǎn)突變均包含三步驟首先使用位點(diǎn)特異性的甲基化酶將目的DNA甲基化；然后通過(guò)兩條有重疊的引物進(jìn)行突變反應(yīng)，其中一條引物帶目的突變位點(diǎn)；最后將突變產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到mcrBC+的大腸桿菌DH5a-Tl，挑克隆，通過(guò)Sacl及Xhol雙酶切鑒定，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)該位點(diǎn)已完成所期望的突變。提取含已突變基因質(zhì)粒，重行三歩驟完成另一個(gè)位點(diǎn)突變，最后獲得正確的目的基因。實(shí)施例3:BJ46a桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建BJ46a于Sacl及Xhol位點(diǎn)雙酶切后插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacHTC的MCS中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci-Tl，以LB/AP平板篩選陽(yáng)性重組子，PCR擴(kuò)增、酶切鑒定，提取pFastBacHTC—BJ46a重組體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，48h后通過(guò)藍(lán)白篩選，挑取單個(gè)白色菌落劃線，證實(shí)所得菌落均為白斑，挑克隆PCR鑒定。結(jié)果表明成功構(gòu)建桿狀病毒重組轉(zhuǎn)座載體、重組穿梭載體。抽提細(xì)胞轉(zhuǎn)染用的高純度質(zhì)粒Bacmid—BJ46a重組體。實(shí)施例4:重組BJ46a蛋白在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)、純化、鑒定以Cellfectin脂質(zhì)體與Bacmid-BJ46a重組體混合，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，收集含有重組桿狀病毒顆粒的Pl病毒；取轉(zhuǎn)染上清Pl以MOI0.1感染Sf9細(xì)胞獲得更高滴度的P2病毒，進(jìn)而擴(kuò)增P3病毒。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率，選用存活率大于或等于97%細(xì)胞接種于12孔板，密度為1X106細(xì)胞/孔。室溫貼壁lh，以M0I10進(jìn)行重組病毒Bacmid-BJ46a接種，感染Sf9細(xì)胞。分別在24、48、72、96、120h吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗三次，吸凈殘液。每孔細(xì)胞加入1X上樣緩沖液(終濃度為0.08MTris-HC1，2%SDS，10%甘油，5%P-巰基乙醇，2%溴酚蘭)200ul，4t:裂解細(xì)胞30min，裂解物轉(zhuǎn)移到離心管中，沸水浴10min，使蛋白徹底變性，4°C12000g離心10min去除碎屑，-20。C保存?zhèn)溆?。以SDS—PAGE電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色及Western-blot分析表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明感染重組病毒48、72、96、120h在48.8-64.2kDa之間可見(jiàn)明顯條帶——重組融合蛋白，感染未發(fā)生重組病毒Bacmid的細(xì)胞及正常Sf9細(xì)胞均未見(jiàn)該條帶。最適宜的融合蛋白表達(dá)時(shí)間為感染后96h。大規(guī)模培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，擴(kuò)增病毒。用高滴度重組病毒感染Sf9細(xì)胞，MOI值為10pfu/cell，在最佳表達(dá)時(shí)間點(diǎn)——感染后96h收集細(xì)胞。力Q6mlNativeBinding緩沖液重懸細(xì)胞，經(jīng)兩次凍融循環(huán)，lml—次性針筒抽吸4次，裂解液4°C12000g離心10min去除碎屑，使用ProBondTM純化系統(tǒng)對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物行SDS—PAGE電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色及Western-blot分析。Western-blot具體方法為電泳完畢后，將膠上的蛋白通過(guò)電轉(zhuǎn)膜儀(250mA,3h)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，0.3%BSA的TBS中封閉過(guò)夜，順序加一抗為兔抗BJ46a抗體，二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，NBT/BCIP顯色。結(jié)果顯示成功純化重組BJ46a蛋白。在重組BJ46a蛋白提純過(guò)程中，以同樣條件純化感染空載體Bacmid的Sf9細(xì)胞，獲取的雜蛋白作為后續(xù)重組BJ46a蛋白系列功能實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。實(shí)施例5:重組BJ46a蛋白的生物學(xué)活性分析請(qǐng)參閱圖2、圖3，MMP(collagenase)水解底物gelatin產(chǎn)生熒光物質(zhì)，在激發(fā)波長(zhǎng)EX495nm、發(fā)射波長(zhǎng)EM515nm時(shí)有明顯的光吸收值，而底物gelatin在相應(yīng)波長(zhǎng)處幾乎無(wú)光吸收值。基質(zhì)金屬蛋白酶aosm'&'^collagenase終濃度分別為0.05U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL，室溫，于不同時(shí)間點(diǎn)用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)0D值，結(jié)果表明0.2U/mL、0.4U/mLC7asz^zVi鵬collagenase在較短時(shí)間內(nèi)熒光值上升明顯(圖2)。使用EnzChekGelatinase/CollagenaseAssayKit檢測(cè)重組BJ46a蛋白抑制醒Ps活性。通過(guò)檢測(cè)水解產(chǎn)物的生成量可達(dá)到檢測(cè)酶活性的目的。以加入抑制劑BJ46a的濃度為橫坐標(biāo)，基質(zhì)金屬蛋白酶殘余活性％為縱坐標(biāo)，繪制重組蛋白BJ46a對(duì)麗Ps的抑制活性曲線。結(jié)果表明隨著重組蛋白濃度的增高，畫(huà)Ps的活性呈下降趨勢(shì)，BJ46a對(duì)應(yīng)Ps抑制活性的IC5。值為0.12mg/ml(圖3)。實(shí)施例6:重組BJ46a蛋白處理的B16細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的檢測(cè)請(qǐng)參閱圖4，采用Transwell小室(Transwellchamber)分析方》去評(píng)價(jià)重組BJ46a蛋白處理后B16細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力。首先把Transwell(CorningCostar3422型，USA)倒置，在Transwell侵襲小室聚碳酸酯膜下表面滴加10PiFibronectin(0.5mg/ml)室溫1h風(fēng)干，膜內(nèi)側(cè)加入20WMatrigel(9.lmg/mlMatrigel1:8稀釋液)，37°C1h使Matrigel形成凝膠狀。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，PBS洗滌，重懸于0.1%BSA-無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，配制成2Xl(f個(gè)細(xì)胞/ml，加入重組BJ46a蛋白，使其終濃度為0.2mg/ml，以雜蛋白處理B16細(xì)胞為對(duì)照組，單純B16細(xì)胞為空白對(duì)照組，37°C596C02培養(yǎng)箱溫育2h后加入侵襲小室上室，下室加600W含10%胎牛血清1640液，置37°C，5%〔02培養(yǎng)48h。取出小室棄除上室液體，用棉簽擦盡上室膜面未穿膜的細(xì)胞及Matrigel，室溫下甲醇固定5min，蘇木素染色，400倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，取其平均值，以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)一重組BJ46a蛋白處理組侵襲細(xì)胞數(shù)抑制率(％)=-X100%對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)分析時(shí)在聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)不加Matrigel,37°C,5%0)2培養(yǎng)18h，其余操作步驟和計(jì)數(shù)方法同體外侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4及表1所示，重組BJ46a蛋白處理組B16侵襲穿越重建基底膜的細(xì)胞數(shù)為5.93±0.66，明顯低于對(duì)照組(39±2.79，代O.Ol，抑制率84.8%)和空白對(duì)照組(41.4±3.37，代O.Ol)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示BJ46a蛋白具有抑制B16細(xì)胞體外侵襲的潛能，但對(duì)B16細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有影響。表l經(jīng)重組BJ46a蛋白預(yù)處理的B16細(xì)胞體外遷移及侵襲能力(n=3)MovingpotentialInvisionpotentialGroup(cells/field)(cells/field);±s400X;±s200XBJ46aa38±2.305.93±0.66尸線01controlb42.4±3.62PAO.0539±2.79撒O.05blankcontrolc41.87±2.2741.4±3.37袍.b、a.c比較，沐.c比較實(shí)施例7:重組BJ46a蛋白預(yù)處理B16細(xì)胞小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移請(qǐng)參閱圖5，C57BL/6小鼠40只，按動(dòng)物體重(16—18g)隨機(jī)分為4組，每組10只。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞，胰酶消化并離心沉淀細(xì)胞，PBS液清洗細(xì)胞2次，用PBS液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為lX106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，加入不同濃度的重組BJ46a蛋白，同時(shí)設(shè)立PBS空白對(duì)照組、雜蛋白對(duì)照組。于C57BL/6小鼠尾靜脈注射200W瘤細(xì)胞懸液。注射后20天處死小鼠，取肺組織。計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)。組織經(jīng)中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其病理變化。結(jié)果如圖5及表2所示對(duì)照組小鼠肺部可見(jiàn)大量散在腫瘤轉(zhuǎn)移灶，并出現(xiàn)彌漫性胸腔轉(zhuǎn)移；光鏡下多數(shù)肺部轉(zhuǎn)移灶呈片狀融合，轉(zhuǎn)移灶內(nèi)瘤細(xì)胞體積大，細(xì)胞形狀各異，核異型性明顯，可見(jiàn)多量黑色素顆粒。重組BJ46a蛋白處理組，肺臟轉(zhuǎn)移瘤灶小，瘤結(jié)節(jié)數(shù)目明顯減少，與對(duì)照組相比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(代O.001)，說(shuō)明重組BJ46a蛋白可抑制B16細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移。終濃度0.3mg/ml的重組BJ46a蛋白組形成的瘤結(jié)節(jié)數(shù)略少于0.2mg/ml組，但二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>GGGGTACCATCTCAAGTGAGGGGGGATTTAG-3，(下劃線為Kpnl酶切位點(diǎn))，下游引物為5，-CCGCTCGAGCTACAGCTCGAAGTGATG-3，(下劃線為Xhol酶切位點(diǎn))。引入Kpnl及Xhol酶切位點(diǎn)的BJ46a基因經(jīng)雙酶切后正向插入pcDNA3.lHisC，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，置于37'C培養(yǎng)箱16h，在氨芐青霉素(濃度為100ug/ml)平板上隨機(jī)挑取兩個(gè)克隆，搖菌過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA。測(cè)序結(jié)果表明BJ46aDNA插入片段序列及讀碼框完全正確，構(gòu)建的載體命名為pcDNA3.1HisC-BJ46a。實(shí)施例9:pcDNA3.1HisC-BJ46a轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選轉(zhuǎn)染前一天，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞用胰酶消化，以3乂105個(gè)/孔接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，到轉(zhuǎn)染當(dāng)天50%80%匯片。轉(zhuǎn)染試劑Fugene6取3ul，用無(wú)血清培養(yǎng)基RPMI-1640稀釋到100ul，混勻孵育5min。按照轉(zhuǎn)染試劑DNA(ug)比例3:2直接加入DNA，混勻并孵育30min。逐滴均勻加入培養(yǎng)細(xì)胞的6孔板中。轉(zhuǎn)染24h后換含G418(600Pg/ml)的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。2w后，重組質(zhì)粒組、空載體組均有抗性細(xì)胞克隆形成而單純B16細(xì)胞對(duì)照組全部死亡。轉(zhuǎn)染3w挑選單細(xì)胞陽(yáng)性克隆若干，再換含G418(300Pg/ml)的培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)以防止轉(zhuǎn)入基因丟失。經(jīng)600|ig/mlG418抗性篩選克隆化細(xì)胞后，RT-PCR方法初篩分析B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a細(xì)胞目的基因表達(dá)，結(jié)果表明2個(gè)BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆均檢測(cè)到lkp左右的cDNA片段，而轉(zhuǎn)染空載體的B16/pcDNA3.1HisC細(xì)胞未檢測(cè)到上述條帶。實(shí)施例10:BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞株體外侵襲能力的檢測(cè)請(qǐng)參閱圖6，在Transwell侵襲小室(CorningCostar3422型，USA)聚碳酸酯膜外側(cè)滴加10MlFN(0.5mg/ml)并風(fēng)干，膜內(nèi)側(cè)加入20Matrigel(原液9.lmg/ml，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液按1:8稀釋)，風(fēng)干。于小室上室內(nèi)分別加入200W重懸于0.1%BSA-無(wú)血清1640培養(yǎng)液的上述B16/pcDNA3.lHisC-BJ46a細(xì)胞、B16/pcDNA3.1HisC細(xì)胞和空白對(duì)照B16細(xì)胞(含2X105個(gè)細(xì)胞)，下室加600W含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，置37°C,5%C02培養(yǎng)箱48h。取出小室棄除上室液體，用棉簽擦盡上室膜面未穿膜的細(xì)胞，室溫下甲醇固定5min，常規(guī)蘇木素染色，200倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，取其平均值，以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果如圖6、表3所示B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a細(xì)胞侵襲穿越重建基底膜明顯受到抑制，侵襲至小室下室的細(xì)胞數(shù)為8.53±1.60，明顯低于空載體組(20.93±2.16，代0.05，抑制率為59.2%)和空白對(duì)照組(41.60±3.10，代O.Ol)。提示BJ46a基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可抑制B16細(xì)胞的體外侵襲潛能，但對(duì)B16細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有影響。表3B16細(xì)胞克隆體外遷移及侵襲能力(n=3)CellMovingpotential(cells/field)5±s400X,值Invisionpotential(cells/field)x±s200XP值B16/pcDNA3.1HisC-BJ46aa38.47±2.69B16/pcDNA3.1HisCb39.53±2.38B16°41.2±3.37伸>0.05戶(hù)#>0.058.53±1.6020.93±2.1641.6±3.10尸*〈0.01尸詞.05袍.b、a.c比較，#b.c比較實(shí)施例11:B16/pcDNA3.1HisC—BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型請(qǐng)參閱圖7，C57BL/6小鼠30只，按體重隨機(jī)分為3組，每組10只。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a、B16/pcDNA3.1HisC和B16三組細(xì)胞，反復(fù)吹打并離心沉淀細(xì)胞，PBS液清洗2次，用PBS液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1X106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，于C57BL/6小鼠尾靜脈注射200W瘤細(xì)胞懸液。注射后20天頸椎脫臼法處死小鼠，取肺組織。計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)。組織經(jīng)中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其病理變化。另外，選取瘤結(jié)節(jié)，3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定，酒精-丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂618包埋劑包埋；超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，日立Hu-12A型透射電鏡觀察、攝影。結(jié)果表明三組細(xì)胞C57BL/6小鼠肺轉(zhuǎn)移率均為100%，但其肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)均有不同。B16/pcDNA3.1HisC細(xì)胞組、空白對(duì)照B16細(xì)胞組小鼠肺部可見(jiàn)大量散在腫瘤轉(zhuǎn)移灶，并出現(xiàn)彌漫性胸腔轉(zhuǎn)移。B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a細(xì)胞組小鼠肺臟轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目明顯少于空載體組及空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。光鏡下空白對(duì)照B16細(xì)胞組、B16/pcDNA3.1HisC細(xì)胞組肺部轉(zhuǎn)移灶呈片狀融合，形成巨大瘤灶，血管內(nèi)有瘤栓；轉(zhuǎn)移灶內(nèi)瘤細(xì)胞體積大，細(xì)胞形狀各異，核異型性明顯，可見(jiàn)黑色素顆粒；較大的瘤結(jié)節(jié)內(nèi)B16細(xì)胞伸出突起，彼此之間相互連接，形成環(huán)狀網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)一一血管生成擬態(tài)，內(nèi)有紅細(xì)胞。轉(zhuǎn)染BJ46a組瘤結(jié)節(jié)小(圖7)，說(shuō)明基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可抑制B16細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移。表4接種B16/BJ46a細(xì)胞的C57BL/6小鼠肺臟轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>gttgaaValGluPheLysgtggaaValGluccttegProSerAsnLysgagattGluliegtggagValGlucacgatHisAspcat3ttHisliectggaaLeuGluatgMetg肪GluAsnAsngacAspAspgtgValAsnC8CHisteaSertttPheAspggaGlyLysaatAsn卿ArggetAlacatHisttcPhecctProtgtCys110gttVal125eggArg140cctPro155Glu170gggGly185attlie200catHis215tgcCys230aaaLys245gatAsptttPheCgiigtcValgC3Ala33tAsnC8gGinLyscagGinValC3CHis卿ArggatAspValcttleucacHisgagGlutgcCysgcaAlaaagLysLystgtCysgtaValtecSerLysgttValcatHisactThrg33GlucagGinlietgcCyscctProgetcAspgacAsptatTyrAsncctProgttValtttPheatgMet115cacHis130Lys145tctSer160ca_cHis175gagGlu190tgcCys205aa_tAsn220ttcPhe235gagGlu250tttPhetecSertgtCysgttValgttValcctProactThrseaThr鄉(xiāng)ArgtegSer33tAsnsetThrccaProgaaGlutacTyrgaaGlugetAlagcaAlategSerg3CAspgttValcceiProattlietatTyrg33GlugatAspgatAspctgLeugtgvalgttValgetAlacagGintacTyrgaa_GluggaGlycatHistgtCysgaaGlugetAlagtcValactThr120tctSer135ttgLeu150cttLeu165cttLeu180tatTyr195etcLeu210gacAsp225ageSer240a/tclie255360405450495540585630675720765<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>LeuAsnPheValHisProHisAsnAspThrSerThiSeiHis61u290295300SerHisGluHisLeuAlaGluValProValAlaPheValLysLys305310315GluLeuProLysAsplieSerAspArgHisThrThrProValLys320325330GlyCysProGlyLysValHisHisPheGluLeu335340權(quán)利要求1.一種蛇毒金屬蛋白酶抑制劑BJ46a抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的制備方法，其特征是1)BJ46a桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中序列AF294836，設(shè)計(jì)與人工合成相對(duì)應(yīng)的20條互補(bǔ)的寡核苷酸，以及10對(duì)PCR引物，通過(guò)緩慢退火PCR法使之拼接為BJ46a基因，經(jīng)SacI及XhoI雙酶切后定向克隆到載體pET-42a(+)，PCR擴(kuò)增、酶切及測(cè)序分析；用定點(diǎn)突變法逐一改正錯(cuò)誤位點(diǎn)，獲得含正確目的基因的pET-42a(+)/BJ46a質(zhì)粒；在合成BJ46a基因的基礎(chǔ)上，將其插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacHTC的MCS中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α-T1，以LB/AP平板篩選、PCR擴(kuò)增和酶切鑒定獲得陽(yáng)性重組子，提取pFastBacHTC-BJ46a重組體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，48h后通過(guò)藍(lán)白篩選，挑取單個(gè)白色菌落劃線，所得菌落均為白斑，從而構(gòu)建桿狀病毒重組轉(zhuǎn)座載體、重組穿梭載體；2)重組BJ46a蛋白在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)、純化利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白，以Cellfectin脂質(zhì)體與重組子Bacmid-BJ46a混合，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲P1病毒；P1病毒再感染昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得更高滴度的P2病毒，進(jìn)而擴(kuò)增P3病毒；將重組桿狀病毒感染Sf9，Westernblot示重組BJ46a蛋白表達(dá)；用滴度5×107pfu/ml的重組病毒P3感染Sf9細(xì)胞，MOI值為10pfu/cell，在感染后96h收集細(xì)胞；使用ProBondTM純化系統(tǒng)對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，SDS—PAGE電泳分離；3)重組BJ46a蛋白生物學(xué)活性基質(zhì)金屬蛋白酶Clostridiumcollagenase終濃度分別為0.05U/ml、0.2U/ml、0.4U/ml，繪制酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線；使用EnzChekGelatinase/CollagenaseAssayKit檢測(cè)重組BJ46a蛋白抑制MMPs活性；以加入抑制劑BJ46a的濃度為橫坐標(biāo)，基質(zhì)金屬蛋白酶殘余活性％為縱坐標(biāo)，繪制重組蛋白BJ46a對(duì)MMPs的抑制活性曲線，表明BJ46a對(duì)MMPs抑制活性的IC50值為0.12mg/ml。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是:根據(jù)GenBank中查找的BJ46a基因序列AF294836將其分為20個(gè)片段，并相應(yīng)設(shè)計(jì)10對(duì)引物，合成純化；20個(gè)片段序列分別為1)5'-ATGAATTCCCTGGTAGCTCTCGTGCTCCTGGGTCAGATTATAGGATCTACGCTTAGCTCTCAAGTGAGGG-3'2)5'-ACCTGTATCTGTCCACTCTTTAGCGTCTTTCTCGTCGCATTCTMATCCCCCCTCACTTGAGAGCTMGC-3，3)5'-GAGTGGACAGATACAGGTGTGCGCTACATCAACGAGCATAAACTACATGGATACMATATGCCCTCAATGTAA_3，4)5'-TTAAGGAAGACTGCCACCCAATCGCCATCCCAGGGAACGACAACGATATTCTTAATTACATTGAGGGCATATTTG-3'5)5'-TGGGTGGCAGTCTTCCTTMATTAAATCTTCTGGAGACAGAATGTCATGTGTTGGATCCAACTCCTGTCA_3，6)5'-ACAGTCCATTTCAACAGCATGATTATGCTGTGGCCTTACAGTACAATTCTTGACAGGAGTTGGATCCMC-3，7)5'-ATGCTGTTGAMTGGACTGTGATGTCAAGATMTGTTTAATGTTGATACTTTCAAAGAAGATGTTTTTGC-3，8)5'-GACAATTTCGCCGCACGTTTTCCACAGAATCTGGAGTGGAGTGGCATTTTGCAAAAACATCTTCTTTGAA-3'9)5'-MACGTGCGGCGAAATTGTCCTAAATGTCCAATTCTGTTGCCTTCGAATMCCCTCAGGTGGTAGACTCT-3'10)5'-TAAACGTGGTCGGAAAGTTTTTCATTGTGTTTATTAAGCACATATTCAACAGAGTCTACCACCTGAGGGT-3'11)5，-MACTTTCCGACCACGTTTACGMGTTCTTGAGATTTCAAGAGGGCAGCACAAATATGAGCCTGAAGCTT-3'12)5'-GAGTTCCTGAGCAGTGCAGTTAACCTCCACAATAGCAAACTCCACATAGTAAGCTTCAGGCTCATATTTG-3'13)5，-ACTGCACTGCTCAGGAACTCCACGATGACCATCATCACTGCCATCCTAATACAGCAGGAGAAGACCATAT-3'<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>20個(gè)片段經(jīng)緩慢退火PCR兩兩拼接后分別獲得12、34、56、78、910、1112、1314、1516、1718、1920:120bp的10個(gè)DNA片段;12、34、910、1112、1314、1516、1718、1920進(jìn)一步拼接為14、912、1316、1720:220bp的4個(gè)片段;14、56拼接為16，78、912拼接為712，即320bp的2個(gè)片段；16、712拼接為620bp的112,1316、1720拼接為420bp的1320;112、1320拼接為1026bp的120,即完整BJ46a基因。3.重組BJ46a蛋白體外抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的檢測(cè)，其特征是應(yīng)用Transwell小室分析B16體外穿越基底膜能力，重組BJ46a蛋白處理組B16細(xì)胞數(shù)為5.93±0.66，明顯低于對(duì)照組。4.應(yīng)用B16細(xì)胞實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型分析腫瘤細(xì)胞體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力，其特征是不同濃度重組BJ46a蛋白處理組肺部轉(zhuǎn)移瘤數(shù)為1.1±0.83、0.9±0.7，明顯低于對(duì)照組。5.構(gòu)建pcDNA3.IHisC-BJ46a載體及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞系的篩選，其特征是用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)將BJ46a克隆到pcDNA3.IHisC質(zhì)粒中，構(gòu)建pcDNA3.IHisC-BJ46a載體；Fugene6法轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，經(jīng)G418篩選抗性細(xì)胞克隆。6.B16/pcDNA3.1HisC—BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株體外侵襲能力分析，其特征是采用Transwell小室侵襲轉(zhuǎn)移模型B16/pcDNA3.IHisC-BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株體外侵襲能力明顯降低，其穿膜細(xì)胞數(shù)低于B16/pcDNA3.1HisC。7.B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型，其特征是采用C57BL/6小鼠經(jīng)尾靜脈注射B16/pcDNA3.IHisC-BJ46a細(xì)胞、B16/pcDNA3.1HisC細(xì)胞、B16細(xì)胞建立實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型，BJ46a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可抑制B16細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種蛇毒金屬蛋白酶抑制劑BJ46a抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用及應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域。本發(fā)明根據(jù)GenBank中的BJ46a基因序列(AF294836)，設(shè)計(jì)與合成BJ46a全基因。克隆到桿狀病毒表達(dá)載體，在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞生產(chǎn)具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的重組BJ46a蛋白，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明其具有抗黑色素瘤細(xì)胞B16侵襲轉(zhuǎn)移功能。本發(fā)明應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a細(xì)胞株，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，證明BJ46a在基因水平抑制B16細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本發(fā)明應(yīng)用于預(yù)防與治療腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，具有巨大應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N15/866GK101429525SQ200710009950公開(kāi)日2009年5月13日申請(qǐng)日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日發(fā)明者徐劍文,旭林,林建銀申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)