專利名稱：類胡蘿卜素尤其蝦青素的重組生產(chǎn)及其可利用的生物物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及類胡蘿卜素，特別是蝦青素的重組生產(chǎn)，及可用于該生產(chǎn)的生物物質(zhì)。
已知蝦青素分布于多種生物體如動(dòng)物(例如鳥類如火烈鳥和scarletibis，和魚如虹鱒(rainbow trout)和大麻哈魚(salmon))、藻和微生物中。并且還認(rèn)識(shí)到同大多數(shù)類胡蘿卜素一樣，蝦青素也具有很強(qiáng)的針對活性氧的抗氧化特性，因此蝦青素有望作為醫(yī)藥用途來保護(hù)活體細(xì)胞免受某些疾病如癌癥的侵襲。尤其是，因?yàn)槲r青素能賦予動(dòng)物以鮮艷的桔紅色并能在市場里吸引顧客，所以從工業(yè)應(yīng)用的角度來看，特別是在魚如大麻哈魚的養(yǎng)殖業(yè)中對作為顯色試劑的蝦青素的需要與日俱增。
已知Phaffia rhodozyma為專門生產(chǎn)蝦青素的產(chǎn)胡蘿卜素酵母菌。與另一種產(chǎn)胡羅卜素酵母，紅酵母屬的種不同，Phaffia rhodozyma能夠發(fā)酵某些糖如D-葡萄糖。從工業(yè)應(yīng)用的角度來看，這是一個(gè)重要的性質(zhì)。最近的分類學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Phaffia rhodozyma具有有性繁殖并且其有性形態(tài)(telemorphic state)被命名為Xanthophyllomyces dendrorhous(W.I.Golubev；酵母11,101-110,1995)。為了從Phaffia rhodozyma中獲得蝦青素的高產(chǎn)菌株，進(jìn)行了一些菌株改造的研究，但近十年中，研究只是局限于采用傳統(tǒng)的誘變和原生質(zhì)體融合的方法。近來，Wery等采用Phaffia rhodozyma研制一種宿主載體系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)中非復(fù)制質(zhì)粒以多拷貝被組合到Phaffia rhodozyma基因組的核糖體DNA上(Wery等，基因，184,89-97,1997)。并且Verdoes等報(bào)道了更多的用來獲得Phaffia rhodozyma轉(zhuǎn)化子及其三個(gè)產(chǎn)胡蘿卜素基因的改造載體，所述三個(gè)基因編碼能催化3,7-二甲基-2,6-辛二烯焦磷酸生成β-胡蘿卜素的酶(國際專利WO97/23633)?；蚬こ谭椒▽τ赑haffia rhodozyma的菌株改造研究的重要作用日益增加，在不久的將來將突破通過傳統(tǒng)方法達(dá)到的產(chǎn)率。
如上所述，蝦青素具有抗氧化劑特性，并且這一特性似乎在體內(nèi)具有防活性氧類物質(zhì)如O2.,H2O2和OH.的重要作用，該活性氧類物質(zhì)在活細(xì)胞中不斷的產(chǎn)生。經(jīng)過傳統(tǒng)的化學(xué)誘變后，通過篩選抗霉素-敏感菌株，An等從Phaffia rhodozyma中獲得了蝦青素高產(chǎn)菌株(An,G-H.等，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Env.Microbiol.),55(1),116-124,1989)。已知抗霉素是細(xì)胞色素b和c1之間呼吸鏈的抑制劑(Lucchini,G.等，Mol.Gen.Genet.,177,139-,1979)并能增強(qiáng)這種抗霉素-敏感突變株中的色素形成作用。由于初級呼吸鏈中bc1復(fù)合物阻斷而產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)促進(jìn)了類胡蘿卜素的生成(An,G-H.等，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，55,116-124,1989)。實(shí)際上，培養(yǎng)基中加入生成O2的物質(zhì)杜醌能夠增加Phaffia rhodozyma中類胡蘿卜素的總含量(主要的類胡蘿卜素是蝦青素)以及葉黃素的相對含量，而活性氧類物質(zhì)淬滅因子甘露糖醇則起相反的作用(Schroeder,W.A.等，普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Mocrobiol.),139,907-912,1993)。這些結(jié)果促使這些作者得出Phaffia rhodozyma中的蝦青素具有抗氧化劑特點(diǎn)的結(jié)論。事實(shí)上，如果充分誘導(dǎo)生物氧化作用，就會(huì)增加指數(shù)生長后期產(chǎn)生蝦青素的量。此外，培養(yǎng)基中加入氧化底物如乙醇能增強(qiáng)Phaffia rhodozyma中蝦青素的產(chǎn)生量(Gu,W-L.等，J.Ind.Mocrobiol.Biotechnol.,19,114-117,1997)。盡管Schroeder等試圖通過比較親本菌株與抗霉素-敏感的蝦青素高產(chǎn)菌株之間的差異，找到作為Phaffia rhodozyma中天然活性氧類物質(zhì)淬滅因子的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶活性與蝦青素的產(chǎn)率之間的關(guān)系，但沒有觀察到體外活性的直接關(guān)系。
本發(fā)明提供了活性氧類物質(zhì)淬滅因子的基因和酶，如SOD和過氧化氫酶，它們是可用于改進(jìn)類胡蘿卜素，特別是蝦青素的生產(chǎn)工藝的有效生物物質(zhì)。本發(fā)明涉及線粒體和細(xì)胞質(zhì)的SOD和過氧化氫酶編碼基因的克隆和測定。本發(fā)明還涉及Phaffia rhodozyma中基因裂解后產(chǎn)生的酶的特性。通過在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下于合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)化體能夠證實(shí)其裂解對胡蘿卜素形成的作用。
特別是，本發(fā)明提供了生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，該方法包括培養(yǎng)重組生物體和回收培養(yǎng)物中的類胡蘿卜素，所述重組生物體中編碼一種或多種活性氧類物質(zhì)淬滅因子的基因通過借助對該基因具有特異性的裂解盒基本上裂解。所述重組生物體的宿主生物體可以屬于原核生物界、原生生物界或真菌界。更優(yōu)選所述重組生物體的宿主生物體可屬于歐文氏菌屬、紅細(xì)菌屬、粘球菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、聚球藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、土壤桿菌屬、鏈霉菌屬、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、鏈孢霉屬、紅酵母屬、布拉霉屬或須霉屬。最優(yōu)選地是，所述的重組生物體是P.rhodozyma的菌株。
活性氧類物質(zhì)淬滅因子是線粒體超氧化物歧化酶(SOD)，細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)和/或過氧化氫酶。
本發(fā)明還提供了一種可生產(chǎn)類胡蘿卜素的重組生物體，其特征在于編碼至少一種活性氧類物質(zhì)淬滅因子的基因被借助對該基因特異性的裂解盒基本上裂解。被裂解的活性氧類物質(zhì)淬滅因子是線粒體超氧化物歧化酶(SOD)，細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)和/或過氧化氫酶。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用來制備本發(fā)明的重組生物體的裂解盒，該裂解金用于裂解產(chǎn)類胡蘿卜素生物體中有效的活性氧類物質(zhì)淬滅因子的編碼基因，該基因含有與編碼活性氧類物質(zhì)淬滅因子的部分DNA序列基本相同的部分核苷酸序列和可選擇性標(biāo)記基因。用于構(gòu)建裂解盒的靶生物體可屬于原核生物界、原生生物界或真菌界，更優(yōu)選屬于歐文氏菌屬、紅細(xì)菌屬、粘球菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、聚球藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、土壤桿菌屬、鏈霉菌屬、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、鏈孢霉屬、紅酵母屬、布拉霉屬或須霉屬。被裂解的活性氧類物質(zhì)淬滅因子是線粒體超氧化物歧化酶(SOD)，細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)和/或過氧化氫酶。
如本文所用，多核苷酸或多肽序列(A)如果相對于另一序列(B)至少75％相同，優(yōu)選至少85％相同，如至少95％相同則為基本相同。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼活性氧類物質(zhì)淬滅因子(其在產(chǎn)生類胡蘿卜素的生物體中發(fā)揮作用)的重組DNA序列。DNA序列可來源于屬于原核生物界、原生生物界或真菌界的生物體，更優(yōu)選屬于歐文氏菌屬、紅細(xì)菌屬、粘球菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、聚球藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、土壤桿菌屬、鏈霉菌屬、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、鏈孢霉屬、紅酵母屬、布拉霉屬或須霉屬的生物體。特別優(yōu)選P.rhodozyma。由重組DNA序列編碼的活性氧類物質(zhì)淬滅因子可以是線粒體超氧化物歧化酶(SOD)，細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)和/或過氧化氫酶。
編碼線粒體超氧化物歧化酶的重組DNA序列可以是SEQ ID NO:1或4所示的序列，或它可以與SEQ ID NO:1或4具有高度的同源性，足以和SEQID NO:1或4中的任意一個(gè)序列發(fā)生重組。編碼細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶的重組DNA序列可以是SEQ ID NO:2或6所示的序列，或它可以與SEQ ID NO:2或6具有高度的同源性，足以和SEQ ID NO:2或6中的任意一個(gè)序列發(fā)生重組。編碼過氧化氫酶的重組DNA序列可以是SEQ ID NO:3或8所示的序列，或它可以與SEQ ID NO:3或8具有高度的同源性，足以和SEQ ID NO:3或8中的任意一個(gè)序列發(fā)生重組。
在本發(fā)明中，只要認(rèn)為適當(dāng)就可利用以下雜交和洗滌條件的任意組合來鑒定同源多核苷酸序列高度嚴(yán)謹(jǐn)條件6×SSC0.5％ SDS100μg/ml變性的鮭精DNA50％甲酰胺于42℃輕輕旋轉(zhuǎn)過夜。
高度嚴(yán)謹(jǐn)洗滌2×SSC洗1次，0.5％SDS室溫15分鐘，然后0.1×SSC洗1次，0.5％SDS室溫15分鐘。
低度嚴(yán)謹(jǐn)雜交6×SSC0.5％ SDS100μg/ml變性的鮭精DNA50％甲酰胺于37℃輕輕旋轉(zhuǎn)過夜。
低度嚴(yán)謹(jǐn)洗滌0.1×SSC洗1次，0.5％SDS室溫15分鐘。
可通過改變上述雜交反應(yīng)溫度和、或洗滌條件以獲得中度嚴(yán)謹(jǐn)條件。
因此，如本文所用，如果一序列(A)與另一序列(B)在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件(即上述高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件)下雜交，而且如果序列A所編碼的多肽或多肽片段具有與B所編碼的多肽相同的活性，則稱序列(A)相對于另一序列(B)“高度同源”。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有位于目的蛋白編碼區(qū)域上游的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼區(qū)域的重組DNA片段，該目的蛋白可以是線粒體超氧化物歧化酶。該重組DNA片段的表達(dá)使得目的蛋白定位于線粒體上。因此，本發(fā)明還提供了將目的蛋白定位于線粒體上的方法，該方法包括含有位于目的蛋白編碼區(qū)域上游的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼區(qū)域的重組DNA片段在合適的重組宿主生物體中的表達(dá)。
如上所述，本發(fā)明公開了活性氧類物質(zhì)淬滅因子，如線粒體超氧化物歧化酶、細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的核苷酸序列。這些多聚核苷酸被用來作為克隆編碼活性氧類物質(zhì)淬滅因子基因的探針或引物，基于基因的同源性，該活性氧類物質(zhì)淬滅因子在其它產(chǎn)生類胡蘿卜素的生物體中發(fā)生作用。


圖1表示通過使用從ATCC96594和它的SOD突變株中獲得的不含細(xì)胞的提取物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后的超氧化物歧化酶的活性染色分析。泳道1,P.rhodozyma ATCC96594；泳道2,P.rhodozyma ATCC96594∷pSOD/G717(SOD1裂解物)；泳道3,P.rhodozyma ATCC96594∷pSOD/G828(SOD2裂解物)；泳道4,P.rhodozyma ATCC96594。
主要如上述解釋，本發(fā)明的目的是提供一種通過生物方法生產(chǎn)類胡蘿卜素的新方法。所述新方法包括培養(yǎng)一種重組微生物，和從培養(yǎng)物中回收類胡蘿卜素，其中該微生物中編碼一種或多種活性氧類物質(zhì)淬滅因子的基因被借助對該基因具有特異性的裂解盒充分裂解。
本發(fā)明的目的還在于提供一個(gè)含有編碼活性氧類物質(zhì)淬滅因子的開放式閱讀框的重組DNA序列，所述活性氧類物質(zhì)淬滅因子可以是一種酶，如線粒體SOD或細(xì)胞質(zhì)SOD。該重組DNA序列可以含有部分編碼過氧化氫酶的基因片段。因?yàn)檫@些序列能與編碼所述酶的天然基因重組從而特異性地裂解該基因，所以它們被用來構(gòu)建所述的裂解盒。
所述重組DNA序列可以是一種源自屬于原核生物界、原生生物界或真菌界的生物體，更優(yōu)選地屬于歐文氏菌屬、紅細(xì)菌屬、粘球菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、聚球藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、土壤桿菌屬、鏈霉菌屬、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、鏈孢霉屬、紅酵母屬、布拉霉屬或須霉屬的一種生物體的重組DNA序列。特別優(yōu)選的生物體是P.rhodozyma。由該重組DNA序列編碼的活性氧類物質(zhì)淬滅因子可以是線粒體SOD，細(xì)胞質(zhì)SOD和/或過氧化氫酶。該重組DNA序列的一個(gè)特定例子是源自于Phaffia rhodozyma的基因并選自(ⅰ)SEQ ID NO:1或2所示的DNA序列；(ⅱ)SEQ ID NO:4或6所示的那些cDNA；(ⅲ)SEQ ID NO:1,2,4或6所示的DNA序列的同類編碼或等位(基因)變異體，和(ⅳ)SEQ IDNO:1,2,4或6所示的DNA序列中添加、插入、刪除、和/或置換了一個(gè)或多個(gè)核苷酸所得到的衍生物，該衍生物編碼具有所述酶活性的多肽。所述重組DNA序列的特征還在于(a)它編碼具有選自SEQ ID NO:5和7所示的氨基酸序列的酶，或(b)它編碼選自下組的酶的變異體(ⅰ)一個(gè)等位(基因)變異體，和(ⅱ)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、插入、刪除、和/或置換并具有所述酶活性的酶。
如本文所用，“等位基因變異體”指在二倍體生物如Phaffia rhodozyma、Xanthophyllomyces、dendrorhous等的兩個(gè)等位基因的任一個(gè)上至少有一個(gè)突變的變異體。一種指定基因的兩個(gè)等位基因有相同的形狀或特性，但一具體等位基因與該基因的另一等位基因在編碼產(chǎn)物或功能上有定性或定量的差別。等位基因變異體可天然產(chǎn)生或經(jīng)化學(xué)誘變而人工產(chǎn)生。野生型等位基因編碼一特定生物的野生株中特定的表型特征。
如本文所用，“同類編碼變異體”指下述變異體，其一個(gè)特定基因的核苷酸序列與野生型基因的序列有區(qū)別，但其翻譯產(chǎn)物(即氨基酸序列)與野生型蛋白質(zhì)相同。這是由于遺傳密碼的簡并性造成的，并且是各種生物在密碼子的利用中的差異造成的。
如本文所用，“DNA序列的衍生物”指下述DNA序列，其編碼的多肽具有相應(yīng)SEQ ID NO的活性但與該DNA序列不同在于1-20個(gè)，優(yōu)選1-10個(gè)，如1-5個(gè)核苷酸的添加、插入、刪除，和/或置換。
特別涉及的上述重組DNA序列可以是源自Phafffia rhodozyma的基因，其選自(ⅰ)SEQ ID NO:3代表的DNA序列；(ⅱ)SEQ ID NO:8所定義的cDNA；(ⅲ)SEQ ID NO:3或8代表的DNA序列的同類編碼或等位(基因)變異體，和(ⅳ)SEQ ID NO:3或8代表的DNA序列中添加、插入、刪除、和/或置換了一個(gè)或多個(gè)核苷酸所得到的衍生物，該衍生物編碼具有所述酶活性的多肽。所述重組DNA序列的特征還在于(a)它編碼具有選自SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列中的部分氨基酸序列的酶，或(b)它編碼的所述酶的一種變異體，其選自(ⅰ)一個(gè)等位(基因)變異體，和(ⅱ)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸被添加、插入、刪除、和/或置換并具有所述酶活性的酶。這種重組DNA序列優(yōu)選地可以是載體的形式。
本發(fā)明還提供了用所述重組DNA序列轉(zhuǎn)化宿主生物體以便得到這樣一種生物體，該生物體中編碼至少一種活性氧類物質(zhì)淬滅因子的基因因引入該基因特異性裂解盒而基本上被裂解。如本文所用，一種基因如果其編碼的多肽的活性相對于未被裂解的基因降低，則稱該基因被“裂解”或“被基本上裂解”。優(yōu)選地，活性降低100％，優(yōu)選至少50％如至少75％，更優(yōu)選至少90％-100％。該重組DNA序列的合適形式可以是載體。通過使用該重組DNA序列所得到的重組生物體在其編碼線粒體SOD，細(xì)胞質(zhì)SOD，或過氧化氫酶的DNA序列中被裂解。被該重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主生物體可有效改進(jìn)類胡蘿卜素，特別是蝦青素的生產(chǎn)方法。因此，本發(fā)明也提供了這樣的重組生物體。
這種生產(chǎn)類胡蘿卜素的生物方法能提高類胡蘿卜素，特別是蝦青素的產(chǎn)率。因此，以在能誘導(dǎo)產(chǎn)生類胡蘿卜素的條件下培養(yǎng)上述重組生物體為特征的生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法是本發(fā)明的一個(gè)方面。這種方法可以用于蝦青素的生物生產(chǎn)。
許多研究者指出活性氧類物質(zhì)可以促進(jìn)已知的產(chǎn)胡蘿卜素生物體產(chǎn)生類胡蘿卜素。環(huán)境的氧化壓力可增強(qiáng)Haematococcus pluvialisde的孢囊細(xì)胞對類胡蘿卜素的生物合成(Kobayashi等，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，59,867-873,1993)。活性氧類物質(zhì)可誘導(dǎo)類胡蘿卜素的生物合成，并且所積累的類胡蘿卜素可以保護(hù)Dunaliella bardawil免遭氧化壓力的破壞(Shaish等，Planta.,190,363-368,1993)。盡管在使活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)生改變的各種培養(yǎng)條件下對P.rhodozyma體內(nèi)產(chǎn)生蝦青素進(jìn)行了研究，但大概由于在這種研究中仍有天然活性氧類物質(zhì)淬滅因子存在并且在某種程度上彌補(bǔ)了活性氧類物質(zhì)對類胡蘿卜素生產(chǎn)的影響，所以還沒有弄清楚活性氧的產(chǎn)生與類胡蘿卜素產(chǎn)率之間的相互關(guān)系(Schroeder,W.A.等，普通微生物學(xué)雜志，139,907-912,1993)。
本發(fā)明中，為了排除P.rhodozyma中存在的天然活性氧類物質(zhì)淬滅因子抑制活性氧對蝦青素生產(chǎn)的正面作用的可能性，從P.rhodozyma中克隆天然活性氧類物質(zhì)淬滅因子如SOD和過氧化氫酶，通過構(gòu)建和引進(jìn)基因裂解質(zhì)粒來破壞天然活性氧類物質(zhì)淬滅因子的表達(dá)。假設(shè)蝦青素在P.rhodozyma中起著抗氧化劑的作用，天然活性氧類物質(zhì)淬滅因子的失活可能影響類胡蘿卜素的產(chǎn)生，其方式是由天然活性氧類物質(zhì)淬滅因子的缺乏導(dǎo)致體內(nèi)活性氧類物質(zhì)相對增加，使作為活性氧類物質(zhì)的另一種抑制因素的蝦青素產(chǎn)生。
活性氧類物質(zhì)可通過對細(xì)胞內(nèi)分子如蛋白質(zhì)或核酸的氧化損傷而對活細(xì)胞具有毒性。近來研究通過果蠅和線蟲中超氧化物歧化酶活性的增加，存活期的增加，與氧化損傷作用的減少之間的相互關(guān)系，表明衰老是由氧化損傷作用引起的(Agarwal,S.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，91,12332-12335,1994,Larsen,P.L.美國國家科學(xué)院院報(bào)，90,8905-8909,1993,Sohal,R.S.等，生物化學(xué)雜志，270,15671-15674,1995)。SOD和相關(guān)的抗氧化酶以及它們的基因在原核生物和真核生物中也進(jìn)行了充分的研究。
啤酒糖酵母如同大多數(shù)的真核生物一樣，在胞質(zhì)溶膠中含有Cu/ZnSOD(SOD1基因的產(chǎn)物)，在線粒體中含有MnSOD(SOD2基因的產(chǎn)物)。這些酶催化O2.的歧化，而生成O2和H2O2。小分子抗氧化劑，如谷胱甘肽和抗壞血酸；其它抗氧化酶，如過氧化氫酶和過氧化物酶；以及金屬螯合蛋白如金屬硫蛋白，可能通過減少氧化損傷使需氧微生物在有O2的條件下生存。細(xì)胞質(zhì)SOD的重要性通過缺乏SOD的啤酒糖酵母和大腸桿菌對雙氧的高度敏感性證實(shí)。在兩種生物體中，SOD活性的喪失與有氧條件下的慢速生長，較高的突變率和特異的生物合成缺陷有關(guān)。(sod1-酵母的需氧生長需要賴氨酸和蛋氨酸，而sod-大腸桿菌需要枝鏈氨基酸)。某些情況下，這些效果已知是由超氧化物對鐵硫簇蛋白的抑制作用而引起的(Gardner,P.R.等，生物化學(xué)雜志，266,19328-19333,1991,Kuo,C.F.等，生物化學(xué)雜志，262,4724-4727,1987)。如果，生長在有氧條件下并以葡萄糖作為碳源，啤酒糖酵母的sod2突變株不受影響。然而，它們在要求需氧代謝的碳源中對高氧含量非常敏感而在正常氧含量(nomoxia)中生長緩慢。
因?yàn)榫幋aSOD和過氧化氫酶的基因被從其它的種中克隆下來，所以來源于P.rhodozyma的相應(yīng)基因可采用簡并PCR方法進(jìn)行克隆。首先，通過上述方法，我們可以克隆含有部分SOD基因和CAT基因的一個(gè)部分基因片段。所述簡并PCR方法是一種克隆目的基因的方法，該目的基因與來源于其它種的功能相同或相似的已知酶具有氨基酸序列的高度同源性。通過將氨基酸序列反譯成相應(yīng)的(“簡并”)核苷酸序列來設(shè)計(jì)簡并引物，該簡并引物用來作為簡并PCR方法中的引物。在這種簡并引物中，通常使用含有A,C,G或T中的任何堿基的混合引物，或多義密碼中含有肌苷的引物。本發(fā)明中，采用這種混合引物作為簡并引物來克隆上述基因。所采用的PCR反應(yīng)條件隨下述引物和要克隆的基因而變化。本發(fā)明中，序列相互不同的兩種SOD基因被從同一PCR帶中經(jīng)簡并PCR克隆下來并被命名為SOD1和SOD2基因。
含有帶內(nèi)含子的編碼區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)如啟動(dòng)子或終止子的全基因可通過篩選構(gòu)建在合適宿主中的噬菌體載體或質(zhì)粒載體上的基因組文庫而從染色體上克隆下來，方法是將上述簡并PCR方法得到的一個(gè)部分DNA片段標(biāo)記后作為探針。在文庫的構(gòu)建及隨后的遺傳操作如測序、限制性消化、連接等過程中，通常采用大腸桿菌作為宿主菌，并用大腸桿菌載體、噬菌體載體如λ噬菌體載體、或質(zhì)粒載體如pUC載體。本發(fā)明中，根據(jù)插入大小在λ載體的衍生體，λZAPⅡ和λDASHⅡ中構(gòu)建P.rhodozyma的EcoRⅠ基因組文庫。插入大小，必須克隆的插入長度，是通過在構(gòu)建文庫前對每一基因進(jìn)行DNA印記雜交來確定的。本發(fā)明中，按照廠商提供的說明書(Boehringer-Mannheim,Germany)，以地高辛配基(DIG)，即一種類固醇半抗原取代傳統(tǒng)32p標(biāo)記物來標(biāo)記用作探針的DNA。通過采用DIG-標(biāo)記的具有部分目的基因的DNA片段作為探針篩選由P.rhodozyma的染色體構(gòu)建的基因組文庫。挑選出雜交噬菌斑并進(jìn)一步進(jìn)行研究。如果使用λDASHⅡ(插入大小為9至23kb)，制備的λDNA被EcoRⅠ消化，然后將EcoRⅠ插入片段克隆到質(zhì)粒載體如pUC19或pBluescriptⅡSK+中。當(dāng)采用λZAPⅡ構(gòu)建基因組文庫時(shí)，利用單鏈M13噬菌體衍生物Ex輔助噬菌體(Ex assist phage)(Stratagene,La Jolla,USA)，體內(nèi)切除方案方便地用于克隆到質(zhì)粒的后續(xù)步驟。所獲質(zhì)粒DNA經(jīng)測序檢查。本發(fā)明中，從λZAPⅡ文庫中分別獲得SOD1和SOD2基因，而過氧化氫酶(CAT)基因則克隆自λDASHⅡ文庫。
本發(fā)明中，我們使用了自動(dòng)熒光DNA測序儀ALFered系統(tǒng)(Pharmacia,Uppsala,SWeden)，采用自動(dòng)循環(huán)測序程序，其中大多數(shù)測序使用Taq DNA聚合酶。
本發(fā)明中，發(fā)明人確定了含有SOD1基因或SOD2基因的開放讀框及其啟動(dòng)子和終止子序列的基因組序列。通過序列分析，根據(jù)其氨基末端存在轉(zhuǎn)運(yùn)肽來判斷，發(fā)現(xiàn)SOD1編碼線粒體SOD。相反，SOD2不具有這種轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列并且這一事實(shí)暗示SOD2編碼細(xì)胞質(zhì)SOD。發(fā)明人還確定了CAT基因的開放讀框的部分基因組序列。
轉(zhuǎn)運(yùn)肽是一個(gè)信號序列，用來將核基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到定位于線粒體的蛋白如參與TCA循環(huán)的酶上，其中所述核基因在染色體上編碼而其翻譯蛋白在線粒體中發(fā)揮功能。在氨基末端加轉(zhuǎn)運(yùn)肽有利于某些蛋白質(zhì)在線粒體中的表達(dá)。
本發(fā)明中，通過連接上述基因的部分片段來構(gòu)建SOD1,SOD2和CAT基因的裂解質(zhì)粒，該質(zhì)粒不含基因的任一末端，具有自殺載體的抗藥基因，由于缺乏自主復(fù)制序列而不能在P.rhodozyma中自主復(fù)制。一個(gè)編碼能使宿主在毒性抗生素存在下生存的酶的抗藥基因通常被作為選擇標(biāo)記。定居在pPR2T(Verdoes等(國際專利出版物，WO97/23633))上的G418抗性基因是抗藥基因的一個(gè)實(shí)例。這種自殺質(zhì)粒不能自我復(fù)制，只能利用載體和染色體之間的同源序列進(jìn)行單交重組，而以整合的形式存在于宿主染色體上。與目的基因重組時(shí)，由于缺少基因的兩端其基因序列不能重組到宿主菌的染色體上，結(jié)果目的基因在如此獲得的重組菌株中被裂解。裂解質(zhì)粒的另一個(gè)實(shí)例是雙交換型質(zhì)粒。這種類型的裂解質(zhì)粒含有待裂解之目的基因的兩個(gè)不同片段并且篩選標(biāo)記基因如抗藥基因被插到這兩個(gè)片段之間。受體細(xì)胞染色體和供體質(zhì)粒DNA在該基因的兩個(gè)同源區(qū)域重組后，染色體序列被供體DNA置換且篩選標(biāo)記基因被插入到待裂解的目的基因上?？傊p交換型質(zhì)粒比單交型載體的重組頻率低。
在本發(fā)明中，發(fā)明人通過相應(yīng)基因的裂解使得目的酶失活。評價(jià)目的基因產(chǎn)物效果的其它方法是利用基因工程方法降低它的表達(dá)。某些方法可用于此目的。其中一種是反義方法。反義法是通過引入一段人工基因片段(其序列與目的基因的序列互補(bǔ))來降低目的基因的表達(dá)。這種反義基因片段與目的基因的成熟mRNA片段體內(nèi)形成復(fù)合體，結(jié)果降低了mRNA的翻譯效率。
另一方法是使啟動(dòng)子區(qū)突變?？傊?，基因由具有不同功能的幾個(gè)部分組成。在真核生物中，編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的基因被轉(zhuǎn)錄成前信使RNA(pre-mRNA)，它不同于核糖體RNA(rRNA)，小核RNA(snRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)的基因。盡管RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)在該轉(zhuǎn)錄過程中起著關(guān)鍵作用，但是如果沒有能覆蓋上游包含啟動(dòng)子之區(qū)域的順式元件和上游活化序列(UAS)，以及反式作用蛋白因子，PolⅡ不能單獨(dú)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。首先，由幾個(gè)堿性蛋白組分組成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物識(shí)別表達(dá)基因的5’-鄰近區(qū)域的啟動(dòng)子序列。對需在某些特殊調(diào)節(jié)(如熱休克反應(yīng)，或?qū)I養(yǎng)缺乏的環(huán)境的適應(yīng)等)下表達(dá)的基因來說，上述過程還涉及其它因素。在這種情況下，在5’-非翻譯上游區(qū)的啟動(dòng)子序列附近需要有一個(gè)UAS存在，并且一些正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)蛋白識(shí)別UAS并與UAS結(jié)合。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與啟動(dòng)子序列的結(jié)合強(qiáng)度受啟動(dòng)子鄰近區(qū)之反式作用因子結(jié)合的影響，并且這能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。
通過磷酸化作用激活轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物后，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物啟動(dòng)從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)延伸復(fù)合物從該基因的啟動(dòng)子區(qū)向3’方向移動(dòng)時(shí)，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的某些部分脫離(這個(gè)步驟被稱作啟動(dòng)子清除事件)，而延伸復(fù)合物繼續(xù)轉(zhuǎn)錄直至位于該基因3’-側(cè)下游區(qū)的終止序列。
為了降低目的基因的表達(dá)，通常在含有上述UAS序列的目的基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行常規(guī)化學(xué)誘變或基因定點(diǎn)誘變。用含有這樣一個(gè)突變啟動(dòng)子區(qū)域的重組DNA轉(zhuǎn)化宿主菌來獲得其中目的酶表達(dá)降低的突變菌株。如上所述，這種降低基因表達(dá)的嘗試也可如基因裂解一樣，用于測定基因產(chǎn)物對活體生物體中環(huán)境的影響。
作為轉(zhuǎn)化方法，LiCl法(Wery等，酵母，12(7),641-651,1996)和電穿孔法(Wery等，基因，184,89-97,1997)均被用于轉(zhuǎn)化P.rhodozyma，但是，這種條件下的轉(zhuǎn)化效率似乎仍然很低。本發(fā)明中，Biolistic轉(zhuǎn)化方法(Johnston等，分子生物學(xué)方法，53,147-153,1996)用于轉(zhuǎn)化P.rhodozyma。Biolistic方法是一個(gè)簡單可靠的方法，其中利用高壓氦氣將包裹在金或鎢微粒表面的供體DNA直接射入活細(xì)胞中。用轉(zhuǎn)化方法成功地轉(zhuǎn)化了新型隱球菌，它和P.Rhodozyma同屬擔(dān)子菌綱(basisdiomycetous)，并且用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法很難轉(zhuǎn)化(Toifaletti等.，細(xì)菌學(xué)，175(5),1405-1411,1993)。本發(fā)明中，這一BioliStic方法被成功地用來轉(zhuǎn)化P.rhodozyma細(xì)胞。
基因裂解的發(fā)生可直接通過酶活性證實(shí)，也可用所得轉(zhuǎn)化體的染色體經(jīng)PCR或DNA印跡雜交證實(shí)。本發(fā)明中，通過進(jìn)行活性染色來直接證實(shí)SOD的裂解和通過類似于常用于細(xì)菌分類學(xué)的過氧化氫酶試驗(yàn)中采用的目測法來定性過氧化氫酶的裂解。
在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這種基因工程獲得的P.rhodozyma并評估其產(chǎn)生蝦青素的產(chǎn)率。
本發(fā)明用以下實(shí)施例參照附圖作進(jìn)一步舉例說明。
實(shí)施例實(shí)施例中使用的材料和方法描述如下菌株P(guān).rhodozyma ATCC96594(根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1998年4月8日再次進(jìn)行了保藏，保藏號為ATCC74438)大腸桿菌DH5α:F-,φ80d,lacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,hsd(rk-,mK+),recA1,endA1,deoR,thi-1,supE44,gyrA96,relA1(Toyobo,Osaka，日本)大腸桿菌XL1-Blue MRF’:Δ(mcrA)183,Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173,endA1,supE44,thi-1,recA1,gyrA96,relA1,lac[F’proAB,lacⅠqZΔM15,Tn10(terr](Stratagene,La Jolla,USA)大腸桿菌SOLR:e14-Δ(mcrA),Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171,sbcC,recB,recJ,umuC∷Tn5(kanr),uvrC,lac,gyrA96,relA1,thi-1,endA1,λR,[F’proAB,lacⅠqZ Δ M15]Su-(非抑制的(nonsuppressing))(Stratagene)大腸桿菌XL1-MRA(P2):Δ(mcrA)183,Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173,endAl,supE44,thi-1,gyrA96,relA1,lac(P2溶原菌)(Stratagene)大腸桿菌TOP10:F-,mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80,ΔlacZM15,ΔlacX74,recA1,deoR,araD139,(ara-leu)7697,galU,galK,rpsL(Strr),endA1,nupG(Invitrogen,Carlsbad,USA)載體λZAPⅡ(Stratagene)λDASHⅡ(Stratagene)pBluescriptⅡSK+(Stratagene)pCR2.1TOPO(Invitrogen)pUC19(Takara Shuzo,Otsu，日本)培養(yǎng)基P.rhodozyma菌株常規(guī)維持于YPD瓊脂平板上(DIFCO,Detroit，美國)。大腸桿菌菌株被保存在LB培養(yǎng)基中(每升培養(yǎng)基含有10g細(xì)菌用胰蛋白胨，5g酵母浸膏(DIFCO)和5g NaCl)。NZY培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含有5gNaCl,2gMgSO4-7H2O,5g酵母浸膏(DIFCO),10gA型NZ胺(NZ aminetype A)(WAKO,Osaka，日本))被用于在軟瓊脂(0.7％瓊脂(WAKO))中繁殖λ噬菌體。制備瓊脂培養(yǎng)基需要加入1.5％的瓊脂(WAKO)。
方法分子遺傳技術(shù)的一般方法是根據(jù)“分子克隆”實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)中的方法。從Takara Shuzo(日本)購買限制酶和T4DNA連接酶。
用QIAGEN基因組試劑盒(QIAGEN,Hilden,Germany)按照廠家提供的說明書從P.rhodozyma中分離染色體DNA。利用DNA自動(dòng)分離系統(tǒng)(PI-50,Kurabo,Co.Ltd.,Osaka，日本)從大腸桿菌中小量制備質(zhì)粒DNA。通過QIAGEN柱(QIAGEN)從大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中量制備質(zhì)粒DNA。利用Wizard lambda制備DNA純化系統(tǒng)(Promega,Madison,USA)按照廠家提供的說明書分離λDNA。采用QIAquick或QIAEXⅡ(QIAGEN)在瓊脂糖上分離和純化DNA片段。λ噬菌體衍生體的操作按照廠家制定的說明書進(jìn)行(Stratagene)。
通過使用Isogen(Nippon Gene,Toyama，日本)，利用酚法從P.rhodozyma中分離總RNA。使用mRNA分離試劑盒(Clontech,Palo Alto,USA)從如此獲得的總RNA中純化出mRNA。使用CapFinder cDNA構(gòu)建試劑盒(Clontech)合成cDNA。
使用GigapackⅢ金包裝提取物(Stratagene)進(jìn)行體外包裝。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在Perkin Elmer 2400型的熱循環(huán)儀中進(jìn)行。實(shí)施例中描述了每一PCR反應(yīng)條件。PCR引物從商家購買或采用DNA合成儀合成(392型，Perkin Elmer，日本，Urayasu，日本)。用于DNA測序的熒光DNA引物購自Pharmacia公司。利用熒光DNA自動(dòng)測序儀(ALFred,Pharmacia)進(jìn)行DNA測序。
大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞購自Toyobo(日本)。
P.rhodozyma進(jìn)行biolistic轉(zhuǎn)化所使用的設(shè)備和試劑購自Nippon Bio-Red Laboratories(日本，東京)。
實(shí)施例1從P.rhodozyma中分離mRNA并構(gòu)建cDNA文庫為了構(gòu)建P.rhodozyma的cDNA文庫，細(xì)胞破碎后，緊接著采用酚提取法分離總RNA，利用mRNA分離試劑盒(Clontech)從P.rhodozyma的ATCC96594菌株中純化出mRNA。
首先，通過離心(1500×g離心10分鐘)從用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)了兩天的10ml培養(yǎng)物中收集ATCC96594菌株的細(xì)胞并用提取緩沖液(10mM檸檬酸鈉/HCl(PH6.2)含有0.7M KCl)洗滌一次。將細(xì)胞懸浮在2.5ml的提取緩沖液中，用弗氏壓碎勻漿器(Ohtake Works Corp.，日本，東京)按照生產(chǎn)廠家提供的方法以1500kgf/cm2的條件將細(xì)胞破碎并且馬上與兩倍體積的isogen(Nippon gene)混合。通過這一步驟，回收到400μg的總RNA。
然后，用mRNA分離試劑盒(Clontech)按照廠家提供的方法純化該總RNA。最后，得到16μg P.rhodozymaATCC96594菌株的mRNA。
用CapFinder PCR cDNA構(gòu)建試劑盒(Clontech)按照廠家提供的方法獲得P.thodozyma的cDNA。用1μg的純mRNA經(jīng)PCR擴(kuò)增而合成第一條鏈。該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)后，得到了1mg的cDNA庫。
實(shí)施例2兩種P.rhodozyma的部分SOD基因的克隆采用簡并PCR方法克隆P.rhodozyma的一個(gè)部分SOD基因。兩種混合引物根據(jù)其它菌種的已知超氧化物歧化酶基因的共同序列進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成，該兩種混合引物的核苷酸序列見表1。
表1用于克隆SOD1和SOD2基因的引物序列Sod1；AARCAYCAYCARACNTAYGTNAA(有義引物)(SEQ ID NO:10)Sod4；GCCCANCCNGANCCYTGNACNCC(反義引物)(SEQ ID NO:11)(R=A或G；Y=C或T；N=A,C,G或T)以ExTaq(Takara Shuzo)為DNA聚合酶和以實(shí)施例1得到的cDNA庫為模板進(jìn)行25輪PCR，每一輪為94℃ 15秒，46℃ 30秒，72℃為15秒，然后使反應(yīng)混合物在瓊脂糖凝膠上電泳?；厥站哂兴栝L度的PCR帶并利用QIAquick(QIAGEN)按照生產(chǎn)廠家提供的方法進(jìn)行純化，然后連接到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)上。對感受態(tài)大腸桿菌TOP10進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，挑選出6個(gè)白色菌落，然后利用DNA自動(dòng)分離系統(tǒng)(Kurabo PI-50)分離質(zhì)粒。測序后，發(fā)現(xiàn)兩種克隆具有互不相同的序列，其推導(dǎo)出的氨基酸序列分別與已知SOD基因相類似。這些分離出的cDNA克隆被命名為pSOD614#2和pSOD614#3并被用來作進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例3從P.rhodozyma中分離基因組DNA利用QIAGEN基因組試劑盒按照生產(chǎn)廠家提供的方法從P.rhodozyma中分離基因組DNA。
首先，通過離心(1500×g離心10分鐘)從用YPD培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的100ml培養(yǎng)物中收集P.rhodozyma ATCC96594菌株的細(xì)胞并用TE緩沖液(含有1mM EDTA的10mM Tris/HCl(pH8.0))洗滌一次。將細(xì)胞懸浮在QIAGEN基因組試劑盒的Y1緩沖液8ml中，加入濃度為2mg/ml的溶細(xì)胞酶(SIGMA)經(jīng)酶降解來破碎細(xì)胞并將反應(yīng)混合物于30℃溫育90分鐘，然后進(jìn)行下一步的提取步驟。最后得到20μg的基因組DNA。
實(shí)施例4以pSOD614#2和pSOD614#3作為探針的DNA印跡雜交進(jìn)行DNA印跡雜交以便克隆含P.rhodozyma的SOD基因的基因組片段。用EcoRⅠ消化2μg的基因組DNA并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行酸性和堿性處理。經(jīng)transblot(Joto Rika，日本，東京)運(yùn)行1小時(shí)使變性的DNA向尼龍膜(-HybondN+,Amersham)轉(zhuǎn)移。對轉(zhuǎn)移到尼龍膜上的DNA進(jìn)行熱處理固定(80℃,90分鐘)。按照DIG多引發(fā)方法(DIG multipriming)(BoehringerMannheim)標(biāo)記模板DNA(EcoRⅠ消化的pSOD614#2和pSOD614#3)來制備探針。按照廠家提供的方法進(jìn)行雜交。結(jié)果，與由pSOD614#2制備的探針雜交的帶顯示7.5千堿基(kb)的長度，而與由pSOD614#3制備的探針雜交的帶顯示8.0千堿基(kb)的長度。
實(shí)施例5含有序列互不相同的SOD基因的基因組片段的克隆用EcoRⅠ消化4μg的基因組DNA并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。然后，利用透析膜、通過傳統(tǒng)的洗脫方法回收長度為7至9kb的DNA。純化的DNA與1μg的經(jīng)EcoRⅠ-消化和CIAP(牛小腸堿性磷酸酶)-處理的λZAPⅡ(Strangene)于16℃下過夜以連接，并用GigapackⅢ金包裝提取物(Strangene)進(jìn)行包裝。用包裝的提取物感染大腸桿菌XL1Blue MRF’菌株，然后涂布于NZY培養(yǎng)基(其在LB瓊脂培養(yǎng)基上)。以EcoRⅠ消化的pSOD614#2和pSOD614#3為探針篩選出大約6000個(gè)噬菌斑。6個(gè)噬菌斑與標(biāo)記的pSOD614#2探針進(jìn)行了雜交，2個(gè)噬菌斑與標(biāo)記的pSOD614#3探針進(jìn)行了雜交。然后，按照生產(chǎn)廠家提供的方法(Strangene)對雜交噬菌斑進(jìn)行體內(nèi)切除。以sod1和sod4為引物進(jìn)行PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從6個(gè)pSOD614#2-雜交噬菌斑分離的一個(gè)質(zhì)粒與pSOD614#2具有相同的片段。這一質(zhì)粒被命名為pSOD703。在以sod1和sod4為引物的PCR分析結(jié)果中，還發(fā)現(xiàn)從2個(gè)pSOD614#3-雜交噬菌斑分離的兩個(gè)質(zhì)粒與pSOD614#3具有相同的片段。其中一個(gè)質(zhì)粒被命名為pSOD626并用于進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例6從P.rhodozyma中得到的兩種MnSOD基因的序列分析采用引物-步行(primer-walking)法對pSOD703和pSOD626進(jìn)行測序來確定完整核苷酸序列。位于pSOD703上的SOD1基因和位于pSOD626上的SOD2基因的核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID NO:1,NO:2.NO:5和NO:7。
BLAST分析(Altschul.S.F.等，分子生物學(xué)雜志215,403-410,1990)的結(jié)果表明，SOD1和SOD2基因的推導(dǎo)氨基酸序列與從其它菌種中得到的已知MnSOD同源，但不與Cu/Zn SOD或Fe SOD同源。
SOD1基因具有7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子，其推導(dǎo)的開放閱讀框由223個(gè)氨基酸組成。另一方面，SOD2基因具有10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子，其推導(dǎo)的開放閱讀框由199個(gè)氨基酸組成。兩種分離的SOD基因之間的最大差別在于SOD1基因氨基酸末端的延伸區(qū)，該序列可能作為到線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
事實(shí)上，Schroeder等已報(bào)導(dǎo)了兩種SOD，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的活性染色，分析出該兩種SOD是源自P.rhodozyma的抗KCN和H2O2的SOD。他們指出兩種MnSOD是凝集體或同工酶，但沒有提到它們的精確特征和亞細(xì)胞定位。如下所述，這兩種抗KCN和H2O2的SOD(即MnSOD)是SOD1和SOD2基因的產(chǎn)物。如“發(fā)明詳述”部分所述，大多數(shù)真核生物在其細(xì)胞內(nèi)不同部位具有不同種類的SOD(MnSOD在線粒體中，Cu/ZnSOD在細(xì)胞質(zhì)中)。這是兩種Mn SOD在不同亞細(xì)胞位置上發(fā)揮作用的第一個(gè)實(shí)例。
實(shí)施例7SOD1和SOD2基因的裂解質(zhì)粒的構(gòu)建如“發(fā)明詳述”部分所述，通過將G418抗性結(jié)構(gòu)基因插入到甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)基因的啟動(dòng)子和終止子之間并連接到KpnⅠ和HindⅢ消化的pUC19上來構(gòu)建具有抗藥標(biāo)記盒的質(zhì)粒。這一質(zhì)粒被命名為pUC19-G418并用來作進(jìn)一步的研究。通過以表2所示序列為引物的PCR方法體外合成SOD1和SOD2基因的部分片段用于同源重組。
表2Sod14:GGTACCTCCGATGATAGGAATGTGAG(有義引物)(SEQ ID NO:12)Sod15:GAATTCAGTTCAACGGAGGAGGACAC(反義引物)(SEQ ID NO:13)Sod47:GAATTCGGAGGAGGACACATCAACCG(有義引物)(SEQ ID NO:14)Sod48:GGTACCTGTACTGGAGGTAGAAAGCG(反義引物)(SEQ ID NO:15)PCR的條件是25個(gè)循環(huán)反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)為94℃維持15秒鐘，50℃維持30秒鐘和72℃維持15分鐘。以0.1μg由實(shí)施例3得到的基因組DNA為模板，以ExTaq為DNA聚合酶。分別以sod14和sod15為引物經(jīng)PCR擴(kuò)增SOD1的一個(gè)部分片段，以sod47和sod48為引物經(jīng)PCR擴(kuò)增SOD2基因的一個(gè)部分片段?；厥諗U(kuò)增的每一個(gè)0.65kb片段，并按照廠家提供的方案將其克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)上。從大腸桿菌TOP10轉(zhuǎn)化體的白色菌落中挑選6個(gè)單菌落并從那些轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒。通過限制性分析和測序，一個(gè)具有部分SOD1基因的克隆被篩選出來作進(jìn)一步研究并被命名為pSOD715。以類似的方式，一個(gè)具有部分SOD2基因的克隆被篩選出來并被命名為pSOD826。
然后，用EcoRⅠ和KpnⅠ消化pSOD715和pSOD826，所產(chǎn)生的0.65kb片段采用QIAquick方案純化，并連接到EcoRⅠ-和KpnⅠ-消化的pUC19-G418上。從大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化體的抗氨芐青霉素菌落中挑選6個(gè)單菌落并從那些轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒。通過限制性分析和測序，獲得了一個(gè)克隆，其中一個(gè)部分SOD1被融合到G418抗性盒的克隆并被命名為pSOD/G717。以類似的方式，獲得了一個(gè)部分SOD2被融合到G418抗性盒的克隆并被命名為pSOD/G828。
實(shí)施例8用biolistic方法轉(zhuǎn)化P.rhodozyma ATCC96594按照“分子生物學(xué)方法”(Johnston等，53；147-153,1996)中描述的方法制定轉(zhuǎn)化方案。作為宿主菌的P.rhodozyma ATCC96594在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)到穩(wěn)定期。離心培養(yǎng)液后，用無菌水將細(xì)胞濃縮10倍，然后取200μl的細(xì)胞懸浮液鋪在含有100μg的遺傳霉素，0.75M的甘露醇和山梨糖醇的YPD培養(yǎng)基上。將5μg來自pSOD/G717和pSOD/G828的環(huán)形DNA包裹上1.5mg的0.9μm金微粒來作為biolistic轉(zhuǎn)化的供體DNA。20℃下培養(yǎng)一星期后產(chǎn)生了幾百個(gè)遺傳霉素-抗性克隆。挑選4個(gè)這種轉(zhuǎn)化體并制備其染色體。通過PCR和DNA印跡雜交分析，其中一個(gè)轉(zhuǎn)化體被確定具有SOD1或SOD2基因的染色體裂解結(jié)構(gòu)，并用來作進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例9對從SOD1和SOD2裂解物的候選者中獲得的粗提物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的活性染色分析ATCC96594菌株和從ATCC96594的biolistic轉(zhuǎn)化中獲得的候選者用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天后，在4℃下以3000×g離心10分鐘進(jìn)行收集。用Tris-HCl緩沖液(10mM/PH8.0)洗滌后，用同樣的緩沖液將細(xì)胞濃縮10倍。用弗氏壓榨勻漿器(Ohtake Works)，在1500kg/cm2下破碎細(xì)胞，并在1500rpm下微量離心(TOMY,MRX150)勻漿級分來制備粗提物。
采用PIERCE(Rockford，美國)的BCA蛋白分析試劑測定如此獲得的粗提物中的蛋白質(zhì)濃度。按照Schroeder W,A.等描述的方法(普通微生物學(xué)雜志.139,907-912,1993)，對相當(dāng)于300μg蛋白質(zhì)的粗提物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳?；钚匀旧治鰠⒖糉lohe等描述的方法(酶學(xué)方法，105,93-104,1984)。
活性染色的結(jié)果見
圖1。親代菌株，ATCC96594的提取物中，觀察到兩條帶在暗背景下為透明帶，該透明帶具有SOD活性。相反，其中SOD1基因被裂解的ATCC96594∷pSOD/G717菌株在不變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中不具有高遷移率的活性帶，而其中SOD2基因被裂解的ATCC96594∷pSOD/G828菌株在不變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中不具有低遷移率的活性帶。從這一結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P.rhodozyma的粗提物中的兩種MnSOD是SOD1和SOD2基因的產(chǎn)物，并且，在不變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有高遷移率和低遷移率的SOD分別對應(yīng)于SOD1和SOD2基因的產(chǎn)物。
實(shí)施例10克隆P.rhodozyma的部分過氧化氫酶(CAT)基因采用簡并PCR方法克隆P.rhodozyma的部分CAT基因。如表3所示的兩種混合引物是根據(jù)源自其它菌種的已知過氧化氫酶基因的共有序列進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成的。
表3用于克隆CAT基因的引物序列Cat2；MGNTTYTCNACNGTNGGNGGNGA(有義引物)(SEQ ID NO:16)Cat5；CKRTGNCKYTGNGTRTCNGGRTA(反義引物)(SEQ ID NO:17)(M=A或C；N=A,C,G或T；Y=C或T；K=G或T；R=A或G)以ExTaq(Takara Shuzo)為DNA聚合酶和以實(shí)施例3得到的基因組DNA為模板進(jìn)行25輪PCR，每輪為94℃維持15秒鐘，45℃維持30秒鐘，72℃維持15秒鐘，反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。回收具有1.0kb長度的一條PCR帶并利用QIAquick(QIAGEN)按照生產(chǎn)廠家提供的方法進(jìn)行純化，然后連接到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)上。對感受態(tài)大腸桿菌TOP10進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，挑選出6個(gè)白色菌落，然后利用DNA自動(dòng)分離系統(tǒng)分離質(zhì)粒。測序后，發(fā)現(xiàn)兩種克隆的序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與已知的CAT基因相類似。這些分離的DNA克隆中的一個(gè)被命名為pCAT702并被用來作進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例11含有CAT基因的基因組片段的克隆以與實(shí)施例4相似的方式，采用pCAT702作為探針進(jìn)行DNA印跡雜交的研究。結(jié)果，觀察到了大小為9kb至23kb的雜交帶。接著，用EcoRⅠ消化4μg的基因組DNA并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。然后，利用透析膜、通過傳統(tǒng)的洗脫方法回收長度為9kb至23kb的DNA。純化的DNA與1μg的經(jīng)EcoRⅠ-消化和CIAP(牛小腸堿性磷酸酶)-處理的λDASHⅡ(Strangene)于16℃過夜以進(jìn)行連接，并用GigapackⅢ金包裝提取物(Strangene)進(jìn)行包裝。用包裝的提取物感染大腸桿菌XL1Blue MRA(P2)菌株，然后涂布于NZY培養(yǎng)基(其在LB瓊脂培養(yǎng)基上)。以EcoRⅠ消化的pCAT702為探針篩選出大約8000個(gè)噬菌斑。6個(gè)噬菌斑與標(biāo)記的pCAT702探針進(jìn)行了雜交。從每一λ克隆中制備λDNA，并且從以Cat2和Cat5為引物的PCR和序列分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)6個(gè)克隆中的4個(gè)具有與插入的pCAT702相同的片段。CAT基因的一個(gè)部分核苷酸及其推導(dǎo)出的氨基酸序列為序列表部分的SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:9。
實(shí)施例12CAT基因的裂解質(zhì)粒的構(gòu)建以與實(shí)施例7相似的方式，構(gòu)建CAT基因的裂解質(zhì)粒。首先，SacⅠ接頭被插入到pUC19-G418的HindⅢ位點(diǎn)上，其中定位著G418-抗性盒的終止子區(qū)，并且限制性分析結(jié)果表明產(chǎn)生了pUC19-G418Sa，其在G418-抗性盒的末端具有SacⅠ位點(diǎn)。然后，pUC19-G419Sa的KpnⅠ-和SacⅠ-片段被連接到KpnⅠ-和SacⅠ-消化的pCAT702上，并產(chǎn)生pCAT/706，其中一個(gè)部分基因組CAT基因與G418-抗性金融合。
實(shí)施例13 以pCAT/706作為供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P.rhodozyma ATCC 96594以類似于實(shí)施例8的方式，采用CAT-裂解質(zhì)粒，pCAT/706轉(zhuǎn)化P.rhodozyma ATCC 96594。20℃下培養(yǎng)一星期后產(chǎn)生了幾百個(gè)遺傳霉素-抗性克隆。挑選4個(gè)這種轉(zhuǎn)化體并制備其染色體。通過PCR和DNA印跡雜交分析，其中一個(gè)轉(zhuǎn)化體被確定具有染色體CAT基因的裂解結(jié)構(gòu)，并用來作進(jìn)一步的研究。
然后采用過氧化氫酶試驗(yàn)定性CAT裂解物的兩個(gè)候選者，該方法通常用來進(jìn)行細(xì)菌分類的研究。將一接種環(huán)的P.rhodozyma細(xì)胞浸入3％的H2O2溶液中，然后觀察到氧氣的生成。盡管當(dāng)ATCC 96594細(xì)胞一進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)，就立刻產(chǎn)生了O2泡沫，而兩株ATCC 96594∷pCAT/706突變體被浸入到H2O2溶液中時(shí)，卻很久才產(chǎn)生O2泡沫。這一結(jié)果意味著CAT基因發(fā)生了裂解，但殘余的微弱活性表明存在著另一種催化消除H2O2的物質(zhì)如源自P.rhodozyma的過氧化物酶。
實(shí)施例14 評價(jià)P.rhodozyma的SOD1,SOD2和CAT裂解體的蝦青素產(chǎn)生SOD1,SOD2和CAT的基因裂解對蝦青素之產(chǎn)生的影響用YPD培養(yǎng)基中的振蕩來評價(jià)。將生長在YPD瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)胞懸浮到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，然后將一部分細(xì)胞懸浮液接種在500ml帶擋板搖瓶中的50mlYPD培養(yǎng)基中。細(xì)胞在200r.p.m.和20℃的條件下培養(yǎng)84小時(shí)。間隔適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，取3ml培養(yǎng)液并分析細(xì)胞的產(chǎn)量，葡萄糖的消耗及蝦青素的含量。
細(xì)胞產(chǎn)量以66nm處的光密度計(jì)量，也可以細(xì)胞干重表示，干重是使細(xì)胞經(jīng)0.45μm醋酸纖維膜加硝酸纖維膜(HAWP04700,Millipore,Bedford，美國)過濾并于80℃下加熱過夜后測得。從以玻璃珠破碎的P.rhodozyma細(xì)胞中提取類胡蘿卜素后，采用HPLC測定P.rhodozyma的蝦青素含量。提取后，加入5ml含有適當(dāng)濃度的胭脂樹橙作為內(nèi)標(biāo)的丙酮/BHT/水。采用下述HPLC系統(tǒng)分析上清液中蝦青素的含量。
HPLC柱YMC-Pak ODS-A(6mm,150mm)溫度室溫洗脫液乙腈/甲醇/異丙醇(85/10/5)進(jìn)樣體積10μl流速2.0ml/分鐘檢測471nm處的UV表4概述了從84小時(shí)-培養(yǎng)物中獲得的結(jié)果。
表4 SOD和CAT突變對P.rhodozyma的總類胡蘿卜素和蝦青素產(chǎn)率的影響菌株總類胡蘿卜素蝦青素(mg/g細(xì)胞干重)(mg/g細(xì)胞干重)ATCC96594 0.169 0.111△SOD1 0.259 0.146
△SOD2 0.202 0.129△CAT 0.229 0.144SOD1和SOD2裂解體顯示出高于其宿主菌，ATCC96594的總類胡蘿卜素和蝦青素的產(chǎn)率。尤其是SOD1裂解體的類胡蘿卜素和蝦青素產(chǎn)量分別明顯地增加了53.3％和31.5％。
根據(jù)推導(dǎo)的其氨基酸末端的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列來判斷，SOD1似乎是線粒體酶并且可能起著清除超氧化物自由基的作用，該超氧化物自由基是線粒體的呼吸鏈上出現(xiàn)的一種活性氧類物質(zhì)。這些數(shù)據(jù)表明，由于胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生而補(bǔ)償了天然活性氧類物質(zhì)淬滅因子SOD1的缺乏，從而促進(jìn)了蝦青素的產(chǎn)生。
序列表<110>F.HOFFMANN-LA ROCHE AG<120>類胡蘿卜素尤其蝦青素的重組生產(chǎn)及其可利用的生物物質(zhì)<130>SOD<140><141><160>17<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>3632<212>DNA<213>Phaffia rhodozyma<220><221>5′UTR<222>(922)..(923)<223>實(shí)驗(yàn)的<220><221>外顯子<222>(986)..(1096)<220><221>內(nèi)含子<222>(1097)..(1306)<220><221>外顯子<222>(1307)..(1456)<220><221>內(nèi)含子<222>(1457)..(1555)<220><221>外顯子<222>(1556)..(1589)<220><221>內(nèi)含子<222>(1590)..(1694)<220><221>外顯子<222>(1695)..(1799)<220><221>內(nèi)含子<222>(1800)..(1920)<220><221>外顯子<222>(1921)..(1982)<220><221>內(nèi)含子<222>(1983)..(2076)<221>外顯子<222>(2077)..(2140)<220><221>內(nèi)含子<222>(2141)..(2246)<220><221>外顯子<222>(2247)..(2272)<220><221>內(nèi)含子<222>(2273)..(2390)<220><221>外顯子<222>(2391)..(2507)<220><221>聚腺苷酸位點(diǎn)<222>(2663)..(2664)<223>實(shí)驗(yàn)的<400>1tcctgttgat aatctttcta acgccttgta ctttgaccaa ggcgtttgtc cgaaattttg 60caaacttagt gttggtcgca tggacggtct tcggatccag aactgacggc tcgccaataa 120agtatgacga tggtagaggt gaaggaggga accacaggtt gaccagtctc aaagagtgct 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1．一種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，該方法包括培養(yǎng)重組生物體，并從培養(yǎng)物中回收類胡蘿卜素，所述生物體中編碼一種或多種活性氧類物質(zhì)淬滅因子的基因借助特異于該基因的裂解盒而基本上裂解。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的重組生物體的宿主生物體屬于原核生物界、原生生物界或真菌界。
3．如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述重組生物體的宿主生物體屬于歐文氏菌屬、紅細(xì)菌屬、粘球菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、聚球藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、土壤桿菌屬、鏈霉菌屬、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、鏈孢霉屬、紅酵母屬、布拉霉屬或須霉屬。
4．如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述重組生物體的宿主生物體是P.rhodozyma的一個(gè)菌株。
5．如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述活性氧類物質(zhì)淬滅因子是線粒體超氧化物歧化酶(SOD)，細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)和/或過氧化氫酶。
6．一種能夠產(chǎn)生類胡蘿卜素的重組生物體，其特征在于其中編碼至少一種活性氧類物質(zhì)淬滅因子的基因借助特異于該基因的裂解金而基本上裂解。
7．如權(quán)利要求6所述重組生物體，其中所述重組生物體的宿主生物體屬于原核生物界、原生生物界或真菌界，更優(yōu)選地屬于歐文氏菌屬、紅細(xì)菌屬、粘球菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、聚球藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、土壤桿菌屬、鏈霉菌屬、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、鏈孢霉屬、紅酵母屬、布拉霉屬或須霉屬。
8．如權(quán)利要求6或7所述重組生物體，其中被裂解的所述活性氧類物質(zhì)淬滅因子是線粒體超氧化物歧化酶(SOD)，細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)和/或過氧化氫酶。
9．一種用于裂解活性氧類物質(zhì)淬滅因子的編碼基因的裂解盒，該活性氧類物質(zhì)淬滅因子對在產(chǎn)生類胡蘿卜素的生物體中的胡蘿卜素形成有效，所述裂解盒包括與編碼活性氧類物質(zhì)淬滅因子的部分DNA序列基本相同的部分核苷酸序列和選擇性標(biāo)記基因。
10．如權(quán)利要求9所述的裂解盒，其中所述生物體屬于原核生物界、原生生物界或真菌界，更優(yōu)選地屬于歐文氏菌屬、紅細(xì)菌屬、粘球菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、聚球藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、土壤桿菌屬、鏈霉菌屬、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、鏈孢霉屬、紅酵母屬、布拉霉屬或須霉屬。
11．如權(quán)利要求9或10所述的裂解盒，其中被裂解的所述活性氧類物質(zhì)淬滅因子是線粒體超氧化物歧化酶(SOD)，細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)和/或過氧化氫酶。
12．如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的裂解盒，其中編碼缺陷性氧類物質(zhì)淬滅因子的部分核苷酸序列與引入了裂解盒的生物體中活性氧類物質(zhì)淬滅因子的至少部分編碼DNA序列相同。
13．如權(quán)利要求12所述的裂解盒，其中與活性氧類物質(zhì)淬滅因子的部分編碼DNA序列基本相同的部分核苷酸序列相對于相應(yīng)功能基因含有至少一個(gè)缺失和/或突變。
14．一種編碼活性氧類物質(zhì)淬滅因子的重組DNA序列，其有效于可產(chǎn)類胡蘿卜素的生物體中的胡蘿卜素形成。
15．如權(quán)利要求14所述的重組DNA序列，其中所述生物體屬于原核生物界、原生生物界或真菌界。
16．如權(quán)利要求14或15所述的重組DNA序列，其中所述生物體屬于原核生物界、原生生物界或真菌界，更優(yōu)選地屬于歐文氏菌屬、紅細(xì)菌屬、粘球菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、聚球藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、土壤桿菌屬、鏈霉菌屬、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、鏈孢霉屬、紅酵母屬、布拉霉屬或須霉屬。
17．如權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)所述的重組DNA序列，其為源自于微生物P.rhodozyma的序列。
18．如權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的重組DNA序列，其中活性氧類物質(zhì)淬滅因子是線粒體超氧化物歧化酶。
19．如權(quán)利要求18所述的重組DNA序列，其中所述序列由SEQ ID NO:1或4定義，或與SEQ ID NO:1或4所示的序列具有足以與SEQ ID NO:1和4中的任意一個(gè)序列重組的高度同源性。
20．如權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的重組DNA序列，其中活性氧類物質(zhì)淬滅因子是細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶。
21．如權(quán)利要求20所述的重組DNA序列，其中所述序列由SEQ ID NO:2或6定義，或與SEQ ID NO:2或6所示的序列具有足以與SEQ ID NO:2和6中的任意一個(gè)序列重組的高度同源性。
22．如權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的重組DNA序列，其中活性氧類物質(zhì)淬滅因子是過氧化氫酶。
23．如權(quán)利要求22所述的重組DNA序列，其中所述序列由SEQ ID NO:3或8定義，或與SEQ ID NO:3或8所示的序列具有足以與SEQ ID NO:3和8中的任意一個(gè)序列重組的高度同源性。
24．一種重組DNA片段，其含有位于目的蛋白編碼區(qū)上游的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼區(qū)。
25．如權(quán)利要求24所述的重組DNA片段，其中目的蛋白是線粒體超氧化物歧化酶。
26．一種定位線粒體中的目的蛋白的方法，該方法包括在合適的重組宿主生物體中表達(dá)權(quán)利要求24或25所定義的重組DNA片段。
27．一種多核苷酸，其作為探針用于克隆活性氧類物質(zhì)淬滅因子的基因，所述的活性氧類物質(zhì)淬滅因子有效于可產(chǎn)類胡蘿卜素的生物體中的胡蘿卜素形成。
28．如權(quán)利要求27所述的多核苷酸，其中所述活性氧類物質(zhì)淬滅因子是線粒體超氧化物歧化酶(SOD)，細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)和/或過氧化氫酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及類胡蘿卜素的生產(chǎn)方法，其包括培養(yǎng)重組生物并從培養(yǎng)物中回收類胡蘿卜素，其中該重組生物中編碼一或多種活性氧類物質(zhì)淬滅因子的一個(gè)基因被特異于該基因的裂解盒基本上裂解，本發(fā)明還涉及可用于該方法的遺傳物質(zhì)，如可產(chǎn)生類胡蘿卜素的重組生物、裂解盒、重組DNA序列、重組DNA片段；和多核苷酸。
文檔編號C12N1/21GK1316520SQ0013711
公開日2001年10月10日 申請日期2000年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月1日
發(fā)明者星野立夫, 小島一之, 瀨戶口豐 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司