專利名稱：一種中性粒細胞體外保存方法及培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞體外培養(yǎng)領域，尤其涉及一種中性粒細胞體外保存方法及培養(yǎng)基。
背景技術：
中性粒細胞占血液白細胞總數(shù)的60-70%，是白細胞中數(shù)量最多的一種。中性粒細胞胞漿中含有初級和次級兩種顆粒，初級顆粒較大，即溶酶體顆粒，內(nèi)含髓過氧化物酶、酸性磷酸酶和溶菌酶；次級(特殊)顆粒較小，內(nèi)含堿性磷酸酶、溶菌酶、防御素和殺菌滲透增強蛋白等。中性粒細胞具有很強的趨化作用和吞噬功能，當病原體在局部引發(fā)感染時，它們可迅速穿越血管內(nèi)皮細胞進入感染部位，對侵入的病原體發(fā)揮吞噬殺傷和清除作用。也可通過調(diào)理作用促進和增強其吞噬殺菌作用。中性粒細胞是急性炎癥反應中的主要效應細胞，從骨髓中釋放出來的中性粒細胞在眾多趨化因子的作用下聚集于炎癥部位。中性粒細胞在組織損傷部位的聚集是機體自我保護、自我修復的生理性反應之一。中性粒細胞來源于骨髓，產(chǎn)生速率高，每分鐘約為I X IO7個，但存活期短，用現(xiàn)有的體外保方法，只能保存約為1-2天。因此，現(xiàn)有技術還有待于改進和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種中性粒細胞體外保存方法及培養(yǎng)基，旨在解決現(xiàn)有技術中中性粒細胞體外保存時間短的問題。本發(fā)明的技術方案如下
一種用于中性粒細胞體外保存的培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基為RPM I 1640培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中添加有濃度為10_，10_6M DEX0所述的用于中性粒細胞體外保存方法的培養(yǎng)基，其中，所述RPM I 1640培養(yǎng)基中含體積分數(shù)為10%的胎牛血清、2 mmol /L L2谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100U/L鏈霉素。所述的用于中性粒細胞體外保存方法的培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基中添加有濃度為 KT5M DEX。一種中性粒細胞體外保存方法，其中，其具體步驟如下
以RPM I 1640培養(yǎng)基為中性粒細胞的培養(yǎng)基，在所述RPM I 1640培養(yǎng)基中添加濃度為 I (T4 I (T6M DEX ；
將中性粒細胞懸浮于RPM I 1640培養(yǎng)基中，在37°C、濕度100%、體積分數(shù)為5%C02和體積分數(shù)為95%空氣條件下進行培養(yǎng)。所述的中性粒細胞體外保存方法，其中，在所述RPM I 1640培養(yǎng)基中添加濃度為 KT5M DEX。有益效果經(jīng)過使用添加了 DEX的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)中性粒細胞，可以延長中性粒細胞的體外保存時間，其中采用IO-5Hiol /L的DEX的效果最好。采用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基和方法，不僅可以延長中性粒細胞體外保存的時間，而且步驟簡單，效果顯著。


圖I為本發(fā)明實施例I中對照組中性粒細胞體外培養(yǎng)活性測定結果圖。圖2為本發(fā)明實施例I中實驗組中性粒細胞體外培養(yǎng)活性測定結果圖。圖3為本發(fā)明實施例I中在對照組和實驗組的中性粒細胞體外培養(yǎng)活性測定結果對比圖。圖4為本發(fā)明實施例2中在三種不同濃度的DEX下中性粒細胞體外培養(yǎng)活性測定結果圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種中性粒細胞體外保存方法及培養(yǎng)基，為使本發(fā)明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明所提供的用于中性粒細胞體外保存的培養(yǎng)基，是在中性粒細胞的培養(yǎng)基中添加濃度為IO-4IO-6M DEX (地塞米松)制備而成的。采用所述用于中性粒細胞體外保存方法的培養(yǎng)基可延長中性粒細胞的體外保存時間。所述中性粒細胞的培養(yǎng)基為RPM I 1640培養(yǎng)基，其中含10% (體積分數(shù))胎牛血清，2 mmol /L L2谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素。正常體外中性粒細胞在普通的RPM I 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，只能存活50%， 在72小時基本全部凋亡。而在RPM I 1640培養(yǎng)基中添加DEX后，中性粒細胞在體外培養(yǎng) 24小時活性仍然可以達到90%，72小時后活性仍然可以達到50%。所述用于中性粒細胞體外保存方法的培養(yǎng)基，優(yōu)選為添加KT5M DEX，采用此培養(yǎng)基培養(yǎng)中性粒細胞，其體外保存時間最長。本發(fā)明所提供的中性粒細胞體外保存方法，其具體步驟如下
以RPM I 1640培養(yǎng)基為中性粒細胞的培養(yǎng)基，在所述RPM I 1640培養(yǎng)基中添加濃度為 I (T4 I (T6M DEX ；
將中性粒細胞懸浮于RPM I 1640培養(yǎng)基中，在37°C、濕度100%、5% (體積分數(shù))CO2和 95% (體積分數(shù))空氣條件下進行培養(yǎng)。采用本發(fā)明方法，即可延長中性粒細胞體外保存的時間，當在所述RPM I 1640培養(yǎng)基中添加濃度為10_5m DEX時，中性粒細胞的保存時間最長。實施例I
I、中性粒細胞采集取健康大鼠靜脈血，用3. 8%枸櫞酸鈉抗凝(9 : I)。血細胞部分中加入6%葡聚糖，沉降30分鐘后，吸取無紅細胞的上層液，用0. 9%生理鹽水洗滌2次后，然后加入2ml 42%和51%的Percoll并離心，收集42%到51% percoll界面間的中性粒細胞， 然后用0. 9%生理鹽水洗滌2次，以含10%熱滅活小牛血清，青霉素100U / ml、鏈霉素100 U / ml的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細胞，使其濃度為2 X IO7個/ ml (中性粒細胞彡95%)。2、中性粒細胞培養(yǎng)中性粒細胞懸浮于RPM I 1640培養(yǎng)基，其中含10%(體積分數(shù))胎牛血清，2 mmol /L L2谷氨酰胺，100 U /mL青霉素，100 mg/L鏈霉素。按每孔終濃度2 X IO6細胞/mL接種于24孔平底培養(yǎng)板(美國Costar公司)，實驗組10_5mol /L的地塞米松(dexamethas one, DEX)，對照組不加任何藥物。在37°C、濕度100%、5% (體積分數(shù))CO2和95% (體積分數(shù))空氣條件下進行培養(yǎng)。3、中性粒細胞活性的測定加O. 12mL中性粒細胞懸液于干凈、硅化的小塑料試管中，再加等量的O. 11%NBT溶液，然后在37°C孵育20分鐘，接著在室溫(22°C )靜置10 分鐘，取底部細胞涂片、瑞氏染色，在XlOO倍油鏡下計數(shù)100個中性粒細胞，其中胞漿有藍黑色甲沉淀者為NBT陽性(激活)中性粒細胞。由此可計算出激活中性粒細胞的百分率。通過臺盼藍排斥實驗計數(shù)并評價細胞存活率。形態(tài)學觀察中性粒細胞純度達94% 97%。4、凋亡檢測及標記中性粒細胞培養(yǎng)設定額度時間后采用溴化丙錠(PI)染色， 流式細胞技術(FCM)檢測。吖啶橙和溴乙啶均用生理鹽水配置為100mg/L濃度，吖啶橙用于核形態(tài)觀察，以識別凋亡，溴乙啶用于檢測細胞活性。取25μ L細胞懸液加5μ L染液染色lOmin，置玻片上，在熒光顯微鏡下觀察，每個樣品至少計數(shù)100個細胞。同時流式細胞術進行驗證。用無凋亡核形態(tài)的活細胞數(shù)除以觀察的總細胞數(shù)，求得活細胞百分比。其中，對照組和實驗組是分別設定培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h、72h，每組設定3個平行孔。在培養(yǎng)Oh、12h、24h、36h、48h、72h，分別取對照組和實驗組中的中性粒細胞，測定其活性。具體結果如圖廣3所示，對照組在進行體外培養(yǎng)24小時后，只能存活50%，在72小時基本全部凋亡。而在RPM I 1640培養(yǎng)基中添加DEX后，中性粒細胞在體外培養(yǎng)24小時活性仍然可以達到90%，72小時后活性仍然可以達到50%。實施例2
中性粒細胞采集、中性粒細胞培養(yǎng)、中性粒細胞活性的測定、凋亡檢測及標記的步驟與實施例I基本相同。不同在于，實驗組為3組，分別是添加了 10_4 M的地塞米松，10_5 M的地塞米松，10_6 M的地塞米松。經(jīng)過活性測定，可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過使用添加了地塞米松的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)中性粒細胞，可以延長中性粒細胞的體外保存時間，其中采用10_5 M的地塞米松的效果最好。如圖4 所示，圖4為體外培養(yǎng)24小時后，不同濃度DEX下中性粒細胞的存活率。應當理解的是，本發(fā)明的應用不限于上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種用于中性粒細胞體外保存的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為RPM I 1640培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中添加有濃度為10_，10_6 M DEX0
2.根據(jù)權利要求I所述的用于中性粒細胞體外保存方法的培養(yǎng)基，其特征在于，所述 RPM I 1640培養(yǎng)基中含體積分數(shù)為10%的胎牛血清、2 mmol /L L2谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100U/L鏈霉素。
3.根據(jù)權利要求I所述的用于中性粒細胞體外保存的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中添加有濃度為10_5m DEX0
4.一種中性粒細胞體外保存方法，其特征在于，其具體步驟如下以RPM I 1640培養(yǎng)基為中性粒細胞的培養(yǎng)基，在所述RPM I 1640培養(yǎng)基中添加濃度為 I (T4 I (T6M DEX ；將中性粒細胞懸浮于RPM I 1640培養(yǎng)基中，在37°C、濕度100%、體積分數(shù)為5%C02和體積分數(shù)為95%空氣條件下進行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權利要求4所述的中性粒細胞體外保存方法，其特征在于，在所述RPMI 1640 培養(yǎng)基中添加濃度為10_5M DEX0
全文摘要
本發(fā)明公開一種中性粒細胞體外保存方法及培養(yǎng)基，所述用于中性粒細胞體外保存的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中添加有濃度為10-4~10-6MDEX。采用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基和方法，可以延長中性粒細胞體外保存的時間，步驟簡單，效果顯著。
文檔編號C12N5/0787GK102586187SQ20121004212
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月23日 優(yōu)先權日2012年2月23日
發(fā)明者李曉祥, 沈政 申請人:深圳市中美康士生物科技有限公司